CN113711101A - 用于对样本成像的荧光扫描显微镜和方法 - Google Patents

Abstract

介绍了一种荧光扫描显微镜，其包括：激发光源，该激发光源被设计用于产生激发光分布，该激发光分布激发存在于样本中的荧光团，以便自发地发射荧光光子；去激发光源，该去激发光源被设计用于产生去激发光分布，该去激发光分布通过荧光光子的受激发射来使得由所述激发光分布在所述样本中激发的荧光团去激发；照明单元，该照明单元被设计用于将所述激发光分布和所述去激发光分布合并成沿着所述样本的多个照明目标点扫描的光分布，使得所述激发光分布的强度最大值和所述去激发光分布的强度最小值在相应的照明目标点中在空间上相互叠加；探测器，该探测器被设计用于检测从所述相应的照明目标点发射的荧光光子(根据这些荧光光子的到达时间)；和处理器。该处理器被设计用于，评估在所述相应的照明目标点中检测到的荧光光子的到达时间；基于所述评估生成代表相应照明目标点的第一图像点和第二图像点；把所述第一图像点合并成第一样本图像，并且把所述第二图像点合并成第二样本图像；并且，借助两个样本图像来确定在所述激发光分布的强度最大值和所述去激发光分布的强度最小值之间的空间偏移。

Description

用于对样本成像的荧光扫描显微镜和方法

技术领域

本发明涉及一种荧光扫描显微镜以及一种使用荧光扫描显微镜对样本成像的方法。

背景技术

在荧光显微术领域，为了样本的高分辨率成像，通常采用所谓的STED方法，其中，利用由激发光和去激发光叠加产生的光分布来照射样本。在此，STED表示“受激发射损耗”。在此，激发光旨在激发存在于样本中的荧光团，以便自发发射荧光。相比之下，去激发光(其波长不同于激发光的波长)用于通过荧光的受激发射来去激发由激发光激发的荧光团。为了提高图像分辨率，给激发光叠加具有特殊光分布的去激发光，该激发光以激光束的形式聚焦到样本中的相应的照明目标点上。这种去激发光分布具有强度零点和与其邻接的尽量陡峭地上升的强度边沿。为了获得尽可能最佳的图像分辨率，必须将去激发光分布叠加在激发光分布上，使去激发光分布的零点与激发光分布的强度最大值精确地重合。如果确保了这一点，则在照明目标点中抑制在激发光分布的外部区域中的荧光自发发射，从而仅从在去激发光分布的零点周围的区域探测自发发射的荧光。如果该样本区域采用扫描方法移动经过样本的大量照明目标点，则可以通过探测不受去激发光分布抑制的荧光来获得样本的高分辨率图像。

如果不能确保去激发光分布的零点与激发光分布的最大值重合，则会出现两种降低图像质量的效应。首先，在去激发光和激发光叠加中的失准调节导致图像亮度的降低。其次，这种失准调节突出了在激发光分布中的不希望有的次生最大值。在图1中示出了这两种效应，其中，为了简单起见，在那里假设在方向x上的一维光分布。

图1a示出了去激发光和激发光最佳叠加的情况。在此，实线表示激发光分布E，虚线表示去激发光分布D。在这种最佳情况下，去激发光分布D的由N表示的零点在x方向上与激发光分布E的最大值M精确地叠加。

图1c示出了在相应的照明目标点中探测到的荧光分布，该荧光分布由根据图1a的去激发光和激发光的最佳叠加而产生。这种荧光分布示出高强度的且尖锐的最大值，该最大值的较小的半宽决定了在方向x上的空间分辨率。

相比之下，图1b示出了失准调节的情况，其中，去激发光分布D的零点N与激发光分布E的最大值M不重合。这种失准导致在图1d中示出的荧光分布。如与图1c相比可以看出，去激发光和激发光的不精确叠加导致荧光分布的最大值明显减小。此外，在荧光分布中出现显着的次生最大值，如图1d中的箭头所示。这种次生最大值出现在x方向上的一些点处，在这些点处，荧光激发通过去激发光分布没有猝灭到足够的程度。

由现有技术已知各种解决方案，其旨在确保激发最大值和去激发零点局部地重合。第一种方法在本领域中以术语“easy STED”为人所知，并在出版物EP 2 158 475 A2以及Reuss,M.,“Simpler STED setups”,Ruperto-Carola University of Heidelberg,2010(博士论文)中有所描述。这些出版物中公开的基本思想在于，通过公共单模光纤将激发光和去激发光引导到样本上。由此确保样本中的两个光分布始终以所需的方式精确叠加。但问题在于，必须在光纤的出射端和物镜之间设置移相掩模，该移相掩模旨在影响去激发光，使得去激发光在照明目标点具有所希望的光分布。在传统的STED配置中，这种移相掩模仅在去激发光的光路中起作用，但与此不同地，在该方法中，激发光也穿过移相掩模。为了在很大程度上避免移相掩模对激发光的影响，移相掩模必须由不同的材料以复杂的方式制造。在此，必须确保移相掩模在去激发光的波长处产生所希望的相变。因此，这种方法的主要缺点在于，移相掩模必须针对激发光和去激发光波长的特定组合进行特别优化。出于这个原因，所得到的显微镜结构在可采用的波长方面并因此在可使用的荧光团方面是不灵活的。另一个缺点在于，探测到的荧光通常也穿过移相掩模，并因此减弱。

在文件DE 10 2007 011 305 A1中描述了另一种方法。在该方法中，使用校准标本来测量激发光分布和去激发光分布的相对位置。知道了相对位置，然后就可以通过一个或多个执行部件在用于激发光和去激发光的分开的光路之一中优化叠加。这种方法的一个特点在于，校准标本代替样本不是被插入，而是被摆动到中间图像平面中。通过这种方式就不需要为了检查或优化调节而移除样本。然而，这种方法的缺点是，校准标本必须摆动到中间图像平面中，并且显微镜必须重新配置，使得该显微镜在反射模式下工作。这使得该方法变慢。

在出版物DE 10 2013 227 107 A1中也公开了对STED显微镜的调节。但这种方法主要是关于移相掩模在去激发光的光路中的对准，而不是关于激发光和去激发光的叠加。

上述所有方法还有如下缺点：不能考虑样本对激发光和去激发光的相对位置的影响。于是特别地，样本内折射率的变化会影响光分布的位置。在Gould,T.J.；Kromann,E.B.；Burke,D.；Booth,M.J.&Bewersdorf,J.的“Auto-aligning stimulated missiondepletion microscope using adaptive optics”,Opt.Lett.,2013,38,1860-1862中描述了对此的解决方案。在这种方法中，借助高分辨率图像本身来确定激发光和去激发光的最佳叠加。在此，基于图像亮度和图像清晰度，确定评估图像质量的度量值。在优化过程中，然后控制在去激发光的光路中的空间光调制器，简称SLM，使得该度量值最大化。该方法的缺点是，为了优化，需要多个迭代步骤，因为该度量值不包含关于方向的任何信息，去激发光分布必须在该方向上移动，以便实现最佳的叠加。

关于现有技术，还参考在本领域中称为“Time-Gated(时间门控)STED”的方法，该方法例如在Vicidomini,G.；Moneron,G.；Han,K.Y.；Westphal,V.；Ta,H.；Reuss,M.；Engelhardt,J.；Eggeling,C.&Hell,S.W.的“Sharper low-power STED nanoscopy bytime gating”Nat Methods,2011,8,571-573中有所描述。该方法与脉冲激光光源一起工作，以产生激发光和连续激光光源，即连续激发的激光，用于产生去激发光。在此，该方法考虑到检测到的荧光光子到达时间包含有关光子是否来自去激发光分布的零点区域的信息。

发明内容

本发明的目的是，提出一种荧光扫描显微镜和一种使用这种荧光扫描显微镜对样本成像的方法，它们能实现以简单的方式确定在激发光分布的最大值和去激发光分布的最小值之间的空间偏移。

本发明通过独立权利要求的主题实现了该目的。在从属权利要求中给出了有利的改进。

提出了一种荧光扫描显微镜，特别是STED扫描显微镜，其包括激发光源和去激发光源，该激发光源被设计用于产生激发光分布，该激发光分布激发存在于样本中的荧光团，以便自发地发射荧光光子，该去激发光源被设计用于产生去激发光分布，该去激发光分布通过荧光光子的受激发射的方式来使得由激发光分布在样本中激发的荧光团去激发。荧光扫描显微镜还包括照明单元，该照明单元被设计用于将激发光分布和去激发光分布合并成一个沿着样本的多个照明目标点扫描的光分布，使得激发光分布的强度最大值和去激发光分布的强度最小值在空间上相互叠加于相应的照明目标点。此外，荧光扫描显微镜包括探测器，该探测器被设计用于检测从相应的照明目标点发射的荧光光子(根据它们的到达时间)。荧光扫描显微镜还包括处理器，该处理器被设计用于评估在照明目标点中检测到的荧光光子的到达时间。处理器还设计用于基于该评估生成代表相应照明目标点的第一图像点和第二图像点。处理器还被设计用于把第一图像点合并成第一样本图像，并且把第二图像点合并成第二样本图像。最后，处理器被设计用于，借助两个样本图像来确定在激发光分布的强度最大值和去激发光分布的强度最小值之间的空间偏移。

因此，这里提出的解决方案规定了产生两个样本图像，这些样本图像在被考虑用于产生相应样本图像的荧光光子的探测到的到达时间方面彼此不同。因此，所要求保护的荧光扫描显微镜利用了这样一个事实，即荧光团在激发态下的停留时间—下面也称为荧光团的寿命—取决于相应的荧光团是否位于去激发光分布的零点区域内。于是，在去激发光分布的零点区域内，寿命仅由荧光团的自发发射率决定。相反，在去激发光分布不为零的区域中，除了自发发射率外，还要考虑受激发射率。这缩短了在上述区域内的寿命。因此，由探测器检测到的到达时间也包含了关于荧光团的空间分布的信息。该信息包含在根据本发明产生的两个样本图像中，因为这些样本图像在分配给它们的荧光光子的到达时间方面彼此不同。结果，由该信息可以通过图像比较来确定出在激发光分布的强度最大值和去激发光的强度最小值之间的空间偏移。

在此特别有利的是，对两个样本图像的比较直接能实现确定去激发光分布相对于激发光分布移动的方向和距离，以便补偿偏移，从而实现这些光分布的最佳叠加。偏移的方向和距离可通过算法确定，因此只需要少量的迭代来消除偏移，甚至可能只需要唯一的一次迭代。以这种方式，可以避免开头解释的由于失准调节而导致的缺点，例如图像亮度的降低和激发光分布中不希望的次生最大值的突出。

还特别有利的是，激发光分布和去激发光分布之间的偏移是在要成像的样本本身上确定的，而不是例如使用校准标本确定的。由此已经固有地考虑到了样本本身比如由于其变化的折射率而对激发和去激发光分布的相对位置所具有的影响。

由于确定空间偏移所基于的两个样本图像代表了分别检测到的荧光光子的不同到达时间，并且相应的到达时间又取决于发射相关荧光光子的荧光团的位置，因此两个样本图像具有不同的分辨率。特别是，代表早期荧光光子(即具有相对较短的到达时间的光子)的样本图像的分辨率低于代表晚期荧光光子(即具有相对较长的到达时间的光子)的样本图像。

激发光分布和去激发光分布之间的空间偏移尤其可以借助二维的样本图像来确定。然而，也可以检测在所有三个空间方向上的偏移。在这种情况下，摄取三维的图像堆栈，而不是二维的样本图像。在所有情况下，代表早期荧光光子的样本图像或图像堆栈包含关于激发光分布的最大值位置的信息，而代表晚期荧光光子的样本图像或图像堆栈包含关于去激发光分布的零点位置的信息。偏移可以这样确定，即两个样本图像或图像堆栈例如通过互相关而彼此关联。

因此，在一种优选的实施方式中，处理器被设计用于，借助两个样本图像来确定在激发光分布的强度最大值和去激发光分布的强度最小值之间的空间偏移，其方式为，两个样本图像通过互相关，例如通过确定在两个样本图像之间或者也仅在两个样本图像的彼此相应的部分区域之间例如在样本图像的各个或多个行和/或列和/或部分之间的互相关，而彼此关联。这种互相关的使用特别适合于仅借助两个样本图像来确定空间偏移，而为此无需由现有技术已知的更复杂和/或更不精确的方法。后者例如包括，使用校准标本或拟合到单个的荧光点对象。然而在这方面应该强调的是，为了确定在激发光分布的强度最大值和去激发光分布的强度最小值之间的空间偏移，在本发明的范围内，除了其他方法外，例如还可考虑，替代于或者也附加于互相关的使用，特别是通过拟合来确定在两个样本图像中可见的一个或多个单独的荧光点对象的位置。

此处提出的解决方案还具有以下优点：为了确定在激发和去激发光分布之间的空间偏移，不必更改荧光扫描显微镜的配置，因为为此所需的测量数据在一定程度上是作为实际的高分辨率的图像摄取的副产物而产生的。

探测器优选地被设计用于通过时间相关的单光子计数来检测从相应的照明目标点发射的荧光光子(根据它们的到达时间)。采用这种时间相关的单光子计数，能够实现特别精确地检测到达时间。然而，探测器还可以按其他方式探测荧光光子的到达时间，其方式例如为，该探测器将光强度即在至少两个单独的彼此相继的时间间隔内的入射的荧光光子相加，其中，这些至少两个间隔在开始时间—荧光光子的到达时间参照该开始时间—之后位于荧光寿命范围内。然后将与一个时间间隔相关的荧光光子分配给一个样本图像，并将与另一个时间间隔相关的荧光光子分配给另一个样本图像。

荧光扫描显微镜优选地包括调节部件，该调节部件可由处理器控制，以影响激发光分布和/或去激发光分布，用于补偿空间偏移。通过使用这种调节部件，可以在实际的图像摄取期间自动地实现激发光分布和去激发光分布的精确叠加，从而保证高的成像质量。

调节部件可优选地由处理器控制，以便针对图像场的不同区域各自地影响激发光分布和/或去激发光分布，用于补偿空间偏移。以这种方式可以自适应地对这些光分布的叠加进行优化，只要保证调节部件以足够高的速度工作。

在一种优选的实施方式中，调节部件是一种可移调地布置在去激发光分布的光路中或激发光分布的光路中的光偏转部件。这种光偏转部件例如可以设计成快速倾斜反射镜的形式。为了即使在三维地校正这些光分布的叠加的情况下也能够调整轴向的方向，作为调节部件，可以设想可移调的透镜或可移调的透镜系统，其确保两个光分布之一可在轴向方向上相对于另一个光分布进行移调。也可设想使用承担此任务的空间光调制器(SLM：Spatial Light Modulator)。由此可以在一定限度内影响光分布的横向偏转，且同时影响光分布的轴向位置。此外，还可以使用该部件来产生对于空间特定的去激发光分布所需的相位信息。

在一种特别优选的设计中，两个光源中的至少一个是脉冲的或调制的激光光源，其中，探测器被设计用于参照开始时间检测荧光光子的到达时间，该开始时间是由激光光源的光脉冲或光调制确定的。在此，使用脉冲的激光光源比调制源具有某些优势，因为这里考察的荧光团的寿命通常很短，需要非常快的光调制。

处理器优选地评估在相应照明目标点中检测到的荧光光子，其方式为，该处理器将到达时间与预定阈值进行比较，并将其到达时间小于或等于预定阈值的那些荧光光子分配给第一图像点，而将其到达时间大于预定阈值的那些荧光光子分配给第二图像点。在该实施方式中，借助一个唯一的阈值将荧光光子在一定程度上分类为早期光子和晚期光子。在此，基于早期荧光光子来产生分辨率较低的样本图像，并且基于晚期荧光光子来产生在空间上与其错开的分辨率较高的样本图像。分辨率不同的原因是，去激发光分布的作用随着荧光团被施加的剂量而增加。换句话说，样本被去激发光分布照射的时间越长，去激发光分布对荧光团的作用就越大。因此，早期荧光光子更相应于在不使用去激发光的情况下获得的荧光信号，而晚期荧光光子代表与在常规STED方法中检测到的信号相对应的荧光信号。因此，早期荧光光子主要提供关于激发光分布的信息，特别是其最大值，而晚期荧光光子主要反映去激发光分布，特别是其零点。

在上述实施方式中，借助一个唯一的阈值将荧光光子分类为早期荧光光子和晚期荧光光子，该实施方式是一种用于确定光分布的空间偏移的特别简单的方法。

然而，评估可以如下扩展：使得荧光光子不仅根据它们到达探测器的到达时间分为两类，即早期类和晚期类，而且各自地考虑所有荧光光子的实际到达时间。为此，处理器例如可以评估在相应照明目标点中检测到的荧光光子，其方式为，该处理器根据荧光光子的通过检测到的到达时间给出的时间分布，调整包含第一拟合参数和第二拟合参数的模型函数，从而确定出第一拟合参数和第二拟合参数。处理器然后基于第一拟合参数生成第一图像点，并且基于第二拟合参数生成第二图像点。以这种方式，针对每个图像点，根据探测到的荧光光子的时间分布来调整模型函数。

模型函数例如由以下关系式(1)给出：

(1)m(t)＝a0*exp(-t/t0)+a1*exp(-t/t1)

在这里，t表示相应的荧光光子的到达时间，t0是不存在去激发光分布时荧光团的平均寿命，t1是存在去激发光分布时荧光团的平均寿命，a0是第一拟合参数，a1是第二拟合参数。

为每个照明目标点分别确定拟合参数a0和a1。通过考虑实际到达时间，与仅将到达时间分为两类的情况相比，使用了更多的信息。因此，也可以更精确地确定空间偏移。

激发光源优选地是脉冲的或调制的激光光源，其确定了开始时间。这具有如下优点：在传统的STED方法中也使用脉冲的激发光源工作。因此，在这方面，无需对已有的STED配置进行更改。

去激发光源可以设计为连续波激光光源，但也可以设计为脉冲的或调制的激光光源。然而，设计为连续波激光光源具有如下优势：这种源比脉冲源便宜得多，特别是如果后者要在传统STED应用中使用高激光功率工作。

特别优选的实施方式是，规定脉冲激发和连续波去激发的组合，或脉冲激发和脉冲去激发的组合。然而，也可以规定连续波激发和脉冲去激发的组合。

荧光扫描显微镜优选地包括延迟单元，该延迟单元可由处理器控制，以使得去激发光源与激发光源在时间上协调，从而去激发光源的光脉冲或光调制在相应的照明目标点的位置与激发光源的光脉冲或光调制相比具有预定的延迟。当无论激发光源还是去激发光源都被设计为脉冲的或调制的激光光源时，这种实施方式被视为特别有利。

如果借助上述阈值将荧光光子到达探测器的时间分为两类，那么在上述实施方式中，该阈值对应于去激发光源的光脉冲或光调制在相应的照明目标点的位置与激发光源的光脉冲或光调制相比所具有的延迟。

特别是当无论激发光源还是去激发光源都被设计为脉冲的激光光源时，去激发光源的脉冲长度优选地大于激发光源的脉冲长度。替代地或附加地，去激发光源的脉冲长度可以位于荧光团激发态的平均寿命的范围内，特别是在从0.1到6.0ns的范围内。

在另一实施方式中，处理器可以被设计用于，除了确定空间偏移之外，还借助两个样本图像来确定去激发光分布的其它的失配。在该实施方式中，在激发光分布的最大值与去激发光分布的零点之间的空间偏移被视为去激发光分布的一般性的失准调节的特殊情况，其除了前述偏移之外，还考虑了进一步的失配。这方面的一个例子是由球面像差引起的失配。后者例如可以通过如下措施来减小：将两个具有低分辨率或高分辨率的样本图像的亮度相互比较，并借助这种比较，例如相应地控制在去激发光的光路中的空间光调制器(或Spatial Light Modulator，简称SLM)，或者也控制在显微镜物镜中的执行件，用于减小球面像差。

这具有实际意义，特别是当这种球面像差对去激发光分布产生不利影响时。于是尤其去激发光分布的零点质量对成像质量有相当大的影响。由于其非线性，STED方法依赖于这样一个事实，即去激发光分布的强度在其最小值时实际上为零，并且随着离开该最小值而急剧上升。

因此，去激发光路中的球面像差比激发光路中的球差具有明显更不利的影响。然而，可以使用单独由激发光束生成的样本图像作为参考，例如作为图像亮度的参考。在此，通过比较两个样本图像的亮度，没有必要的是：使用要费力地确定的质量度量，并且必须借助该质量度量首先评估球面像差校正的成功程度。通过考虑两个样本图像，校正可以说是一个固有的参考，例如，如果要借助一个唯一的图像来评估校正质量，则情况并非如此。

从上面的解释中可立即看出，去激发光分布的强度最小值优选地为强度零点。

在另一方面，本发明提出了一种使用荧光扫描显微镜对样本成像的方法。该方法包括以下步骤：产生激发光分布，该激发光分布激发存在于样本中的荧光团，以便自发地发射荧光光子；产生去激发光分布，该去激发光分布通过荧光光子的受激发射使得由激发光分布在样本中激发的荧光团去激发；将激发光分布和去激发光分布合并成一个沿着样本的多个照明目标点扫描的光分布，使得激发光分布的强度最大值和去激发光分布的强度最小值在相应的照明目标点中在空间上彼此叠加；通过时间相关的单光子计数来检测从相应的照明目标点发射的荧光光子(根据它们的到达时间)；评估在相应的照明目标点检测到的荧光光子的到达时间；基于该评估产生代表相应的照明目标点的第一图像点和第二图像点；将第一图像点合并为第一样本图像，将第二图像点合并为第二样本图像；并且借助两个样本图像来确定在激发光分布的强度最大值和去激发光分布的强度最小值之间的空间偏移。

附图说明

下面参考附图借助实施例解释本发明。其中：

图1是说明去激发光分布和激发光分布的空间叠加如何影响检测荧光信号的曲线图；

图2示出了根据一个实施例的荧光扫描显微镜的示意图；

图3是示出荧光信号的空间分布的曲线图，这些荧光信号根据一个实施例代表早期的荧光光子和晚期的荧光光子；

图4是示出拟合参数的空间分布的曲线图，这些拟合参数根据另一实施例用于评估；

图5示出了根据另一实施例的荧光扫描显微镜；和

图6示出了用来说明脉冲激发光和脉冲去激发光如何在时间上彼此协调的示范性曲线图。

具体实施方式

图2示出了根据实施例的荧光扫描显微镜100的示意图。在下文中，将首先简要概述荧光扫描显微镜100的基本结构和基本工作方式，然后更详细地解释根据所示实施例的具体实现方式。

荧光扫描显微镜100包括激发光源102，该激发光源被设计用于产生图1中所示类型的激发光分布E，该激发光分布激发存在于样本104中的荧光团，以便自发地发射荧光。由激发光源102产生的激发光分布E的波长因此被设计用于在具体应用中使用的荧光团。

荧光扫描显微镜100还包括去激发光源106，该去激发光源被设计用于产生图1中所示类型的去激发光分布D，该去激发光分布通过荧光的受激发射使得由激发光分布在样本104中激发的荧光团去激发。由去激发光源106产生的去激发光分布D的波长也与在具体应用中使用的荧光团相匹配。去激发光分布D的波长经过特殊选择，使得当通过受激发射利用去激发光分布D照射时，可靠地引起在样本104中存在的荧光团从它们的激发态返回到基态。为此目的，去激发光分布D优选地具有大约与荧光团在从激发态到基态转变期间发射的荧光的波长相等的波长。

荧光扫描显微镜100还具有在图2中总体用108表示的照明单元。该照明单元被设计用于将激发光分布E和去激发光分布D合并成一种叠加的光分布，并且利用如此产生的光分布来扫描样本104的多个照明目标点。合并如下进行：使得激发光分布E的强度最大值M和去激发光分布D的强度最小值N在空间上相互叠加于相应的照明目标点。在此力求如示范性地在开篇所述的图1a中所示的空间叠加。然而，由于通常无法避免一定的失准调节，因此经常出现在激发光分布E的强度最大值M和去激发光分布D的强度最小值N之间的不可忽略的空间偏移，如示范性地在图1b中示出。

荧光扫描显微镜100还具有探测器110，该探测器检测从相应的照明目标点发射的荧光光子。探测器110被设计用于测量随时间快速变化的光强度。因此该探测器能够通过时间相关的单光子计数来探测从相应的照明目标点发射的荧光光子。

最后，荧光扫描显微镜100包含处理器112，该处理器能够实现确定激发光分布E和去激发光分布D之间的空间偏移。为此，处理器112评估在相应的照明目标点中检测到的荧光光子的由探测器110确定的到达时间。基于该评估，处理器112然后产生第一图像点和第二图像点，这两个图像点都代表相同的照明目标点。处理器112对利用由激发光分布E和去激发光分布D组成的光分布扫描的所有照明目标点采用相同的做法。处理器112因此产生组合成第一样本图像的多个第一图像点和组合成第二样本图像的多个第二图像点。以此方式，生成两个样本图像，处理器112然后借助这些样本图像来确定在激发光分布E的强度最大值M与去激发光分布D的强度最小值N之间的空间偏移。

图2中具体示出的结构仅代表用于实现上述功能原理的示范性实施方式，特别地，荧光扫描显微镜100不应局限于该特定实施方式。例如，在根据图2的实施方式中，激发光源102被设计为脉冲激光光源，而去激发光源106是连续波激光光源。两个光源102、106各自将它们的光馈送给照明单元108，在根据图2的实施例中，除了两个光源102、106、探测器110和处理器112之外的所有显微镜组件都被分配给该照明单元。

特别地，激发光源102发射激发光L1，该激发光通过固定的反射镜114反射到第一波长选择分光器116上。第一波长选择分光器116将激发光L1反射到第二波长选择分光器118上，该第二波长选择分光器在光栅装置120的方向上透射激发光L1。相比之下，去激发光源106将去激发光L2发射到移相掩膜122上，该移相掩膜影响去激发光L2，使得在样本104中从激发光L2产生的去激发光分布D具有所希望的零点N。在穿过移相掩膜122之后，去激发光L2在可由处理器112控制的调节部件124例如可移动的倾斜反射镜处被反射到第二波长选择分光器118上。替代地，例如也可以使用SLM作为调节部件124。此外，移相掩膜112和调节部件124也可以由同一个部件例如SLM形成。波长选择分光器118在同样由处理器112控制的光栅装置120的方向上反射去激发光L2。

通过第二波长选择分光器118，激发光L1和去激发光L2于是相互叠加，并馈送给光栅装置120。从该光栅装置，叠加的光分布通过物镜126聚焦到相应的照明目标点上，由此在该照明目标点中以期望的形状产生光分布，该光分布规定了激发光分布E的强度最大值M与去激发光分布D的强度最小值N的空间叠加。光栅装置120在此确保叠加的光分布沿样本104移动，使得样本104的大量照明目标点被该光分布扫描。

用叠加的光分布照射的样本104发出荧光L3，该荧光通过物镜126返回到光栅装置120上。在根据图2的实施例中，因而规定了对荧光L3的所谓的去扫描探测。荧光L3然后依次通过两个波长选择分光器118、116，并落到探测器110上，该探测器探测荧光L3，并向处理器112输出相应的输出信号S。

如已经解释的，探测器110通过时间相关的单光子计数来探测代表荧光L3的荧光光子。在此，探测器110参照开始时间检测荧光光子的到达时间，在根据图2的实施例中，该开始时间由被设计为脉冲激光光源的激发光源102发射的光脉冲确定。为此，激发光源102向处理器112输出电的触发信号T，从该电触发信号可以确定各个激光脉冲的时间点，并因此确定上述开始时间。

基于由处理器112评估的荧光光子到达时间，处理器112控制调节部件124，以便影响去激发光分布D，使得激发光分布E的强度最大值M和去激发光分布D的强度最小值N之间的空间偏移得到补偿。在根据图2的实施例中，调节部件124位于去激发光L2的光路中。然而，也可以考虑在激发光E的光路中设置相应的调节部件。在根据图2的实施例中设计为倾斜反射镜的调节部件124—如果它可以由处理器112足够快地控制，还提供了如下可能性：在自适应过程中针对所摄取的图像场的不同区域，各自地影响去激发光分布D。

如上面进一步解释的，处理器112基于对荧光光子的评估生成两个样本图像，借助这些样本图像可以确定在激发光分布和去激发光分布之间的空间偏移。在根据图2的实施例中，处理器112为此评估在每个照明目标点中检测到的荧光光子，其方式为，该处理器将到达时间与预定的阈值进行比较。处理器112将那些到达时间小于或等于预定阈值的荧光光子分配给对应于相应的照明目标点的第一图像点。相反，处理器112将那些到达时间大于预定阈值的荧光光子分配给对应于同一个照明目标点的第二图像点。以这种方式，处理器112生成两个样本图像，其中的一个样本图像指配于早期荧光光子，另一个样本图像指配于晚期荧光光子。对于一维情况，在图3中地示范性地示出了这种评估方式。

在图3中，虚线P1示出了由早期荧光光子沿方向x产生的点状物体的荧光信号的变化曲线。相比之下，实线P2示出了从晚期荧光光子获得的相关荧光信号。荧光信号P2具有较小的半宽度，因此适用于产生高分辨率的样本图像。

荧光信号P1、P2的半宽是由于早期荧光光子所代表的荧光信号P1受去激发光分布D的影响仍然很小。相比之下，去激发光分布D对晚期光子完全有效，从而减小了荧光信号P2的半宽，提高了分辨率。

在根据图3的示例中，去激发光分布D的零点N相对于激发光分布E的最大值M错开了空间偏移dx。空间偏移dx的绝对距离和方向都可以从图3所示的荧光信号P1、P2确定。

关于根据图3的视图，应该指出的是，在那里示出的荧光信号P1、P2是归一化的。通过该归一化，计算出由空间偏移dx引起的并且在开头参考图1d解释过的强度下降。

根据图3的示例代表了一种特别简单的荧光光子评估方式，在根据图4的视图中示出了相比之下扩展了的评估。在该示例中，处理器112评估在相应的照明目标点中检测到的荧光光子a1，其方式为，该处理器例如根据探测到的荧光光子时间分布来调整根据关系式(1)的在上面给出的模型函数，并从中确定两个拟合参数a0、a1。基于这两个拟合参数a0、a1，处理器112然后生成两个与同一个照明目标点相关的图像点，随后使用大量这种图像点产生两个样本图像，从这些样本图像确定出空间偏移dx。

图4示范性地示出了两个拟合参数a0和a1沿轴x的变化曲线，假设在激发光分布E的最大值M与去激发光分布D的零点N之间存在空间偏移dx。在此，实线示出了拟合参数a1的变化曲线，虚线示出了拟合参数a0的变化曲线。a1的变化曲线类似于图3中的由晚期光子代表的荧光信号P2。这是因为，拟合参数a1是长寿命荧光团数量的量度，只有这些荧光团才能产生晚期荧光光子。相反，拟合参数a0的变化曲线类似于图3中的由早期光子代表的荧光信号P1。然而，与其不同的是，拟合参数a0在去激发光分布D的零点N位置具有最小值。这是因为，拟合参数a0是短寿命荧光团的量度，并且在去激发光分布D的零点N位置不存在短寿命荧光团。

在图5中示出了荧光扫描显微镜200，这是一种相比于图2改型了的实施方式。在该改型的实施方式中，不仅激发光源102而且去激发光源106都被设计为脉冲激光光源。

根据图5的实施例还具有可由处理器112控制的延迟单元228。在此，处理器112适当地控制延迟单元228，使得去激发光源106在时间上与激发光源102协调。特别地，延迟单元228确保去激发光源106的相应光脉冲在所考察的照明目标点的位置处与激发光源102的光脉冲相比具有预定的延迟。

为了实现期望的时间协调，激发光源102既向处理器112又向延迟单元228输出触发信号T。延迟单元228产生相对于触发信号T延迟的触发信号T'。在此，延迟可以由处理器112调节。延迟的触发信号T'用于使去激发光源106的光脉冲与激发光源102的光脉冲同步。

对在根据图5的实施例中探测到的荧光光子的评估可以依照在图3和图4中所示的方法进行。在较简单的评估情况下，其中荧光光子仅分类为早期光子和晚期光子，可以设定延迟T'，使得该延迟对应于用于该分类的阈值。

就根据图5的实施例中光源102、106的时间协调而言，要避免去激发光源106的光脉冲比荧光团的寿命短很多。此外，两个光脉冲在时间上精确地重合虽然在原则上是可能的，但却是不利的。因为在这种情况下，荧光光子的受激发射基本上与激发同时发生。然而，在受激发射之后，所有仍然被激发的荧光团都具有相同的寿命，因此这些荧光团仅借助它们的荧光光子到达探测器110的时间很难区分。这种情况在图6a中示出。

为了避免这种情况，图5中的延迟单元228例如可以经过配置，使得由去激发光源106发射的光脉冲比激发光源102发射的光脉冲延迟时间间隔dt到达样本104。该解决方案在图6b中示出。在激发光脉冲后的时间跨度dt内，荧光光子按照激发光分布E发射。然后通过输出去激发光脉冲进行受激发射。在此，一部分荧光被猝灭，使得荧光团优选在去激发光分布D的零点N区域内发射光子。通过这种方式，由早期荧光光子生成的样本图像提供了关于激发光分布E的最大值M的位置的信息，而由晚期荧光光子生成的样本图像提供了关于去激发光分布D的零点N的位置的信息。

另一种可能的时间协调在图6c中示出。于是例如可以调节去激发光脉冲的脉冲长度，使得该脉冲长度处于荧光团激发态的平均寿命范围内，例如在从0.1到6.0ns的范围内。在这种情况下，受激发射沿着去激发光脉冲的脉冲长度的时间范围分布，或沿着在时间上在激发光脉冲之后到达样本104的去激发光脉冲部分分布。由于受激发射的这种时间拉伸，可以从早期光子中获得根据激发光分布E建立的样本图像，而可以从晚期荧光光子中生成主要由去激发光分布D的零点N的区域构成的样本图像。

上面解释的实施方式应纯粹示范性地予以理解。。特别地，这些实施方式也不限于脉冲激光光源和连续波激光光源的具体描述的组合。例如，荧光扫描显微镜100、200也可以在如下工作模式下工作：激发通过连续波激光光源进行，并且去激发通过脉冲激光光源进行。在这种实施方式中，荧光光子到达探测器110的时间与去激发光D的脉冲时间点有关。在去激发脉冲之后不久探测到的荧光光子于是包含关于去激发光分布D的零点N位置的信息。相反，在去激发脉冲之前不久或之后较长时间探测到的荧光光子提供了有关激发光分布E的最大值M位置的信息。

尽管已经描述了在所述装置的范畴内的一些方面，但是很明显，这些方面也是对相应方法的描述，其中，一个方框或装置对应于一个方法步骤或一个方法步骤的功能。类似地，在方法步骤的范畴内描述的方面也是对相应方框或部件或相应装置的特性的描述。部分或全部方法步骤可以通过(或使用)硬件装置来执行，例如处理器、微处理器、可编程计算机或电子电路都可以。在一些实施例中，一个或多个最重要的方法步骤可以由这种装置执行。

根据某些实施要求，本发明的实施例可以用硬件或软件来实施。实施可以通过非易失性存储介质来进行，如软盘、DVD、蓝光、CD、ROM、PROM和EPROM、EEPROM或闪存存储器，在该存储介质上存储着电子可读的控制信号，这些控制信号与可编程的计算机系统配合作用(或可以配合作用)，从而执行相应的方法。因此，数字存储介质可以是计算机可读的。

根据本发明的一些实施例包括数据载体，该数据载体具有电子可读的控制信号，这些控制信号可以与可编程的计算机系统配合作用，从而执行这里所述的方法之一。

一般而言，本发明的实施例可以被实施为具有程序代码的计算机程序产品，其中，当计算机程序产品在计算机上运行时，该程序代码对于执行方法之一是有效的。程序代码例如可以存储在机器可读的载体上。

其它的实施例包括用于执行这里描述的方法之一的计算机程序，其存储在机器可读的载体上。

换言之，本发明的实施例因此是具有程序代码的计算机程序，用于当计算机程序在计算机上运行时执行这里描述的方法之一。

因此，本发明的另一实施例是一种存储介质(或数据载体或计算机可读的介质)，其包括存储在其上的计算机程序，用于当它由处理器执行时执行这里描述的方法之一。数据载体、数字存储介质或记录介质通常是有形的和/或不是无缝的。本发明的另一实施例是如这里所述的装置，该装置包括处理器和存储介质。

因此，本发明的另一实施例是数据流或信号序列，其形成用于执行在此描述的方法之一的计算机程序。数据流或信号序列可以例如以这种方式配置，即它们通过数据通信连接例如通过互联网传输。

另一个实施例包括处理机构，例如计算机或可编程的逻辑装置，其被配置或适配为执行这里所述的方法之一。

另一个实施例包括计算机，在该计算机上安装了用于执行这里描述的方法之一的计算机程序。

根据本发明的另一个实施例包括一种装置或系统，其被配置为向接收器(例如电子地或光学地)传输用于执行这里所述方法之一的计算机程序。接收器例如可以是计算机、移动装置、存储装置等。该装置或系统例如可以包括用于将计算机程序传输到接收器的文件服务器。

在一些实施例中，可以使用可编程的逻辑装置(例如现场可编程门阵列，FPGA)，以便执行这里所述方法的一些或全部功能。在一些实施例中，现场可编程门阵列可以与微处理器协作，以便执行这里所述的方法之一。通常，这些方法优选地由任何硬件设备执行。

附图标记清单

100 荧光扫描显微镜

102 激发光源

104 样本

106 去激发光源

108 照明单元

110 探测器

112 处理器

114 反射镜

116 波长选择分光器

118 波长选择分光器

120 光栅装置

122 移相掩膜

124 调节部件

126 物镜

228 延迟单元

D 去激发光分布

E 激发光分布

N 去激发光分布的强度最小值

M 激发光分布的强度最大值

P1 荧光信号

P2 荧光信号

a0 拟合参数

a1 拟合参数

dx 偏移

dt 时间间隔

T 触发信号

T' 触发信号

L1 激发光

L2 去激发光

L3 荧光

Claims (20)

1.一种荧光扫描显微镜(100、200)，包括：

激发光源(102)，该激发光源被设计用于产生激发光分布(E)，该激发光分布激发存在于样本(104)中的荧光团，以便自发地发射荧光光子；

去激发光源(106)，该去激发光源被设计用于产生去激发光分布(D)，该去激发光分布通过荧光光子的受激发射来使得由所述激发光分布(E)在所述样本(104)中激发的荧光团去激发；

照明单元(108)，该照明单元被设计用于将所述激发光分布(E)和所述去激发光分布(D)合并成沿着所述样本(104)的多个照明目标点扫描的光分布，使得所述激发光分布(E)的强度最大值(M)和所述去激发光分布(D)的强度最小值(N)在相应的照明目标点中在空间上相互叠加；

探测器(110)，该探测器被设计用于根据从所述相应的照明目标点发射的荧光光子的到达时间来检测这些荧光光子；和

处理器(112)，该处理器被设计用于，

评估在所述相应的照明目标点中检测到的荧光光子的到达时间，

基于所述评估生成代表相应照明目标点的第一图像点和第二图像点，

把所述第一图像点合并成第一样本图像(P1)，并且把所述第二图像点合并成第二样本图像(P2)，并且，

借助两个样本图像(P1、P2)来确定在所述激发光分布(E)的强度最大值(M)和所述去激发光分布(D)的强度最小值(N)之间的空间偏移(dx)。

2.根据权利要求1所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述探测器(110)被设计用于通过时间相关的单光子计数来根据从所述相应的照明目标点发射的荧光光子的到达时间检测这些荧光光子。

3.根据权利要求1或2所述的荧光扫描显微镜(100、200)，包括调节部件(124)，该调节部件可由所述处理器(112)控制，以影响所述激发光分布(E)和/或所述去激发光分布(D)，用于补偿所述空间偏移(dx)。

4.根据权利要求3所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其特征在于，所述调节部件(124)可由所述处理器(112)控制，以便针对图像场的不同区域各自地影响所述激发光分布(E)和/或所述去激发光分布(D)，用于补偿所述空间偏移(dx)。

5.根据权利要求3或4所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其特征在于，所述调节部件(124)是一种可移调地布置在所述去激发光分布(D)的光路中或所述激发光分布(E)的光路中的光偏转部件。

6.根据前述权利要求中任一项所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述两个光源(102、106)中的至少一个是脉冲的或调制的激光光源，并且所述探测器(110)被设计用于参考开始时间检测所述荧光光子的到达时间，该开始时间是通过所述激光光源的光脉冲或光调制确定的。

7.根据权利要求6所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述处理器(112)评估在相应照明目标点中检测到的荧光光子，其方式为，该处理器将所述到达时间与预定阈值进行比较，并将其到达时间小于或等于所述预定阈值的那些荧光光子分配给所述第一图像点，而将其到达时间大于所述预定阈值的那些荧光光子分配给所述第二图像点。

8.根据权利要求6所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述处理器(112)评估在相应照明目标点中检测到的荧光光子，其方式为，该处理器根据荧光光子的通过检测到的到达时间给出的时间分布，调整包含第一拟合参数和第二拟合参数的模型函数，从而确定出所述第一拟合参数和所述第二拟合参数，并且，

所述处理器(112)基于所述第一拟合参数生成所述第一图像点，并且基于所述第二拟合参数生成所述第二图像点。

9.根据权利要求8所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述模型函数由以下函数m(t)给出：

m(t)＝a0*exp(-t/t0)+a1*exp(-t/t1)

其中，t表示相应的荧光光子的到达时间，

t0是不存在所述去激发光分布(D)时荧光团的平均寿命，

t1是存在所述去激发光分布(D)时荧光团的平均寿命，

a0是所述第一拟合参数，并且，

a1是所述第二拟合参数。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述激发光源(102)是脉冲的或调制的激光光源，该激光光源确定了开始时间。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的扫描荧光显微镜(100)，其中，所述去激发光源(106)是连续波激光光源。

12.根据权利要求6至10中任一项所述的荧光扫描显微镜(200)，其中，所述去激发光源(106)是脉冲的或调制的激光光源。

13.根据权利要求12所述的荧光扫描显微镜(200)，包括延迟单元(228)，该延迟单元可由所述处理器(112)控制，以使得所述去激发光源(106)与所述激发光源(102)在时间上协调，从而所述去激发光源(106)的光脉冲或光调制在相应的照明目标点的位置与所述激发光源(102)的光脉冲或光调制相比具有预定的延迟。

14.根据权利要求13所述的荧光扫描显微镜(200)，其中，所述阈值对应于所述去激发光源(106)的光脉冲或光调制在相应的照明目标点的位置与所述激发光源(102)的光脉冲或光调制相比所具有的延迟。

15.根据权利要求12所述的荧光扫描显微镜(200)，其中，

所述去激发光源(106)的脉冲长度大于所述激发光源(102)的脉冲长度，和/或，

所述去激发光源(106)的脉冲长度位于荧光团激发态的平均寿命的范围内，特别是在从0.1到6.0ns的范围内。

16.根据前述权利要求中任一项所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述处理器(112)被设计用于，除了确定所述空间偏移(dx)之外，还借助两个样本图像来确定所述去激发光分布(D)的其它的失配。

17.根据前述权利要求中任一项所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述去激发光分布(D)的强度最小值(N)为强度零点。

18.根据前述权利要求中任一项所述的荧光扫描显微镜(100、200)，其中，所述处理器(112)被设计用于确定所述空间偏移(dx)，其方式为，使得两个样本图像(P1、P2)通过互相关而彼此关联。

19.一种使用荧光扫描显微镜(100、200)对样本(104)成像的方法，包括以下步骤：

产生激发光分布(E)，该激发光分布激发存在于所述样本(104)中的荧光团，以便自发地发射荧光光子；

产生去激发光分布(D)，该去激发光分布通过荧光光子的受激发射使得由所述激发光分布(E)在所述样本(104)中激发的荧光团去激发；

将所述激发光分布(E)和所述去激发光分布(D)合并成沿着所述样本(104)的多个照明目标点扫描的光分布，使得所述激发光分布(E)的强度最大值(M)和所述去激发光分布(D)的强度最小值(N)在相应的照明目标点中在空间上彼此叠加；

根据从所述相应的照明目标点发射的荧光光子的到达时间来检测这些荧光光子；

评估在所述相应的照明目标点检测到的荧光光子的到达时间；

基于所述评估产生代表相应的照明目标点的第一图像点和第二图像点；

将所述第一图像点合并为第一样本图像(P1)，并将所述第二图像点合并为第二样本图像(P2)；并且，

借助两个样本图像(P1、P2)来确定在所述激发光分布(E)的强度最大值(M)和所述去激发光分布(D)的强度最小值(N)之间的空间偏移(dx)。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，确定所述空间偏移(dx)，其方式为，使得两个样本图像(P1、P2)通过互相关而彼此关联。

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