JP2019086529A - 顕微鏡、照明装置、及び観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】観察対象の位置からの光を高精度で検出する。【解決手段】顕微鏡は、蛍光物質を活性化させる活性化光または活性化された蛍光物質を励起させる励起光に設定される第１光と、活性化光と励起光とのうち第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射する照明系と、第１光と第２光とが照射された試料から放射される蛍光を、第１方向とは異なる第２方向から検出する検出系と、を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡、照明装置、及び観察方法に関する。

試料に含まれる蛍光物質からの蛍光を検出する顕微鏡が知られている（例えば、下記の非特許文献１参照）。

Patrick Hoyer、他１０名、"Breaking the diffraction limit of light-sheet fluorescence microscopy by RESOLFT"、Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Mar 29

本発明の第１の態様に従えば、蛍光物質を活性化させる活性化光または活性化された蛍光物質を励起させる励起光に設定される第１光と、活性化光と励起光とのうち第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射する照明系と、第１光と第２光とが照射された試料から放射される蛍光を、第１方向とは異なる第２方向から検出する検出系と、を備える顕微鏡が提供される。

本発明の第２の態様に従えば、蛍光物質を励起させる励起光または励起した蛍光物質に誘導放出を生じさせる誘導光に設定される第１光と、励起光と誘導光とのうち第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射する照明系と、第１光と第２光とが照射された試料から放射される蛍光を、第１方向とは異なる第２方向から検出する検出系と、を備える顕微鏡が提供される。

本発明の第３の態様に従えば、蛍光物質を活性化させる活性化光または活性化された蛍光物質を励起させる励起光に設定される第１光と、活性化光と励起光とのうち第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射することと、第１光と第２光とが照射された試料から放射される蛍光を、第１方向とは異なる第２方向から検出することと、を含む観察方法が提供される。

本発明の第４の態様に従えば、蛍光物質を励起させる励起光または励起した蛍光物質に誘導放出を生じさせる誘導光に設定される第１光と、励起光と誘導光とのうち第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射することと、第１光と第２光とが照射された試料から放射される蛍光を、第１方向とは異なる第２方向から検出することと、を含む観察方法が提供される。

第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 第１実施形態に係るマスクを示す図である。 ベッセルビームおよびガウスビームを示す図である。 第１実施形態に係る照明光を示す図である。 実施形態に係る第１の観察方法を示すフローチャートである。 実施形態に係る第２の観察方法を示すフローチャートである。 第２実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 第２実施形態に係る照明光を示す図である。 実施例と比較例との比較を示す図である。 第３実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 照明光および蛍光の強度分布を示す図である。 第４実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 第４実施形態に係るビーム成形部を示す図である。 第５実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 複数のビームの種類について照明光の強度分布を示す図である。 第６実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 第６実施形態に係る顕微鏡の動作を示すフローチャートである。 第７実施形態に係る顕微鏡を示す図である。 第７実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。 第８実施形態に係る顕微鏡を示す図である。

［第１実施形態］
第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。顕微鏡１は、例えば、蛍光物質で標識（ラベル）された試料Ｓの蛍光観察に利用される。顕微鏡１は、試料Ｓに含まれる蛍光物質が発する蛍光を検出する。試料Ｓは、生きた細胞（ライブセル）を含んでもよいし、ホルムアルデヒド溶液等の組織固定液を用いて固定された細胞を含んでもよく、組織等でもよい。試料Ｓは、観察対象物を保持する保持部材（例、カバーガラス、シャーレ）を含んでいてもよい。

図１の顕微鏡１（顕微鏡システム）は、照明系２、検出系３、及びステージ４を備える。ステージ４は、試料Ｓを保持する。照明系２は、試料Ｓに対して、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２を第１方向（図中のＹ方向）から照射する。照明系２は、第１対物レンズ５を備え、第１対物レンズ５から第１光Ｌ１および第２光Ｌ２を照射する。

試料Ｓは、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって第３光Ｌ３を放射する。試料Ｓは、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって第３光Ｌ３を放射し、かつ第１光Ｌ１と第２光Ｌ２と一方の光のみの照射によって第３光Ｌ３を放射しなくてもよい。また、試料Ｓは、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって第３光Ｌ３を放射し、かつ第１光Ｌ１と第２光Ｌ２と一方の光のみの照射によって第３光Ｌ３を放射してもよい。検出系３は、第１方向（Ｙ方向）と異なる第２方向（図中のＺ方向）から、第３光Ｌ３を検出する。第２方向は、例えば、第１方向と交差する方向、第１方向に垂直な方向である。検出系３は、第２対物レンズ６を備え、試料Ｓから第２対物レンズ６に入射した光を検出する。以下、顕微鏡１の各部について説明する。

以下の説明において、図１などに示すＸＹＺ直交座標系を参照する。このＸＹＺ直交座標系において、Ｙ方向は、第１対物レンズ５の光軸５Ａと平行な方向である。また、Ｚ方向は、第２対物レンズ６の光軸６Ａと平行な方向である。Ｘ方向は、Ｙ方向およびＺ方向のそれぞれに垂直な方向である。

上記の蛍光物質は、例えば、フォトスイッチャブル プローブ（ＰＰ）を含む。蛍光物質は、例えば、活性化光が照射されることで不活性状態から活性状態に遷移する。蛍光物質は、活性状態において励起光が照射されることによって、基底状態から励起状態に遷移する。蛍光物質は、励起状態において蛍光を発して、基底状態に遷移する。また、蛍光物質は、不活性化光が照射されることによって活性化状態から不活性状態に遷移する。不活性状態において、蛍光物質は、励起光が照射されても励起状態に遷移せず、蛍光を発しない。不活性化光は、励起光と同じ波長である場合もあるし、励起光と異なる波長である場合もある。上記の蛍光物質は、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料等の蛍光色素でもよいし、蛍光タンパク質でもよい。試料Ｓに含まれる蛍光物質の種類は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。

本実施形態において、第１光Ｌ１は、蛍光物質を活性化させる活性化光または活性化された蛍光物質を励起させる励起光に設定される。また、第２光Ｌ２は、活性化光と励起光とのうち第１光と異なる光に設定される。この場合、蛍光物質は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって第３光Ｌ３（蛍光）を放射し、かつ第１光Ｌ１または第２光Ｌ２の照射によって第３光Ｌ３（蛍光）を放射しない。本実施形態において、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とのうち、一方の光は、蛍光物質を活性化する活性化光であり、他方の光は活性化された蛍光物質を励起する励起光である。以下の説明においては、適宜、第１光Ｌ１を活性化光Ｌ１と称し、第２光Ｌ２を励起光Ｌ２と称する。

なお、第１光Ｌ１が励起光であって励起光Ｌ２が活性化光でもよい。また、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を包括して、適宜、照明光と称する。試料Ｓに含まれる蛍光物質は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とが照射されることによって、第３光Ｌ３として蛍光を放射する。以下の説明において、適宜、第３光Ｌ３を蛍光Ｌ３と称する。試料Ｓに含まれる蛍光物質は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２との一方が照射されない場合に、蛍光Ｌ３が発生しない。

照明系２は、第１光源１１、第２光源１２、及び照明光学系１３を備える。第１光源１１は、活性化光Ｌ１を発する。第１光源１１は、例えば、ＬＤ（レーザダイオード）あるいはＬＥＤ（発光ダイオード）などの固体光源を含む。第２光源１２は、励起光Ｌ２を発する。励起光Ｌ２は、活性化光Ｌ１と波長が異なる。第２光源１２は、例えば、ＬＤ（レーザダイオード）あるいはＬＥＤ（発光ダイオード）などの固体光源を含む。

照明光学系１３は、第１光源１１からの活性化光Ｌ１および第２光源１２からの励起光Ｌ２を、それぞれ第１対物レンズ５へ導き、第１対物レンズ５から試料Ｓに照射する。

照明光学系１３は、第１光源１１の光出射側に配置されたレンズ１５、レンズ１６、レンズ１７、レンズ１８、及びダイクロイックミラー１９を備える。レンズ１５は、第１光源１１から出射した活性化光Ｌ１を集光する。レンズ１６は、レンズ１５が集光した活性化光Ｌ１をほぼ平行光に変換する。レンズ１７は、レンズ１６からの活性化光を集光する。レンズ１６とレンズ１７との間には、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０と光学的に共役な瞳共役面Ｐ１が配置される。レンズ１８は、レンズ１７が集光した活性化光Ｌ１をほぼ平行光に変換する。レンズ１８を通った活性化光Ｌ１は、ダイクロイックミラー１９に入射する。

また、照明光学系１３は、第２光源１２の光出射側に配置されたレンズ２１、レンズ２２、レンズ２３、及びレンズ２４を備える。レンズ２１は、第２光源１２から出射した励起光Ｌ２を集光する。レンズ２２は、レンズ２１が集光した励起光Ｌ２をほぼ平行光に変換する。レンズ２３は、レンズ２２からの励起光Ｌ２を集光する。レンズ２２とレンズ２３との間には、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０と光学的に共役な瞳共役面Ｐ２が配置される。

レンズ２４は、レンズ２３が集光した励起光Ｌ２をほぼ平行光に変換する。レンズ２４を通った励起光Ｌ２は、ダイクロイックミラー１９に入射する。励起光Ｌ２の光路は、ダイクロイックミラー１９と第１対物レンズ５との間において、活性化光Ｌ１の光路の少なくとも一部と重複する。

本実施形態において、照明光学系１３は、ビーム成形部２５を備える。ビーム成形部２５は、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０における活性化光Ｌ１の強度分布と励起光Ｌ２の強度分布とが互いに異なるように、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２との一方または双方を成形する。図１において、ビーム成形部２５は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とのうち励起光Ｌ２のみを成形する。例えば、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０において、活性化光Ｌ１はガウスビームであり、励起光Ｌ２はベッセルビームである。この場合、ビーム成形部２５は、励起光Ｌ２が瞳面Ｐ０においてベッセルビームとなるように、励起光Ｌ２をビーム成型する。ビーム成形部２５は、第１対物レンズ５の瞳共役面Ｐ２において励起光Ｌ２が通る領域を規定するマスク２６を備える。

マスク２６は、励起光Ｌ２が入射し、かつ活性化光Ｌ１が入射しない位置に配置される。例えば、マスク２６は、第１光源１１とダイクロイックミラー１９との間の光路に配置される。マスク２６は、瞳共役面Ｐ２と同じ位置またはその近傍の位置に配置される。

図２は、第１実施形態に係るマスクを示す図である。マスク２６は、励起光Ｌ２が通る開口２６ａを有する。マスク２６において開口２６ａ以外の部分は、励起光Ｌ２の少なくとも一部を遮る遮光部２６ｂになっている。開口２６ａは、例えば、照明光学系１３の光軸１３Ａを中心とする円環形状である。開口２６ａには、例えば、励起光Ｌ２が透過する特性の透明部材２６ｃが埋め込まれている。遮光部２６ｂのうち透明部材２６ｃよりも内側の部分は、透明部材２６ｃを介して、遮光部２６ｂのうち透明部材２６ｃよりも外側の部分に支持される。

なお、実施形態に係るマスク２６は、例えば図２（Ｂ）に示すように、図２（Ａ）と異なる形態でもよい。図２（Ｂ）のマスク２６は、複数の開口２６ａを有する。複数の開口２６ａは、照明光学系１３の光軸１３Ａの周囲に離散的に配置される。遮光部２６ｂは、開口２６ａよりも照明光学系１３の光軸１３Ａに近い部分と、開口２６ａよりも照明光学系１３の光軸１３Ａから遠い部分とが連続している。図２（Ｂ）において、開口２６ａには、図２（Ａ）に示した透明部材２６ｃが埋め込まれていなくてもよく、開口２６ａは、例えば空隙などでもよい。また、図２（Ａ）、図２（Ｂ）に示した開口２６ａは、例であり、開口２６ａの位置、形状、及び数の少なくとも１つが図２（Ａ）、図２（Ｂ）と異なってもよい。

なお、図２のマスク２６は、光を遮る領域（遮光領域）が固定の部材であるが、光を遮る領域を可変の部材でもよい。例えば、マスク２６は、開口２６ａを開閉可能な機械式の絞りでもよい。また、マスク２６は、空間光変調器（ＳＬＭ）によって光を遮る領域を可変であってもよい。

なお、ビーム成形部２５（図１参照）は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とのうち活性化光Ｌ１のみを成形してもよい。例えば、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０において、活性化光Ｌ１はベッセルビームであり、励起光Ｌ２はガウスビームであってもよい。この場合、瞳共役面Ｐ２にマスク２６が配置される代わりに、瞳共役面Ｐ１にマスク２６と同様のマスクが配置される。

また、ビーム成形部２５は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２の双方を成形してもよい。例えば、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０において、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、それぞれベッセルビームであってもよい。この場合、瞳共役面Ｐ１および瞳共役面Ｐ２のそれぞれにマスク２６が配置される。

また、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０において、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、それぞれガウスビームであってもよい。この場合、顕微鏡１は、ビーム成形部２５を備えなくてもよい。

図１の説明に戻り、ダイクロイックミラー１９は、活性化光Ｌ１が反射し、かつ励起光Ｌ２が透過する特性を有する。照明光学系１３は、ダイクロイックミラー１９から試料Ｓへ向かう順に、レンズ３１、レンズ３２、走査部３３、レンズ３４、レンズ３５、及び第１対物レンズ５を備える。ダイクロイックミラー１９で反射した活性化光Ｌ１、及びダイクロイックミラー１９を透過した励起光Ｌ２は、レンズ３１に入射する。レンズ３１は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を集光する。レンズ３２は、レンズ３１が集光した活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２をほぼ平行光に変換する。

レンズ３２を通った活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、走査部３３に入射する。走査部３３は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を、試料Ｓにおいて第１方向（Ｙ方向）および第２方向（Ｚ方向）のそれぞれと異なる方向（Ｘ方向）に走査する。走査部３３による走査方向は、例えば、第１方向と交差（例、直交）し、かつ第２方向と交差（例、直交）する方向である。走査部３３は、例えば、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とを、第１対物レンズ５の光軸５Ａおよび第２対物レンズ６のそれぞれに交差する第３方向（図中Ｘ方向）に偏向させる。

走査部３３は、例えば、第１対物レンズ５の光軸５Ａに対する傾きが可変の偏向ミラー（走査ミラー）を含む。偏向ミラーは、例えば、ガルバノミラーまたはＭＥＭＳミラーである。活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、走査部３３を介して、レンズ３４に入射する。レンズ３４は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を集光する。レンズ３５は、レンズ３４が集光した活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２をほぼ平行光に変換する。活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、レンズ３５を介して第１対物レンズ５に入射する。第１対物レンズ５は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を集光する。

図３は、ベッセルビームおよびガウスビームを示す図である。図３（Ａ）には、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０に励起光Ｌ２が入射する領域Ａ１、及びベッセルビームとして第１対物レンズ５から出射する励起光Ｌ２を示した。また、図３（Ｂ）には、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０に活性化光Ｌ１が入射する領域Ａ２、及びガウスビームとして第１対物レンズ５から出射する活性化光Ｌ１を示した。

図３（Ａ）に示すように、励起光Ｌ２は、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０で、図２のマスク２６の開口２６ａに対応する円環形状の領域Ａ１に入射する。瞳面Ｐ０における励起光Ｌ２の強度分布は、ガウス分布に対して、第１対物レンズ５の光軸５Ａの位置およびその周囲の強度が低い分布である。第１対物レンズ５から出射した励起光Ｌ２は、第１対物レンズ５の光軸５Ａに対して傾いた向きから選択的に、第１対物レンズ５の焦点面ＦＰへ向かう。第１対物レンズ５は、Ｙ方向において、焦点面ＦＰと第２対物レンズ６の光軸６Ａ（図１参照）とが同じ位置になるように、位置決めされる。

図３（Ｂ）に示すように、活性化光Ｌ１は、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０で円形状の領域Ａ２に入射する。瞳面Ｐ０における活性化光Ｌ１の強度分布は、ほぼガウス分布である。第１対物レンズ５から出射した活性化光Ｌ１は、第１対物レンズ５の光軸５Ａとの角度が小さい光線であるほどその強度が強いガウスビームとして、第１対物レンズ５の焦点面ＦＰへ向かう。

図１の説明に戻り、検出系３は、検出光学系４１および検出部４２を備える。検出光学系４１は、試料Ｓで発生した蛍光Ｌ３を検出部４２へ導く。検出光学系４１は、第２対物レンズ６、レンズ４３、及びフィルタ４４を備える。第２対物レンズ６およびレンズ４３は、蛍光Ｌ３の像を形成する。

フィルタ４４は、蛍光Ｌ３が透過し、蛍光Ｌ３と異なる波長の光（例、外光、試料Ｓで反射、散乱した照明光）を遮る特性を有する。フィルタ４４は、試料Ｓと検出部４２との間の光路に配置される。例えば、フィルタ４４は、レンズ４３と検出部４２との間の光路に配置される。

検出部４２は、蛍光Ｌ３の像が形成される位置またはその近傍に配置される。検出部４２は、例えば、ＣＭＯＳイメージセンサあるいはＣＣＤイメージセンサなどの撮像素子である。検出部４２は、検出光学系４１が形成した蛍光Ｌ３の像を撮像することで、蛍光Ｌ３を検出する。

次に、顕微鏡１の実効視野について説明する。図４は、第１実施形態に係る照明光を示す図である。図４において、符号Ａ３は、蛍光の検出対象の領域（以下、検出領域Ａ３という）である。検出領域Ａ３は、例えば、検出可能なレベルの蛍光が試料Ｓで発生するように、照明光（活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２）が照射される照明領域である。検出領域Ａ３は、シート状の領域である。以下、Ｚ方向における検出領域Ａ３の寸法を適宜、シート厚ＳＺと称する。シート厚ＳＺは、ＸＺ平面における照明光の光強度分布の半値全幅（ＦＷＨＭ）である。

シート厚ＳＺが小さい場合、例えば、Ｚ方向において検出対象の位置とずれた位置（例、背景）における蛍光（例、背景光）の発生が抑制される。そのため、シート厚ＳＺが小さい場合、検出対象の位置からの蛍光を信号とし、検出対象の位置とずれた位置からの蛍光をノイズとすると、Ｓ／Ｎ比が高くなる。

また、Ｙ方向における検出領域Ａ３の寸法を、適宜、シート長ＳＹと称する。シート長ＳＹは、検出系３の実質的な視野（実効視野）のＹ方向における寸法に相当する。シート長ＳＹは、ＹＺ平面における照明光の光強度分布の半値全幅（ＦＷＨＭ）である。また、図４（Ｂ）に示す検出領域Ａ３のＸ方向の寸法を、適宜、検出領域Ａ３の幅ＳＸと称する。検出領域Ａ３の幅ＳＸは、走査部３３が試料を照明光（活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２）で走査する範囲に相当する。

ここで、活性化光を照明系から照射し、励起光を検出系から照射する場合について説明する。活性化光がガウシアンビームである場合、上記のシート厚と実効視野の広さとはトレードオフの関係になる。例えば、照明系の開口数が大きいほどシート厚が小さくなるが、シート長も小さくなり実効視野が狭くなる。また、活性化光がベッセルビームである場合、シート厚を薄くしつつ、実効視野を広くすることができる。しかしながら、活性化光がベッセルビームである場合、活性化光がガウシアンビームである場合と比較して、サイドローブが増加する。そのため、活性化光がベッセルビームである場合、サイドローブに起因する蛍光がノイズとなり、上記のＳ／Ｎ比が低下する。なお、励起光を照明系から照射し、活性化光を検出系から照射する場合についても同様である。

実施形態に係る顕微鏡１において、照明系２は、検出系３の検出方向（例、Ｚ方向）と異なる照射方向（例、Ｙ方向）から、第１光（例、活性化光Ｌ１）および第２光（例、励起光Ｌ２）を照射するので、シート厚を薄くしつつ実効視野を広くすることができ、かつサイドローブを低減することができる。

次に、上述の顕微鏡１の構成に基づき、実施形態に係る観察方法について説明する。図５は、実施形態に係る第１の観察方法を示すフローチャートである。ステップＳ１において、照明系２は、第１光（例、活性化光Ｌ１）と第２光（例、励起光Ｌ２）とを、試料Ｓに対してＹ方向から照射開始する。ステップＳ２において、走査部３３は、第１光（例、活性化光Ｌ１）と第２光（例、励起光Ｌ２）とで、試料ＳをＸ方向に走査する。これにより、図４に示したシート状の検出領域Ａ３に第１光および第２光が照射される。

ステップＳ３において、検出系３は、試料Ｓからの光（例、蛍光Ｌ３）をＺ方向から検出する。例えば、検出部４２は、ステップＳ１における照明光の照射開始と同期して露光を開始する。また、検出部４２は、ステップＳ２において照明光で試料が走査される間に露光を継続する。また、検出部４２は、照明光の走査終了と同期して露光を終了する。

図６は、実施形態に係る第２の観察方法を示すフローチャートである。ステップＳ１１において、走査部３３は、Ｘ方向における照明光の照射位置を設定する。ステップＳ１２において、照明系２は、第１光（例、活性化光Ｌ１）と第２光（例、励起光Ｌ２）とを、試料Ｓに対してＹ方向から照射する。ステップＳ１３において、検出系３は、試料Ｓからの光（例、蛍光Ｌ３）をＺ方向から検出する。

ステップＳ１４において、顕微鏡１（例、顕微鏡１の制御部）は、照射位置を変更するか否かを判定する。顕微鏡１は、例えば、予定された照射位置の一部についてステップＳ１２の処理およびステップＳ１３の処理が終了していない場合、照射位置を変更すると判定する。顕微鏡１は、照射位置を変更すると判定した場合（ステップＳ１４；Ｙｅｓ）、ステップＳ１１において照射位置を次の照射位置に設定し、ステップＳ１２の処理およびステップＳ１３の処理を繰り返す。

顕微鏡１は、照射位置を変更しないと判定した場合（ステップＳ１４；Ｎｏ）、ステップＳ１５において画像を生成する。顕微鏡１は、ステップＳ１５において、ステップＳ１２の処理およびステップＳ１３の処理を繰り返すことで得られる検出部４２の検出結果に基づいて、画像を生成する。

なお、顕微鏡１は、第１光源１１を備えなくてもよい。例えば、第１光源１１は、顕微鏡１に外付けされる外部装置でもよい。顕微鏡１は、第１光源１１を備えない状態で提供され、第１光源１１は、顕微鏡１による観察が実行される際に顕微鏡１に取り付けられてもよい。第１光源１１は、顕微鏡１において交換可能に設けられてもよい。また、第２光源１２についても第１光源１１と同様であり、顕微鏡１は、第２光源１２を備えなくてもよい。なお、照明系２は、顕微鏡１と別に提供される照明装置でもよい。照明系２は、試料Ｓからの光を顕微鏡１によって検出する際に、顕微鏡１に取り付けられてもよい。

なお、図１などにおいて、活性化光Ｌ１がガウスビームであり、励起光Ｌ２がベッセルビームであるが、本実施形態あるいは後述の実施形態において、励起光Ｌ２がガウスビームであって、活性化光Ｌ１がベッセルビームでもよい。また、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、ガウスビームでもよい。また、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、ベッセルビームでもよい。また、図１では第１光Ｌ１は活性化光であり、第２光は励起光であるが、本実施形態および後述の実施形態において第１光Ｌ１が励起光であって、第２光Ｌ２が活性化光でもよい。

なお、実施形態において、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との一方または双方は、エアリービームでもよい。エアリービームは、所定の光学面において位置によって位相が変化する光である。エアリービームは、所定の光学面において、位相の空間分布が不均一である。上記の所定の光学面は、例えば、第１対物レンズ５に対して試料Ｓと反対側における第１対物レンズ５の焦点面（瞳面Ｐ０）、あるいは第１対物レンズ５に対して試料Ｓと同じ側における第１対物レンズ５の焦点面（図３（Ａ）の焦点面ＦＰ）である。

第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との一方または双方をエアリービームに成形する手法として、例えば、ビーム成形部２５が位相の空間分布を調整する手法がある。例えば、ビーム成形部２５は、第１光Ｌ１をエアリービームに成形する場合、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０における第１光Ｌ１の位相が不均一な空間分布になるように、第１光Ｌ１の位相を調整する。例えば、ビーム成形部２５は、照明光学系１３の光軸に交差する面内で屈折率が不均一な光学部材を含む。この光学部材は、例えば、領域ごとに屈折率が固定値に設定された部材でもよいし、液晶パネルのように屈折率が領域ごとに可変の部材でもよい。

上記の光学部材は、例えば、図１に示した瞳共役面Ｐ１またはその近傍に配置される。なお、ビーム成形部２５は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との一方または双方について、瞳面Ｐ０における空間的な強度分布と空間的な位相分布との一方のみを調整してもよいし、瞳面Ｐ０における空間的な強度分布および空間的な位相分布の双方を調整してもよい。

なお、本実施形態あるいは後述の実施形態において、第１光の強度分布と第２光の強度分布との組み合わせは、任意に選択される。ここで、第１光の強度分布と第２光の強度分布との組み合わせを、（第１光のビームの種類、第２光のビームの種類）で表す。第１光の強度分布と第２光の強度分布との組み合わせは、例えば、（ガウスビーム，ガウスビーム）、（ガウスビーム，ベッセルビーム）、（ガウスビーム，エアリービーム）、（ベッセルビーム，ガウスビーム）、（ベッセルビーム，ベッセルビーム）、（ベッセルビーム，エアリービーム）、（エアリービーム，ガウスビーム）、（エアリービーム，ベッセルビーム）、（エアリービーム，エアリービーム）のいずれでもよい。

［第２実施形態］
第２実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図７は、第２実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、照明系２は、試料Ｓにおいて第１方向（Ｙ方向）と第２方向（Ｚ方向）とのいずれとも異なる方向（Ｘ方向）に分布するシート状の第１光（例、活性化光Ｌ１）と第２光（例、励起光Ｌ２）とを照射する。照明系２は、シート状の照明光Ｌ（活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２）によって、図４に示したシート状の検出領域Ａ３を照明する。照明光学系１３は、図１の走査部３３の代わりに、ミラー５１および光学部材５２を備える。

ミラー５１は、折り曲げミラーであり、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２が入射する位置に配置される。ミラー５１で反射した活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、光学部材５２に入射する。光学部材５２は、例えばシリンドリカルレンズなどのように、パワーの異方性を有する。光学部材５２は、照明光をＺ方向に偏向するパワーをほぼ有していない。そのため、ＹＺ面における検出領域Ａ３（図４参照）は、第１実施形態と同様である。

図８は、第２実施形態に係る照明光を示す図である。光学部材５２は、ＸＺ面において、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２をそれぞれ瞳面Ｐ０に集光する。第１対物レンズ５は、瞳面Ｐ０を通った活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を、それぞれほぼ平行光に変換し、試料Ｓに照射する。

図９は、実施例と比較例との比較を示す図である。図９（Ａ）には、第１対物レンズ５の焦点面ＦＰ（図３参照）における光の強度分布を示した。横軸は、Ｚ方向の位置であり、縦軸は、任意単位（ａ．ｕ．）で表される光強度である。

強度分布ＤＧおよび強度分布ＤＢは、比較例の強度分布である。強度分布ＤＧは、第１対物レンズ５から、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２との一方のみをガウスビームとして照射した場合の強度分布に相当する。強度分布ＤＧである場合のシート厚ＳＺ１は、メインローブに対する半値全幅である。ここで、強度分布において光強度の１つの極小から極大を経て隣の極小に至る部分をエンベロープと称する。メインローブは、複数のエンベロープのうち、光強度の極大値が最大であるエンベロープである。サイドローブは、複数のエンベロープのうちメインローブを除いたエンベロープである。

強度分布ＤＢは、第１対物レンズ５から、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２との一方のみをベッセルビームとして照射した場合の強度分布に相当する。強度分布ＤＢである場合のシート厚ＳＺ２は、メインローブに対する半値全幅である。

強度分布ＤＧＢは、実施例の強度分布である。強度分布ＤＧＢは、第１対物レンズ５から、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２との一方の光をガウスビームとして照射し、かつ活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２との他方の光をベッセルビームとして照射した場合の強度分布に相当する。強度分布ＤＧＢである場合のシート厚ＳＺ３は、メインローブに対する半値全幅である。

ここで、第１光（活性化光Ｌ１）および第２光（励起光Ｌ２）の双方を含む照明光の点像強度分布関数（Point Spread Function）をＰＳＦｅｆｆとする。また、第１光（例、活性化光Ｌ１）の点像強度分布関数をＰＳＦ１とし、第２光（例、励起光Ｌ２）の点像強度分布関数をＰＳＦ２とする。弱い光による線形なプロセスを仮定すると、ＰＳＦｅｆｆは、（ＰＳＦｅｆｆ＝ＰＳＦ１×ＰＳＦ２）で表される。

ＰＳＦ１およびＰＳＦ２は、メインローブのピーク位置から外れると急峻に減少する。強度分布ＤＧＢにおいて、メインローブのピーク位置から外れた位置におけるＰＳＦｅｆｆは、ＰＳＦ１およびＰＳＦ２が掛け合わされた値であるので、ＰＳＦ１およびＰＳＦ２のいずれよりも急峻に減少する。そのため、図９（Ａ）に示すように、実施例に係る強度分布ＤＧＢは、比較例に係る強度分布ＤＧおよび強度分布ＤＢに比べて、半値全幅（シート厚ＳＺ３）が小さくなり、またサイドローブが低減される。

図９（Ｂ）には、実施例および比較例のそれぞれについて、「シート厚」、「視野」、及び「サイドローブ」の評価を示した。図９（Ｂ）において、「ガウスビーム」および「ベッセルビーム」は、比較例である。「ガウスビーム」は、図９（Ａ）の強度分布ＤＧに対応する。「ベッセルビーム」は、図９（Ａ）の強度分布ＤＢに対応する。また、「実施例」は、図９（Ａ）の強度分布ＤＧＢに対応する。図９（Ｂ）において、「×」が最も良好でなく、「△」、「〇」、「◎」の順に良好であることを示す。すなわち、「◎」が最も良好であることを示す。

「実施例」に係るシート厚は、図９（Ａ）から分かるように、「ガウスビーム」および「ベッセルビーム」のいずれよりも薄い。そのため、実施形態に係る顕微鏡１は、背景光を低減すること、Ｚ方向の分解能を向上させることができる。また、「実施例」に係る視野は、「ベッセルビーム」と同程度の広さであり、「ガウスビーム」よりも広い。また、「実施例」に係るサイドローブは、「ガウスビーム」および「ベッセルビーム」のいずれよりも低減される。以上のように、実施形態に係る顕微鏡１は、シート厚を低減しつつ視野を広くし、かつサイドローブを低減することができる。

［第３実施形態］
第３実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１０は、第３実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、照明系２は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を、それぞれベッセルビームとして試料Ｓに照射する。図１０の照明系２は、図１の構成に、ビーム成形部２５としてマスク５５を加えた構成である。

マスク５５は、例えば、活性化光Ｌ１の光路において励起光Ｌ２が入射しない位置に配置される。例えば、マスク５５は、第２光源１２とダイクロイックミラー１９との間の光路に配置される。マスク５５は、例えば、瞳共役面Ｐ１と同じ位置またはその近傍の位置に配置される。マスク５５は、図２などで説明したマスク２６と同様である。

図１１は、照明光および蛍光の強度分布を示す図である。図１１（Ａ）において、強度分布Ｅ１は、第１対物レンズ５の焦点面ＦＰ（図３参照）における活性化光Ｌ１の強度分布である。また、強度分布Ｅ２は、第１対物レンズ５の焦点面ＦＰ（図３参照）における励起光Ｌ２の強度分布である。また、強度分布Ｅ３は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２の双方を含む照明光の強度分布である。この照明光のＰＳＦは、活性化光Ｌ１のＰＳＦと励起光Ｌ２のＰＳＦとの掛け合わせで近似される。そのため、強度分布Ｅ３は、強度分布Ｅ１および強度分布Ｅ２のいずれよりも、サイドローブが低減されている。

なお、分布Ｅ４には、検出系３が検出可能な範囲を概念的に示した。分布Ｅ４において、相対的に明るい部分（例、白）は、検出系３の感度が相対的に高い部分である。分布Ｅ４において、相対的に暗い部分（例、黒）は、検出系３の感度が相対的に低い部分である。強度分布Ｅ５は、検出系３によって検出される蛍光Ｌ３の強度分布である。強度分布Ｅ５は、強度分布Ｅ３と分布Ｅ４との掛け合わせで近似される。

また、図１１（Ｂ）において、横軸は、焦点面ＦＰ（図３参照）におけるＺ方向の位置であり、縦軸は光強度（ａ．ｕ．）である。活性化光Ｌ１の強度分布Ｅ１と励起光Ｌ２の強度分布Ｅ２とは、例えば、サイドローブの位置が互いに異なるように調整される。この場合、照明光の強度分布Ｅ３において、サイドローブを効果的に低減することができる。

なお、マスク２６とマスク５５の一方または双方は、空間光変調器（ＳＬＭ）を含んでもよい。ビーム成形部２５に空間光変調器を用いる場合、第１対物レンズ５の瞳面Ｐ０における強度分布が可変であり、強度分布Ｅ１と強度分布Ｅ２とでサイドローブの相対位置を可変である。強度分布Ｅ１と強度分布Ｅ２とのサイドローブの相対位置は、例えば、強度分布Ｅ１と強度分布Ｅ２とを掛け合わせた値をサイドローブで積算した積算値が最小あるいは閾値以下になるように設定される。

なお、ビーム成形部２５として開口の位置および寸法が固定のマスクを用いる場合、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とでサイドローブの位置が互いに異なるように、開口の位置および寸法を予め設定してもよい。また、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とでサイドローブの位置が同じでもよい。この場合においても、照明光の強度分布は、活性化光Ｌ１の強度分布Ｅ１と励起光Ｌ２の強度分布Ｅ２との掛け合わせになるので、サイドローブが低減される。

［第４実施形態］
第４実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１２は、第４実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、ビーム成形部２５は、マスク５４を備える。マスク５４は、活性化光Ｌ１が入射し、かつ励起光Ｌ２が入射する位置に配置される。本実施形態において、瞳共役面Ｐ１は、ダイクロイックミラー１９とレンズ３１との間の光路に配置される。マスク５４は、瞳共役面Ｐ１の位置またはその近傍に配置される。

図１３は、第４実施形態に係るビーム成形部（マスク）を示す図である。ビーム成形部２５（図１２参照）のマスク５４は、領域５４ａ、領域５４ｂ、及び領域５４ｃを有する。領域５４ａおよび領域５４ｂは、例えば波長フィルタを含み、所定波長の光が透過する。領域５４ａは、活性化光Ｌ１が透過し、励起光Ｌ２を遮光する領域である。領域５４ｂは、活性化光Ｌ１を遮光し、励起光Ｌ２が透過する領域である。領域５４ｃは、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を遮光する領域である。このようなマスク５４を用いると、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２の双方を成形する場合に、例えばビーム成形部２５の構成をシンプルにすることができる。

［第５実施形態］
第５実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１４は、第５実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、照明系２は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を、それぞれガウスビームとして試料Ｓに照射する。照明光学系１３は、図１で説明したレンズ１７、レンズ１８、レンズ２３、マスク２６、及びレンズ２４を省いた構成である。

図１５は、複数のビームの種類について照明光の強度分布を示す図である。図４において、横軸は焦点面ＦＰ（図３参照）におけるＺ方向の位置であり、縦軸は、光強度（ａ．ｕ．）である。強度分布Ｆ１および強度分布Ｆ２は、比較例であり、照明系から活性化光または励起光の一方のみの照明光を照射した場合の強度分布である。強度分布Ｆ１は、照明光がガウスビームである場合の強度分布である。強度分布Ｆ２は、照明光がベッセルビームである場合の強度分布である。

強度分布Ｆ３、強度分布Ｆ４、及び強度分布Ｆ５は、実施例であり、照明系２から活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を照射した場合の強度分布である。強度分布Ｆ３は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２がそれぞれガウスビームである場合（図１４参照）の強度分布である。強度分布Ｆ４は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とのうち、一方の光がベッセルビームであり、他方の光がガウスビームである場合（図１参照）の強度分布である。強度分布Ｆ５は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２がそれぞれベッセルビームである場合（図１０参照）の強度分布である。このように、実施例に係る強度分布は、比較例の強度分布に比べて、半値全幅（シート厚）を薄くしつつ、サイドローブを低減することができる。

［第６実施形態］
第６実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１６は、第６実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、照明系２は、活性状態の蛍光物質を不活性状態にする不活性化光Ｌ４を試料Ｓに照射する。照明系２は、第３光源５６、レンズ５７、レンズ５８、ダイクロイックミラー５９、及び制御部６０を備える。

第３光源５６は、不活性化光Ｌ４を発する。第３光源５６は、例えば、ＬＤ（レーザダイオード）あるいはＬＥＤ（発光ダイオード）などの固体光源を含む。レンズ５７は、第３光源５６からの不活性化光Ｌ４を集光する。レンズ５８は、レンズ５７によって集光された不活性化光Ｌ４をほぼ平行光に変換する。レンズ５８を通った不活性化光Ｌ４は、ダイクロイックミラー５９に入射する。ダイクロイックミラー５９は、励起光Ｌ２が透過し、不活性化光Ｌ４が反射する。不活性化光Ｌ４は、ダイクロイックミラー５９で反射し、励起光Ｌ２と同じ光路を通って試料Ｓに照射される。

本実施形態において、顕微鏡１は、顕微鏡１の各部を制御する制御部６０を備える。制御部６０は、活性化光Ｌ１の照射タイミング、励起光Ｌ２の照射タイミング、及び不活性化光の照射タイミングを制御する。制御部６０は、第１光源１１を制御して、活性化光Ｌ１が試料Ｓに照射される照射タイミングを制御する。また、制御部６０は、第２光源１２を制御して、励起光Ｌ２が試料Ｓに照射される照射タイミングを制御する。また、制御部６０は、第３光源５６を制御して、不活性化光Ｌ４が試料Ｓに照射されるタイミングを制御する。

図１７は、第６実施形態に係る顕微鏡の動作を示すフローチャートである。ステップＳ１１において、制御部６０は、走査部３３を制御して、Ｘ方向における照射位置を設定する。また、制御部６０は、ステップＳ１２において、第１光源１１および第２光源１２を制御し、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２をＹ方向から照射させる。また、ステップＳ１３において、制御部６０は、検出部４２を制御して、検出部４２に検出を実行させる。

また、ステップＳ２１において、制御部６０は、第３光源５６を制御して不活性化光Ｌ１を試料Ｓに照射させる。また、ステップＳ１４において、制御部６０は、照射位置を変更するか否かを判定する。制御部６０は、照射位置を変更すると判定した場合（ステップＳ１４；Ｙｅｓ）、ステップＳ１１において、走査部３３を制御して、Ｘ方向における照射位置を次の照射位置に設定する。

なお、不活性光Ｌ４を照射する構成は、図１６の形態に限定されない。例えば、不活性化光Ｌ４を試料Ｓに照射する光学系は、照明光学系１３と別に設けられてもよい。検出系３は、第２対物レンズ６から不活性化光Ｌ４を照射してもよい。また、不活性化光Ｌ４は、励起光Ｌ２と同じ波長である場合がある。この場合、照明系２は、第２光源１２からの励起光Ｌ２を不活性化光Ｌ４として照射してもよい。

［第７実施形態］
第７実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１８は、第７実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、顕微鏡１は、励起した蛍光物質に誘導放出を生じさせ、誘導放出によって減衰した蛍光を検出する。

本実施形態において、第１光Ｌ１は、蛍光物質を励起させる励起光または励起した蛍光物質に誘導放出を生じさせる誘導光に設定される。また、第２光Ｌ２は、励起光と誘導光とのうち第１光と異なる光に設定される。本実施形態において、蛍光物質は、励起光と誘導光のうち励起光のみが照射された第１状態で蛍光を放射し、かつ励起光と誘導光とが照射された第２状態において第１状態よりも減衰した蛍光を放射する。

本実施形態において、試料Ｓに含まれる蛍光物質は、フォトスイッチャブル プローブ（ＰＰ）以外の蛍光物質でよい。本実施形態に係る蛍光物質は、励起光が照射されることで励起状態に遷移する。励起状態の蛍光物質の一部は、蛍光を発して基底状態に遷移する。また、励起状態の蛍光物質の一部は、誘導光が照射されることによって誘導放出を生じ、基底状態に遷移する。

本実施形態において、照明系２は、第４光源６１を備える。第４光源６１は、第１光Ｌ５として、励起した蛍光物質に誘導放出を生じさせる誘導光を発する。以下の説明において、適宜、誘導光に符号Ｌ５を付して表す（例、誘導光Ｌ５）。照明光学系１３は、第１実施形態などと同様であり、第４光源６１から発せられた誘導光Ｌ５は、照明光学系１３を経由して試料Ｓに照射される。

本実施形態において、制御部６０は、第２光源１２を制御して、試料Ｓに励起光Ｌ２が照射されるタイミングを制御する。また、制御部６０は、第４光源６１を制御して、試料Ｓに誘導光Ｌ５が照射されるタイミングを制御する。また、制御部６０は、検出部４２を制御し、試料Ｓから放射される光の検出を実行させる。制御部６０は、第２光源１２を制御して励起光Ｌ２の照射を開始させた後、検出部４２を制御して蛍光Ｌ３を検出する第１検出処理を実行させる。第１検出処理は、励起光Ｌ２が照射された試料Ｓから放射される蛍光Ｌ３を検出する処理である。

本実施形態において、励起光Ｌ２および誘導光Ｌ５は、時分割で試料Ｓに照射される。制御部６０は、第１検出処理の終了後に、第２光源１２を制御して励起光Ｌ２の照射を停止させる。制御部６０は、第４光源６１を制御して、励起光Ｌ２の照射が停止された状態で試料Ｓに誘導光Ｌ５を照射させる。制御部６０は、検出部４２を制御し、励起光Ｌ２が照射された後に誘導光Ｌ５が照射された試料Ｓから放射される蛍光Ｌ３を検出する第２検出処理を実行させる。第２検出処理は、励起光Ｌ２および誘導光Ｌ５が照射された試料Ｓから放射される蛍光Ｌ３を検出する処理である。本実施形態に係る顕微鏡１は、第１検出処理の検出結果（例、第１画像）と第２検出処理の検出結果（例、第２画像）との比較（例、差分）によって、画像を生成する。

次に、上述の顕微鏡１の動作に基づき、本実施形態に係る観察方法について説明する。図１９は、第７実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。顕微鏡１の各部については、適宜、図１８を参照する。図１９のステップＳ３１において、制御部６０は、第１光（励起光Ｌ２）をＹ方向から照射させる。ステップＳ３２において、制御部６０は、試料からの光（蛍光Ｌ３）をＺ方向から検出させる。ステップＳ３３において、制御部６０は、第２光（誘導光Ｌ５）をＹ方向から照射させる。ステップＳ３４において、制御部６０は、試料からの光をＺ方向から検出させる。なお、蛍光の寿命が制御系の切り替え所要時間よりも短い場合には、ステップＳ３３において、第１光（励起光Ｌ２）と第２光（誘導光Ｌ５）とをＹ方向から照射させてもよい。

ステップＳ３５において、顕微鏡１は、ステップＳ３２の検出結果とステップ３４の検出結果とに基づいて、画像を生成する。例えば、顕微鏡１（例、画像処理部）は、ステップＳ３２の第１検出処理で得られる第１画像と、ステップＳ３４の第２検出処理で得られる第２画像との比較によって第３画像（結果画像）を生成する。例えば、顕微鏡１は、第３画像として、第１画像と第２画像との差分に相当する画像を生成する。

なお、顕微鏡１は、図１で説明したように照明光で試料Ｓを走査して蛍光Ｌ３の検出を実行してもよい。また、顕微鏡１は、図７で説明したように走査を行わないで、蛍光Ｌ３の検出を実行してもよい。また、励起光Ｌ２のビームの種類は、ガウスビーム、ベッセルビーム、エアリービームのいずれでもよい。

［第８実施形態］
第８実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図２０は、第８実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、顕微鏡１は、図１８と同様に誘導放出によって減衰した蛍光を検出する。本実施形態において、顕微鏡１は、誘導光Ｌ５の照射を、励起光Ｌ２の照射の少なくとも一部と並行して実行する。

本実施形態に係る顕微鏡１は、変調部６２、変調部６３、変調器６４、及びロックイン検出部６５を備える。変調部６２および変調部６３は、それぞれ、光の強度を変調する。変調部６２および変調部６３は、例えば音響光学素子（ＡＯＭ）などの空間光変調器を含む。

変調部６２は、誘導光Ｌ５の光路に配置される。変調部６２は、例えば、誘導光Ｌ５の光路のうち励起光Ｌ２が入射しない位置に配置される。図２０において、変調器６２は、第４光源６１とダイクロイックミラー１９との間（例、第４光源６１とレンズ１５との間）の光路に配置される。変調器６４は、制御部６０によって指定された周波数の信号を生成する。変調器６４は、第１周波数ω１の信号を生成し、この信号を変調部６２へ供給する。変調部６２は、変調器６４から供給された信号に基づいて、強度変調を実行する。変調器６４は、強度変調によって、第１光（誘導光Ｌ５）の強度が変化する周波数を第１周波数ω１に設定する。

変調部６３は、励起光Ｌ２の光路に配置される。変調部６３は、例えば、励起光Ｌ２の光路のうち誘導光Ｌ５が入射しない位置に配置される。図２０において、変調器６３は、第２光源１２とダイクロイックミラー１９との間（例、第２光源１２とレンズ２１との間）の光路に配置される。変調器６４は、第２周波数ω２の信号を生成し、この信号を変調部６３へ供給する。変調部６３は、変調器６４から供給された信号に基づいて、強度変調を実行する。変調器６４は、強度変調によって、第２光（励起光Ｌ２）の強度が変化する周波数を第２周波数ω２に設定する。

ロックイン検出部６５は、第１周波数ω１と第２周波数ω２とに基づいて、試料Ｓから放射される蛍光Ｌ３を検出する。ロックイン検出部６５は、例えば検出部４２に設けられる。検出部４２は、例えばロックインカメラを含む。変調器６４は、第１周波数ω１と第２周波数ω２との差分の周波数（ω１−ω２）の信号を生成し、この信号をロックイン検出部６５へ供給する。ロックイン検出部６５は、変調器６４から供給された信号に基づいて、ロックイン検出を実行する。例えば、ロックイン検出部６５は、蛍光Ｌ３を検出して得られる信号と、変調器６４から供給される信号とを掛け合わせ、掛け合わせた信号を積算する。顕微鏡１は、ロックイン検出部６５の検出結果に基づいて、画像を生成する。

ロックイン検出部６５は、例えば、乗算器、積算器などを含む回路（ハードウェア）によってロックイン検出を実行する。なお、ロックイン検出部６５は、ソフトウェアによってロックイン検出を実行してもよい。例えば、ロックイン検出部６５は、汎用の演算器（例、ＣＰＵ）がプログラムに従って検出部４２の検出結果を演算し、ロックイン検出を実行する形態でもよい。

なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態などで説明した態様に限定されるものではない。上述の実施形態などで説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上述の実施形態などで説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の実施形態などで引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１・・・顕微鏡、２・・・照明系（照明装置）、３・・・検出系、５・・・第１対物レンズ、５Ａ・・・光軸、６・・・第２対物レンズ、６Ａ・・・光軸、Ｓ・・・試料、２５・・・ビーム成形部、３３・・・走査部、６０・・・制御部、６２、６３・・・変調部、６５・・・ロックイン検出部、Ｌ１・・・第１光（活性化光）、Ｌ２・・・第２光（励起光）、Ｌ３・・・第３光（蛍光）、Ｌ５・・・第１光（誘導光）、Ｐ０・・・瞳面

Claims (19)

1. 蛍光物質を活性化させる活性化光または活性化された前記蛍光物質を励起させる励起光に設定される第１光と、前記活性化光と前記励起光とのうち前記第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射する照明系と、
   前記第１光と前記第２光とが照射された前記試料から放射される蛍光を、前記第１方向とは異なる第２方向から検出する検出系と、を備える顕微鏡。
2. 前記蛍光物質を不活性状態にする不活性化光を前記試料に照射し、
   前記活性化光の照射タイミング、前記励起光の照射タイミング、及び前記不活性化光の照射タイミングを制御する制御部を備える、請求項１に記載の顕微鏡。
3. 蛍光物質を励起させる励起光または励起した前記蛍光物質に誘導放出を生じさせる誘導光に設定される第１光と、前記励起光と前記誘導光とのうち前記第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射する照明系と、
   前記第１光と前記第２光とが照射された前記試料から放射される蛍光を、前記第１方向とは異なる第２方向から検出する検出系と、を備える顕微鏡。
4. 前記励起光が照射された前記試料から放射される蛍光を検出する第１検出処理を前記検出系に実行させ、前記励起光と前記誘導光とが照射された前記試料から放射される蛍光を検出する第２検出処理を前記第１検出処理の後に前記検出系に実行させる制御部を備える、
   請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記第１光の強度が変化する第１周波数と、前記第２光の強度が変化する第２周波数とを互いに異なる値に設定する変調部を備える、
   請求項４に記載の顕微鏡。
6. 前記第１周波数と前記第２周波数とに基づいて、前記試料から放射される蛍光を検出するロックイン検出部を備える、
   請求項５に記載の顕微鏡。
7. 前記照明系は、第１対物レンズを含み、前記第１対物レンズの光軸が前記第１方向に設定され、
   前記検出系は、第２対物レンズを含み、前記第２対物レンズの光軸が前記第２方向に設定される、
   請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
8. 前記第１光および前記第２光は、それぞれ、前記第１対物レンズの瞳面においてガウスビーム、ベッセルビーム、又はエアリービームである、
   請求項７に記載の顕微鏡。
9. 前記第１対物レンズの瞳面における前記第１光の強度分布と前記第２光の強度分布とが互いに異なるように、前記第１光と前記第２光との一方または双方を成形するビーム成形部を備える、請求項７または請求項８に記載の顕微鏡。
10. 前記第１対物レンズの瞳面において、前記第１光はガウスビームであり、前記第２光はベッセルビームである、請求項９に記載の顕微鏡。
11. 前記ビーム成形部は、前記第１対物レンズの瞳共役面において光が通る領域を規定するマスクを備える、請求項１０に記載の顕微鏡。
12. 前記第１対物レンズの瞳面において、前記第１光および前記第２光はガウスビームである、請求項７または請求項８に記載の顕微鏡。
13. 前記第１対物レンズの瞳面において、前記第１光および前記第２光はベッセルビームである、請求項７または請求項８に記載の顕微鏡。
14. 前記試料における前記第１光のサイドローブの位置は、前記試料における前記第２光のサイドローブの位置と異なる、請求項１３に記載の顕微鏡。
15. 前記第１対物レンズの瞳面における前記第１光と前記第２光との一方または双方の光の位相の空間分布を不均一に設定し、前記一方または双方の光をエアリービームに成形するビーム成形部を備える、
    請求項７または請求項８に記載の顕微鏡。
16. 前記照明系は、前記第１光および前記第２光を前記試料上に集光し、
    前記第１光および前記第２光を、前記試料において前記第１方向および前記第２方向のそれぞれと交差する方向に走査する走査部を備える、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
17. 前記照明系は、前記試料において前記第１方向および前記第２方向に交差する方向に分布するシート状の前記第１光と前記第２光とを照射する、請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
18. 蛍光物質を活性化させる活性化光または活性化された前記蛍光物質を励起させる励起光に設定される第１光と、前記活性化光と前記励起光とのうち前記第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射することと、
    前記第１光と前記第２光とが照射された前記試料から放射される蛍光を、前記第１方向とは異なる第２方向から検出することと、を含む観察方法。
19. 蛍光物質を励起させる励起光または励起した前記蛍光物質に誘導放出を生じさせる誘導光に設定される第１光と、前記励起光と前記誘導光とのうち前記第１光と異なる光に設定される第２光とを、試料に対して第１方向から照射することと、
    前記第１光と前記第２光とが照射された前記試料から放射される蛍光を、前記第１方向とは異なる第２方向から検出することと、を含む観察方法。