JP2012093757A - Sted光シートを用いるspim顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】y方向の照明光源とz方向検出光カメラとを有するSPIM顕微鏡(選択的面結像顕微鏡)が開示される。xスキャナは、x方向に照明光線を走査することによって、連続的な光シートを生成する。STED失活光線を選択的にオンにすることによって、光シートを選択的に、より薄くすることができ、したがって、光学解像度を改善することができる。
【選択図】図4
Description
i)y照明方向と反対の検出光の共焦点検出、
ii)z方向への広視野検出光のSPIM検出、
iii)z方向への広視野検出光の多光子検出、
iv)上記の共焦点検出とスピン検出(spin detection)の同時検出、
v)上記の共焦点検出と多光子検出の同時検出。
・パルス励起と遅延パルス失活
・CW(連続波)励起とCW失活
・パルス励起とCW失活
・パルスMP(多光子)励起とパルス失活
・パルスMP(多光子)励起とCW失活
i)高解像度であるが、物体の中の、より小さい対象域を画像化する二次元画像(SPIM)、
ii)低解像度であるが、物体の中の、より大きい対象域を画像化する二次元画像(SPIM)、
iii)高解像度でのz方向の一次元共焦点画像x−t、
iv)より低解像度でのz方向の一次元共焦点画像x−t。
2 物体
3 対物レンズ
4 レーザ
5 照明光線
6 コリメートレンズ
7 円柱レンズ
9 カメラ
10 照明光線の経路
11 検出光線の経路
12 スキャナ
13 ズーム光学系
14 カラーフィルタ
15 管状レンズ
16 カメラ
17 物体キャリア
18 検出器
19 フォトダイオード
20 開口
21 検出光
22 画像処理ユニット
23 モニタ
24 ダイクロイックミラー
25 ズームレンズ
26 レンズ
27 焦点距離の範囲
28 SPIM画像処理ユニット
29 SPIMモニタ
30 照明点
31 励起光線
32 失活光線
34 統合光線経路
35 検出光
36 光検出器
37 ダイクロイックミラー
38 開口
39 位相板
40 失活光線
41 励起光線
42 照明対物レンズ
43 調光ミラー
44 検出光線の経路
45 光電子倍増器またはアバランシェフォトダイオード
46 レーザ
47 失活光線の経路
50 失活点
Claims (24)
- y方向から画像化対象の物体へと照明光線を送る光源と、
前記y方向に対して略垂直に延び第一の検出方向としてのz方向に、蛍光および/または反射光として前記物体から発せられる光を検出するカメラと、
を備えて構成されるSTED−SPIM顕微鏡において、
前記y方向と前記z方向に対して略垂直に延びるx方向に前記照明光線を走査することによって連続的な光シートを生成する第一のxスキャナであって、前記光シートが前記x方向と前記y方向によって画定される平面内で連続的に形成される第一のxスキャナと、
前記y方向から、少なくとも1つの失活光線を前記物体へと送り、前記連続的に生成される光シートを前記z方向により薄くする失活光源であって、前記失活光線が少なくとも前記照明光線に関して前記z方向にずれた地点で最大強度を有し、前記x方向に走査される前記照明光線に平行に延びる失活光源と、
を特徴とするSTED−SPIM顕微鏡。 - 前記失活光線を、その断面がz方向に少なくとも2つの最大強度を有し、それらの間に、前記励起光線の中央に設けられたゼロ地点があるように、変調するように構成された失活光線変調器を特徴とする、請求項1に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記失活光線を変調するように構成された位相板を特徴とする、請求項2に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記励起光線をベッセルビームに変調するように構成された励起光線変調器を特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記励起光線変調器が可変音響式屈折率分布型(TAG)レンズであることを特徴とする、請求項4に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記励起光線変調器がアキシコンであることを特徴とする、請求項4に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 少なくとも前記励起光線を変調するようになされた、少なくとも1つの音響光学素子を特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記音響光学素子が音響光学偏向器(AOD)であることを特徴とする、請求項7に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記音響光学素子が、前記励起光線の周波数と強度を調整するための音響光学可変フィルタ(AOTF)であることを特徴とする、請求項7に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記失活光線は一定の周波数を有することを特徴とする、請求項7〜9のいずれか一項一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記励起光線と前記失活光線の強度を調整するように構成された、少なくとも1つの強度コントローラを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記強度コントローラが音響光学素子であることを特徴とする、請求項11に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記失活光線変調器が可変音響式屈折率分布型(TAG)レンズであることを特徴とする、請求項2に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記失活光線変調器が光空間変調器(SLM)であることを特徴とする、請求項2に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記失活光線を追加しない通常のSPIMモードである第一の動作モードと、前記失活光線が追加でオンにされるSPIMプラスSTEDモードである第二の動作モードの間で切り替えるように構成されたスイッチを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記スイッチが、前記第一の動作モードと前記第二の動作モードの間で永久的な選択を行うように構成されていることを特徴とする、請求項15に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記スイッチが、前記第一の動作モードと前記第二の動作モードの間で、特定の切り替え周波数で自動的に切り替えるように構成されていることを特徴とする、請求項15に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記切り替え周波数を用いて前記第一の動作モードと前記第二の動作モードによって第一の検出方向に前記カメラによって検出された検出光を、2つのデータストリームに分割し、同時に、前記第一の動作モードによる画像と前記第二の動作モードによる画像を生成する画像処理ユニットを特徴とする、請求項17に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記励起光線の光線経路内に設置され、相互に機械的に動かされて開口数を変化させ、したがって、前記連続的に生成される光シートの焦点を拡張または短縮させ、したがって前記物体内で前記光シートによって照明される前記y照明方向における視野の長さを拡張または短縮させる複数のレンズ集合を含む光学ズームを備える照明光学系を特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記x方向と反対の第二の方向に、前記物体から発せられた蛍光および/または反射検出光を検出する光検出器を特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- SPIM法を適用することによってz方向に検出される二次元広視野画像と平行して、前記x方向に延びる線である、前記物体の共焦点一次元画像が生成されることを特徴とする、請求項20に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 前記物体を前記z方向に移動させて、それぞれの照明面にて相互にz方向に離間された複数の光シートが連続的に生成されるようにし、前記各光シートと前記カメラの間の距離が一定のままであるzスキャナを特徴とする、請求項20に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
- 次の動作モード、
i)前記y照明方向と反対の検出光の共焦点検出、
ii)前記z方向での広視野検出光のSPIM検出、
iii)前記z方向での広視野検出光の多光子検出、
iv)前記共焦点検出とスピン検出の同時検出、
v)前記共焦点検出と多光子検出の同時検出、
の間で切り替えるように構成されたスイッチを特徴とする、請求項20〜22のいずれか一項に記載のSTED−SPIM顕微鏡。 - 前記動作モードi)〜v)は、選択的に追加で前記STED失活光線をオンにして、またはオンにせずに実行可能であることを特徴とする、請求項23に記載のSTED−SPIM顕微鏡。
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