JP2023541449A - 多次元撮像のための方法およびシステム - Google Patents

Abstract

多深度共焦点撮像システムは、励起ビームおよび対物レンズを提供するように構成された少なくとも一つの光源を含む。励起ビームは、対物レンズを通して励起方向に沿って第一の複数の焦点深度で試料内に集束される。画像センサーは、対物レンズを介して試料からの放射を受信し、放射は、第二の複数の焦点深度で、画像センサーに対する焦点を画定する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０７７，８５２号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願は、その全体が参照によりすべての目的に対して本明細書に組み込まれる。

生物全体、組織、および細胞など、生理学的に関連のあるシステムにおける生物学的撮像は、典型的には、高度な光学技術およびハードウェアを必要とする。例えば、光シート蛍光顕微鏡法（ＬＳＦＭ）は、１９９４年に導入されて以来、数十年にわたって進化してきた技術である。ＬＳＦＭ技術は、入射光に対して直交軸上の蛍光を検出することによって、観察から照明を分離する。

従来の落射蛍光モダリティと比較して、ＬＳＦＭは低い照度を利用するため、分析した試料への光損傷を最小化する。ＬＳＦＭはさらに、複数の軸方向での走査を可能にし、それによって、迅速な３Ｄ撮像および中高の光学分解能を可能にする。しかしながら、ＬＳＦＭシステムは実施が難しく、典型的に、二つ以上の対物レンズ、非標準試料調製プロトコル、難しいアライメント手順、および画像取得中に生成されたテラバイト単位のデータを処理するための複雑なワークフローやコンピュータストレージを必要とするため、評判がよくない。十分な光学分解能で、多くの場合は、多次元（例えば、ｘ、ｙ、ｚ、ｔ）で情報を捕捉しながら、光損傷および光毒性を最小化するために、技術的進歩が必要とされる。

本明細書では、蛍光顕微鏡法のシステムおよび技術の改善、ならびに前述の問題および当技術分野でのその他の問題の解決策が開示されている。

一態様では、撮像システムが開示されている。非限定的な例示的実施形態では、撮像システムは、試料を照射する光源、対物レンズ、およびセンサーアレイ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイ）を含み、試料は試料ステージ上にあり、またセンサーアレイは検出ステージ上にある。

別の態様では、試料を撮像する方法が開示されている。実施形態では、方法は、複数の深度で試料を照射して、アクティブピクセルセンサーアレイで試料（例えば、蛍光励起事象、散乱光、透過光、または反射光）からの光を検出することと、試料を走査することとを含む。実施形態では、本方法は、複数の深度で試料を照射して蛍光事象を生成することと、アクティブピクセルセンサーアレイで各蛍光事象を検出することと、試料を走査することとを含む。

別の態様では、多深度共焦点撮像システムが開示されており、このシステムは、励起ビームを提供するように構成された少なくとも一つの光源と、対物レンズであって、励起ビームが、対物レンズを通して励起方向に沿って、第一の複数の焦点深度（例えば、２～１０個の異なる深度、４～１２個の異なる深度、５～８個の異なる深度など、二つ以上の異なる深度）で試料内に集束される、対物レンズと、画像センサーであって、対物レンズを介して試料からの放射（例えば、励起放射、蛍光励起放射、散乱光放射、透過光放射、または反射光放射などの光ビーム）を受け、放射が、第二の複数の焦点深度で画像センサーに対する焦点を画定する、画像センサーと、を備える。実施形態では、画像センサーの少なくとも一部分は、対物レンズの光軸に対して斜め向き（例えば、非垂直角度）に位置付けられる。

別の態様では、多深度共焦点撮像システムが開示されており、システムは、少なくとも一つの光源と、複数の光源から励起光を受ける複数の光ファイバーであって、光ファイバーが、試料内の複数の深度で、試料内に励起光を導入するように空間的に配置されている、複数の光ファイバー（例えば、光ファイバーの数は試料内の深度の数に関する）と、を含む。

別の態様では、試料の二次元画像または三次元画像を生成する方法が開示されており、方法は、励起方向に沿って励起ビームを試料に導入することであって、励起ビームが試料中の複数の深度で集束される、導入することと、対応する複数の放射（例えば、励起放射、蛍光励起放射、散乱光放射、透過光放射、または反射光放射などの光ビーム）を画像センサー上に集束させることであって、放射が画像センサーに対して複数の深度で集束される、集束させることと、試料の複数の平面画像を取得するために、試料を励起方向に対して直交する方向に沿って走査することであって、平面画像が試料の複数の深度を画定する、走査することと、を含む。実施形態では、画像センサーは、励起方向に対してある傾斜角で配向される。

本明細書に記載される主題の一つ以上の変形物の詳細は、添付図面および以下の説明に記載されている。本明細書に記載される主題のその他の特徴および利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなる。

図１は、撮像システムの概略図を示す。 図２は、撮像システムの別の概略図を示す。 図３は、複数の深度の照明が３Ｄパターンの光ファイバー照明装置を通って横断する、撮像システムの態様を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、コンピュータシミュレーションを通して視覚化された多深度焦点生成の原理を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、コンピュータシミュレーションを通して視覚化された多深度焦点生成の原理を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、市販の光学素子を使用した光学シミュレーションを示す。 図５Ａおよび５Ｂは、市販の光学素子を使用した光学シミュレーションを示す。 図６は、ファイバー束および多深度焦点を示す試料の拡大図を示す。 図７Ａおよび７Ｂは、試料内で生成されたラインパターンのシミュレーションであり、回折限界焦点を確認する図であり、これが共焦点３Ｄ撮像を提供することを示す。 図７Ａおよび７Ｂは、試料内で生成されたラインパターンのシミュレーションであり、回折限界焦点を確認する図であり、これが共焦点３Ｄ撮像を提供することを示す。 図８は、照射パターンの軸方向位置と、ファイバー束内でのファイバーのオフセットとの関係を示し、これについては本明細書でさらに説明する。 図９は、対物レンズおよびコリミテーションレンズを含む撮像システムの倍率が、ファイバー束の軸方向オフセットにどのように関連するかを示す。 図１０は、検出器の前方に縞パターンを有する光学フィルターを配置することによって、焦点の外れた蛍光からの蛍光バックグラウンドを低減するための、多色同時撮像設計を示す。 図１１は、本明細書に記載の方法および装置に従って取得された画像を示す。左の画像は、１．５μｍ間隔で、異なる深度で試料内に投射された５本の一連のラインを示す。画像センサーが試料に対して正常である（すなわち、傾いていない）場合、ラインの集合のうち部分集合で焦点が合う。画像センサー（例えば、カメラ）が傾いている（すなわち、試料に対して斜めである）場合、異なる深度のすべてのラインの集合で同時に焦点が合う。 図１２Ａ～１２Ｄは、複数の深度の照明を生成するための実施形態を示す。例えば、平坦な反射面（図１２Ａ）または頂点（図１２Ｂ）を有する反射体アレイは、交互の深度での照射パターンを生成するために使用されてもよい。図１２Ｃは、交互の深度での照射パターンを提供する、千鳥状に配置されたピンホールアレイを示す。図１２Ｄは、反射面が移動可能なポスト（例えば、アクチュエータ）に取り付けられ、ポストの高さが望ましい照明深度を達成するために変動される、分割ミラー方式を示す。 図１２Ａ～１２Ｄは、複数の深度の照明を生成するための実施形態を示す。例えば、平坦な反射面（図１２Ａ）または頂点（図１２Ｂ）を有する反射体アレイは、交互の深度での照射パターンを生成するために使用されてもよい。図１２Ｃは、交互の深度での照射パターンを提供する、千鳥状に配置されたピンホールアレイを示す。図１２Ｄは、反射面が移動可能なポスト（例えば、アクチュエータ）に取り付けられ、ポストの高さが望ましい照明深度を達成するために変動される、分割ミラー方式を示す。 図１２Ａ～１２Ｄは、複数の深度の照明を生成するための実施形態を示す。例えば、平坦な反射面（図１２Ａ）または頂点（図１２Ｂ）を有する反射体アレイは、交互の深度での照射パターンを生成するために使用されてもよい。図１２Ｃは、交互の深度での照射パターンを提供する、千鳥状に配置されたピンホールアレイを示す。図１２Ｄは、反射面が移動可能なポスト（例えば、アクチュエータ）に取り付けられ、ポストの高さが望ましい照明深度を達成するために変動される、分割ミラー方式を示す。 図１２Ａ～１２Ｄは、複数の深度の照明を生成するための実施形態を示す。例えば、平坦な反射面（図１２Ａ）または頂点（図１２Ｂ）を有する反射体アレイは、交互の深度での照射パターンを生成するために使用されてもよい。図１２Ｃは、交互の深度での照射パターンを提供する、千鳥状に配置されたピンホールアレイを示す。図１２Ｄは、反射面が移動可能なポスト（例えば、アクチュエータ）に取り付けられ、ポストの高さが望ましい照明深度を達成するために変動される、分割ミラー方式を示す。

多次元（例えば、二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ））の蛍光撮像は、創薬、疾患診断、および材料検査において重要な役割を果たしている。標準的な方法は、典型的には、共焦点顕微鏡法と呼ばれる、三次元で試料を撮像することを含む。共焦点顕微鏡法に基づく撮像技術は、励起光を試料の回折限界スポットに集束させ、放射された蛍光を共役像面に配置された開口（例えば、ピンホール）に通し、放射光を集める。開口は、焦点の外れた放射光を拒否し、光学切片能力を可能にする。試料または励起焦点を３Ｄで走査することによって、容積測定画像が生成される。しかしながら、こうした走査方法は低速であり、高強度のレーザー照射を用いて試料を反復走査することを必要とし、これが試料に著しい光損傷を引き起こす可能性がある。

多焦点走査型共焦点顕微鏡は、画像取得の速度を加速させるために開発された。それらは、複数の回折限界励起スポットを同時に走査して、試料全体または一次元の連続線全体にわたって励起スポットのアレイを形成する、平行化の方法を用いている。しかしながら、これらの方法もまた、一度に一つの平面を撮像するもので、すなわち、複数の焦点または線の焦点は同じ焦点面に限定される。したがって、試料の三次元容積測定ビューを生成するには、複数の画像が異なるＺ位置で撮影されなければならず、これは撮像の処理能力を制限し、試料を光損傷する可能性がある。

考察したように、ＬＳＦＭは、３Ｄ撮像のための共焦点蛍光顕微鏡法の有望な代替法として浮上してきた。光シート顕微鏡法は、点または線の代わりに光の平面で試料を照射する。ＬＳＦＭ技術は、共焦点顕微鏡法よりも高速で３Ｄ画像を取得することができる。しかし、従来のＬＳＦＭ顕微鏡では、一つは照明用の対物レンズ、もう一つは検出用の対物レンズという二つの別々の対物レンズを試料側で使用する必要がある。対物レンズは、直交する配置で位置付けられる。互いに直交関係にある二つの対物レンズの配置はかなりの量の空間を必要とする可能性があり、このため、特に空間が不足している場合、光シート顕微鏡技術では多数の試料を撮像しにくい。さらに、ＬＳＦＭは、画像取得中に生成されたテラバイト単位のデータを処理するために、難しいアライメント手順や複雑なワークフローとコンピュータストレージを必要とする。

斜面光シート顕微鏡法は、空間不足で試料が二つの対物レンズによって撮像できない用途で、従来の光シート顕微鏡法の空間制限を克服するために開発された。斜面光シート顕微鏡では、光シートは試料内に集束され、対物レンズの軸に対して傾斜角で撮像される。斜面光は、二つの対物レンズを有する従来的な光シート顕微鏡によって撮像することができない試料での蛍光ベースの顕微鏡光シート撮像の使用を可能にするが、いくつかの欠点を有する。特に、光シートは、撮像面に対して９０度で同じ対物レンズから試料に導入されなければならない。このような照明を実現するには、高い開口数（ＮＡ）を有する対物レンズを使用する必要がある。非限定的な例では、１．０より大きい開口は、高い開口数とみなされる。非限定的な実施例では、１．４より大きい開口は、高い開口数とみなされる。このような高いＮＡの対物レンズは、対物レンズの前面と試料との間に液浸油を必要とする。したがって、斜面光シート顕微鏡法の典型的な実施は限定的であり、液浸油を使用できない画像試料には典型的に適用できない。実施形態では、対物レンズは、１．０未満の開口数を含む。実施形態では、対物レンズは、０．１～１．６５の開口数を含む。実施形態では、対物レンズは、０．１～０．９５の開口数を含む。実施形態では、対物レンズは、１．０～１．６５の開口数を含む。実施形態では、対物レンズは、少なくとも０．２、０．３、０．４、または０．５の開口数を含む。実施形態では、対物レンズは、０．８、０．７、０．６、または０．５を超えない開口数を含む。実施形態では、対物レンズは、１．４、１．３、１．２、１．１、または１．０を超えない開口数を含む。

本開示のシステムおよび方法は、試料を撮像するために高ＮＡ浸漬タイプの対物レンズを必要とすることなど、斜面顕微鏡法の困難を克服し、また典型的な共焦点顕微鏡法システムに見られる低い処理能力という障害にも対処する。より高倍率の対物レンズは一般に、より浅い被写界深度を有する。例えば、約１．４の開口数を有する１００×対物レンズは、約１μｍの被写界深度を有する。本明細書に記載される装置および方法を使用して試料を観察する場合、浅い被写界深度という限界は、複数の焦点深度の画像を同時に取得して、複雑な３Ｄ構造の画像データを２Ｄ平面で効果的に提示することによって、回避することは容易である。

以前の共焦点顕微鏡法の方法論やシステムと比較して、本明細書に記載のシステムおよび方法は、試料を複数の深度で同時に撮像することによって、処理能力を著しく増大させる。斜面光シート顕微鏡法とは対照的に、開示されたシステムは、多深度の同時撮像を介して類似の処理能力を達成するだけでなく、多共焦点タイプの励起を使用することによって高ＮＡ浸漬タイプの対物レンズの必要性も排除する。共焦点励起および斜面観察のシームレスな統合は、相乗効果的な利点を提供し、適用する試料のタイプを制限することなく、高い処理能力の撮像を可能にする。

図１および図２は、照明装置または光源１０２、試料１０５、対物レンズ１１０、および画像センサー１１５（これは、アレイ検出器またはカメラとすることができる）を含む、撮像システムの概略図を示す。実施形態では、照明装置または光源は、試料に入射光を提供する放射源（すなわち、伝播された電磁エネルギーの起源または発生器）である。放射源は、紫外線（ＵＶ）範囲（約２００～３９０ｎｍ）、可視（ＶＩＳ）範囲（約３９０～７７０ｎｍ）、または赤外線（ＩＲ）範囲（約０．７７～２５ミクロン）、または電磁スペクトルの他の範囲における電磁放射を生成する照射源を含むことができる。実施形態では、照明装置または光源は、アークランプまたは石英ハロゲンランプなどのランプである。実施形態では、照明装置または光源は、可干渉光源である。

実施形態では、光源は、レーザー、ＬＥＤ（発光ダイオード）、水銀灯もしくはタングステンランプ、または超連続ダイオードである。実施形態では、光源は、２００ｎｍ～１５００ｎｍの波長を有する励起ビームを提供する。実施形態では、レーザーは、４０５ｎｍ、４７０ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、５２０ｎｍ、５３２ｎｍ、５６１ｎｍ、６３３ｎｍ、６３９ｎｍ、６４０ｎｍ、８００ｎｍ、８０８ｎｍ、９１２ｎｍ、１０２４ｎｍ、または１５００ｎｍの波長を有する励起ビームを提供する。実施形態では、レーザーは、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、または６３３ｎｍの波長を有する励起ビームを提供する。

実施形態では、照明装置または光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）である。ＬＥＤは、例えば、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、薄膜エレクトロルミネセント素子（ＴＦＥＬＤ）、または量子ドットベースの無機有機ＬＥＤとすることができる。ＬＥＤは、燐光ＯＬＥＤ（ＰＨＯＬＥＤ）を含むことができる。
実施形態では、光源は、一つ以上の励起ビームを提供する。励起ビームは、試料または試料領域に向けて伝播される電磁エネルギーを意味することが意図されている。励起ビームは、電磁波または電磁粒子の集合が一様方向に伝播されるように形成されてもよく、伝播の方向に対して直交する二次元断面は、長方形または長楕円形である。励起ビームの例示的な二次元断面は、長方形、楕円形、または長円形の形状を含むことができる。励起ビームの断面幅は、例えば、約０．０５μｍ～約１０μｍの範囲の一方または両方の寸法を有することができる。例えば、励起ビームの寸法は、少なくとも約０．０５μｍ、０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、または１０μｍでありうる。さらに、励起ビームの寸法は、例えば、最大で約０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、または１０μｍでありうる。これらの寸法は単に例示的なものであり、望ましい場合には、他の寸法を有する励起ビームを使用できることが理解される。

実施形態では、光源は、レーザー（例えば、固体レーザーまたはガスレーザーなどのレーザー）である。実施形態では、光源は、一つ以上の垂直共振器型面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）、垂直外部共振器面発光レーザー（ＶＥＣＳＥＬ）、またはダイオード励起固体（ＤＰＳＳ）レーザーを含む。実施形態では、光源は、連続波（ＣＷ）レーザーまたはパルスレーザーである。実施形態では、光源はパルスレーザーである。実施形態では、光源は超短パルスレーザーである。超短レーザーは、ピコ秒以下の時間の間、励起ビームを生成することができるレーザーである。超短レーザーは、典型的に、励起ビームのパルスを制御するためのパルスコントローラ、パルス整形器、および空間光変調器などの追加の構成要素を含む。実施形態では、超短レーザーは、フェムト秒またはピコ秒の間、励起ビームを提供する。実施形態では、光源はフェムト秒またはピコ秒のパルスレーザーである。実施形態では、レーザーは、チタンサファイアレーザー、色素レーザー、またはファイバーレーザーである。実施形態では、システムは、二つ以上の光源（例えば、レーザー）を含む。実施形態では、第一の光源は、赤色波長の光を放射するように構成され、第二の光源は、緑色波長の光を放射するように構成される。実施形態では、システムは、二つ以上のレーザーを含む。

システムはまた、一群のレンズ（例えば、コリメーティングレンズ、ビーム成形レンズ（例えば、パウエルレンズ）、および円柱レンズ）、ミラー（例えば、二色性ミラー）、ビームスプリッタ、一つ以上のピンホール開口、励起フィルター、またはそれらの組み合わせを含む、他の構成要素を含んでもよい。例えば、光源の方向、サイズ、および／または偏光は、レンズ、ミラー、および／または偏光子を使用して調整されてもよい。実施形態では、システムの構成要素のうちの一つ以上は、自動的に調整または操作されてもよい。自動制御装置は、電動式並進ステージ、作動装置、一つ以上のピエゾステージ、および／または一つ以上の自動スイッチおよびフリップ式のミラーおよびレンズを含んでもよい。実施形態では、システムは、一つ以上の光源から放射される光を望ましいパターンに成形するように構成された一つ以上の光学部品（例えば、ビーム成形レンズ）を含む。例えば、一部の実施形態では、光学部品は、光をラインパターンに成形してもよい（例えば、一つ以上のパウエルレンズ、または他のビーム整形レンズ、回折構成要素、または散乱構成要素を使用することによって）。実施形態では、光学部品は、ライン発生器を含む。本明細書で使用される「ライン発生器」は、伝播の光軸に対して垂直な平面内で回折限界の、または回析限界に近い励起ビームを、ラインの水平軸に沿って実質的に均一な強度分布で生成するように構成された光学部品を指す。例示的なライン発生器としては、限定はされないが、角度均一性、円柱マイクロレンズアレイ、回折素子、またはパウエルレンズなどの非球面屈折レンズを有する一次元ディフューザーが挙げられる。実施形態では、光学部品は、パウエルレンズ、マイクロレンズ、またはマイクロレンズアレイを含む。実施形態では、光学部品は、ガラス、金属、またはプラスチック上に製作されたマイクロレンズを含む。実施形態では、励起ビームは、一つ以上のビーム成形レンズ（複数可）を通して方向付けられてもよい。一部の実施形態では、単一のビーム成形レンズが使用されて、複数の光源（例えば、二つの光源）から出力される励起ビームを成形してもよい。一部の実施形態では、別個のビーム成形レンズが各光ビームに使用されてもよい。実施形態では、ビーム成形レンズはパウエルレンズであり、パウエルプリズムとも呼ばれる。ビームの形状は、既知の技術、例えば、ライン、円錐、超ガウシアン、リング、ドーナツ、ベッセル・ガウス、エルミート・ガウシアン、ラゲール・ガウシアン、超幾何ガウシアン、インス・ガウシアン、およびこれに類するものに従って、適切な幾可学的形状に成形されてもよい。実施形態では、ビームは、許容可能な限界内（例えば、ビーム全体にわたり３０％未満の強度変化）で均一である。実施形態では、ビームは形状が示されるか、または勾配を含む。

当然のことながら、システムの要素はそれぞれ別個の構造であることができ、または複数の素子が共通の構造に組み合わせられることもできる。試料１２０は、試料ステージ上に位置付けられることができ、画像センサー１１５は、検出ステージ上に位置付けられることができる。実施形態では、試料ステージは移動可能である（例えば、ｘｙ平面内で少なくとも移動することができる）。実施形態では、試料ステージは、電動式並進ステージである。実施形態では、試料ステージは、マイクロプレート受けおよび／またはマイクロプレートを受けて保持するように構成される。実施形態では、試料ステージは、マイクロプレート受けおよび試料を含有するマイクロプレートを受けて保持するように構成される。実施形態では、装置は、締結具、回路基板、および類似した繊細な構成要素を隠し、それらを埃および／またはヒトとの接触から保護し、見栄えをよくする、一つ以上の「ファシアプレート」またはカバーをさらに含む。例示的な実施形態では、画像センサー１１５は、一つ以上のアクティブピクセルセンサーアレイ（例えば、ＣＭＯＳアレイ、またはＣＣＤアレイ、またはそれらの組み合わせ）を含む。例示的な実施形態では、画像センサー１１５は、複数のアクティブピクセルセンサーアレイ（例えば、ＣＭＯＳアレイ、またはＣＣＤアレイ、またはそれらの組み合わせ）を含む。例示的な実施形態では、画像センサー１１５は、アクティブピクセルセンサーアレイ（例えば、ＣＭＯＳアレイ、またはＣＣＤアレイ、またはそれらの組み合わせ）である。実施形態では、画像センサーはＣＭＯＳアレイである。ＣＭＯＳカメラとも呼ばれるＣＭＯＳアレイは、典型的に、ピクセルのアレイを含む集積回路を備えた画像センサーであるアクティブピクセルセンサー（ＡＰＳ）を使用し、各ピクセルは光検出器およびアクティブな増幅器を含む。実施形態では、画像センサーは、ＰＩＮフォトダイオード、ＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳアレイ、ラインスキャナー、フォトダイオード、フォトトランジスタ、フォトマルチプライヤ、またはアバランシェフォトダイオードを含む。実施形態では、画像センサーはＣＣＤアレイである。実施形態では、画像センサーは、試料の高解像度画像を生成するための高いＳ／Ｎ比および高い共焦点性を有する共焦点時間遅延および積分（ＴＤＩ）ライン走査撮像システムを含む。実施形態では、装置は、一つ以上のセンサーアレイを含む。実施形態では、各センサーアレイは、ＴＤＩセンサーアレイである。センサーアレイは、接触した光子のエネルギーを電気的応答に変換する複数の素子を有する装置または器具を指す。「時間遅延積分」または「ＴＤＩ」という用語は、検出器アレイの素子の異なる部分集合による、試料の異なる部分の連続的な検出を指し、素子の部分集合間での電荷の伝達は、撮像される試料の見かけの動きと同期した速度で、かつ同じ方向に進行する。例えば、ＴＤＩは、フレーム移送装置が、試料の見かけの移動に整列されかつ同期された線形アレイのスタックによって試料の連続的なビデオ画像を生成するように試料を走査することによって実施されることができ、それによって、画像が一つのラインから次のラインに移動するにつれて、蓄積された電荷がそれと共に移動する。電荷の蓄積は、電荷の列が検出器の一端からシリアルレジスタに移動するのに必要な全時間の間に統合することができる。実施形態では、センサーアレイ（例えば、ＴＤＩセンサーアレイ）は、ビニングのために構成されることができる。

実施形態では、画像センサー（例えば、ＣＣＤアレイまたはＣＭＯＳアレイ）は、ビニングのために構成されることができる。ビニングは、アレイ内の複数のピクセルからの電荷を１ピクセルに合計することによって、検出器アレイの感度を高める。使用されることができるビニングの例示的なタイプは、水平ビニング、垂直ビニング、またはフルビニングを含む。水平ビニングでは、検出器アレイの各ラインの隣接するピクセルの対を合計する。垂直ビニングでは、アレイ内の２本のラインからの隣接するピクセルの対を合計する。フルビニングは、４つの隣接するピクセルが合計される、水平ビニングと垂直ビニングの組み合わせである。

システムは、走査素子をさらに含んでもよく、走査素子は、ある方向に沿って試料を走査するように構成された機械的構成要素、電気機械的構成要素、ソフトウェア構成要素、またはそれらの組み合わせであってもよく、その方向は走査方向に対応していてもよい。一実施形態では、走査方向は、試料の励起方向に対して直交する。一実施形態では、走査方向は、励起ビーム方向に対して非直交であり、直交投影された構成要素が、最終的な画像再構成に直接寄与する。「走査素子」という用語は、試料の異なる部分を順次検出することができる素子を意味することが意図される。走査素子は、例えば、対物レンズ、画像センサー、または試料の光源を含む、システムの一つ以上の構成要素の位置を変更することによって動作することができる。例示的な走査素子としては、限定されるものではないが、ビーム（例えば、励起ビーム）を試料にわたって移動させるように構成された検流計、または試料をビームにわたって移動させるように構成された並進ステージが挙げられる。

システムは、多深度共焦点撮像を達成するように構成される。これに関して、本システムは、斜面光シート顕微鏡法用の高ＮＡ浸漬タイプの対物レンズを使用する必要なく、多深度撮像を達成する。以下でさらに説明される実施形態では、システムは、少なくとも部分的に照明装置または光源１０２として機能する一組の光ファイバーを含み、光ファイバーは、試料１０５内に多深度励起パターンを導入するように構成された三次元の束のパターンで組み立てられる。光ファイバーの束は、視野のサイズを増大させるためになど、視野を修正するために、回折光学素子またはマイクロレンズアレイに組み込まれているか、またはその他の方法で結合されてもよい。別の方法として、実施形態では、システムは、図１２Ａ～１２Ｄに記載される照明構成を含む。例えば、図１２Ａは、平坦な反射面（図１２Ａに対する水平面など）を有する構造から形成される反射体アレイに光が結合される、照明構成を示す。図１２Ｂは、それぞれが頂点を形成する反射面を有する傾斜構造から形成される反射体アレイに光が結合される、照明構成を示す。図１２Ｃは、交互の深度で照射パターンを提供する、千鳥状に配置されたピンホールまたはスリットアレイを示す。図１２Ｄは、分割ミラー方式を利用する照明構成を示し、反射面は、移動可能なポスト（例えば、アクチュエータ）などの少なくとも一つの移動可能な構造に取り付けられる。ポストは、所望の照射深度を達成するために変化させることができる高さで反射面を支持する。実施形態では、圧電アクチュエータは、適切な照明構成を生成するために、ポストおよび反射面に電気機械的に結合されて、使用されることができる。

図２に示すように、光源１０２は、励起方向２１０に沿って試料へと向けられる、励起ビーム２０５（例えば、レーザーまたはＬＥＤ照明ビームなど）の複数のラインを生成する。励起ビーム２０５は、対物レンズ１１０（図１）を通して試料１０５内に集束され、集束励起ビームがそれを通過するように、二色性ミラーと試料１０５との間に挟まれてもよい。システムは、励起ビーム２０５を試料１０５の様々な異なる焦点深度（Ｚ軸に対してなど）で集束させるように構成される。実施形態では、焦点深度は１μｍ～２０μｍである。対物レンズ１１０は、試料１０５からの結果の放射（例えば、励起放射）を収集し、放射を画像センサー１１５上に集束させる。実施形態では、対物レンズは顕微鏡対物レンズである。本発明に有用な例示的なテレセントリック対物レンズには、米国特許第５，８４７，４００号に記載のあるものが含まれ、これは参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、対物レンズは空気対物レンズである。実施形態では、対物レンズは液浸対物レンズである。実施形態では、対物レンズは、大きな開口数（ＮＡ）（例えば、０．９５～１．５の範囲のＮＡ）を有し、空気浸漬または液体浸漬（例えば、水、油、または他の浸漬流体）を介して撮像を行う。

意図される用途（すなわち、撮像されることが望まれる物体）に応じて、焦点距離および倍率は、望ましい標的に適合するように変更されることができる。対物レンズの倍率は、チューブレンズの焦点距離と対物レンズの焦点距離の比率であるため、チューブレンズの焦点距離を増減させると対物レンズの倍率は変化する。例えば、チューブレンズの焦点距離を１６０ｍｍに一定に保ち、対物レンズの焦点距離を１．６ｍｍから５０ｍｍに変えると、結果的にそれぞれ１００Ｘから３．２Ｘに等しい物体の倍率になる。実施形態では、対物レンズは、２ｍｍ～２５ｍｍの範囲の焦点距離を有してもよい。実施形態では、対物レンズは、１ｍｍ～５０ｍｍの焦点距離を有してもよい。実施形態では、対物レンズは、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５ｍｍの焦点距離を有してもよい。実施形態では、対物レンズは、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、または１．６ｍｍの焦点距離を有してもよい。実施形態では、対物レンズは、１．６ｍｍの焦点距離を有してもよい。

励起焦点は試料の異なる深度にあるため、それらの結果的かつ対応する焦点は、試料の焦点深度に対応する画像センサー上の異なる高さまたは位置にある。これは、図１１の左に提示された画像に図示されている。実施形態では、焦点深度は、０．０（すなわち、試料の表面上）、－０．５、－１．０、－１．５、および－２．０μｍであり、ここで負符号は、表面からの長さを示す。実施形態では、焦点深度は、間隔の深度で分離されている。実施形態では、間隔の深度（例えば、デルタｚ）は、表面に対して０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、または２．０μｍである。例えば、撮像システムが、５つの束（例えば、３３０ａ、３３０ｂ、３３０ｃ、３３０ｄ、および３３０ｅ）に対して１．０μｍの間隔深度を有する場合、撮像される総深度は、試料の表面に対して５．０μｍである。

試料は、検出されることが意図される物体または位置を指す。実施形態では、試料は、撮像のための標的である複数の別個の特徴を含む。一部の実施形態では、試料は、標的核酸が標的特徴として付着されている、ビーズまたはウェルなどの表面を有する非平面構造を含む。実施形態では、試料は、試料ホルダーによって保持される。試料ホルダーは、マルチウェルプレートであることができる。一部の実例では、マルチウェルプレートは、１６個、２４個、４８個、９６個、３８４個またはそれを超える試料ウェルを有する。これらの例の一部では、光源のアレイ、例えば、ＬＥＤは、１６個、２４個、４８個、９６個、３８４個またはそれを超える対応する光源を有する。一部の実例では、マルチウェルプレートは、生物学的分析のための標準的なマイクロウェルプレートである。 実施形態では、試料ホルダーは、少なくとも内部的に、フッ素化ポリマーまたはＢＳＡなどの生物学的材料が試料ホルダーに付着することを防止するための材料で被覆される。実施形態では、試料は、配列決定されたものでありうるゲノム材料を含む。実施形態では、試料は、標識ヌクレオチド、例えば、異なる光の波長に対応する異なる標識を含有するヌクレオチドを含む。標識は、例えば、蛍光標識、化学発光標識または生物発光標識であってもよい。例えば、遺伝子配列決定（またはＤＮＡ配列決定）では、実施形態は、核酸ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡの鎖）内のヌクレオチド塩基の正確な順序を決定するために使用されてもよい。ヌクレオチド塩基は、特異的蛍光標識（例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはチミン（Ｔ））で標識化されてもよい。あるいは、例えば、一つの色、二つの色、または三つの色での配列決定方法が使用されてもよい。蛍光に関しては、ヌクレオチド塩基の各々は、核酸を励起光で連続的に励起することによって順番に決定されてもよい。核酸は、本明細書に記載されるように、励起光を吸収して、画像センサー上に異なる波長の放射光を透過してもよい。画像センサーは、放射光の波長およびフォトダイオードによって受信される強度を測定してもよい。各ヌクレオチド（例えば、蛍光標識ヌクレオチド）は、特定の波長および／または強度の励起光によって励起されると、特定の波長の光および／または強度を画像センサーに放射してもよく、核酸内の特定の位置での特定のヌクレオチド塩基の存在の同定を可能にする。その特定のヌクレオチド塩基が決定されると、それは核酸から除去されてもよく、その結果、連続的に次のヌクレオチド塩基が類似のプロセスに従って決定されてもよい。

実施形態では、試料は基質を含む。実施形態では、試料はフローセルを含む。実施形態では、フローセルは、半透明カバープレート、基質、およびその間に挟まれた液体を含み、生物学的試料は、半透明カバープレートの内側面または基質の内側面に位置してもよい。例えば、カバーガラスは、約１００μｍ～約５００μｍの厚さであってもよく、液体層は、約５０μｍ～約１５０μｍの厚さであってもよく、基質は、約０．５μｍ～約１．５μｍの厚さであってもよい。実施形態では、試料はゲルを含む。この文脈での「ゲル」という用語は、液体およびガスに対して透過性である半硬質固体を指す。例示的なゲルとしては、限定されないが、アガロースなどのコロイド構造を有するもの、ゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、またはポリアクリルアミドまたはその誘導体などの架橋ポリマー構造が挙げられる。ポリヌクレオチドなどの分析物は、共有結合または非共有結合の手段を介してゲルまたはポリマー材料に付着することができる。核酸をゲルに付着させるための例示的な方法および反応物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号に記載される。分析物、試料、組織、または細胞は、核酸を含むことができ、核酸は、３’酸素、５’酸素を介して、または３’末端ヌクレオチドの塩基部分、５’ヌクレオチドの塩基部分、および／または分子中の他の場所の一つ以上の塩基部分を介してなど、それらの長さに沿った他の場所で、ゲルまたはポリマーに付着することができる。実施形態では、試料は、ポリマー層（代替的にポリマーコーティングとも呼ばれる）を含む。

例えば、生物学的試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または配列決定されうる別のゲノム材料を含んでもよい。本明細書で使用される「固体支持体」および「基質」および「基質表面」および「固体表面」という用語は、複数の官能基が付着されうる、離散的な固体表面または半固体表面を指す。固体支持体は、プラスチック、セラミック、金属、または高分子材料（例えば、ハイドロゲル）からなる任意のタイプの固体、多孔質、または中空の球、ボール、円筒、またはその他の類似の構成を包含してもよく、その上に核酸などの生物学的材料が（例えば、共有結合的または非共有結合的に）固定されてもよい。固体支持体は、球状（例えば、ミクロスフェア）であるか、または立方体、直方体、錐体、円筒形、円錐形、長楕円形、もしくは円盤形などの非球状または不規則な形状を有しうる、離散粒子を含んでもよい。ビーズは、非球状の形状を有することができる。固体支持体は、「ビーズ」という用語と互換的に使用されてもよい。固体支持体は、プライマーが付着する表面上にポリマーまたはハイドロゲルをさらに含みうる。例示的な固体支持体としては、限定されないが、ガラスおよび変性ガラスもしくは機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）、環状オレフィン共重合体、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミックス、樹脂、Ｚｅｏｎｏｒ、ケイ素および変性ケイ素を含むシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバー束、光パターン化可能なドライフィルムレジスト、ＵＶ硬化型の接着剤およびポリマーを含む。固体支持体またはその領域は、実質的に平坦であることができる。固体支持体は、ウェル、ピット、チャネル、隆線、隆起部、ペグ、ポストなどの表面特徴を有することができる。固体支持体という用語は、それに共有結合した複数の官能基を含む表面を有する基質を包含し、官能基は試料を固定するために選択される。実施形態では、試料は、基質を含み、基質は、例えば、ガラス表面、プラスチック表面、ラテックス、デキストラン、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリレート共重合体、ポリアクリルアミド共重合体、金表面、およびシリコンウエハなど、核酸が付着されることが可能な任意の不活性の基質またはマトリクスを含むことができる。

実施形態では、試料はアレイ（例えば、マイクロアレイ）である。典型的なマイクロアレイには、部位（時には特徴と呼ばれる）が含まれ、各々が標的の集団を有する。アレイの部位または特徴は、典型的には離散的であり、互いの間の空間で分離されている。特徴のサイズおよび特徴間の間隔は、アレイが高密度、中密度または低密度でありうるように、変更することができる。高密度アレイは、約１５μｍ未満で分離された部位を有することを特徴とする。中密度アレイは、約１５～３０μｍで部位が分離されているのに対し、低密度アレイは、３０μｍを超えて部位が分離されている。実施形態では、試料は、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、または０．５μｍ未満で分離される特徴を含むアレイである。他の例示的な試料としては、限定はされないが、生物学的標本（例えば、核酸、タンパク質、細胞、ウイルス、または組織）、ナノ粒子、または電子チップ（例えば、マイクロプロセッサチップ）が挙げられる。実施形態では、試料は、表面を含む基質を含むマイクロプレートアレイを含み、表面は、表面上の間質領域によって互いに分離された複数のウェルを含み、一つ以上のウェルは、試料（例えば、細胞または組織試料）、粒子、または核酸を含む。実施形態では、試料は細胞を含む。実施形態では、試料は粒子を含む。実施形態では、試料は核酸を含む。実施形態では、試料は組織試料である。実施形態では、試料は細胞を含む。実施形態では、表面はオリゴヌクレオチドを実質的に含まない。実施形態では、マイクロプレートアレイは、２個、４個、６個、１２個、２４個、４８個、９６個、３８４個、または１５３６個のウェルを含む。実施形態では、マイクロプレートアレイは、２４個、４８個、９６個、または３８４個のウェルを含む。実施形態では、マイクロプレートアレイは２４個のウェルを含む。実施形態では、マイクロプレートアレイは４８個のウェルを含む。実施形態では、マイクロプレートアレイは９６個のウェルを含む。実施形態では、マイクロプレートアレイは３８４個のウェルを含む。実施形態では、マイクロプレートの寸法は、アメリカ規格協会（ＡＮＳＩ）および検査室自動化およびスクリーニング協会（ＳＬＡＳ）によって提供される基準に適合する。例えば、公差および寸法は、ＡＮＳＩ ＳＬＡＳ １－２００４（Ｒ２０１２）、ＡＮＳＩ ＳＬＡＳ ２－２００４（Ｒ２０１２）、ＡＮＳＩ ＳＬＡＳ ３－２００４（Ｒ２０１２）、ＡＮＳＩ ＳＬＡＳ ４－２００４（Ｒ２０１２）、およびＡＮＳＩ ＳＬＡＳ ６－２０１２に記載がある。実施形態では、マイクロプレートは、幅８５．４ｍｍ±０．５ｍｍ、長さ１２７．７ｍｍ±０．５ｍｍの長方形形状を有し、６個、１２個、２４個、４８個、または９６個のウェルを含む。実施形態では、マイクロプレートは、幅８５．４ｍｍ±０．５ｍｍ、長さ１２７．７ｍｍ±０．５ｍｍの長方形形状を有し、６個、１２個、２４個、４８個、または９６個のウェルを含み、各ウェルの平均直径は約５～７ｍｍである。実施形態では、マイクロプレートは、幅８５．４ｍｍ±０．５ｍｍ、長さ１２７．７ｍｍ±０．５ｍｍの長方形形状を有し、６個、１２個、２４個、４８個、または９６個のウェルを含み、各ウェルの平均直径は約６ｍｍである。

実施形態では、試料は標識を含む。標識部分は、例えば、分光法を使用して、試料を検出することを可能にする任意の部分であることができる。例示的な標識部分は、蛍光標識、質量標識、化学発光標識、電気化学標識、検出可能な標識などである。本明細書で使用される「標識」という用語は、直接的または間接的に、それ自体または別の分子との相互作用のいずれかによって、検出可能なシグナルを生成または結果として生じることが可能な分子を一般的に指す。検出可能な標識の非限定的な例としては、蛍光染料、ビオチン、ジゴキシン、ハプテン、およびエピトープを含む標識が挙げられる。一般に、染料は、比色信号、発光信号、生物発光信号、化学発光信号、燐光信号、または蛍光信号などの光学的に検出可能な信号を提供することができる分子、化合物、または物質である。実施形態では、染料は蛍光染料である。染料の非限定的な例には、ＣＦ染料（Ｂｉｏｔｉｕｍ， Ｉｎｃ．）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｙ染料（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＲＤｙｅｓ（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）、およびＨｉＬｙｔｅ染料（Ａｎａｓｐｅｃ， Ｉｎｃ．）を含み、その一部は市販されている。実施形態では、標識は発蛍光団である。検出可能な薬剤（すなわち、標識）の例としては、蛍光および発光性の物質、分子、または組成物を含む造影剤が含まれ、限定はされないが、一般に「染料」、「標識」、または「指標」と呼称される様々な有機または無機の小分子が挙げられる。例としては、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン染料、Ａｌｅｘａ染料、およびシアニン染料が挙げられる。実施形態では、検出可能な部分は、蛍光分子（例えば、アクリジン染料、シアニン染料、フッ素染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、またはローダミン染料）である。実施形態では、検出可能な部分は、蛍光分子（例えば、アクリジン染料、シアニン染料、フッ素染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、またはローダミン染料）である。

実施形態では、試料は標識を含まない。実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムは、試料からの散乱光を検出する。実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムは、試料からの回折光を検出する。実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムは、試料からの反射光を検出する。実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムは、試料からの吸収光を検出する。実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムは、試料からの屈折光を検出する。実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムは、試料によって吸収されない透過光を検出する。実施形態では、装置は、細胞形態（例えば、細胞境界、粒度、または細胞形状）を決定するように構成される。例えば、細胞境界を決定することは、画像のピクセル値を単一の強度閾値と比較することを含み、これは、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７， Ｒ１００（２００６）およびＡｒｃｅ，Ｓ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ３， ２２６６（２０１３）に記載されるヒストグラムベースのアプローチを使用して迅速に決定されてもよい。

実施形態では、画像センサー１１５の少なくとも一部分は、対物レンズ１１０の光軸に対して傾斜して、または斜め向きに位置付けられ、画像センサー上の励起焦点の高さの差を補償する。すなわち、画像センサーは、対物レンズ１１０の光軸に対して斜めに位置付け、配置、または配向される。実施形態では、傾斜角（すなわち、対物レンズ１１０の光軸に対するセンサー１１５間の角度）は、０°～９０°である。実施形態では、傾斜角は１０°～８０°である。実施形態では、傾斜角は１５°～６５°である。実施形態では、傾斜角は２５°～４５°である。実施形態では、傾斜角は５°～２０°である。実施形態では、傾斜角は５°～１５°である。実施形態では、傾斜角は約５°、６°、７°、８°、９°、１０°、１１°、１２°、１３°、１４°、１５°、１６°、１７°、１８°、１９°、または約２０°である。画像センサーの配向、またはその態様は、励起ビームの異なるＺ軸焦点深度に対応して選択される。画像センサー（すなわち、カメラ）の傾き角は、コリメーションレンズおよび／またはタブレンズの焦点距離に依存する。実施形態では、画像センサー（すなわち、カメラ）の傾き角は、コリメーションレンズおよびタブレンズの焦点距離に依存する。

画像センサーは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイ、フォトダイオードのアレイ、アバランシェフォトダイオードのアレイ、光電子増倍管（ＰＭＴ）のアレイ、または光ファイバーのアレイであってもよく、またはこれらを含んでもよい。実施形態では、画像センサーは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイおよび電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイのうちの少なくとも一つである。一実施形態では、画像センサーはカメラである。一実施形態では、画像センサーは複数のカメラである。一実施形態では、画像センサーは四つのカメラである。一実施形態では、画像センサーは二つのカメラである。一実施形態では、画像センサーは単一のカメラである。実施形態では、画像センサーは光ファイバーのアレイである。実施形態では、画像センサーは、ライトフィールドカメラ（すなわち、プレノプティックカメラ）であり、例えば、米国特許出願第２０１５／００２９３８６号（米国特許出願第１４／４５６，１３２号）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のあるライトフィールドカメラである。実施形態では、画像システムは画像センサーを含む。実施形態では、画像センサーはＣＭＯＳアレイである。ＣＭＯＳカメラとも呼ばれるＣＭＯＳアレイは、典型的に、ピクセルのアレイを含む集積回路を備えた画像センサーであるアクティブピクセルセンサー（ＡＰＳ）を使用し、各ピクセルは光検出器およびアクティブな増幅器を含む。実施形態では、画像センサーは、ＰＩＮフォトダイオード、ＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳアレイ、ラインスキャナー、フォトダイオード、フォトトランジスタ、フォトマルチプライヤ、またはアバランシェフォトダイオードを含む。実施形態では、画像センサーはＣＣＤアレイである。実施形態では、画像センサーは、試料の高解像度画像を生成するための高いＳ／Ｎ比および高い共焦点性を有する共焦点時間遅延および積分（ＴＤＩ）ライン走査撮像システムを含む。画像センサーは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイ、フォトダイオードのアレイ、アバランシェフォトダイオードのアレイ、光電子増倍管（ＰＭＴ）のアレイ、または光ファイバーのアレイであってもよく、またはこれらを含んでもよい。実施形態では、画像センサーは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイおよび電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイのうちの少なくとも一つである。一実施形態では、画像センサーはカメラである。一実施形態では、画像センサーは複数のカメラである。一実施形態では、画像センサーは四つのカメラである。一実施形態では、画像センサーは二つのカメラである。一実施形態では、画像センサーは単一のカメラである。実施形態では、画像センサーは光ファイバーのアレイである。

焦点の外れたバックグラウンドを拒絶するために、画像センサーは、画像センサー上の焦点の回折限界スポットサイズに対応するピクセルの一部分のみが光子に対して感受性があり、共焦点検出を達成するように、設定、位置決め、または配向される。そうすることで、システムは同時に、様々な深度で複数の放射（例えば、ライン）を撮像する。

一実施形態では、システムは、励起方向２１０に直交する走査方向など、単一の方向（すなわち、その軸に沿った前方および後方の動きを含む単一の軸）で、またはそれらに沿って試料１０５を走査して、試料１０５の３Ｄ容積測定画像を生成する。試料１０５の走査は、画像センサーに同期化されることができる。システムは、多深度焦点にわたって試料１０５を走査する際、画像センサーは、異なる深度で試料の複数の画像を同時に記録または生成し、それによって試料１０５の３Ｄ容積測定画像を生成する。システムは、アレイ検出器に結合されたエアリービームを利用して、走査方向と共通方向または同一方向の回折限界を超える画像の超解像度を達成するように構成されることができる。「結合」という用語は、直接的または間接的な結合、接続、締結、接触または連結を指し、物理的、光学的、電気的、流体的、機械的、化学的、磁気的、電磁的、通信的または他の結合、または前述の組み合わせなどの様々な形態の結合を指しうる。一つの形態の結合が指定される場合、これは、他の形態の結合が除外されることを意味しない。例えば、別の構成要素に物理的に連結された一つの構成要素は、（直接的または間接的に）二つの構成要素の物理的取り付けまたは接触を参照しうるが、例えば、通信リンク（例えば、ＲＦリンクまたは光リンク）など、構成要素間の他の形態の結合も、通信的に二つの構成要素を結合することを排除しない。

上述のように、システムの一実施形態は、試料１０５内に多深度励起パターンを導入するように構成された三次元の束のパターンで組み立てられた光ファイバーを含む。図３は、試料に対して多深度の照明を生成する３Ｄパターンの光ファイバー照明装置を用いるシステムの概略図を示す。図３の例示的な実施形態では、システムは、異なる励起波長を有する一つ以上のレーザー（レーザー３０５およびレーザー３１０を含む）を含む。システムはまた、対応するレーザー発生装置を含むことができる。図３は、二つのレーザー３０５、３１０を示すが、数量は変化させることができる。非限定的な例では、一つのレーザーは５３２ｎｍの励起波長を有し、別のレーザーは６４０ｎｍの励起波長を有するが、励起波長は変化させることができる。システムはさらに、各レーザーについてそれぞれのスプリッタ３１５（例えば、ビームスプリッタ）を含み、これは、レーザーの光を、各レーザー３０５および３１０それぞれに対応する複数の光ファイバー３２０および３２２に分割する。図３は、各スプリッタ３１５が１対５のスプリッタである実施形態を示すが、スプリッタは、様々な量の光ファイバーに分割するように構成されることができる。本明細書で使用される「ビームスプリッタ」という用語は、当技術分野での通常の意味に従い使用され、励起ビームの第一の部分を通過し、ビームの第二の部分を反射する光学素子を指す。例えば、ビームスプリッタは、第一の波長範囲のビームを選択的に通過し、第二の異なる波長範囲のビームを反射するように構成されることができる。蛍光検出に使用される場合、ビームスプリッタは、典型的には、短めの波長の励起ビームを反射し、長めの波長の放射ビームを透過する。

なおも図３を参照すると、ファイバー３２０は、ファイバー３２０の焦点端は試料に対してＺ軸にオフセット（すなわち、図１１のデルタｚ深度として表示されているもの）された１Ｄパターンで配置され、これは焦点端に対して位置付けられる。各レーザーに対応するファイバーは分離され、別個の束３３０にグループ化され、各束は、それぞれのレーザーからの少なくとも一つのファイバーを含む。各束３３０について、その束内のファイバーは、Ｚ軸に沿って共通の焦点端を有する。図示した実施形態は、５つの束（すなわち、５つのセット）である３３０ａ、３３０ｂ、３３０ｃ、３３０ｄ、および３３０ｅを含み、各束３３０は、レーザー３０５からの少なくとも一つのファイバー３２０と、レーザー３１０からの少なくとも一つのファイバー３２２とを含む。例えば、束３３０ａは、レーザー３０５からのファイバー３２０ａを含み、レーザー３１０からのファイバー３２２ａをさらに含む。束３３０ａのファイバー３２０ａおよび３２２ａの焦点端は、試料に対して共通のＺ軸位置を有する。実施形態では、ファイバー束は、シングルモード、マルチモード、またはそれらの組み合わせ（すなわち、シングルモードとマルチモードのファイバーの組み合わせ）を含む。実施形態では、束内のファイバーの数は１～５００本でありうる。典型的には、ファイバーの数を増やすと、照明の均質性が増大し、したがって、撮像システムの視野の増加をもたらす。

各束３３０は、別の束３３０からＺ軸に沿ってオフセットされる焦点端を有する。したがって、各束３３０は、別の束に対するＺ軸に沿って、試料中の異なる焦点を達成する。例えば、束３３０ａ内のファイバーの焦点端は、束３３０ｂ内のファイバーの焦点端からＺ軸オフセット距離３３５だけオフセットされる。非限定的な実施例では、Ｚ軸オフセット距離３３５は、約６００μｍである。オフセット距離３３５は、すべての束３３０にわたって同じであることができるか、または、束間で変化することもできる。すなわち、Ｚ軸オフセット距離は、必ずしも一つの束と別の束との間で一様ではなく、むしろ、すべての束の焦点端を結ぶラインが必ずしも直線的ではないように変化することができる。すべての束の焦点端を結ぶこうしたラインも、直線的または曲線的であることができる。

ファイバーのＺ軸へのオフセットによって、異なる焦点面間の距離が決定される。最適なオフセット距離は、典型的に、光学系の倍率に依存する。非限定的な例では、撮像システムの軸方向分解能が１．５μｍであり、その軸方向倍率が２０である場合、ファイバーのオフセットは１．５×２０×２０＝６００μｍである。こうした配置により、異なるファイバーが、試料内に正確に撮像システムの軸方向分解能限界によって分離された焦点を生成することが可能になる。対象平面が予め決定されている実施形態では、ファイバーのオフセットは、照明がそれらの所定の平面と重なり合うことを可能にするように、それに応じて調整されてもよい。本明細書で使用される「倍率」という用語は、当技術分野での通常の意味に従って使用され、物体のサイズと物体の画像のサイズとの比率を指す。

なおも図３を参照すると、共通束３３０内に位置するファイバー３２０、３２２は、ｚ軸に対して垂直なＸ軸に沿ったオフセット距離３４０だけ互いにオフセットされることができる。「ｚ軸」および「ｚ方向」という用語は、概して、顕微鏡法および撮像システムの技術におけるその使用と一貫して使用されることが意図され、ここで、ｚ軸は焦点軸を指す。したがって、ｚ軸並進運動は、焦点軸の長さを増減させる。ｚ軸並進運動は、例えば、（例えば、試料ステージもしくは光学素子またはその両方を移動することによって）光学ステージに対して試料ステージを移動させることによって実施することができる。非限定的な実施例では、オフセット距離３４０は約４００μｍである。さらに、隣接する第二の束３３０に対する第一の束３３０から、ｘ軸に沿ったオフセット距離３４５が存在することができる。例えば、束３３０ｄと束３３０ｅとの間のオフセット距離３４５は、非限定的な例では、約８００μｍとすることができる。図３に示す配置は、各束３３０のファイバーの出力を別の束に対してＺ軸にオフセットし、ファイバーの出力は、複数深度の撮像を達成するために、各束に対して異なる深度で、対物レンズを通して試料内に集束される。

図４Ａおよび４Ｂは、コンピュータシミュレーション（ＺＥＭＡＸ製のＯＰＴＩＣＳＴＵＤＩＯソフトウェアの使用など）によって視覚化された多深度焦点生成の原理を示す。近軸シミュレーションが、本明細書に記載されるシステムによって達成される原理を説明するための基礎として使用される。図４Ａは、例示的なファイバー束３３０に対する光学的レイアウトのＹ－Ｚ平面図を示す。ファイバー束（図３に描写した束など）は、コリメーションレンズ４０５の焦点面に配置され、これが３Ｄパターン化されたファイバーの出力をほぼコリメートされたビームに変換し、その後、円柱レンズ４１０および対物レンズ４２０を通過する。図４ｂは、対物レンズの後焦点面における円柱レンズ焦点の一次元での表現を示す。結果として、複数の焦点のラインが試料内に生成される。図４Ａの挿入画は、ファイバーが軸方向（Ｚ軸など）にオフセットされていることを示す。対応して、それらの焦点は、試料内で軸方向にもオフセットされる。図４Ｂは、Ｘ－Ｚ平面における光学的レイアウトの図を示す。励起ビームは、励起線に対応して、Ｘ－Ｚ平面内で試料中に広がる。具体的には、５つのシングルモデル光ファイバー（図４Ａの挿入画）を有するファイバー束（３３０）は、焦点距離が１５０ｍｍである近軸レンズの焦点面（４０５）に配置される。ファイバー束内のファイバーは、横方向に８００μｍ、軸方向に６００μｍだけ分離される。光の波長は５２０ｎｍである。近軸レンズ（４０５）は、ファイバー束からの光をコリメートされたビームに変換する。ＸＺ平面内の焦点レンズが７５ｍｍである近軸円柱レンズ（４１０）は、次に光を近軸レンズ（４２０）の焦点面の複数のラインに集束させる。近軸レンズ（４２０）の焦点距離は１０ｍｍである。次いで、近軸レンズ（４２０）は、物体空間（図４Ａの挿入画）内で、複数の回折限界ライン焦点を生成する。ライン焦点は、軸方向に１．５μｍだけオフセットされる。

図５Ａおよび５Ｂは、市販の光学素子を使用した例示的な光学シミュレーションを示す。３Ｄパターン化されたファイバー束を、色消しレンズの焦点（例えば、ｆ＝６０ｍｍ）に配置する。次いで、色消し円柱レンズ（ｆ＝１００ｍｍ）は、対物レンズの後焦点面（ＮＡ＝０．８）に光を集束させる。多深度ライン焦点が、試料内に生成される。

図６は、ファイバー束および多深度焦点を示す試料の拡大図を示す。図７Ａ～７Ｂは、試料中の生成された線パターンのシミュレーションを示す。シミュレーションは、回折限界焦点を確認し、これが共焦点３Ｄ撮像を提供することを示す。

図８は、ファイバー束内のファイバーの軸方向配置と、撮像システムの倍率Ｍとの関係を示す。ファイバー束の軸方向オフセットは、複数の焦点の望ましい軸方向オフセットのＭ^２である。図８は、３つの異なる倍率、１０Ｘ、１５Ｘ、および２０Ｘの例を示す。ファイバーの軸方向オフセット計算値が、複数の焦点面の望ましいオフセットに対してプロットされる。さらに、上記の計算は、試料中の屈折率を１（例えば、空気）とみなすことに留意することが重要である。試料の屈折率ｎが１と異なる場合（例えば、水のｎは１．３３、グリセロールのｎは１．４７、液浸油のｎは１．５１）、ファイバーの軸方向オフセットは、比例関係から係数ｎを乗じるべきである。

図９は、２μｍ、６μｍ、１０μｍ、および１６μｍの一連の固定焦点面において、ファイバーの軸方向オフセットが倍率係数の二乗（すなわちＭ^２）にどのように依存するかをさらに図示する。複数深度の照明は、多色撮像のためにさらに拡張されうる。図１０は、多色撮像の原理を示す。物体平面における各レーザーの励起は、複数の異なる発蛍光団からの蛍光シグナルの広帯域を励起する。例えば、５２０ｎｍレーザーは、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５６１、Ｃｙ３、およびＡｔｔｏ５５５を励起しうる。６４０ｎｍレーザーは、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６４０、Ａｌｅｘａ７５０、Ａｔｔｏ６４０、およびＡｔｔｏ６４０ｎを励起しうる。異なる発蛍光団からの蛍光を二色性光学素子によってさらに分離し、カメラ上の空間的に分離されたラインに投影しうる。焦点の外れた蛍光シグナルからバックグラウンドをさらに抑制するために、複数の縞パターンを有する光学フィルターをカメラの前に配置して、選択された蛍光ラインのみを通過させ、不要なものを拒否してもよい。光学フィルターは、当技術分野でのその通常の意味に従って使用され、特定の波長、偏光、または周波数を有する光の通過を選択的に通過または拒絶する装置を指す。この用語は、誘電体材料の複数の層が、様々な層からの反射の間の干渉が建設的であるかまたは破壊的であるかに応じて光を透過または反射する、干渉フィルターを含むことができる。干渉フィルターは、当技術分野では、二色フィルター、または誘電体フィルターとも呼ばれる。用語は、吸収によって選択的な波長または波長範囲を有する光の通過を防止する吸収フィルターを含むことができる。吸収フィルターには、例えば、着色ガラスまたは有色液体が含まれる。フィルターは、例えば、バンドパス、ショートパス、およびロングパスを含む、一つ以上の特定のフィルター透過特性を有することができる。バンドパスフィルターは、最大放射光透過の中心波長（Ｔ_ｍａｘ）および帯域幅によって画定される波長範囲の光を選択的に通過させ、この範囲外の光の通過を遮断する。Ｔ_ｍａｘは、中心波長で透過される放射光の割合を画定する。帯域幅は、典型的には、Ｔ_ｍａｘの半分の透過値でフィルターによって通過させられる波長の範囲である、半値全幅（ＦＷＨＭ）として記述される。バンドパスフィルターは、１０ナノメートル（ｎｍ）、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、または５０ｎｍのＦＷＨＭを有することができる。ロングパスフィルターは、Ｔ_ｍａｘおよびカットオン波長によって画定される高めの波長の光を選択的に通過させる。カットオン波長は、光透過率がＴ_ｍａｘの半分である波長であり、波長がカットオン波長より高く増加すると、透過率は増加し、波長がカットオン波長より低く減少すると透過率は減少する。ショートパスフィルターは、Ｔ_ｍａｘおよびカットオフ波長によって画定される低めの波長の放射光を選択的に通過させる。カットオフ波長は、光透過率がＴ_ｍａｘの半分である波長であり、波長がカットオフ波長より大きくなると、透過率は減少し、波長がカットオフ波長より小さくなると、透過率は増加する。フィルターは、５０～１００％、６０～９０％、または７０～８０％のＴ_ｍａｘを有することができる。

実施形態では、システムは精密取付板を含む。精密取付板は、取付ピン、溝、スロット、グロメット、タブ、磁石、データム表面、ツーリングボールのほか、サブアセンブリまたは対象モジュールを受け入れるように設計された他の表面などのアライメント表面で作製されてもよい。

一態様では、遺伝子（例えば、核酸）配列決定システムが提供され、遺伝子配列決定システムは、本明細書に記載される撮像システム（例えば、多深度共焦点撮像システム）を含む。遺伝子配列決定システムは、励起ビームを利用して、ＤＮＡ含有試料中の標識ヌクレオチドを励起し、ＤＮＡ内に存在する塩基対の分析を可能にする。高速配列決定では、ＤＮＡ発蛍光団に励起ビームを送達するために、高速走査を採用し、画像センサーによって検出されるＤＮＡ試料からの反応性光子の十分な放射を刺激する。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術の多くは、合成による配列決定（ＳＢＳ）の形態を使用し、ここで、修飾ヌクレオチドが酵素と共に使用され、制御された様式でＤＮＡテンプレートの配列を読み取る。実施形態では、配列決定は、合成による配列決定プロセスを含み、個々のヌクレオチドは、重合されて成長する相補鎖を形成するため、反復的に識別される。実施形態では、成長する相補鎖に付加されるヌクレオチドは、標識と、さらなる伸長を防止する可逆的鎖ターミネーターとの両方を含み、その結果、ヌクレオチドは、ターミネーターを除去してさらなるヌクレオチドを付加および同定する前に、標識によって識別されてもよい。こうした可逆的鎖ターミネーターは、例えば、米国特許第７，５４１，４４４号および第７，０５７，０２６号に記載されている、着脱可能な３’保護基を含む。こうした修飾ヌクレオチドが、配列決定されたテンプレート領域に対して相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に組み込まれると、さらなる配列伸長を誘導するために利用可能な遊離３’－ＯＨ基はなく、したがってポリメラーゼはさらなるヌクレオチドを付加することができない。成長中の鎖に組み込まれた塩基の同一性が決定されると、３’可逆的ターミネーターを除去して、連続的に次のヌクレオチドの付加が可能にされてもよい。実施形態では、遺伝子配列決定システムは、４つの異なる標識を含む４つの異なるヌクレオチドの検出を利用する。

実施形態では、遺伝子配列決定システムは、４つより少ない異なる標識を含む４つの異なるヌクレオチドの検出を利用する。第一の例として、一対のヌクレオチドタイプは、同じ波長で検出されることができるが、強度などのシグナル状態の違いに基づいて、対の一方のメンバーに対して他方と比較して区別されてもよく、または対の他方のメンバーに対して検出されたシグナルと比較して、見かけのシグナルを出現させるかまたは消失させる、対の一方のメンバーに対する変化（例えば、化学修飾、光化学修飾、もしくは物理的修飾を介して）に基づいて区別されてもよい。第二の例として、四つの異なるヌクレオチドタイプのうちの三つは、特定の条件下で検出することができ、一方で第四のヌクレオチドタイプは、それらの条件下で検出可能な標識を欠いているか、またはそれらの条件下で最小限に検出される。最初の三つのヌクレオチドタイプの核酸への組み込みは、それぞれのシグナルの存在に基づいて決定されることができ、第四のヌクレオチドタイプの核酸への組み込みは、任意のシグナルの非存在または最小の検出に基づいて決定されることができる。第三の例として、一つのヌクレオチドタイプは、二つの異なるチャネルで検出される標識を含むことができ、一方で他のヌクレオチドタイプは、一つを超えないチャネルで検出される。

一態様では、細胞撮像システムが提供され、細胞撮像システムは、本明細書に記載される撮像システム（例えば、多深度共焦点撮像システム）を含む。細胞撮像システムは、励起ビームを利用して、細胞（例えば、対象組織からの試料、または生検、血液試料、もしくは細胞培養からの試料）を含む試料からの放射（例えば、回折光、反射光、屈折光）を検出する。細胞を含む試料の非限定的な例としては、血液または血液製剤（例えば、血清、血漿、血小板、バフィーコート、等）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、肺、胃、腹膜、管、耳、関節鏡検査）、生検試料、セロセンテシス試料、細胞（血液細胞、リンパ球、胎盤細胞、幹細胞、骨髄由来細胞、胚細胞または胎児細胞）、またはその一部（例えば、ミトコンドリア、核、抽出物、等）、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、乳房液、同類またはその組み合わせを含むがこれらに限定されない、対象からの流体または組織が挙げられる。組織の非限定的な例としては、器官組織（例えば、肝臓、腎臓、肺、胸腺、副腎、皮膚、膀胱、生殖器、腸、結腸、脾臓、脳、同種またはその一部）、上皮組織、毛髪、毛包、導管、管、骨、目、鼻、口、喉、耳、爪、同種のもの、その部分またはその組み合わせが挙げられる。試料は、正常な、健全な、病的な（例えば、感染した）、および／または癌性の（例えば、癌細胞）、細胞または組織を含んでもよい。対象から得られた試料は、複数の生物体（例えば、ウイルス核酸、胎児核酸、細菌核酸、寄生虫核酸）の細胞または細胞材料（例えば、核酸）を含んでもよい。

一態様では、組織撮像システムが提供され、組織撮像システムは、本明細書に記載される撮像システム（例えば、多深度共焦点撮像システム）を含む。組織撮像システムは、励起ビームを利用して、組織（例えば、対象組織からの試料、または生検、血液試料、もしくは細胞培養からの試料）を含む試料からの放射（例えば、回折光、反射光、屈折光）を検出する。

実施形態では、システム（例えば、遺伝子配列決定システム、細胞撮像システム、または組織撮像システム）は、流体連通する一つ以上の相互接続されたチャンバー、ポート、およびチャネルの統合システムを含み、単独で、または支持機能を提供するアプライアンスもしくは器具と連携して、分析の反応またはプロセスを実施するように構成される。試薬吸引マニホールドおよび／または試薬分注マニホールドは、流体システムと流体連通する。流体システムは、装置の流体ネットワークを洗浄またはクリーニングするために、また反応物を希釈するために、流体を貯蔵してもよい。例えば、流体システムは、試薬、酵素、他の生体分子、緩衝溶液、水性溶液、および非極性溶液を貯蔵するための様々な貯蔵部を含んでもよい。さらに、流体システムは、廃棄物を受けるための廃棄物貯蔵部も含みうる。本明細書で使用される場合、流体は、液体、ゲル、ガス、またはそれらの混合物であってもよい。また、流体は、二つ以上の流体の混合物とすることができる。流体ネットワークは、それを通って流れる一つ以上の流体を有するように構成された複数の流体構成要素（例えば、流体ライン、ポンプ、吸引器、ノズル、弁、またはその他の流体装置、マニホールド、貯蔵部）を含んでもよい。実施形態では、システムは、一つ以上の蠕動ポンプを含む。実施形態では、システムは、一つ以上のシリンジポンプを含む。実施形態では、サポート機能は、試料導入、流体および／または試薬の駆動手段、温度制御、検出システム、データ収集・統合システムのうちの少なくとも一つを含み、テンプレートポリヌクレオチド（例えば、任意にバーコードを含む標的ポリヌクレオチド）の核酸配列を決定するように構成される。装置は、例えば、弁およびポンプを利用する圧力駆動流量制御を使用して、一つ以上の方向および／または装置の一つ以上のチャネルへの試薬、分子、または酵素の流れを操作することができる。

一態様では、細胞試料（例えば、細胞を含む組織試料）を撮像する方法が提供される。実施形態では、方法は、細胞を含む試料を提供し、複数の深度で試料を照射して、アクティブピクセルセンサーアレイで試料（例えば、蛍光励起事象、散乱光、透過光、または反射光）からの放射を検出することと、試料を走査することとを含む。

実施形態では、本方法は、試料の物理的形態または構造の二次元または三次元の写真、画像、ビデオ、またはその他の表現を取得する工程をさらに含む。この表現は、光照射野、蛍光、または他の顕微鏡技術を介して得ることができる。実施形態では、方法は、追加の画像診断法または免疫組織化学モダリティ（例えば、免疫染色）をさらに含む。免疫組織化学（ＩＨＣ）は、抗体と抗原との間の特異的結合を利用して、一般的に光顕微鏡で検出および検査される、細胞および組織中の特異的抗原を検出し、局在化させる強力な技術である。Ｍａｇａｋｉ， Ｓ．， Ｈｏｊａｔ， Ｓ． Ａ．， Ｗｅｉ， Ｂ．， Ｓｏ， Ａ．， ＆ Ｙｏｎｇ， Ｗ． Ｈ． （２０１９）． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．）， １８９７， ２８９－２９８に記載のあるプロトコルなど、既知のＩＨＣモダリティを使用してもよく、これは参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、追加の画像診断法は、明視野顕微鏡法、位相差顕微鏡法、ノマルスキー微分干渉顕微鏡法、または暗視野顕微鏡法を含む。実施形態では、方法は、当技術分野で公知の方法を使用して、細胞形態（例えば、細胞境界または細胞形状）を決定することをさらに含む。例えば、細胞境界を決定することは、画像のピクセル値を単一の強度閾値と比較することを含み、これは、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７， Ｒ１００ （２００６） ａｎｄ Ａｒｃｅ， Ｓ．， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ３， ２２６６ （２０１３）に記載されるヒストグラムベースのアプローチを使用して迅速に決定されてもよい。この表現と空間的に分解された核酸検出結果との比較を使用して、組織の認識可能な特徴を有する遺伝情報を局在化することができる。システムおよび本明細書に記述される方法で使用するために改変されうる核酸の空間的検出のための例示的な方法は、米国特許第２０１４／００６６３１８号に記載があり、これは参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、方法は、一つの軸（例えば、ｚ方向）に沿って走査することによって、画像の二次元平面を取得することを含む。例えば、複数の二次元平面が、ｘｙ平面内の同じ試料に対して取得されてもよく、それによって検出事象が、異なるｚ平面上で発生してもよい。本明細書に提供される方法の実施形態では、方法は、一つの撮像面を、隣接する撮像面から区別するのに十分な分解能で、複数の二次元平面の各々を通して撮像することを含む。実施形態では、本明細書に記載される方法および装置は、同時に、複数の深度に分解された光学断面画像を取得する。
実施形態では、本方法は、追加の画像処理技術（例えば、フィルタリング、マスキング、平滑化、ＵｎＳｈａｒｐマスクフィルター（ＵＳＭ）、デコンボリューション、または最大強度投影（ＭＩＰ））を実施することを含む。実施形態では、方法は、放射の高周波成分を増幅する線形または非線形のフィルターを使用して、放射を計算的にフィルタリングすることを含む。例えば、ＵＳＭ法は、オリジナルの画像の複製物にガウスぼかしを適用し、それをオリジナルの画像と比較する。差が閾値設定より大きい場合、画像は減算される。実施形態では、方法は、最大強度投影（ＭＩＰ）を含む。最大強度投影は、三次元データ（例えば、本明細書に記載される方法に従って取得された変化する深度からの放射）を取り、それを単一の二次元画像にする、可視化技術である。例えば、投影は、各深度において最も明るいピクセル（ボクセル）を取り、最終的な二次元画像でそのピクセル強度値を表示する。様々な機械学習アプローチ、例えば、方法は、Ｌｕｇａｇｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８， １１４５５ （２０１８）およびＰａｔｔａｒｏｎｅ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ １１， １０３０４ （２０２１）に記載があり、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、本方法は、異なる焦点距離で撮影された複数の画像を組み合わせて、結果として得られる画像を個々のソース画像のどれよりも大きな被写界深度（ＤＯＦ）を有するものにする焦点合成（例えば、ｚスタッキング）を含む。

本明細書に記載される主題の一つ以上の態様または特徴は、デジタル電子回路、集積回路、特別に設計されたＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、および／またはそれらの組み合わせで実現されてもよい。これらの様々な実装は、データおよび命令を受信し、ストレージシステムからデータおよび命令を送信するために結合される、専用または汎用の少なくとも一つのプログラマブルプロセッサを含む、プログラマブルシステム上で実行可能および／または解釈可能な一つ以上のコンピュータプログラム、少なくとも一つの入力装置（例えば、マウス、タッチスクリーンなど）、および少なくとも一つの出力装置における実装を含みうる。本明細書に記載の方法およびシステムは、例えば、特定の命令で構成されたプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のプログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）と、結合プログラム可能論理回路（ＣＰＬＤ）、プログラマブル論理アレイ（ＰＬＡ）、プログラマブルアレイロジック（ＰＡＬ）、離散ゲートまたはトランジスターロジック、離散ハードウェアコンポーネント、または本明細書に記載される機能を実施するように設計された、それらの任意の組み合わせなど、機械によって実施または実施されることができる。プロセッサはマイクロプロセッサとすることができる。プロセッサはまた、コンピューティング装置、例えば、ＤＳＰとマイクロプロセッサの組み合わせ、複数のマイクロプロセッサ、ＤＳＰコアと組み合わせた一つ以上のマイクロプロセッサ、または任意のその他のこうした構成の組み合わせとして実装されることもできる。本明細書に記載の方法またはプロセスの要素は、コンピュータハードウェア内、プロセッサによって実行されるソフトウェアモジュール内、または二つの組み合わせで実装することができる。ソフトウェアモジュールは、ＲＡＭメモリ、フラッシュメモリ、ＲＯＭメモリ、ＥＰＲＯＭメモリ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、レジスタ、ハードディスク、リムーバブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、または当技術分野で既知の任意の他の形態のコンピュータ可読記憶媒体内に常駐することができる。

また、プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、アプリケーション、コンポーネント、またはコードと呼ばれることもある、コンピュータプログラムは、プログラマブルプロセッサのための機械命令を含み、高水準手続き言語、オブジェクト指向プログラミング言語、関数型プログラミング言語、論理プログラミング言語、および／またはアセンブリ言語／機械言語で実施されることができる。本明細書で使用される「機械可読媒体」という用語は、機械可読信号として機械命令を受信する機械可読媒体を含めて、機械命令および／またはプログラマブルプロセッサにデータを提供するために使用される、例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ、およびプログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）などの、任意のコンピュータプログラム製品、器具、および／または装置を指す。「機械可読信号」という用語は、機械命令および／またはデータをプログラマブルプロセッサに提供するために使用される任意の信号を指す。機械可読媒体は、例えば、非一時的固体メモリ、磁気ハードドライブ、または任意の同等の記憶媒体など、このような機械命令を非一時的に格納することができる。機械可読媒体は、代替的または追加的に、例えば、一つ以上の物理プロセッサコアに関連付けられたプロセッサキャッシュまたは他のランダムアクセスメモリなど、このような機械命令を一過性の様式で格納することができる。コンピュータは、例えば、複数バージョンのＷｉｎｄｏｗｓ、またはＭａｃＯＳ、またはＵｎｉｘ、またはＬｉｎｕｘのうちどれか一つなど、様々なオペレーティングシステムのうちどれか一つを実行することができる。

特定の態様では、ユーザーとの相互作用を提供するために、本明細書に記載の主題は、情報をユーザーに表示するための表示装置（例えば、陰極線管（ＣＲＴ）または液晶表示（ＬＣＤ）モニターなど）と、ユーザーが用いて入力をコンピュータに提供しうるポインティング装置（例えば、マウスまたはトラックボールなど）とを有するコンピュータに実装されることができる。他の種類のデバイスを、ユーザーとの相互作用を提供するために使用することもできる。例えば、ユーザーに提供されるフィードバックは、例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、または触覚フィードバックなどの任意の形態の感覚フィードバックとすることができる。また、ユーザーからの入力は、音響的、音声による、または触覚的な入力を含むがこれに限定されない任意の形態で受信されてもよい。他の考えられる入力装置としては、タッチスクリーン、またはシングルポイントもしくはマルチポイントの抵抗性もしくは容量性のトラックパッド、音声認識ハードウェアおよびソフトウェア、光学式スキャナー、光学式ポインター、デジタル画像取り込み装置、および関連する解釈ソフトウェアなどの他のタッチセンス装置が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載される主題は、バックエンドコンポーネント（例えば、データサーバーとして）を含むか、またはミドルウェアコンポーネント（例えば、アプリケーションサーバー）を含むか、またはフロントエンドコンポーネント（例えば、グラフィカルユーザーインターフェースまたはウェブブラウザを有するクライアントコンピュータであって、それを通して、ユーザーが本明細書に記載される主題の実装と相互作用しうる）を含むコンピューティングシステムに、またはこのようなバックエンドコンポーネント、ミドルウェアコンポーネント、もしくはフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせで実装されてもよい。システムの構成要素は、任意の形態または媒体のデジタルデータ通信（例えば、通信ネットワーク）によって相互接続されてもよい。通信ネットワークの例としては、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）、ワイドエリアネットワーク（「ＷＡＮ」）、インターネット、ＷｉＦｉ（ＩＥＥＥ ８０２．１１規格）、ＮＦＣ、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ、ＺＩＧＢＥＥなどが挙げられる。

コンピューティングシステムは、クライアントおよびサーバーを含んでもよい。クライアントおよびサーバーは、概して互いに遠隔であり、典型的には通信ネットワークを介して相互作用する。クライアントとサーバーの関係は、それぞれのコンピュータ上で実行され、かつ互いに対してクライアントとサーバーの関係を有するコンピュータプログラムによって生じる。

本明細書で使用される「約」という用語は、指定された値を含む値の範囲を意味し、当業者であれば、指定された値と合理的に類似しているとみなすであろう。実施形態では、「約」は、当技術分野で一般的に許容可能な測定値を使用した標準偏差内であることを意味する。実施形態では、「約」は、指定された値の±１０％まで拡張させた範囲を意味する。実施形態では、「約」は指定された値を含む。

本明細書に記載される主題は、所望の構成に応じて、システム、器具、方法、および／または物品に具体化されることができる。前述の説明に記載される実装は、本明細書に記載される主題と一致するすべての実装を表すものではない。むしろ、それらは、記載される主題に関連する態様と一致する一部の例に過ぎない。少数の変形物が上記で詳細に説明されているが、他の修正または追加も可能である。特に、さらなる特徴および／または変形物は、本明細書に記載された内容に加えて提供されることができる。例えば、上述の実装は、開示された特徴の様々な組み合わせおよび部分的組み合わせ、ならびに／または上記に開示されたいくつかのさらなる特徴の組み合わせおよび部分的組み合わせを対象とすることができる。さらに、添付図面に図示され、かつ／または本明細書に記述されている論理流れは、望ましい結果を達成するために、示される特定の順序、または連続的な順序を必ずしも必要としない。他の実装は、以下の請求項の範囲内でありうる。

Claims (44)

1. 多深度共焦点撮像システムであって、
   励起ビームを提供するように構成された少なくとも一つの光源と、
   前記励起ビームが、対物レンズを通して励起方向に沿った第一の複数の焦点深度で試料に集束される、対物レンズと、
   前記対物レンズを介して前記試料からの放射を受ける画像センサーであって、前記放射が、第二の複数の焦点深度で前記画像センサーに対する焦点を画定する、画像センサーと、を備える、システム。
2. 前記画像センサーの少なくとも一部分が、前記対物レンズの前記光軸に対して斜め向きに位置付けられる、請求項１に記載のシステム。
3. 前記試料を走査方向に沿って走査するように構成されたスキャナー素子をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
4. 前記走査方向が、前記励起ビーム方向に直交する、請求項３に記載のシステム。
5. 前記走査方向が、前記励起ビーム方向に対して非直交である、請求項３に記載のシステム。
6. 前記画像センサーの前記態様が、前記画像センサーに対する前記放射の前記第二の複数の焦点深度を補償するように、前記対物レンズの前記光軸に対して斜め向きに位置付けられる、請求項１に記載のシステム。
7. 前記光源が、レーザー、ＬＥＤ（発光ダイオード）、水銀灯またはタングステンランプ、または超連続ダイオードである、請求項１に記載のシステム。
8. 前記光源が、２００ｎｍ～１５００ｎｍの波長を有する励起ビームを提供する、請求項１に記載のシステム。
9. 前記光源がレーザーである、請求項１に記載のシステム。
10. 前記レーザーが、連続波（ＣＷ）レーザーまたはパルスレーザーである、請求項７に記載のシステム。
11. 前記レーザーが超短パルスレーザーである、請求項７に記載のシステム。
12. 前記超短パルスレーザーが、フェムト秒パルスレーザーまたはピコ秒パルスレーザーである、請求項９に記載のシステム。
13. 前記レーザーが、４０５ｎｍ、４７０ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、５２０ｎｍ、５３２ｎｍ、５６１ｎｍ、６３３ｎｍ、６３９ｎｍ、６４０ｎｍ、８００ｎｍ、８０８ｎｍ、９１２ｎｍ、１０２４ｎｍ、または１５００ｎｍの波長を有する励起ビームを提供する、請求項７に記載のシステム。
14. 前記画像センサーが、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイ、フォトダイオードのアレイ、アバランシェフォトダイオードのアレイ、光電子増倍管のアレイ（ＰＭＴ）、または光ファイバーのアレイを備える、請求項１に記載のシステム。
15. 前記画像センサーが、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイのうちの少なくとも一つを備える、請求項１に記載のシステム。
16. 前記画像センサーがカメラである、請求項１に記載のシステム。
17. 前記画像センサーが光ファイバーのアレイである、請求項１に記載のシステム。
18. 前記光源が、前記励起ビームを前記試料内に導入する複数の光ファイバーに結合される、請求項１に記載のシステム。
19. 前記光源が、シングルモード光ファイバーを介して結合される、請求項１に記載のシステム。
20. 前記光源が、マルチモード光ファイバーを介して結合される、請求項１に記載のシステム。
21. 前記光ファイバーが少なくとも二つの束にグループ化される、請求項１０に記載のシステム。
22. 光ファイバーの各束が、集束励起ビームを前記試料中の特定の位置において試料に導入し、第一の束の前記特定の位置が、第二の束の前記特定の位置からＺ軸オフセット距離だけオフセットされる、請求項１１に記載のシステム。
23. 前記集束励起ビームが、４０５ｎｍ、４７０ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、５２０ｎｍ、５３２ｎｍ、５６１ｎｍ、６３３ｎｍ、６３９ｎｍ、６４０ｎｍ、８００ｎｍ、８０８ｎｍ、９１２ｎｍ、１０２４ｎｍ、または１５００ｎｍの波長にある、請求項１２に記載のシステム。
24. 回折光学素子およびマイクロレンズのうちの少なくとも一つをさらに備える、請求項１０に記載のシステム。
25. 前記第二の複数の焦点深度が、前記第一の複数の焦点深度に対応する、請求項１に記載のシステム。
26. 前記対物レンズが空気対物レンズである、請求項１に記載のシステム。
27. 前記対物レンズが液浸対物レンズである、請求項１に記載のシステム。
28. 前記対物レンズが高い開口数を有しない、請求項１に記載のシステム。
29. 前記対物レンズが１．０未満の開口数を含む、請求項１に記載のシステム。
30. 前記対物レンズが０．１～１．６５の開口数を含む、請求項１に記載のシステム。
31. 前記対物レンズが、０．１～０．９５の開口数を含む、請求項１に記載のシステム。
32. 前記対物レンズが１．０～１．６５の開口数を含む、請求項１に記載のシステム。
33. 前記対物レンズが１．６ｍｍ～５０ｍｍの焦点距離を含む、請求項１に記載のシステム。
34. 多深度共焦点撮像システムであって、
    少なくとも一つの光源と、
    前記複数の光源から励起光を受ける複数の光ファイバーであって、前記光ファイバーが、前記試料内の複数の深度で、試料内に励起光を導入するように空間的に配置される、複数の光ファイバーと、を備える、システム。
35. 前記光ファイバーが、複数の束にグループ化され、各束が焦点深度を有し、第一の束の前記焦点深度が、試料に対してＺ軸距離だけ第二の束の焦点深度からオフセットされる、請求項３４に記載のシステム。
36. 回折光学素子およびマイクロレンズのうちの少なくとも一つをさらに備える、請求項３４に記載のシステム。
37. 前記少なくとも一つの光源が、複数のレーザーを備える、請求項３４に記載のシステム。
38. 前記レーザーの各々が、各レーザーの光を複数の光ファイバーに分割するそれぞれのスプリッタに結合される、請求項３４に記載のシステム。
39. 各束が、前記レーザーのそれぞれからの少なくとも一つの光ファイバーを含む、請求項３５に記載のシステム。
40. 試料の二次元画像または三次元画像を生成する方法であって、
    励起方向に沿って励起ビームを試料に導入することであって、前記励起ビームが試料中の複数の深度で集束される、導入することと、
    対応する複数の放射を画像センサー上に集束させることであって、前記放射が前記画像センサーに対して複数の深度で集束させられる、集束させることと、
    前記試料の複数の平面画像を取得するために、前記試料を前記励起方向に直交する方向に沿って走査することであって、前記平面画像が前記試料の複数の深度を画定する、走査することと、を含む方法。
41. 前記画像センサーが、励起方向に対してある傾斜角で配向される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記画像センサーが、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）アレイおよび電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイのうちの少なくとも一つである、請求項４０に記載の方法。
43. 少なくとも一つの光ファイバーが、励起ビームを前記試料内に導入するために使用される、請求項４０に記載の方法。
44. 前記画像センサー上の焦点の回折限界スポットサイズに対応する一部分のピクセルのみが共焦点検出を達成するために光子に対して感受性があるように、前記画像センサーを構成することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。

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