JP2017191228A - ライトシート顕微鏡およびサンプル観察方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】サンプルの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得してサンプルを観察する。
【解決手段】サンプルＳが流通可能な管路３と、管路３内を管路３に沿ってサンプルＳを移動させるシリンジポンプ７と、シリンジポンプ７によるサンプルＳの移動方向に交差する平面に沿う平面状の照明光を管路３内に入射させるシリンドリカルレンズ９と、シリンドリカルレンズ９により管路３内に入射される照明光の照射面Ｆに対面して配され、シリンジポンプ７によりサンプルＳが照明光の照射面Ｆを通過させられることによってサンプルＳから発せられる蛍光を集光する対物レンズ１１と、対物レンズ１１により集光されたサンプルＳからの蛍光を撮像するカメラ１３とを備えるライトシート顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ライトシート顕微鏡およびサンプル観察方法に関するものである。
従来、ライトシート顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。ライトシート顕微鏡は、スフェロイドやオルガノイド（人工臓器またはその一部）のような３次元培養細胞の３次元立体像を得て、画像解析技術により薬効の評価を行う、所謂、創薬スクリーニングへの適用を目的とした技術としても注目されている。
創薬スクリーニングでは、一般的に、試験条件を複数設定するためにマルチウエルプレートが利用される。例えば、濃度が異なる薬や異なる細胞種を複数準備し、これらをマルチウエルプレートの各ウエルに割り当てて、得られた解析結果からその薬効を評価する。
このような創薬スクリーニングにおいて、例えば、共焦点顕微鏡などにより、３次元構造のサンプルの３次元立体像を得て細胞スクリーニングを行うのは、蛍光退色等のサンプルへのダメージやスループットの観点から相応しいとはいえず、ハイスループットでサンプルへのダメージが少ないライトシート顕微鏡の利用が望まれている。
米国特許第７５５４７２５号明細書 国際公開第２０１５／１８４１２４号
しかしながら、ライトシート顕微鏡では、基本的に観察光軸に対して照明光路を直交させるように構成する必要があり、マルチウエルプレートをそのまま利用することができないという問題がある。また、特許文献１，２には、スフェロイド（直径０．１から１ｍｍ）のような比較的小さな３次元構造のサンプルを撮像するための最適な方法については述べられていない。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、サンプルの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得してサンプルを観察することができるライトシート顕微鏡およびサンプル観察方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、サンプルが流通可能な管路と、該管路内を該管路に沿って前記サンプルを移動させるサンプル移動部と、該サンプル移動部による前記サンプルの移動方向に交差する平面に沿う平面状の照明光を前記管路内に入射させる照明部と、該照明部により前記管路内に入射される前記照明光の照射面に対面して配され、前記サンプル移動部により前記サンプルが前記照明光の照射面を通過させられることによって前記サンプルから発せられる蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記サンプルからの蛍光を撮像する撮像部とを備えるライトシート顕微鏡を提供する。
本発明によれば、サンプル移動部によりサンプルが管路内を管路に沿って移動させられて、照明部により管路内に入射された平面状の照明光の照射面を通過すると、照明光の照射面に沿ってサンプル内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。したがって、照明光の照射面に対物レンズの焦点面を一致させておくことにより、対物レンズによってその焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を１度に集光して、撮像部により撮像することができる。そして、管路に沿ってサンプルが移動して、サンプルにおける照明光の照射面の位置がその移動方向に変化していくことにより、サンプルの移動方向に交差する方向のサンプルの断層像をサンプルの移動方向の異なる複数の位置において取得することができる。
これにより、サンプルの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得して、サンプルを詳細に観察することができる。また、対物レンズの焦点面以外の場所に照明光を照射しないので、蛍光の退色を抑えてサンプルの良好な３次元的な立体像を得ることができる。
上記発明においては、前記サンプル移動部が、前記管路に沿って前記サンプルを連続的にまたは断続的に移動させ、前記撮像部が、前記照明光の照射面を通過する前記サンプルの画像を時間的に所定の間隔を空けて複数撮像することとしてもよい。
このように構成することで、サンプル移動部によるサンプルの移動量と撮像部の撮像間隔との関係に応じて、サンプルの断層像をサンプルの移動方向の異なる複数の位置において取得することができる。
上記発明においては、前記サンプル移動部が、前記撮像部の露光時間内において前記対物レンズの焦点範囲を超えないように前記サンプルを連続的に移動させることとしてもよい。
このように構成することで、サンプルの高精細な３次元的な立体像を得ることができる。
上記発明においては、前記管路が、前記照明光の照射面と前記対物レンズとの間に該対物レンズの光軸に交差する方向に屈曲する屈曲部を有することとしてもよい。
このように構成することで、対物レンズの配置が管路によって制限されるのを回避し、照明光の照射面に焦点面が一致するように対物レンズを容易に配置することができる。
上記発明においては、前記管路が、前記サンプルが注入される注入口と、前記照明光の照射面よりも鉛直方向下方を迂回する迂回部とを有することとしてもよい。
このように構成することで、注入口から管路内に注入された複数のサンプルが迂回部へ移動すると、それらのサンプルが重力によって迂回部に一旦貯留される。これにより、サンプル移動部により移動させられるサンプルの量を管理し易くするとともに、管路に沿って移動させる各サンプルの順序を安定させることができる。
上記発明においては、前記迂回部が、１度に注入される前記サンプルを含む注入物の総量よりも大きい体積を有することとしてもよい。
このように構成することで、迂回部に一時的に貯留させるサンプルが迂回部から溢れるのを防ぐことができる。
上記発明においては、前記サンプル移動部が、前記管路に注入された前記サンプルを該サンプルの排出側へ押し出しまたは排出側に吸引するポンプ機構であってもよい。
このように構成することで、ポンプ機構により押し出したり吸引したりするだけの簡易な構成で、管路内を管路に沿ってサンプルを容易に移動させることができる。
上記発明においては、前記サンプル移動部が、前記管路に注入された前記サンプルを排出側へ押し出すポンプ機構であり、前記管路が、前記注入口と前記ポンプ機構の開口との間に弁を備えることとしてもよい。
このように構成することで、弁を開くことにより注入口から管内にサンプルが注入され、弁を閉じることによりポンプ機構によってサンプルが押し出される。したがって、弁の開閉により、サンプルの注入とサンプルの移動を容易に切り替えることができる。
上記発明においては、前記サンプルを収容可能な容器を設置可能な容器設置部を備え、前記管路が、前記照明光の照射面を通過した前記サンプルを排出する排出口を有し、該排出口が、前記容器設置部の近傍に配置されていることとしてもよい。
このように構成することで、容器設置部に容器を設置しておくことにより、管路の排出口から排出されるサンプルを容器によって容易に回収することができる。容器としては、管路に注入するサンプルを収容しておいたものを採用することとしてもよい。
上記発明においては、前記サンプルが、３次元的な構造を有する培養細胞であり、培養液と共に前記管路を流通されることとしてもよい。
このように構成することで、培養液にて培養中と略同じ状態のサンプルの３次元的な立体像を得ることができる。
上記発明においては、前記管路における少なくとも前記照明部が対面する領域および前記対物レンズが対面する領域が、前記サンプルと共に前記管路に注入される液体の屈折率と略等しい屈折率を有する透明部材により形成されていることとしてもよい。
このように構成することで、管路における照明部や対物レンズが対面する領域と液体との屈折率の差による影響を低減したサンプルの高精細な画像を取得することができる。
上記発明においては、前記管路が、前記サンプルと共に前記管路に注入される液体の屈折率と略等しい屈折率を有する透明部材からなる筐体の貫通孔により形成されていることとしてもよい。
このように構成することで、筐体における照明部や対物レンズが対面する領域と液体との屈折率の差による影響を低減したサンプルの高精細な画像を取得することができる。
上記発明においては、前記管路が、前記照明光の照射面に交差する一平面内においてのみ屈曲する形状を有することとしてもよい。
このように構成することで、筐体の簡易な形状の貫通孔により管路を構成することができる。
上記発明においては、前記筐体が、前記管路の長手方向に沿って少なくとも２分割された複数の筐体構成部材を貼り合わせることにより形成されていることとしてもよい。
このように構成することで、複数の筐体構成部材に形成した溝により管路を構成することができる。この場合において、管路が、照明光の照射面に交差する一平面内においてのみ屈曲する形状を有することで、筐体構成部材に形成する溝が簡易な形状で済む。
上記発明においては、前記対物レンズが液浸対物レンズであり、前記透明部材と前記対物レンズとの間に、前記透明部材の屈折率に略等しい屈折率を有するイマージョン液が充填されていることとしてもよい。
このように構成することで、液浸対物レンズにより、屈折率が略等しい部材、すなわち、サンプルと共に管路に注入される液体、管路の透明部材およびイマージョン液を介して標本からの蛍光を集光することによって、より高性能化を図ることができる。
上記発明においては、前記イマージョン液が非揮発性を有することとしてもよい。
このように構成することで、蒸発によるイマージョン液の減少を防止することができる。
上記発明においては、前記対物レンズを光軸方向に移動させる照準部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、照準部により、照明光の照射面に対する対物レンズの焦点面の光軸方向の位置を微調整することができる。
上記発明においては、前記照準部が、前記照明光の照射面に対する前記対物レンズの光軸方向の合焦状態を調節する自動焦点機能を有することとしてもよい。
このように構成することで、照明光の照射面に対物レンズの焦点面を一致させた状態を自動的に維持することができる。
本発明は、管路にサンプルを注入する注入ステップと、前記管路における前記サンプルの流通方向に交差する平面に沿う平面状の照明光を前記管路に入射させる照明ステップと、前記管路内において前記サンプルを流通させて、前記照明ステップにより前記管路内に入射されている前記照明光の照射面を通過させるサンプル流通ステップと、前記照明光の照射面を通過させられることによって前記サンプルから発せられる蛍光を撮像する撮像ステップとを含むサンプル観察方法を提供する。
本発明によれば、注入ステップにより管路に注入されてサンプル流通ステップにより管路内を流通させられるサンプルが、照明ステップにより管路内に入射された平面状の照明光の照射面を通過すると、照明光の照射面に沿ってサンプル内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。したがって、照明光の照射面に対物レンズの焦点面を一致させておくことにより、対物レンズの焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を１度に集光して、撮像ステップにより撮像することができる。そして、サンプル流通ステップによりサンプルが照明光の照射面を通過していくことによって、サンプルの移動方向に交差する方向のサンプルの断層像をサンプルの移動方向の異なる複数の位置において取得することができる。
これにより、サンプルの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得して、サンプルを詳細に観察することができる。また、対物レンズの焦点面以外の場所に照明光を照射しないので、蛍光の退色を抑えてサンプルの良好な３次元的な立体像を得ることができる。
上記発明においては、前記サンプル流通ステップが、前記管路に沿って前記サンプルを連続的にまたは断続的に流通させ、前記撮像ステップが、前記照明光の照射面を通過する前記サンプルの画像を時間的に所定の間隔を空けて複数撮像することとしてもよい。
このように構成することで、サンプル流通ステップによるサンプルの移動量と撮像ステップによる撮像間隔との関係に応じて、サンプルの流通方向に交差する方向のサンプルの断層像をサンプルの移動方向の異なる複数の位置において取得することができる。
本発明によれば、サンプルの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得してサンプルを観察することができるという効果を奏する。
（ａ）は本発明の第１実施形態に係るライトシート顕微鏡において、管路の迂回部にサンプルが駐留されている状態を示す縦断面図であり、（ｂ）は（ａ）のライトシート顕微鏡を鉛直方向下方から見た図である。 本発明の第１実施形態に係るサンプル観察方法を説明するフローチャートである。 本発明の第１実施形態に係るライトシート顕微鏡において、サンプルが管路における照明光の照射面を通過する様子を示す縦断面図である。 本発明の第１実施形態に係るライトシート顕微鏡において、サンプルが管路の排出口から容器に排出される様子を示す縦断面図である。 本発明の第１実施形態に係るライトシート顕微鏡において、管路から排出されて容器に収容されているサンプルをピベットにより回収する様子を示す縦断面図である。 （ａ）は本発明の第２実施形態に係るライトシート顕微鏡において、管路の迂回部にサンプルが駐留されている状態を示す縦断面図であり、（ｂ）は（ａ）のライトシート顕微鏡を鉛直方向下方から見た図である。 本発明の第２実施形態に係るライトシート顕微鏡において、サンプルが管路における照明光の照射面を通過する様子を示す縦断面図である。 本発明の第２実施形態に係るライトシート顕微鏡において、管路の排出部近傍までサンプルを吸引した様子を示す縦断面図である。 本発明の第２実施形態に係るライトシート顕微鏡において、管路の注入口まで押し戻したサンプルをピベットにより吸引する様子を示す縦断面図である。 本発明の各実施形態の変形例に係るライトシート顕微鏡において、サンプルが管路における照明光の照射面を通過する様子を示す縦断面図である。 本発明の各実施形態の変形例に係るライトシート顕微鏡において、サンプルの流通方向に対して略４５°傾斜させた平面に沿う平面状の照明光を管路に入射させた場合の構成を示す縦断面図である。
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係るライトシート顕微鏡およびサンプル観察方法について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るライトシート顕微鏡１は、図１（ａ），（ｂ）に示すように、サンプルＳが流通可能な管路３を構成する筐体５と、管路３内を管路３に沿ってサンプルＳを移動させるシリンジポンプ（サンプル移動部）７と、管路３内に平面状の照明光を入射させるシリンドリカルレンズ（照明部）９と、管路３内で照明光が照射されたサンプルＳから発せられる蛍光を集光する対物レンズ１１と、対物レンズ１１により集光されたサンプルＳからの蛍光を撮像するカメラ（撮像部）１３と、シリンジポンプ７やカメラ１３等を制御する制御器１４とを備えている。
また、ライトシート顕微鏡１には、筐体５の近傍に、管路３から排出されるサンプルＳを収容する容器１５を設置可能な容器設置部（図示略）が設けられている。
サンプルＳは、例えば、図示しないマルチウエルプレートにて培養されている３次元的な構造を有する略球状のスフェロイドである。
管路３は、例えば、断面が円形状を有し、照明光の照明光軸に直交する一平面内においてのみ屈曲する形状を有している。この管路３は、サンプルＳの流通方向に沿って注入側から順に、サンプルＳを注入する注入口４ａを有する注入部３ａと、照明光の照射面Ｆよりも鉛直方向下方を迂回する迂回部３ｂと、照明光の照射面Ｆと対物レンズ１１との間で対物レンズ１１の光軸に交差する方向に屈曲する屈曲部３ｃと、照明光の照射面Ｆを通過したサンプルＳを排出する排出口４ｄを有する排出部３ｄとを備えている。
注入部３ａは、注入口４ａが筐体５の上面に開口し、注入口４ａから鉛直方向下方に向かってテーパ状に細くなる略円錐形状を有している。注入口４ａは、迂回部３ｂ、屈曲部３ｃおよび排出部３ｄなどの管路３の他の部分よりも大きい径寸法を有している。
迂回部３ｂは、注入部３ａの鉛直方向下方に配置されており、注入口４ａから注入されたサンプルＳおよび培養液（液体）Ｌが重力により注入部３ａを介して迂回部３ｂに移動してくるようになっている。また、迂回部３ｂは、Ｕ字型に形成されており、注入部３ａから移動してきたサンプルＳおよび培養液Ｌを一時的に貯留することができるようになっている。この迂回部３ｂは、１度に注入されるサンプルＳおよび培養液（液体）Ｌの総量よりも大きい体積を有していることが望ましい。これにより、一時的に貯留するサンプルＳと培養液Ｌが迂回部３ｂから溢れるのを防ぐことができる。
屈曲部３ｃは、鉛直方向上方に向かって屈曲し、筐体５の上面に開口している。
排出部３ｄは、例えば、チューブであり、一端が筐体５の屈曲部３ｃに接続されて、他端の排出口４ｄが容器設置部の近傍に配置されている。
また、管路３には、注入部３ａと迂回部３ｂとの間に開口し、シリンジポンプ７に接続される分岐部３ｅと、分岐部３ｅの開口と注入部３ａとの間に配された弁１７とが備えられている。弁１７は、制御器１４の制御により開閉するようになっている。
これら管路３の注入部３ａ、迂回部３ｂおよび屈曲部３ｃは、透明部材からなる筐体５の貫通孔により形成されている。筐体５は、管路３の長手方向に沿って２分割された２つの筐体構成部材を貼り合わせることにより形成されている。これら筐体構成部材は、サンプルＳと共に管路３に注入される培養液Ｌの屈折率と略等しい屈折率を有している。なお、筐体５は、管路３の長手方向に沿って３分割以上に分割された筐体構成部材により構成されていてもよい。
管路３にサンプルＳを注入する注入手段としては、例えば、ピペッティングロボット１９が用いられる。ピペッティングロボット１９は、例えば、プログラミングによって駆動制御可能な汎用ロボットである。このピペッティングロボット１９は、制御器１４の制御により、サンプルＳと培養液Ｌが収容されたマルチウエルプレート（図示略）のウエルから培養液ＬとともにサンプルＳを吸引し、吸引したサンプルＳと培養液Ｌを管路３の注入口４ａに注入することができるようになっている。また、ピペッティングロボット１９は、制御器１４の制御により、管路３から排出されて容器１５に収容されたサンプルＳと培養液Ｌを容器１５から吸引し、吸引したサンプルＳと培養液Ｌをマルチウエルプレートの元のウエルに注入することができるようになっている。
シリンジポンプ７は、分岐部３ｅを介して管路３内に空気を注入することができるようになっている。このシリンジポンプ７は、制御器１４の制御により、迂回部３ｂにサンプルＳが貯留されて弁１７が閉じられている状態で、分岐部３ｅを介して管路３内に空気を注入するようになっている。これにより、迂回部３ｂに貯留されているサンプルＳと培養液Ｌが屈曲部３ｃを介して排出口４ｄへと移動させられる。
また、シリンジポンプ７は、制御器１４により駆動されることで、複数のサンプルＳを管路３に沿って連続的に移動させるようになっている。具体的には、シリンジポンプ７は、制御器１４により、先頭のサンプルＳが照明光の照射面Ｆに到達する直前までおよび全てのサンプルＳが照射面Ｆを通過した後はサンプルＳを高速で移動させるように駆動し、先頭のサンプルＳが照射面Ｆに到達する直前から全てのサンプルＳが照射面Ｆを通過し終わるまでの間はサンプルＳを低速で移動させるように駆動するようになっている。
サンプルＳが照射面Ｆを通過する間は、カメラ１３の露光時間内において対物レンズ１１の焦点範囲を超えないように、サンプルＳの移動速度を設定することが望ましい。なお、サンプルＳの移動速度は、通常、撮像画像に求められるＳ／Ｎ比、解像度およびスループット等により総合的に決定される。管路３に１度に注入するサンプルＳの量が分っているので、制御器１４によりサンプルＳを移動させる距離を制御することができる。
シリンドリカルレンズ９は、筐体５の側方に設けられ、管路３に対面して配されている。このシリンドリカルレンズ９は、照明光軸に直交する一方向にパワーを有しており、図示しない光源から発せられた照明光を照明光軸に沿う平面に沿って、観察視野（観察視野の大きさ）よりも大きい面積のシート状に集光させるようになっている。そして、シリンドリカルレンズ９は、管路３が屈曲部３ｃで屈曲する直前の（直線状の）位置に、サンプルＳの移動方向に直交する平面に沿う平面状の照明光を入射させることができるようになっている。
対物レンズ１１は、シリンドリカルレンズ９により管路３内に入射される照明光の照射面Ｆに対面して配置されている。また、対物レンズ１１は、照明光の照射面Ｆに焦点面を一致させて配されており、管路３を流通するサンプルＳが照明光の照射面Ｆを通過することによってサンプルＳから発せられる蛍光を集光するようになっている。
カメラ１３は、制御器１４により駆動され、照明光の照射面Ｆを通過するサンプルＳから対物レンズ１１を介して入射される蛍光を撮影して、サンプルＳの断層像を取得するようになっている。具体的には、カメラ１３は、制御器１４により、シリンジポンプ７によるサンプルＳの移動と同期して駆動され、照明光の照射面Ｆを通過するサンプルの画像を時間的に所定の間隔を空けて複数撮像するようになっている。これにより、シリンジポンプ７によるサンプルＳの移動量とカメラ１３の撮像間隔との関係に応じて、サンプルＳの断層像をサンプルＳの移動方向の異なる複数の位置において取得することができる。
制御器１４は、弁１７、ピペッティングロボット１９、シリンジポンプ７およびカメラ１３を制御するようになっている。
本実施形態に係るサンプル観察方法は、図２のフローチャートに示されるように、弁１７を開放する開放ステップＳ１と、管路３にサンプルＳを注入する注入ステップＳ２と、弁１７を閉鎖する閉鎖ステップＳ３と、管路３におけるサンプルＳの流通方向に交差する平面に沿う平面状の照明光を管路３に入射させる照明ステップＳ４と、管路３内においてサンプルＳを流通させて、照明ステップＳ４により管路３内に入射されている照明光の照射面Ｆを通過させるサンプル流通ステップＳ５と、照明光の照射面Ｆを通過させられることによりサンプルＳから発せられる蛍光を撮像する撮像ステップＳ６と、管路３から排出されるサンプルＳを回収する回収ステップＳ７とを含んでいる。
このように構成されたライトシート顕微鏡１およびサンプル観察方法の作用について説明する。
本実施形態に係るライトシート顕微鏡１およびサンプル観察方法によりサンプルＳを観察する場合は、まず、制御器１４の制御により、弁１７が開放され（開放ステップＳ１）、ピペッティングロボット１９が駆動されて、マルチウエルプレートのいずれかのウエルから吸引された複数のサンプルＳと培養液Ｌが管路３の注入口４ａから注入される（注入ステップＳ２）。
注入口４ａから管路３に注入されたサンプルＳは、図１に示すように、重力により注入部３ａを介して迂回部３ｂへ移動し、迂回部３ｂに貯留される。サンプルＳが迂回部３ｂに一旦貯留されることで、シリンジポンプ７により移動させるサンプルＳの量を管理し易くするとともに、管路３に沿って移動させる各サンプルの順序を安定させることができる。サンプルＳが迂回部３ｂに貯留されると、制御器１４により弁１７が閉鎖される（閉鎖ステップＳ３）。
また、光源から照明光が発せられ、シリンドリカルレンズ９により、管路３が屈曲部３ｃで屈曲する直前の（直線状の）位置に、サンプルＳの流通方向に直交する平面に沿う平面状の照明光が入射される（照明ステップＳ４）。
続いて、制御器１４によりシリンジポンプ７が駆動されて分岐部３ｅを介して管路３に空気が注入され、迂回部３ｂに貯留されているサンプルＳが培養液Ｌとともに管路３に沿って屈曲部３ｃ側に移動する。これらのサンプルＳは、シリンジポンプ７により、先頭のサンプルＳが照明光の照射面Ｆに到達する直前まで高速で移動し、先頭のサンプルＳが照射面Ｆに到達する直前で低速に切り換えられて移動する（サンプル流通ステップＳ５）。
そして、図３に示すように、サンプルＳが照明光の照射面Ｆを通過し始めると、照明光の照射面Ｆに沿ってサンプルＳ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。この場合において、対物レンズ１１の焦点面が照明光の照射面Ｆに一致させられているので、対物レンズ１１の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を対物レンズ１１により１度に集光することができる。
また、制御器１４によりサンプルＳの移動と同期してカメラ１３が駆動され、対物レンズ１１により集光されたサンプルＳからの蛍光がカメラ１３によって時間的に所定の間隔を空けて撮像される。この場合において、管路３に沿ってサンプルＳが移動して、サンプルＳにおける照明光の照射面の位置がその移動方向に変化していくことにより、サンプルＳの流通方向に交差する断層像がカメラ１３によってサンプルＳの移動方向の異なる複数の位置において取得される（撮像ステップＳ６）。これにより、サンプルＳの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得して、サンプルＳを詳細に観察することができる。
全てのサンプルＳが照明光の照射面Ｆを通過して、サンプルＳの撮像が終了すると、制御器１４により、シリンジポンプ７によるサンプルＳの移動が高速に切り換えられる。そして、図４に示すように、排出部３ｄの排出口４ｄからサンプルＳが培養液Ｌと共に排出されて容器１５に収容される。
次いで、制御器１４により、ピペッティングロボット１９が駆動され、図５に示すように、容器１５に収容されたサンプルＳが培養液Ｌとともに吸引されて、マルチウエルプレートの元々サンプルＳが収容されていたウエルにサンプルＳが戻される（回収ステップＳ７）。このプロセスが、マルチウエルプレートの観察する複数のウエルに対して順次行われる。
以上説明したように、本実施形態に係るライトシート顕微鏡１およびサンプル観察方法によれば、サンプルが管路３内を移動し平面状の照明光の照射面Ｆを通過し、サンプルＳにおける照明光の照射面Ｆの位置がその移動方向に変化していくことにより、サンプルＳの移動方向に交差する方向のサンプルＳの断層像をサンプルＳの移動方向の異なる複数の位置において取得することができる。
これにより、サンプルＳの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得して、サンプルＳを詳細に観察することができる。また、対物レンズ１１の焦点面以外の場所に照明光を照射しないので、蛍光の退色を抑えてサンプルＳの良好な３次元的な立体像を得ることができる。
本実施形態においては、シリンジポンプ７によりサンプルＳを連続的に移動させることとしたが、これに代えて、例えば、シリンジポンプ７によりサンプルＳを断続的に移動させることとしてもよい。
この場合、サンプルＳの移動停止とともにカメラ１３を作動させて蛍光を撮像し、露光時間の終了とともにサンプルＳを所定の距離だけさらに移動させることを繰り返すことにより、サンプルＳの移動方向の異なる複数の位置においてサンプルＳの断層像を取得してもよい。このようにすることで、カメラ１３の露光時間内でサンプルＳを移動させないので、より良好な画像を取得することができる。
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係るライトシート顕微鏡およびサンプル観察方法について説明する。
本実施形態に係るライトシート顕微鏡１は、図６に示すように、シリンジポンプ７により、管路３に注入されたサンプルＳを排出側に吸引する点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るライトシート顕微鏡１およびサンプル観察方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態においては、シリンジポンプ７が、排出部３ｄの排出口４ｄに接続されている。屈曲部３ｃと排出部３ｄとの間の管路３には、管路３内の空気を外部に排出するための開閉可能な空気ヌキ弁２１が設けられている。空気ヌキ弁２１は、制御器１４の制御により開閉するようになっている。
このシリンジポンプ７は、制御器１４の制御により、迂回部３ｂにサンプルＳが貯留されて空気ヌキ弁２１が閉じられている状態で、管路３内の空気を排出口４ｄ側に吸引するようになっている。これにより、迂回部３ｂに貯留されているサンプルＳと培養液Ｌが屈曲部３ｃを介して排出口４ｄへと移動させられる。制御器１４の制御によるサンプルＳの移動速度の切り替えは第１実施形態と同様である。
また、本実施形態に係るサンプル観察方法は、第１実施形態と同様であるので説明を省略する。
このように構成されたライトシート顕微鏡１およびサンプル観察方法の作用について説明する。
本実施形態に係るライトシート顕微鏡１およびサンプル観察方法によりサンプルＳを観察する場合は、まず、制御器１４の制御により、空気ヌキ弁２１が開放され（開放ステップＳ１）、ピペッティングロボット１９によって注入口４ａからサンプルＳと培養液Ｌが注入される（注入ステップＳ２）。
注入されたサンプルＳおよび培養液Ｌは、図６に示すように、重力によって注入部３ａを介して迂回部３ｂに移動する。サンプルＳおよび培養液Ｌが迂回部３ｂに貯留されると、制御器１４により空気ヌキ弁２１が閉鎖される（閉鎖ステップＳ３）。
また、光源から照明光が発せられ、シリンドリカルレンズ９により、管路３が屈曲部３ｃで屈曲する直前の（直線状の）位置に、サンプルＳの流通方向に直交する平面に沿う平面状の照明光が入射される（照明ステップＳ４）。
続いて、制御器１４によりシリンジポンプ７が駆動されて管路３内の空気が排出口４ｄ側に吸引され、迂回部３ｂに貯留されているサンプルＳが培養液Ｌとともに屈曲部３ｃに向かって管路３に沿って移動する（サンプル流通ステップＳ５）。そして、図７に示すように、サンプルＳが照明ステップＳ４により管路３に入射されている照明光の照射面Ｆを通過し始めると、サンプルＳから発せられる蛍光が対物レンズ１１を介してカメラ１３により撮像される（撮像ステップＳ６）。
図８に示すように、全てのサンプルＳが照明光の照射面Ｆを通過して撮像が終了すると、制御器１４によりシリンジポンプ７の駆動が切り換えられ、排出口４ｄ側から管路３内に空気が注入される。これにより、管路３内の空気が排出口４ｄ側から注入口４ａ側に押し戻されてサンプルＳが管路３を逆方向に移動し、図９に示すように、注入部３ａにサンプルＳが押し出される。
次いで、制御器１４によりピペッティングロボット１９が駆動され、サンプルＳが培養液Ｌとともに吸引されて、マルチウエルプレートの元のウエルに戻される（回収ステップＳ７）。このプロセスが、マルチウエルプレートの観察する複数のウエルに対して順次行われる。
以上説明したように、本実施形態に係るライトシート顕微鏡１およびサンプル観察方法によれば、管路３に注入されたサンプルＳを排出側から吸引することによっても、第１実施形態と同様に、サンプルＳの３次元的な立体像を簡易かつ精度よく取得して、サンプルＳを詳細に観察することができる。この場合において、シリンジポンプ７を管路３の排出口４ｄに接続するので、管路３に分岐部３ｅを設ける必要がなく、管路３をよりシンプルな形状にすることができる。
上記各実施形態は以下のように変形することができる。
以下の変形例では、第１実施形態のようにシリンジポンプ７によりサンプルＳを排出側へ押し出す構成を例示して説明するが、第２実施形態のようにシリンジポンプ７によりサンプルＳを排出側に吸引する構成にも適用してもよい。
上記各実施形態の変形例としては、図１０に示すように、対物レンズ１１と筐体５との間に、筐体５の屈折率に略等しい屈折率を有するシリコーンオイル（イマージョン液）Ｏを充填することとしてもよい。
シリコーンオイルＯは、非揮発性で長期間に亘って安定しているので、メインテナンスの必要が殆どなく、長期間安定して装置を稼動させることができる。本変形例においては、対物レンズ１１として、液浸対物レンズを採用することが好ましい。
本変形例によれば、対物レンズ１１により、屈折率が略等しい部材、すなわち、サンプルＳと培養液Ｌ、管路３の透明部材およびシリコーンオイルＯを介してサンプルＳからの蛍光を集光することによって、より高性能化を図ることができる。
また、図１０に示すように、ライトシート顕微鏡１が、対物レンズ１１を光軸方向に移動させる照準部２３を備えることとしてもよい。この場合、制御器１４により照準部２３を制御することとしてもよい。
各サンプルＳの屈折率が異なると、サンプルＳごとに対物レンズ１１の焦点位置がわずかにずれる場合がある。このような場合において、照準部２３により、対物レンズ１１の焦点面を照明光の照射面Ｆに正確に合わせることができる。
本変形例においては、照準部２３が、制御器１４の制御により照明光の照射面Ｆに対物レンズ１１の焦点面を一致させる自動焦点機能を有することとしてもよい。自動焦点機能としては、例えば、一般的なコントラスト法が利用されてもよい。このようにすることで、照明光の照射面Ｆに対物レンズ１１の焦点面を一致させた状態を自動的に維持することができ、常に良好な画像を取得することができる。
また、同じく図１０に示すように、マルチウエルプレート２５を載置するＸＹ電動ステージ２９を採用することとしてもよい。この場合、制御器１４によりＸＹ電動ステージ２９を制御することとしてもよい。そして、ピペッティングロボット１９により、マルチウエルプレート２５から目的のウエル２７のサンプルＳが吸引されて管路３に注入され、撮像プロセスを経た後、ＸＹ電動ステージ２９が駆動されて管路３の排出口４ｄの近傍にマルチウエルプレート２５が移動し、元のウエル２７にサンプルＳが回収されるようにしてもよい。
このようにすることで、観察プロセス中に中間的に介在する容器が存在しないので、他のサンプルＳからのコンタミンをなくすことができ、引き続き培養を継続するのに好適である。
また、上記各実施形態においては、シリンドリカルレンズ９により、サンプルＳの移動方向に直交する平面に沿う平面状の照明光を管路３に入射させることとしたが、図１１に示すように、シリンドリカルレンズ９により、サンプルＳの移動方向に交差する平面に沿う平面状の照明光を管路３に入射させることとすればよい。図１１は、サンプルＳの移動方向に対して略４５°傾斜させた平面に沿う平面状の照明光を管路３に入射させた場合を示している。
この場合、対物レンズ１１は、シリンドリカルレンズ９により管路３内に入射される照明光の照射面Ｆに対面して配置し、照明光の照射面Ｆに焦点面を一致させておくこととすればよい。このようにした場合も、上記各実施形態と同様に、管路３を流通するサンプルＳが照明光の照射面Ｆを通過することによって、サンプルＳにおける対物レンズ１１の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を対物レンズ１１により１度に集光してカメラ１３により撮像することができる。
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。また、上記各実施形態においては、サンプルＳを培養する容器としてマルチウエルプレート２５を例示して説明したが、サンプルＳはチップやキュベットにより配列されて収容されていてもよい。
また、上記各実施形態においては、管路３が、筐体５の貫通孔により形成されている構成を例示して説明したが、これに代えて、管路３が管により形成されていることとしてもよい。この場合、管における少なくともシリンドリカルレンズ９が対面する領域および対物レンズ１１が対面する領域が、サンプルＳおよび培養液Ｌの屈折率と略等しい屈折率を有する透明部材により形成されていることとすればよい。
また、上記各実施形態においては、サンプルＳとして略球状のスフェロイドを例示したことにより、管路３の断面も円形状としたが、サンプルの形状に合わせて、管路３の断面もサンプルが流通し易い形状に適宜変更することとすればよい。
また、上記各実施形態においては、光源から発せられた照明光をシリンドリカルレンズ９により照明光軸に沿う平面に沿ってシート状に集光させることにより、サンプルＳの移動方向に直交する平面に沿う平面状の照明光を生成している。これに代えて、例えば、軸対象レンズ（図示略）により線状ビームを照明光軸に沿って集光させ、ガルバノスキャナのような光偏向手段（図示略）によりその線状ビームを照明光軸に沿う方向およびサンプルＳの移動方向の両方に直交する方向に走査することで、平面状の照明光を生成することとしてもよい。この場合、カメラ１３の露光時間内に１つの観察面を走査することとすればよい。
また、上記各実施形態においては、シリンドリカルレンズ９によって観察視野よりも大きい面積のシート状に照明光を集光させているが、例えば、シリンドリカルレンズによって観察視野（観察視野の大きさ）よりも小さい面積のシート状にビームを集光させて、そのビームを光偏向手段（図示略）により照明光軸に沿う方向およびサンプルＳの移動方向の両方に直交する方向に走査することとしてもよい。
１ ライトシート顕微鏡
３ 管路
３ｂ 迂回部
３ｃ 屈曲部
４ａ 注入口
４ｄ 排出口
７ シリンジポンプ（サンプル移動部）
９ シリンドリカルレンズ（照明部）
１１ 対物レンズ
１３ カメラ（撮像部）
１７ 弁
２３ 照準部
Ｓ２ 注入ステップ
Ｓ４ 照明ステップ
Ｓ５ サンプル流通ステップ
Ｓ６ 撮像ステップ
Ｌ 培養液（液体）
Ｏ シリコーンオイル（イマージョン液）
Ｓ サンプル（標本）

Claims (20)

  1. サンプルが流通可能な管路と、
    該管路内を該管路に沿って前記サンプルを移動させるサンプル移動部と、
    該サンプル移動部による前記サンプルの移動方向に交差する平面に沿う平面状の照明光を前記管路内に入射させる照明部と、
    該照明部により前記管路内に入射される前記照明光の照射面に対面して配され、前記サンプル移動部により前記サンプルが前記照明光の照射面を通過させられることによって前記サンプルから発せられる蛍光を集光する対物レンズと、
    該対物レンズにより集光された前記サンプルからの蛍光を撮像する撮像部とを備えるライトシート顕微鏡。
  2. 前記サンプル移動部が、前記管路に沿って前記サンプルを連続的にまたは断続的に移動させ、
    前記撮像部が、前記照明光の照射面を通過する前記サンプルの画像を時間的に所定の間隔を空けて複数撮像する請求項１に記載のライトシート顕微鏡。
  3. 前記サンプル移動部が、前記撮像部の露光時間内において前記対物レンズの焦点範囲を超えないように前記サンプルを連続的に移動させる請求項２に記載のライトシート顕微鏡。
  4. 前記管路が、前記照明光の照射面と前記対物レンズとの間に該対物レンズの光軸に交差する方向に屈曲する屈曲部を有する請求項１から請求項３のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  5. 前記管路が、前記サンプルが注入される注入口と、前記照明光の照射面よりも鉛直方向下方を迂回する迂回部とを有する請求項１から請求項４のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  6. 前記迂回部が、１度に注入される前記サンプルを含む注入物の総量よりも大きい体積を有する請求項５に記載のライトシート顕微鏡。
  7. 前記サンプル移動部が、前記管路に注入された前記サンプルを該サンプルの排出側へ押し出しまたは排出側に吸引するポンプ機構である請求項１から請求項６のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  8. 前記サンプル移動部が、前記管路に注入された前記サンプルを排出側へ押し出すポンプ機構であり、
    前記管路が、前記注入口と前記ポンプ機構の開口との間に弁を備える請求項５または請求項６に記載のライトシート顕微鏡。
  9. 前記サンプルを収容可能な容器を設置可能な容器設置部を備え、
    前記管路が、前記照明光の照射面を通過した前記サンプルを排出する排出口を有し、
    該排出口が、前記容器設置部の近傍に配置されている請求項１から請求項８のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  10. 前記サンプルが、３次元的な構造を有する培養細胞であり、培養液と共に前記管路を流通される請求項１から請求項９のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  11. 前記管路における少なくとも前記照明部が対面する領域および前記対物レンズが対面する領域が、前記サンプルと共に前記管路に注入される液体の屈折率と略等しい屈折率を有する透明部材により形成されている請求項１から請求項１０のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  12. 前記管路が、前記サンプルと共に前記管路に注入される液体の屈折率と略等しい屈折率を有する透明部材からなる筐体の貫通孔により形成されている請求項１から請求項１０のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  13. 前記管路が、前記照明光の照射面に交差する一平面内においてのみ屈曲する形状を有する請求項１２のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  14. 前記筐体が、前記管路の長手方向に沿って少なくとも２分割された複数の筐体構成部材を貼り合わせることにより形成されている請求項１３に記載のライトシート顕微鏡。
  15. 前記対物レンズが液浸対物レンズであり、
    前記透明部材と前記対物レンズとの間に、前記透明部材の屈折率に略等しい屈折率を有するイマージョン液が充填されている請求項１２から請求項１４のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  16. 前記イマージョン液が非揮発性を有する請求項１５に記載のライトシート顕微鏡。
  17. 前記対物レンズを光軸方向に移動させる照準部を備える請求項１から請求項１６のいずれかに記載のライトシート顕微鏡。
  18. 前記照準部が、前記照明光の照射面に対する前記対物レンズの光軸方向の合焦状態を調節する自動焦点機能を有する請求項１７に記載のライトシート顕微鏡。
  19. 管路にサンプルを注入する注入ステップと、
    前記管路における前記サンプルの流通方向に交差する平面に沿う平面状の照明光を前記管路に入射させる照明ステップと、
    前記管路内において前記サンプルを流通させて、前記照明ステップにより前記管路内に入射されている前記照明光の照射面を通過させるサンプル流通ステップと、
    前記照明光の照射面を通過させられることによって前記サンプルから発せられる蛍光を撮像する撮像ステップとを含むサンプル観察方法。
  20. 前記サンプル流通ステップが、前記管路に沿って前記サンプルを連続的にまたは断続的に流通させ、
    前記撮像ステップが、前記照明光の照射面を通過する前記サンプルの画像を時間的に所定の間隔を空けて複数撮像する請求項１９に記載のサンプル観察方法。
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