JP2018185456A - 顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】液浸対物レンズと媒質容器との間にイマージョン液を安定して保持することができ、装置の保守を簡単にするとともに信頼性を向上する。
【解決手段】サンプルＳと共にキュベット溶液Ｗ１を収容するキュベット３が浸漬されるチャンバ溶液Ｗ２を貯留するチャンバ５と、チャンバ５の外部に配され、サンプルＳから発せられる光を集光する液浸対物レンズ９と、液浸対物レンズ９により集光された光を検出する検出光学系１３と、チャンバ５内でキュベット３を少なくとも液浸対物レンズ９の光軸に沿う方向に移動可能に支持する電動ＸＹＺステージ７とを備え、キュベット３およびチャンバ５が、サンプルＳからの光を透過可能な透明部３ｂ，５ｂをそれぞれ有し、液浸対物レンズ９が、チャンバ５の透明部５ｂを介してキュベット３の透明部３ｂに対向して配置され、かつ、チャンバ５の透明部５ｂとの間に液浸溶液Ｗ３を介して配置される顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。

従来、サンプル容器に溶液とともに収容したサンプルを観察する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１には、キュベットのようなサンプル容器に第１液浸媒質とともにサンプルが収容され、さらに第１液浸媒質と同等の屈折率を有する第２液浸媒質が貯留された媒質容器内の第２液浸媒質にそのサンプル容器が浸漬され、鉛直方向と直交する方向に光軸を有する検出用対物レンズの少なくとも先端レンズが媒質容器内の第２液浸媒質に浸漬されるように、また、媒質容器内の第２液浸媒質が外部に漏れ出ないように検出用対物レンズが固定され、サンプル容器がＸＹＺ−θ（θの回転軸は鉛直方向）ステージで駆動されてサンプルの断層像が得られるような構造のライトシート顕微鏡が開示されている。

このような構造により、サンプルの撮像位置を変化させても屈折率の変化が最小限に抑えられ、シート照明位置との焦点ズレや球面収差の発生の少ない検出がなされる。サンプルの屈折率と第１液浸媒質の屈折率が第２液浸媒質の屈折率と完全に同じであれば、サンプルの撮像位置が変化しても焦点や球面収差の発生に変化は生じない。実際には、サンプルの屈折率に第１液浸媒質の屈折率と第２液浸媒質の屈折率を完全に合わせることはできず、またサンプルの屈折率も場所により異なるので、サンプルの移動によりシート照明位置との焦点ズレがわずかに生じたり収差が変化したりする。なお、共焦点顕微鏡や多光子励起顕微鏡では対物レンズが照明と検出で共通光路になっているので、上述した焦点に変化は生じない。ただし収差は変化する。

国際公開第２０１５／１８４１２４号

しかしながら、特許文献１に記載のライトシート顕微鏡の構成は、検出用対物レンズの保守、例えば、先端レンズの洗浄が容易ではなく、また、Ｏリング等による第２液浸媒質のシーリングがなされているので、シーリングの劣化等、媒質容器の保守にも手間がかかるという問題の他に、サンプルや観察目的に応じたものに対物レンズを切り替えられないという欠点がある。

上述したように、特許文献１に記載の顕微鏡には、対物レンズとして光学分解能の高い液浸対物レンズが利用されるが、一般的に液浸対物レンズには２つの使い方が知られている。１つは正立型顕微鏡に組み合わされて、例えばシャーレのようなサンプル容器に溶液とともに収容されたサンプルを観察するために、液浸対物レンズの先端部を溶液に浸漬させて観察する方法である。他方は、倒立型顕微鏡で、シャーレ底部の透明部を介してサンプルからの光を集光するために、シャーレ底面と対物レンズの先端部との間にイマージョン液を充填して観察する方法である。

前者はサンプルの汚染の問題や滅菌等のメインテナンスの問題、更にサンプル容器が邪魔となって対物レンズの切り替えが困難であるという特許文献１に記載の顕微鏡と同様の問題があり、後者のようなシャーレ底面を介してサンプルからの光を対物レンズで検出する方法が望ましいことは言うまでもない。

ところが、後者の方法では、サンプルの観察目的位置に焦点を合わせるためにサンプルと液浸対物レンズとの相対位置が調整されるが、大きなＷＤ（working distance）、例えば８ｍｍのＷＤを有するような液浸対物レンズを倒立型顕微鏡に組み合わせて、大きなサンプル、例えば、液浸対物レンズの光軸方向に６ｍｍの厚さを有するサンプルのＸＹＺスタック画像を取得しようとした場合、シャーレの底面近傍にあるサンプルの場所からサンプル上部までを観察するのにイマージョン液はほぼ８ｍｍ〜２ｍｍの厚さに変化する。サンプルの観察位置に応じてイマージョン液の厚さが大きく変化するこのような条件で、イマージョン液を保持することははなはだ困難である。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、液浸対物レンズと媒質容器との間にイマージョン液を安定して保持することができ、装置の保守が簡単で信頼性の高い顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本と共に第１液浸媒質を収容する標本容器が浸漬される第２液浸媒質を貯留する媒質容器と、該媒質容器の外部に配され、前記標本から発せられる光を集光する液浸対物レンズと、該液浸対物レンズにより集光された前記光を検出する検出光学系と、前記媒質容器内で前記標本容器を少なくとも前記液浸対物レンズの光軸に沿う方向に移動可能に支持する可動ステージとを備え、前記標本容器および前記媒質容器が、前記標本からの前記光を透過可能な透明部をそれぞれ有し、前記液浸対物レンズが、前記媒質容器の前記透明部を介して前記標本容器の前記透明部に対向して配置され、かつ、前記媒質容器の前記透明部との間に第３液浸媒質を介して配置される顕微鏡である。

本態様によれば、標本が第１液浸媒質と共に標本容器に収容されて、媒質容器内の第２液浸媒質に標本容器ごと浸漬される。そして、標本から発せられる光が、第１液浸媒質、標本容器の透明部、第２液浸媒質、媒質容器の透明部および第３液浸媒質を介して液浸対物レンズにより集光されて、検出光学系により検出される。したがって、可動ステージにより、媒質容器内で標本容器を液浸対物レンズの光軸に沿う方向に移動させることで、液浸対物レンズの光軸に交差する標本の断層像を取得することができる。

この場合において、可動ステージにより媒質容器内で標本容器を移動させて観察位置を変更しても、液浸対物レンズと媒質容器との相対位置は変化しないので、液浸対物レンズの先端と媒質容器の透明部との間に配されている第３液浸媒質の厚さが変化することはない。よって、観察位置の変更によって第３液浸媒質が液切れすることはなく、また、液浸対物レンズの先端と媒質容器の透明部との間に第３液浸媒質を大量に用意したり頻繁に補給したりしなくて済む。したがって、液浸対物レンズと媒質容器との間に第３液浸媒質を安定して保持することができ、装置の保守を簡単にするとともに信頼性を向上することができる。

上記態様においては、前記媒質容器の前記透明部と前記液浸対物レンズとの間に前記第３液浸媒質を供給する液供給器を備えることとしてもよい。
このように構成することで、液供給器により、媒質容器の透明部と液浸対物レンズとの間に第３液浸媒質を容易に補給することができる。例えば、液浸対物レンズを倍率が異なる他の液浸対物レンズに変更した場合や、液浸対物レンズの位置をその光軸に沿う方向に微調整した場合などに有効である。

上記態様においては、前記液浸対物レンズが、鉛直方向に交差する方向に前記光軸を向けて配置され、前記第３液浸媒質が、前記液浸対物レンズと前記媒質容器の前記透明部との間に表面張力により保持されることとしてもよい。
このように構成することで、液浸対物レンズの先端と媒質容器の透明部との間に第３液浸媒質を保持するための機構が必要なく、簡易な構成にすることができる。

上記態様においては、前記標本容器および前記媒質容器が各々の側壁に前記透明部を有し、前記液浸対物レンズが、鉛直方向に略直交する方向に前記光軸を向けて配置されることとしてもよい。
このように構成することで、液浸対物レンズを媒質容器の側方に側壁の透明部に近接させて第３液浸媒質を介して配置することができる。

上記態様においては、前記液浸対物レンズが、前記光軸に沿う方向に移動可能に支持されることとしてもよい。
このように構成することで、検出光学系の光軸に交差する平面に沿って平面状に集光させた励起光を標本に入射させた場合に、励起光の入射平面に液浸対物レンズの焦点面を一致させて、焦点面に沿う広い範囲において発生する光を液浸対物レンズによって１度に集光し、高解像の画像を取得することができる。この場合において、標本の観察位置を変更した場合に、標本内の屈折率分布に応じて液浸対物レンズの焦点位置にずれが生じたとしても、液浸対物レンズの光軸に沿う方向の位置を微調整して、焦点位置のずれを解消することができる。

上記態様においては、前記第１液浸媒質と前記第２液浸媒質とが互いに略同等の屈折率を有することとしてもよい。
このように構成することで、標本の観察位置の変化による球面収差の発生を抑制するとともに、第１液浸媒質と第２液浸媒質とを等間隔にすることができる。

上記態様においては、前記第３液浸媒質が、前記第２液浸媒質と略同等の屈折率を有することとしてもよい。
このように構成することで、球面収差の発生をより抑制することができる。

上記態様においては、前記検出光学系が、球面収差を調整する球面収差調整機構を備えることとしてもよい。
このように構成することで、観察位置を変更することによって球面収差が変化したとしても、球面収差調整機構により球面収差を補正することができる。

上記態様においては、前記可動ステージの移動に伴い前記球面収差調整機構を制御して、前記球面収差を補正する制御部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、制御部により、観察位置に合わせて球面収差を自動的に補正することができる。

上記態様においては、前記液浸対物レンズを倍率が異なる他の前記液浸対物レンズに切り替えるレンズ切替部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、レンズ切替機構により、液浸対物レンズの倍率を変えて標本を観察することができる。

上記態様においては、前記液浸対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、前記標本から発せられて前記液浸対物レンズにより集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホールを備え、前記検出光学系が、光源から発せられた励起光を前記標本に照射するとともに、前記励起光が照射された前記標本において発生して前記共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を検出することとしてもよい。

このように構成することで、共焦点蛍光画像を取得することができる。この場合において、可動ステージにより媒質容器内で標本容器を移動させて観察位置を変更しても、焦点位置と検出位置が一致しているので、焦点ズレが発生することはない。したがって、液浸対物レンズの焦点位置を微調整することなく、標本の異なる観察位置を共焦点蛍光観察することができる。

上記態様においては、前記液浸対物レンズが、光源から発せられた極短パルスレーザ光を前記標本に照射するとともに、前記極短パルスレーザ光の照射により多光子励起効果によって前記標本において発生する蛍光を集光し、前記検出光学系が、前記液浸対物レンズにより集光された前記蛍光を検出することとしてもよい。

このように構成することで、多光子励起画像を取得することができる。この場合において、可動ステージにより媒質容器内で標本容器を移動させて観察位置を変更しても、焦点位置と検出位置が一致しているので、焦点ズレが発生することはない。したがって、液浸対物レンズの焦点位置を微調整することなく、標本の異なる観察位置を多光子励起観察することができる。

本発明に係る顕微鏡によれば、液浸対物レンズと媒質容器との間にイマージョン液を安定して保持することができ、装置の保守を簡単にするとともに信頼性を向上することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡を水平方向（Ｙ方向）に見た概略構成図である。 本発明の第２実施形態に係る顕微鏡を鉛直方向（Ｚ方向）に見た概略構成図である。 図２のＡ−Ａ断面図である。 本発明の第３実施形態に係る顕微鏡を鉛直方向（Ｚ方向）に見た概略構成図である。 図４のＢ−Ｂ断面図である。 本発明の第４実施形態に係る顕微鏡を水平方向（Ｙ方向）に見た概略構成図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、倒立型の共焦点顕微鏡を構成している。この顕微鏡１は、サンプル（標本）Ｓを収容するキュベット（標本容器）３と、キュベット３を収容可能なチャンバ（媒質容器）５と、キュベット３を支持する電動ＸＹＺステージ（可動ステージ）７と、チャンバ５の外部において複数の液浸対物レンズ９を支持するレボルバ（レンズ切替部）１０と、液浸対物レンズ９を介してキュベット３内のサンプルＳにレーザ光（励起光）を照射する照明光学系１１と、レーザ光の照射によりサンプルＳにおいて発生する蛍光を液浸対物レンズ９を介して検出する検出光学系１３と、電動ＸＹＺステージ７、レボルバ１０、照明光学系１１および検出光学系１３を制御したり画像を生成したりする制御器（制御部）１５とを備えている。

キュベット３は、上部に開口部３ａを有し、底部にレーザ光および蛍光を透過可能な透明部３ｂを有している。このキュベット３には、透明化溶液等のキュベット溶液（第１液浸媒質）Ｗ１が貯留され、キュベット溶液Ｗ１にサンプルＳが浸漬されている。サンプルＳは、キュベット溶液Ｗ１に浸漬されることで透明になっている。

チャンバ５は、キュベット３よりも容積が大きく、上部に開口部５ａを有し、底部にレーザ光および蛍光を透過可能な透明部５ｂを有している。このチャンバ５には、キュベット溶液Ｗ１と屈折率が略等しいチャンバ溶液（第２液浸媒質）Ｗ２が貯留され、そのチャンバ溶液Ｗ２内にキュベット３が浸漬されている。

電動ＸＹＺステージ７は、キュベット３の上部を保持し、キュベット３をチャンバ５の開口部５ａからチャンバ溶液Ｗ２内に浸漬させた状態に支持するようになっている。また、電動ＸＹＺステージ７は、チャンバ５内で、鉛直方向（Ｚ方向）および鉛直方向に交差し互いに直交する方向（Ｘ方向およびＹ方向）にキュベット３を移動させることができるようになっている。

複数の液浸対物レンズ９は、互いに倍率が異なり、それぞれ図示しない多数のレンズを組み合わせて構成されている。これら液浸対物レンズ９は、チャンバ５の外部の下方において、レボルバ１０により鉛直上向きに保持されている。また、これら液浸対物レンズ９は、レボルバ１０により、照明光学系１１および検出光学系１３の光軸Ｑ上に択一的に挿入されて、チャンバ５の底部の透明部５ｂとの間に液体を表面張力により保持可能な隙間をあけて配置されるようになっている。レボルバ１０により、例えば、観察の目的に応じて使用する液浸対物レンズ９を切り替えることができる。

光軸Ｑ上に挿入された液浸対物レンズ９の最先端のレンズの上面９ａとチャンバ５の底部の透明部５ｂとの隙間には、先端部にノズル１７ａを有する水補給器（液供給器）１７により、液浸溶液（第３液浸媒質）Ｗ３を供給することができるようになっている。

液浸対物レンズ９の上面９ａとチャンバ５の透明部５ｂとの隙間に注入された液浸溶液Ｗ３は、表面張力によってその隙間内に保持されるようになっている。液浸溶液Ｗ３は、例えば、シリコーン液であり、キュベット溶液Ｗ１およびチャンバ溶液Ｗ２と略同等の屈折率を有している。

照明光学系１１は、レーザ光を発生するレーザ光源１９と、レーザ光源１９から発せられたレーザ光を導光する光ファイバ２１と、光ファイバ２１により導光されてきたレーザ光を平行光束に変換するコリメートレンズ２３とを備えている。

また、照明光学系１１は、検出光学系１３と共通の光学系として、コリメートレンズ２３により平行光束に変換されたレーザ光を反射するダイクロイックミラー２５と、ダイクロイックミラー２５により反射されたレーザ光を２次元的に走査させるＸＹスキャナ２７と、ＸＹスキャナ２７により走査されたレーザ光をリレーするリレーレンズ２９と、リレーレンズ２９によりリレーされるレーザ光を反射する反射ミラー３１と、反射ミラー３１により反射されたレーザ光を集光する結像レンズ３３とを備えている。

ダイクロイックミラー２５は、コリメートレンズ２３からのレーザ光を反射する一方、サンプルＳから発せられて液浸対物レンズ９、結像レンズ３３、反射ミラー３１、リレーレンズ２９およびＸＹスキャナ２７を介してレーザ光の光路を戻る蛍光を透過させるようになっている。

検出光学系１３は、結像レンズ３３、反射ミラー３１、リレーレンズ２９、ＸＹスキャナ２７およびダイクロイックミラー２５の他、ダイクロイックミラー２５を透過した蛍光を集光する共焦点レンズ３５と、共焦点レンズ３５により集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホール３７と、共焦点ピンホール３７を通過した蛍光を検出する光電子増倍管等の光検出器３９とを備えている。

共焦点ピンホール３７は、液浸対物レンズ９の焦点位置と共役な位置に配置されており、共焦点レンズ３５により集光された蛍光の内、サンプルＳにおける液浸対物レンズ９の焦点位置において発生した蛍光のみを通過させるようになっている。
光検出器３９は、検出した蛍光の強度に相当する光強度信号を生成して制御器１５に送るようになっている。

制御器１５は、例えば、ＣＰＵ(Central Processing Unit）と、ＲＯＭ（Read Only Memory）およびＲＡＭ（Random Access Memory）等の主記憶部と、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）等の補助記憶部と、ユーザが指示を入力する入力部と、データを出力する出力部と、外部機器との間で種々のデータのやりとりを行う外部インタフェース等（いずれも図示略）を備えている。補助記憶部には各種プログラムが格納されており、ＣＰＵが補助記憶部からプログラムをＲＡＭ等の主記憶部に読み出して、そのプログラムを実行することにより、種々の処理が実現されるようになっている。

具体的には、制御器１５は、プログラムの実行により、電動ＸＹＺステージ７によるキュベット３のＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動を制御するようになっている。また、制御器１５は、プログラムの実行により、レーザ光源１９および光検出器３９を制御したり、レボルバ１０による液浸対物レンズ９の切り替えや、液浸対物レンズ９の切り替え時における水補給器１７による液浸溶液Ｗ３の補給を制御したりするようになっている。さらに、制御器１５は、光検出器３９から出力される光強度信号に基づいて、サンプルＳの画像を生成するようになっている。

このように構成された顕微鏡１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１によりサンプルＳを観察するには、まず、制御器１５により電動ＸＹＺステージ７を駆動し、サンプルＳとキュベット溶液Ｗ１が収容されたキュベット３をチャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２に浸漬して、サンプルＳの目的の観察位置を光軸Ｑ上に移動させる。

次いで、制御器１５により、レーザ光源１９からレーザ光を発生させる。レーザ光源１９から発せられたレーザ光は、光ファイバ２１により導光されてコリメートレンズ２３により平行光束に変換された後、ダイクロイックミラー２５により反射されてＸＹスキャナ２７により２次元的に走査され、リレーレンズ２９、反射ミラー３１および結像レンズ３３を介して液浸対物レンズ９により集光される。

液浸対物レンズ９により集光されたレーザ光は、液浸溶液Ｗ３を介してチャンバ５の底部の透明部５ｂを透過し、チャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２、キュベット３の底部の透明部３ｂ、キュベット溶液Ｗ１を介して、光軸Ｑに沿ってサンプルＳに照射される。サンプルＳにレーザ光が照射されることにより、サンプルＳ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

サンプルＳにおいて発生した蛍光の内、光軸Ｑに沿う方向に放射された蛍光は、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の底部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、チャンバ５の底部の透明部５ｂおよび液浸溶液Ｗ３を介してレーザ光の光路を戻り、液浸対物レンズ９により集光される。

液浸対物レンズ９により集光された蛍光は、結像レンズ３３、反射ミラー３１、リレーレンズ２９およびＸＹスキャナ２７を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２５を透過して共焦点レンズ３５により集光される。共焦点レンズ３５により集光された蛍光の内、液浸対物レンズ９の焦点位置において発生した蛍光は共焦点ピンホール３７を通過し、光検出器３９により検出される。そして、光検出器３９から出力される光強度信号に基づいて、制御器１５によりサンプルＳの２次元的な画像が生成される。

制御器１５により、電動ＸＹＺステージ７を駆動し、チャンバ５内でキュベット３をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させることで、サンプルＳの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。

この場合において、チャンバ５内でキュベット３を移動させてサンプルＳの観察位置を変更しても、液浸対物レンズ９とチャンバ５との相対位置は変化しないので、液浸対物レンズ９の先端とチャンバ５の底部の透明部５ｂとの間に配されている液浸溶液Ｗ３の厚さは変化しない。よって、観察位置の変更によって液浸溶液Ｗ３が液切れすることはなく、また、液浸対物レンズ９の先端とチャンバ５の透明部５ｂとの間に液浸溶液Ｗ３を大量に用意したり頻繁に補給したりしなくて済む。特に、液浸溶液Ｗ３として用いるシリコーン液は非揮発性なので液切れし難く、液浸溶液Ｗ３を頻繁に補給することなく長時間の観察を実現することができる。

また、チャンバ５内でキュベット３を移動させて観察位置を変更しても、レーザ光の焦点位置と蛍光の検出位置が一致しているので、焦点ズレが発生することはない。よって、液浸対物レンズ９の焦点位置を微調整することなく、サンプルＳの異なる観察位置の断層像を共焦点蛍光観察することができる。
したがって、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、液浸対物レンズ９とチャンバ５との間に液浸溶液Ｗ３を安定して保持することができ、装置の保守を簡単にするとともに信頼性を向上することができる。

本実施形態においては、キュベット溶液Ｗ１とチャンバ溶液Ｗ２とが略等しい屈折率を有することとした。球面収差の観点から、キュベット溶液Ｗ１とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率は互いに略等しいことが理想だが、キュベット溶液Ｗ１とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率が互いに異なることしてもよい。例えば、キュベット溶液Ｗ１は透明化溶液であるが、コストの観点から、チャンバ溶液Ｗ２は同じ透明化溶液を使うのではなく、屈折率が近くコストの低い溶液を使うこととしてもよい。

また、本実施形態に係る顕微鏡１では、観察位置の変更による焦点ズレは発生しないが、光軸Ｑに沿う方向のサンプルＳの複数の断層像（スタック画像）を得る場合に、各断層像の観察位置が物理的に等間隔ではなくなる。よって、例えば、液浸対物レンズ９の位置を光軸Ｑに沿う方向に微調整する照準部を設けて、複数の断層像の間隔が等間隔になるように補正してもよい。

また、本実施形態においては、液浸溶液Ｗ３がチャンバ溶液Ｗ２およびキュベット溶液Ｗ１と略同等の屈折率を有していることとしたが、液浸溶液Ｗ３がチャンバ溶液Ｗ２およびキュベット溶液Ｗ１と異なる屈折率を有するものであってもよい。その場合、予め、液浸対物レンズ９に補正環（球面収差調整機構）等を設け、補正環等により球面収差を補正しておけばよい。なお、観察位置を変更すると球面収差は変化するので、例えば、制御器１５による制御または手動で、補正環により観察位置に合わせて球面収差を補正することとしてもよい。

また、本実施形態においては、液浸溶液Ｗ３としてシリコーン液を例示したが、これに代えて、例えば、純水等を採用することとしてもよい。水は安価であり、給水が容易に行えるという利点がある。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡４１は、図２および図３に示すように、多光子励起顕微鏡を構成する点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

顕微鏡４１は、キュベット３と、チャンバ５と、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向への移動に加え、Ｚ方向に沿う所定の回転軸回りに回転可能な電動ＸＹＺ−θステージ４３と、液浸対物レンズ９およびレボルバ１０と、照明光学系１１と、検出光学系１３と、制御器１５とを備えている。この顕微鏡４１は、照明光学系１１および検出光学系１３の光軸ＱがＹ方向に沿って配置されている。

本実施形態においては、キュベット３は、側壁部の周方向の全域に亘って、レーザ光および蛍光を透過可能な透明部３ｂを有している。チャンバ５も少なくとも１つの側壁部にレーザ光および蛍光を透過可能な透明部３ｂを有している。

複数の液浸対物レンズ９は、レボルバ１０により、チャンバ５の側壁部の透明部３ｂに面して水平横向きに保持されている。これら液浸対物レンズ９は、レボルバ１０により、照明光学系１１および検出光学系１３の光軸Ｑ上に択一的に挿入されて、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂとの間に表面張力によって液浸溶液Ｗ３を保持可能な間隔をあけて対向して配置されるようになっている。

照明光学系１１は、レーザ光源１９に代えて、極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源４５を備えるとともに、ＸＹスキャナ２７と、リレーレンズ２９と、結像レンズ３３と、検出光学系１３と共通のダイクロイックミラー２５とを備えている。

本実施形態においては、ダイクロイックミラー２５は、液浸対物レンズ９と結像レンズ３３との間に配置されており、結像レンズ３３からのレーザ光を透過させる一方、液浸対物レンズ９により集光されてレーザ光の光路を戻る蛍光を反射するようになっている。

検出光学系１３は、ダイクロイックミラー２５の他、ダイクロイックミラー２５により反射された蛍光を集光する集光レンズ４７と、集光レンズ４７により集光された蛍光を検出する光検出器３９とを備えている。

このように構成された顕微鏡４１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡４１によりサンプルＳを観察するには、制御器１５により電動ＸＹＺステージ７を駆動し、サンプルＳとキュベット溶液Ｗ１が収容されたキュベット３をチャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２に浸漬して目的の観察位置を光軸Ｑ上に移動させ、レーザ光源４５から極短パルスレーザ光を発生させる。

レーザ光源４５から発せられた極短パルスレーザ光（以下、単にレーザ光とする。）は、ＸＹスキャナ２７により２次元的に走査されてリレーレンズ２９によりリレーされた後、反射ミラー３１により反射されて結像レンズ３３により集光され、ダイクロイックミラー２５を透過して液浸対物レンズ９により集光される。

液浸対物レンズ９により集光されたレーザ光は、液浸溶液Ｗ３を介してチャンバ５の側壁部の透明部５ｂを透過し、チャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２、キュベット３の側壁部の透明部３ｂ、キュベット溶液Ｗ１を介して、光軸Ｑに沿ってサンプルＳに照射される。サンプルＳに極短パルスレーザ光が照射されることにより、サンプルＳ内の照射位置において多光子励起効果によって蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

サンプルＳにおいて多光子励起効果によって発生した蛍光の内、光軸Ｑに沿う方向に放射された蛍光は、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の側壁部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂおよび液浸溶液Ｗ３を介してレーザ光の光路を戻り、液浸対物レンズ９により集光される。

液浸対物レンズ９により集光された蛍光は、ＸＹスキャナ２７に戻ることなくダイクロイックミラー２５により反射されて、集光レンズ４７により集光されて光検出器３９により検出される。そして、光検出器３９から出力される光強度信号に基づいて、制御器１５によりサンプルＳの２次元的な画像が生成される。

制御器１５により、電動ＸＹＺステージ７を駆動し、チャンバ５内でキュベット３をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させることで、サンプルＳの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。また、制御器１５により、電動ＸＹＺ−θステージ４３をＺ方向に沿う所定の回転軸回りに回転させて、キュベット３を回転軸回りに反転させることにより、サンプルＳの液浸対物レンズ９から遠かった領域を液浸対物レンズ９に近接させることができる。これにより、サンプルＳの全域に亘って良好なサンプル画像を得られる。

この場合において、チャンバ５内でキュベット３を移動させてサンプルＳの観察位置を変更しても、液浸対物レンズ９とチャンバ５との相対位置は変化しないので、液浸対物レンズ９の先端とチャンバ５の底部の透明部５ｂとの間に配されている液浸溶液Ｗ３の厚さは変化しない。よって、液浸溶液Ｗ３を大量に用意したり頻繁に補給したりしなくて済む。また、レーザ光の焦点位置と蛍光の検出位置が一致しているので、焦点ズレが発生することはない。よって、液浸対物レンズ９の焦点位置を微調整することなく、サンプルＳの異なる観察位置の断層像を多光子励起観察することができる。

したがって、本実施形態に係る顕微鏡１によっても、液浸対物レンズ９とチャンバ５との間に液浸溶液Ｗ３を安定して保持することができ、装置の保守を簡単にするとともに信頼性を向上することができる。

〔第３実施形態〕
本実施形態に係る顕微鏡５１は、図４および図５に示すように、ライトシート顕微鏡を構成する点で第１実施形態および第２実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡１および第２実施形態に係る顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

顕微鏡５１は、キュベット３と、チャンバ５と、電動ＸＹＺ−θステージ４３と、液浸対物レンズ９およびレボルバ１０と、レボルバ１０を液浸対物レンズ９の光軸に沿う方向に移動させる照準部５３と、照明光学系１１と、検出光学系１３と、制御器１５とを備えている。図５において、符号５５はドレインタンクを示している。この照明光学系１１はＹ方向に沿う光軸Ｑを有し、検出光学系１３はＸ方向に沿う

Ｐを有している。

本実施形態においては、キュベット３は、側壁部の周方向の全域に亘って透明部３ｂを有している。チャンバ５は、互いに隣接する２つの側壁部に透明部５ｂを有している。

液浸対物レンズ９は、レボルバ１０により、チャンバ５の一方の側壁部の透明部３ｂに面して水平横向きに保持されている。これら液浸対物レンズ９は、レボルバ１０により、照明光学系１１の光軸Ｑ上に択一的に挿入されて、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂに表面張力によって液浸溶液Ｗ３を保持する間隔をあけて対向して配置されるようになっている。また、本実施形態においては、液浸対物レンズ９は、球面収差を調整する電動補正環（球面収差調整機構）５７を備えている。

照明光学系１１は、レーザ光源１９と、光ファイバ２１と、コリメートレンズ２３と、コリメートレンズ２３により平行光束にされたレーザ光を集光するシリンドリカルレンズ５９と、シリンドリカルレンズ５９により集光されたレーザ光の光束径を変更可能な可変絞り６１とを備えている。

シリンドリカルレンズ５９は、照明光学系１１の光軸Ｑに直交する一方向にパワーを有している。このシリンドリカルレンズ５９は、略平行光束からなるレーザ光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有する平面状に集光して、液浸対物レンズ９の光軸上で焦点を結ばせるようになっている。

可変絞り６１は、シリンドリカルレンズ５９とチャンバ５の他方の側壁部の透明部５ｂとの間に配置されている。可変絞り６１によりレーザ光の光束径を変更することで、シリンドリカルレンズ５９により平面状に集光されたレーザ光の厚さを変更できる。この変更は光路に挿入する液浸対物レンズ９に応じて行われる。

光ファイバ２１の先端部２１ａ、コリメートレンズ２３、シリンドリカルレンズ５９および可変絞り６１は、チャンバ５の他方の側壁部の透明部５ｂに対向して配置されており、レーザ光源１９から発せられたレーザ光をチャンバ５の他方の側壁部の透明部５ｂおよびキュベット３の側壁部の透明部３ｂを介してサンプルＳに入射させるようになっている。

検出光学系１３は、液浸対物レンズ９により集光された蛍光を反射する反射ミラー３１と、反射ミラー３１により反射された蛍光を結像させる結像レンズ３３と、結像レンズ３３により結像された蛍光を撮影するカメラ６３とを備えている。

照準部５３は、液浸対物レンズ９の最先端のレンズの上面９ａとチャンバ５の底部の透明部５ｂとの隙間で液浸溶液Ｗ３の表面張力が働く範囲内で、液浸対物レンズ９を光軸に沿う方向に微動させることにより、液浸対物レンズ９の焦点位置を検出光学系１３の光軸Ｐに沿う方向に微調整することができる。

制御器１５は、レーザ光源１９およびカメラ６３の制御、電動ＸＹＺ−θステージ４３の制御、レボルバ１０の制御、水補給器１７の制御、画像生成の他に、可変絞り６１によるレーザ光の光束径の調整と、電動ＸＹＺ−θステージ４３の移動に伴う電動補正環５７による球面収差の補正と、照準部５３による検出光学系１３の光軸Ｐに沿う方向の液浸対物レンズ９の位置の微調整とを制御するようになっている。

このように構成された顕微鏡５１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡５１によりサンプルＳを観察するには、まず、制御器１５により電動ＸＹＺ−θステージ４３を駆動し、サンプルＳとキュベット溶液Ｗ１が収容されたキュベット３をチャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２に浸漬して目的の観察位置を光軸Ｑおよび光軸Ｐ上に移動させ、レーザ光源１９からレーザ光を発生させる。

レーザ光源１９から発せられたレーザ光は、光ファイバ２１により導光されてシリンドリカルレンズ５９により平行光束にされた後、シリンドリカルレンズ５９により平面状に集光されて可変絞り６１を通過し、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂを透過してチャンバ５内に入射される。

チャンバ５内に入射されたレーザ光は、チャンバ溶液Ｗ２、キュベット３の側壁部の透明部３ｂ、キュベット溶液Ｗ１を介して、検出光学系１３の光軸Ｐに直交する方向からサンプルＳに入射される。サンプルＳに平面状のレーザ光が入射することにより、レーザ光の入射平面に沿ってサンプルＳ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

サンプルＳにおいて発生した蛍光の内、検出光学系１３の光軸Ｐに沿う方向に放射された蛍光は、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の側壁部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、チャンバ５の側壁部の透明部５ｂおよび液浸溶液Ｗ３を介して液浸対物レンズ９により集光される。

液浸対物レンズ９により集光された蛍光は、反射ミラー３１により反射されて結像レンズ３３によりカメラ６３の撮像面上に結像される。これにより、カメラ６３において、サンプルＳの光軸Ｐに直交する断層像が得られる。そして、制御器１５により電動ＸＹＺ−θステージ４３を駆動して、チャンバ５内でキュベット３をＸ、Ｙ、Ｚ方向にそれぞれ移動させることで、サンプルＳの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。

また、制御器１５により電動ＸＹＺ−θステージ４３を駆動して、キュベット３をＺ方向に沿う所定の回転軸回りに回転させて液浸対物レンズ９に対するサンプルＳの向きを反転させ、サンプルＳの液浸対物レンズ９から遠かった領域を液浸対物レンズ９に近接させることで、サンプルＳの略全域に亘って良好な画像を取得することができる。

ここで、シリンドリカルレンズ５９の焦点位置と液浸対物レンズ９の光軸（光軸Ｐ）とを一致させるとともに、レーザ光の入射平面に液浸対物レンズ９の焦点面を一致させることにより、液浸対物レンズ９の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を液浸対物レンズ９により１度に集光してカメラ６３により撮影し、サンプルＳにおける観察領域の鮮明な蛍光画像を取得することができる。また、カメラ６３の撮像平面以外にレーザ光が照射されないので、蛍光の褪色を抑えて良好な３次元立体像を得ることができる。

この場合において、チャンバ５内でキュベット３を移動させてサンプルＳの観察位置を変更しても、液浸対物レンズ９とチャンバ５との隙間に配置される液浸溶液Ｗ３の厚さは（焦点の微調整があっても表面張力によりそのまま保持されて）変化しないので、液浸溶液Ｗ３の液切れを防ぐとともに、液浸溶液Ｗ３を大量に用意したりこれを高い頻度で補給したりしなくて済む。

また、サンプルＳの観察位置を変更した場合に、サンプルＳ内の屈折率分布に応じて液浸対物レンズ９の焦点位置にずれが生じたり、キュベット溶液Ｗ１の屈折率とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率との僅かな相違によって液浸対物レンズ９の焦点位置にずれが生じたりしても、照準部５３により、液浸対物レンズ９の光軸Ｐに沿う方向の位置を微調整するだけで焦点位置のずれを解消することができる。また、照準部５３により焦点ズレを補正すると、液浸溶液Ｗ３の液厚さが変わって球面収差が変化するが、制御器１５により電動補正環５７が制御されて、球面収差を補正することができる。

したがって、本実施形態に係る顕微鏡５１によっても、液浸対物レンズ９とチャンバ５との間に液浸溶液Ｗ３を安定して保持することができ、装置の保守を簡単にするとともに信頼性を向上することができる。

本実施形態においては、ライトシート顕微鏡を例示して説明したが、ライトフィールド顕微鏡に適用してもよい。この場合、照明光学系１１が、さらに、負のパワーを有する第２シリンドリカルレンズ（図示略）を備え、シリンドリカルレンズ５９とチャンバ５との間に第２シリンドリカルレンズを配置して、カメラ６３の撮影光軸に沿う方向に厚さを有するレーザ光をサンプルＳに入射させることとすればよい。また、検出光学系１３が、カメラ６３の撮像面に像を投影させる複数のマイクロレンズからなるマイクロレンズアレイと、マイクロレンズアレイ上に結像させる結像レンズ（いずれも図示略）とを備えることとすればよい。このようにすることで、視差が異なる複数の画像情報を１度に取得することができる。

〔第４実施形態〕
次に、本発明の第４実施形態に係る顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡７１は、図６に示すように、発光顕微鏡を構成する点で第１実施形態から第３実施形態と異なる。
以下、第１実施形態から第３実施形態に係る顕微鏡１，４１，５１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

顕微鏡７１は、照明光学系１１を備えず、キュベット３と、チャンバ５と、電動ＸＹＺ−θステージ４３と、液浸対物レンズ９およびレボルバ１０と、照準部５３と、検出光学系１３と、制御器１５とを備えている。この顕微鏡７１は、検出光学系１３の光軸ＰがＺ方向に沿って配置されている。

本実施形態においては、キュベット３は、底部に光を透過可能な透明部３ｂを有している。チャンバ５も、底部に光を透過可能な透明部５ｂを有している。

液浸対物レンズ９は、チャンバ５の外部に底部の透明部５ｂに近接して設けられ、透明部５ｂに対向して鉛直上向きに配置されている。また、液浸対物レンズ９は、チャンバ５の底部の透明部５ｂとの間に表面張力によって液浸溶液Ｗ３を保持可能な間隔をあけて対向して配置されている。本実施形態においても、液浸対物レンズ９は、球面収差を調整する電動補正環５７を備えている。

検出光学系１３は、結像レンズ３３と、カメラ６３とを備えている。
制御器１５は、レボルバ１０の制御と、画像生成の他、電動ＸＹＺ−θステージ４３の移動に伴う電動補正環５７による球面収差の補正と、照準部５３による検出光学系１３の光軸Ｐに沿う方向の液浸対物レンズ９の位置の微調整とを制御するようになっている。

このように構成された顕微鏡７１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡７１によりサンプルＳを観察するには、まず、制御器１５により電動ＸＹＺ−θステージ４３を駆動し、サンプルＳとキュベット溶液Ｗ１が収容されたキュベット３をチャンバ５内のチャンバ溶液Ｗ２に浸漬して目的の観察位置を光軸Ｐ上に移動させる。

サンプルＳの自己発光の内、検出光学系１３の光軸Ｐに沿う方向に放射された発光は、キュベット溶液Ｗ１、キュベット３の底部の透明部３ｂ、チャンバ溶液Ｗ２、チャンバ５の底部の透明部５ｂおよび液浸溶液Ｗ３を介して液浸対物レンズ９により集光され、結像レンズ３３によりカメラ６３の撮像面上に結像される。

これにより、カメラ６３において、サンプルＳの光軸Ｐに直交する断層像が得られる。そして、制御器１５により電動ＸＹＺ−θステージ４３を駆動して、チャンバ５内でキュベット３をＸ、Ｙ、Ｚ方向にそれぞれ移動させることで、サンプルＳの観察位置を変更して、各観察位置の断層像を取得することができる。

この場合において、チャンバ５内でキュベット３を移動させてサンプルＳの観察位置を変更した場合に、サンプルＳ内の屈折率分布に応じて液浸対物レンズ９の焦点位置にずれが生じたり、キュベット溶液Ｗ１の屈折率とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率との僅かな相違によって液浸対物レンズ９の焦点位置にずれが生じたりしても、照準部５３により液浸対物レンズ９を検出光学系１３の光軸Ｐに沿う方向に微調整するだけで焦点位置のずれを解消することができる。

したがって、本実施形態に係る顕微鏡７１によれば、サンプルＳ内に屈折率分布や、キュベット溶液Ｗ１の屈折率とチャンバ溶液Ｗ２の屈折率とに僅かな相違があっても、電動ＸＹＺ−θステージ４３を駆動して等間隔でＺ方向に撮像するスタック画像を取得する際に、照準部５３によって僅かな焦点の微調整を行うことにより等間隔な画像を得ることができ、歪のない３次元画像を構築することができる。また、光源や照明光学系が不要となる分だけシンプルかつ安価な構成にすることができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、上記各実施形態においては、キュベット溶液Ｗ１、チャンバ溶液Ｗ２、液浸溶液Ｗ３、キュベット３の透明部３ｂおよびチャンバ５の透明部５ｂが全て略同等の屈折率を有することとしたが、キュベット３の透明部３ｂの厚さおよびチャンバ５の透明部５ｂの厚さがそれぞれ一定であれば、チャンバ５内でキュベット３を移動させても、励起光および蛍光が透過するキュベット３の透明部３ｂおよびチャンバ５の透明部５ｂの屈折率は変化しないので、少なくともキュベット溶液Ｗ１とチャンバ溶液Ｗ２とが互いに略同等の屈折率を有するものであればよい。

１，４１，５１，７１ 顕微鏡
３ キュベット（標本容器）
３ｂ，５ｂ 透明部
５ チャンバ（媒質容器）
７ 電動ＸＹＺステージ（可動ステージ）
９ 液浸対物レンズ
１０ レボルバ（レンズ切替部）
１３ 検出光学系
１５ 制御器（制御部）
１７ 水補給器（液供給器）
３７ 共焦点ピンホール
４３ 電動ＸＹＺ−θステージ（可動ステージ）
５７ 電動補正環（球面収差調整機構）
Ｓ サンプル（標本）
Ｗ１ キュベット溶液（第１液浸媒質）
Ｗ２ チャンバ溶液（第２液浸媒質）
Ｗ３ 液浸溶液（第３液浸媒質）

Claims (12)

1. 標本と共に第１液浸媒質を収容する標本容器が浸漬される第２液浸媒質を貯留する媒質容器と、
   該媒質容器の外部に配され、前記標本から発せられる光を集光する液浸対物レンズと、
   該液浸対物レンズにより集光された前記光を検出する検出光学系と、
   前記媒質容器内で前記標本容器を少なくとも前記液浸対物レンズの光軸に沿う方向に移動可能に支持する可動ステージとを備え、
   前記標本容器および前記媒質容器が、前記標本からの前記光を透過可能な透明部をそれぞれ有し、
   前記液浸対物レンズが、前記媒質容器の前記透明部を介して前記標本容器の前記透明部に対向して配置され、かつ、前記媒質容器の前記透明部との間に第３液浸媒質を介して配置される顕微鏡。
2. 前記媒質容器の前記透明部と前記液浸対物レンズとの間に前記第３液浸媒質を供給する液供給器を備える請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記液浸対物レンズが、鉛直方向に交差する方向に前記光軸を向けて配置され、
   前記第３液浸媒質が、前記液浸対物レンズと前記媒質容器の前記透明部との間に表面張力により保持される請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記標本容器および前記媒質容器が各々の側壁に前記透明部を有し、
   前記液浸対物レンズが、鉛直方向に略直交する方向に前記光軸を向けて配置される請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記液浸対物レンズが、前記光軸に沿う方向に移動可能に支持される請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡。
6. 前記第１液浸媒質と前記第２液浸媒質とが互いに略同等の屈折率を有する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡。
7. 前記第３液浸媒質が、前記第２液浸媒質と略同等の屈折率を有する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
8. 前記検出光学系が、球面収差を調整する球面収差調整機構を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡。
9. 前記可動ステージの移動に伴い前記球面収差調整機構を制御して、前記球面収差を補正する制御部を備える請求項８に記載の顕微鏡。
10. 前記液浸対物レンズを倍率が異なる他の前記液浸対物レンズに切り替えるレンズ切替部を備える請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡。
11. 前記液浸対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、前記標本から発せられて前記液浸対物レンズにより集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホールを備え、
    前記検出光学系が、光源から発せられた励起光を前記標本に照射するとともに、前記励起光が照射された前記標本において発生して前記共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を検出する請求項１から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡。
12. 前記液浸対物レンズが、光源から発せられた極短パルスレーザ光を前記標本に照射するとともに、前記極短パルスレーザ光の照射により多光子励起効果によって前記標本において発生する蛍光を集光し、
    前記検出光学系が、前記液浸対物レンズにより集光された前記蛍光を検出する請求項１から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡。

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