CN113316734A - 具有转塔透镜的光片显微镜 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于对生物材料进行成像的光片显微镜。该显微镜使用多个光束，其被聚焦到重叠线上，以激发生物样品内的荧光材料。然后分析和显示激光诱导的荧光图像。

Description

具有转塔透镜的光片显微镜

相关申请的交叉引用

该PCT申请要求保护于2018年12月21日提交的美国临时申请序列号62/783231和于2018年6月30日提交的美国临时申请序列号62/7868917的优先权。这些在先申请中的每一个都通过引用整体地并入。

关于联邦资助研究的声明

不适用。

关于微缩胶片附录的声明

不适用。

背景技术

本发明涉及一种用于对生物样品进行成像的系统。

存在使用激光诱导荧光对生物样品进行成像的成像系统。

这些系统中的一些系统可以以令人印象深刻的清晰度、精度和分辨率生成表面下结构的图像。

这些系统中的一些系统采用F-theta扫描机制，其使用快速移动的反射镜将单个聚焦激光扫描到样品中。由于反射镜移动的速度直接确定了图像采集速度，因此这些系统在可以获取数据的速度方面受到限制，这限制了它们能够捕捉到的效果的时间尺度。而且，移动反射镜具有显著的机械复杂性，这增加了成本并且使高分辨率成为问题。

因此，需要的是一种显微镜，其在具有很少的移动零件（parts）、并且没有高速移动的零件的情况下能够以极好的分辨率、对比度和准确度在三个维度上对生物样品进行成像，其具有成本效益且易于使用。

发明内容

本发明的目的是一种显微镜，其具有对内部、表面下结构或设置在样品块中的结构进行精确成像的增强能力。

本发明的目的是一种显微镜，其能够去除测得图像中的噪声，以通过误差校正获得校正图像。

本发明的目的是通过跨样品横向扫描光片（light sheet），并且然后穿过深度正交地扫描光片来创建三维图像。

本发明的目的是一种显微镜，其可以在不影响激发或检测光学器件的情况下使样品发生改变。

本发明的目的是一种显微镜，其可以在不影响激发光学器件的情况下使物镜发生改变。

本发明的目的是一种显微镜，其中，可以在不接触样品或不影响激发或检测光学器件的情况下从澄清流体中取出样品。

本发明的目的是一种显微镜，该显微镜在具有很少的移动零件、并且没有高速移动的零件的情况下以极好的分辨率、对比度和准确度在三个维度上对生物样品进行成像。

描述了一种用于对生物样品进行成像的光片显微镜。在第一实施例中，显微镜可以包括：至少两个准直光源，每个沿着至少两个不同的传播轴发射光束；至少两个光学子组件，其将至少两个光束聚焦成至少两条直线，其中，两条直线中的至少一条相对于其传播轴定义了非正交角，并且其中，至少两条直线基本上重叠，并且其中，直线和传播轴定义了光片显微镜的激发平面。

在另一个实施例中，描述了一种用于对生物样品进行成像的光片显微镜，其可以包括由光学组件聚焦到照亮生物样品的单线焦点的至少一个光源，定义了具有强度分布函数

的激发。该激发可能会使生物样品发射荧光。显微镜还可以包括用于移动单线焦点的装置，其中，单线焦点保持在显微镜的物侧焦平面中，并且由此照亮生物样品中的多个横向相邻方位。显微镜可以进一步包括：采用映射函数

生成三维生物样品的二维图像的成像系统，以及像素化检测器。该像素化检测器可以将样品发射的荧光的显微镜二维图像转换成至少两个原始图像，其中，该像素化检测器具有点扩散函数

和计算机，该计算机可以存储和操纵由像素化检测器产生的信号，并且被编程为通过去除与函数

和

相关联的退化，从原始图像I中产生恢复的像素化图像F.。

在其他实施例中，公开了一种用于对设置在样品架上的第一生物样品进行成像的光片显微镜。在该实施例中，该显微镜可以包括成像透镜结构，该成像透镜结构包括具有焦平面的工作物镜和至少一个非工作透镜，并且其中，成像透镜结构可通过可移动第一载物台在与焦平面正交的z方向上移动。显微镜可以进一步包括保持一定量流体的容器，其中，样品架可浸入流体中；以及包括形成焦平面的图像的检测器，其中，图像包括第一生物样品的至少一部分。支撑透镜结构的可移动第一载物台可以具有足够的移动范围以将工作物镜浸没在保持在容器中的流体中，由此在检测器上形成第一生物样品的图像，并且其中样品架。当成像透镜结构被浸没时，容器可以具有接纳（admit）成像透镜结构移动的形状。

在又其他实施例中，公开了一种用于对位于样品架上的生物样品进行成像的光片显微镜。该显微镜可以包括通过成像光学器件形成生物样品的图像的检测器，其中，生物样品被设置在成像光学器件的焦平面中。该显微镜可以进一步包括保持一定量流体并且设置在可移动第一载物台上的容器，该可移动第一载物台可在z方向上移动，其中，z方向与焦平面正交，样品架保持生物样品。在该实施例中，生物样品可以浸入流体中，并且生物样品可以处于焦平面中，其中，第一载物台具有一定运动范围，使得样品既可以浸入流体中又可以处于焦平面中，并且然后可以通过第一载物台的运动从流体中取出，其中，第一载物台独立于样品架、成像光学器件和检测器移动容器。

这些和其他特征和优点在以下详细描述和附图中描述或从以下详细描述和附图中变得明显。

附图说明

参照以下附图描述了各种示例性细节，其中：

图1是生物成像设备中的线焦点(line focus)的图示，其中，该线焦点相对于辐射传播的轴线倾斜；

图2是具有两个辐射传播轴的生物成像设备中的两个重叠线焦点的图示；

图3是具有三个辐射传播轴的生物成像设备中的三个重叠线焦点的图示；

图4是具有三个辐射传播轴的光片显微镜的图示，其示出了横向能力；

图5是具有三个辐射传播轴的生物成像设备中的三个重叠线焦点的图示，该设备具有可以定义成像系统的数值孔径的可旋转狭槽结构；

图6a是可以定义成像系统的数值孔径的可旋转狭槽结构的透视图；图6b是可旋转狭槽结构的横截面图；

图7是线焦点的强度作为横向距离的函数的图示，其示出了两个连续的扫描，并且展示了射束的高斯传播；

图8a是线焦点的强度作为横向距离的函数的图示，以及第一数值孔径NA₁的束腰和瑞利距离的图示；图8b是线焦点的强度作为横向距离的函数的图示，以及第二数值孔径NA₂的束腰和瑞利距离的图示，其中，NA₁＜NA₂；

图9是示出了光片在生物样品内的横向水平移动的图示；

图10a、图10b是光学转向元件的两种替换布置，该光学转向元件可以为成像设备生成光片在生物样品内的横向水平移动；

图11是示出了光片在生物样品内的左侧和右侧横向水平移动的图示，其可以分别从左侧以及从右侧对样品进行成像；

图12是描述了对玻璃液体器皿的边界处的光束折射进行校正的图示；

图13是具有像素化检测器的光片显微镜的图示，该光片显微镜在其检测器的视场内对样品进行成像；

图14是示出了光片显微镜从生物样品中产生的激发

和检测

的点扩散函数的图示；

图15描绘了图像形成的不同步骤（图15a、图15b、图15c、图15d）；

图16是描述了如何使用图11中所示的设备将图像的左侧与右侧图像网格化的图示；

图17是示出了光片在x方向上穿过生物样品的横向水平扫描的图示；

图18是示出了用于通过光片显微镜从生物样品中产生三维图像的水平扫描（图18a，x-维度）和深度扫描（图18b，z-维度）的图示；

图19是示出了用于挑选光片显微镜激发和检测的工作波长的滤光片选择的图示；

图20是示出了用于光片显微镜激发和检测的多个光源（图20a和图20b）的图示；

图21是示出了光片显微镜的检测器的组件的图示；

图22a是示出了旋转保持多个物镜的转塔的能力的图示；图22b是容纳转塔透镜的样品台和转塔透镜的透视图；图22c是转塔透镜的透视图；

图23是示出了可以如何独立于转塔物镜显微镜横向移动光片的图示；

图24是示出了可以如何独立于样品和光学系统（图24b）通过垂直移动（图24a）浸入比色皿的视图的图示；

图25a是示出了可移动比色皿的平面图；图25b是横截面图，并且图25c是可以如何独立于样品和光学系统垂直移动比色皿和样品架的端视图(end-on view)；

图26a是示出了可以如何在不干扰光学系统的其余部分的情况下接近样品的侧视图示；图26b示出了从澄清流体中完全取出的样品；

图27是示出了可以如何使用新型样品架处理多个样品的图示。

应当理解，附图不一定按比例绘制，并且相同的数字可以指代相同的特征。

具体实施方式

本说明书的第一部分涉及使用光片和误差校正的、用于生物样品的新型光学成像设备的光学细节。该设备还具有一些设计特征，使其非常简单且易于使用。新型成像设备可以减少不透明结构投射的阴影带来的不确定性，并且也没有高速移动的零件，并且因此可以比其他扫描方法简单得多。第二部分讨论了用于在准确度、对比度和分辨率方面改进图像数据的误差校正方法。第三部分描述了光片显微镜的一些新型机械特征，这些特征使其特别有利且易于使用。

在优选实施例的以下描述中，参考了形成其一部分的附图，并且其中通过图示的方式示出了可以在其中实践本发明的特定实施例。要理解的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施例并且可以进行结构改变。以下附图标记用于指代以下特征。应当理解，提供该列表是为了方便起见，并且该列表可能不是下面的文本中使用的附图标记的穷举。

10 透镜转塔(lens turret)

60 转向镜，包括61、62和63

61，62，63 转向镜实施例100

68，64，66，74 替换实施例中的转向镜

65，67，69 转向镜实施例101

74 第一转向镜实施例100、101

51 旋转孔径，包括狭槽73和孔径52

68、69 转向镜

70 伸缩透镜

73 狭槽

100 可移动光学组件

101 光学系统的替换实施例

100’相邻侧可移动光学组件

120 线聚焦光学子组件#1

140 线聚焦光学子组件#2

160 线聚焦光学子组件#3

200 生物样品

210 线焦点(line focus)/焦平面

300 比色皿

310 检测器视场

350 物镜顶面开口

351，352 从比色皿300的切口(cutout)

360，361 接纳到比色皿和样品的辐射的透明窗口

400 控制器

500 光源

521-526 激光源

530 准直透镜

550 滤光轮激发

560 准直器

600 检测器

660 滤光轮检测器

620 成像透镜

660 检测滤光片

700 物镜

750 粒子

670 物镜

800 样品架

810 样品台

820 样品台支撑点

930 可移动比色皿载物台

900 用于可移动光学组件的载物台

951，952 从比色皿300的切口

1000 澄清流体。

坐标系一般而言应用于附图。x轴通常是扫描维度，即，线焦点将沿其扫描的轴线。y轴通常是线焦点的方向，即，其是焦点沿着其所在的方向，其中在焦线内和沿着焦线具有相对均匀的强度。进入样品的辐射束沿着x、y平面中的x轴行进。z轴通常是查看方向。即，相机和/或检测器的光轴将沿着z轴位于x-y平面之上并且与其正交。

在一个方面，光片显微镜可以利用Scheimpflug光学，这是一种现象，由此使光学元件相对于其光轴倾斜，该元件的聚焦性质也可以倾斜。通过仔细放置和相对定向，可以布置三个激发光源来创建单个线焦点，然后可以跨样品进行扫描。

因此，至少一个光学元件可以相对于传播方向倾斜< >90度(非正交)的角度。当角度α₁相对于与传播轴正交的线被定义时（参见图1），该角度α₁可以优选地小于30度、更优选地小于20度，并且更优选地为大约16度。如下面讨论的，可以针对在液体比色皿支架边界处发生的折射效应来校正该角度。这导致线焦点相对于通过光学系统的传播的轴线倾斜了角度α₁。α₂可能在量值上相似，但是与α₁的意义相反。

根据本发明的一个方面，使用如本文中所述的光片显微镜，由粒子投射的阴影被减少或至少变得明确。使用本文中所述的误差校正过程可以获得甚至更高的精度。在此过程中，与创建一个平滑阴影的扫描射束相比，可以轻松计算出许多不同的阴影，这些阴影在这种情况下可通过切换照明源进行切换。

根据本发明的另一个方面，可以在图像处理算法中以大致相同的方式处理一列像素，因为由于线焦点的性质，该维度上的照明是均匀的。

根据本发明的另一个方面，可以使用非常少的移动零件并且不使用高速移动的零件来产生非常高精度的三维图像。这大大改进了可重复性、成本和可靠性。

光片显微镜

图1是生物成像设备中使用的线焦点的图示，其中，成像设备使用单个准直光源500。来自源500的辐射被聚焦成相对于辐射传播的轴线倾斜的线焦点。来自源500的光辐射由光学子组件120成形，并且被聚焦成落入生物样品200内的一条线210，但是该线相对于通过光学子组件120的传播的轴线倾斜。

光学子组件120可以包含多个光学元件，包括例如两个共焦或球面透镜以及一个柱面透镜。至少一个透镜元件可以相对于辐射传播的轴线倾斜。倾斜角由α₁表示，其中α₁的范围可以是0 <α₁< 40°，并且更通常的范围是5 <α₁< 25°，并且更优选地为大约16°。这种倾斜可能导致线焦点相对于辐射的传播轴倾斜类似的角度α₂。传播轴或传播的轴线是准直光束中心处或附近的光子行进的方向。光轴往往与传播轴相同或平行，但是被定义为光学元件的中性轴：传过透镜的曲率中心并且平行于对称轴的线是光轴。例如，像素化检测器的光轴是从相机或检测器前部的第一透镜或透明窗口到相机或检测器后部的像素化检测器阵列的线。这些角度是相对于与传播的轴线正交的轴线定义的，如图1所示。

在图1所示的实施例中，第二共焦透镜（光学子组件120中的第三光学元件）可以相对于传播的轴线倾斜一定角度。它形成的角度α₁是相对于该传播轴的正交方向测量的。作为该倾斜的结果，线焦点210也相对于该正交轴倾斜角度α₂。基于图1所示的几何形状，α₁在量值上可能相对于该正交轴相似，但是符号相对于该正交轴相反。这是Scheimpflug光学的基础。Scheimpflug原理是一种几何规则，它描述了当透镜平面与图像平面不平行时，光学系统（诸如相机）的焦平面的取向。该原理在此用于在生物样品中形成重叠线，如下文详细描述的。

光学子组件120的元件可以以多种不同的方式布置，诸如圆柱形/球形/球形或球形/球形/圆柱形。然而，球形/圆柱形/球形的配置（图1所示）可以导致最紧凑的布置。

在光学子组件120内，两个透镜可以粘合在一起。Scheimpflug条件也可以利用更多且粘合的元件来实现。然而，图1中所示的配置对于Scheimpflug和曲率校正两者都可能是最有利的。单独的透镜还提供了额外的自由度，因为分离距离可能会影响线焦点的形状及其曲率。

图2是两个光学子组件120和140的另一个实施例的图示。光学子组件中的部件可以相似或相同，每个包含例如两个共焦透镜和一个柱面透镜。这些部件的布置可以类似于图1所示的实施例中所图示的布置。然而，这仅是示例性的，并且光学组件可以具有不同的部件，或者它们可以采用不同的布置或次序。

第二光学子组件140也可以创建线焦点，然而，该光学组件可以不具有倾斜元件。因此，线焦点可以不相对于像平面倾斜，而是代替地可以几乎正好沿着正交方向而行，即，它可以位于像平面中。

应当注意，光学子组件120可以相对于光学子组件140倾斜。换言之，光学子组件120的光轴可以相对于光学子组件140和穿过它行进的光的传播轴形成一定角度。附加地，光学子组件120可以相对于其光轴和穿过它行进的光的传播轴成一定角度地形成线焦点。通过光学子组件120和光学子组件140的部件的适当布置，由光学子组件120引起的线焦点可以基本上正好落在由光学子组件140产生的线焦点上。这些重叠线焦点可以应用于具有两个辐射传播的轴线的生物成像设备内的生物样品。

通过“基本上重叠”或“基本上正好（exactly）重叠”，应当理解，线焦点在重叠中彼此偏离了小于所定义的量。这个量可能是横向错配（misregistration）或角度偏差。即，线焦点尽管基本上正好重叠，但仍然可以横向且有角度地偏离有限量。在仍然“基本上重叠”或“基本上正好重叠”的同时允许的横向偏差量可以根据瑞利长度来定义。角度偏差量可以根据角度偏差度数来定义。出于本描述的目的，“基本上重叠”的重叠线焦点将彼此横向偏离小于4瑞利长度，并且彼此有角度地偏离小于5度。更优选地，“基本上重叠”的线焦点将彼此偏离小于2瑞利长度和3度。又更优选地，“基本上重叠”或“基本上正好重叠”的重叠焦点可以彼此偏离小于1瑞利长度和小于2度。

“部分重叠”可以理解成意味着将一个线焦点放置在相邻线焦点的5瑞利长度内。

生物样品200可以具有用荧光部分（fluorescent moiety）标记的生物结构。因此，当来自源500的具有适当波长的辐射激发这些荧光部分时，生物样品200可以发荧光。这种荧光可以由适当的检测器检测，并且用于获得关于生物样品的信息。下面详细描述该设置。

因此，重要的是，图2所示的设备可以使用来自多个方向的光500。不同的方向可以均得自独立的光源，或者它们可以使用相同光源，但是通过部分透射和部分反射表面分离出单个光源。这些配置也在下面更详细地描述。

具有来自不同方向但具有重叠线焦点的辐射可以具有若干优点。一个优点可能是由拦截来自一个源的光的不透明结构投射的阴影可以与具有对比度的其他源区分开。因此，在图像中看到的对比度可能归因于模糊结构，并且可以通过比较使用来自多个方向的辐射所收集的图像来确定该结构的详细形态。因此，利用偏心光学器件120和160的连续扫描也可以揭示来自生物样品中的单个不透明结构的阴影的深度和范围（extent）。因此，该技术可以用于确定扫描中的什么特征是由于阴影效果所致、什么特征与样品中的真实、新的或分立结构有关。

图3是具有三个辐射传播的轴线的生物成像设备中的三个重叠线焦点的图示。图3示出了三个光学组件120、140和160。三个光学子组件120、140和160的组件可以相似或相同，每个包含例如两个共焦透镜和一个柱面透镜。这些组件的布置可能与图1所示的实施例中图示的相同。然而，这仅是示例性的，并且每个光学子组件可以具有不同的部件，或者它们可以采用不同的布置或次序。

再一次，第二光学子组件140可以创建线焦点，然而，该光学组件可以不具有倾斜元件。因此，线焦点可以不相对于像平面倾斜，而是代替地可以几乎正好沿着正交方向而行，即，它可以位于像平面中。

应当注意，第三光学子组件160可以相对于光学组件120和140倾斜。换言之，光学子组件160的光轴可以相对于光学组件120和140的光轴、以及穿过它行进的光的传播轴形成一定角度。附加地，光学子组件160可以相对于其光轴成一定角度地形成线焦点。通过光学子组件160和光学组件120和140的部件的适当布置，由光学子组件160引起的线焦点可以基本上正好落在由光学组件120和140产生的线焦点上。因此，在图3中，可能存在三个基本上重叠的线焦点，它们全部由附图标记210标明，因为它们基本上重叠。

因此，第三光学子组件160创建另一个线焦点，其正好落在来自光学子组件120和140的前两个线焦点上。该第三光学子组件160可以是光学子组件120的镜像，其倾斜的光学元件在镜像的意义上是倾斜的，如图3所示。因此，可能存在如图3中描绘的对称轴，其中光学上半部120被光学下半部160镜像。

重叠线焦点可以应用于具有三个辐射传播的轴线的生物成像设备内的生物样品200。如前所述，生物样品200可以具有利用荧光部分标记的生物结构。因此，当来自源500的具有适当波长的辐射激发这些荧光部分时，生物样品200可以发荧光。这种荧光可以由适当的检测器检测，并且用于获得关于生物样品的信息。通过从三个不同方向施加辐射，可以有效地测量不透明结构的阴影效应，使得可以确定有关结构形态的详细信息。如果然后通过样品横向扫描该线焦点，则可以获得关于样品中包含的、但横向分开的结构的详细信息。用于穿过样品移动线焦点的装置和方法在下面进行相当详细地描述。

如果来自三个方向120、140和160的光源被顺序激活而不是一致地激活，则可以明确地检测到阴影。这是因为由从一个方向照射的光源照射的不透明物体投射的阴影将遮蔽不透明物体正后方的不同区域，而不是来自另一个方向的光源投射的阴影。因此，在一些实施例中，至少在数据收集的一部分期间，光源500可以被顺序地通电。

最后，通过顺序地激发三个射束，可以容易地将嵌入样品中的结构投射的阴影与例如透镜或反射镜缺陷投射的阴影区分开。另外，还可以通过来自三个射束的顺序照射来测量这种结构的范围。由于三个射束的轨迹不同，可以通过使用三个射束来减少或分开粒子投射的阴影。甚至另外的，通过对许多不同的阴影进行去卷积（在这种情况下是可切换的），与创建一个平滑阴影的扫描射束相比，可以更容易地计算阴影的效果。

图4是具有三个辐射传播的轴线的生物成像设备中的三个重叠线焦点的图示，其中，生物样品包含在流体器皿中，并且由像素化检测器成像。生物样品200可以浸没在比色皿或包含流体的其他器皿300中。“比色皿（cuvette）”是本文中使用的术语，用来指代包含嵌入在各种光学液体中的样品的器皿。比色皿可以具有至少一个窗口，其是光学透明的，且具有较低失真，以允许生成衍射受限的光片。因此，术语“比色皿”、“器皿”和“容器”可互换用来指代包含一定量流体的支持物或容器。流体可以是生物样品浸入其中的澄清流体。比色皿、器皿或容器也可以在一侧开口，用于浸入生物样品200以及用于将物镜浸入流体中，如下文将进一步描述的。“澄清流体（clearing fluid）”是使生物样品对探测辐射而言相对透明的流体。

“横向于一点”或“与一点横向相邻”应该理解为是相对于穿过样品的平面来定义的，其中，横向相邻的第二点通常是在同一平面内、但偏离第一点而还在该平面中的点。“变形透镜”可以是其一个维度上的焦距与其在另一个维度上的焦距不同的透镜。柱面（线聚焦）透镜是变形透镜的一个示例，其具有第一焦距和第二焦距，其中，第一焦距是有限的，而第二焦距基本上是无限的。这样的透镜将在第一焦距处产生线焦点。

“澄清流体”是包含化合物的生物流体，其被设计成使通过样品中的生物结构的非均匀光吸收或散射最小化。澄清流体的使用在对较厚生物样品的多个深度进行成像时很重要，使得探测辐射能够穿透到深处。例如，过氧化氢可以用作澄清流体，用于对血红蛋白和肌红蛋白这两种在生物组织中负责光吸收的主要分子进行脱色。

比色皿300中的流体可以是澄清流体1000，其可以使生物组织对辐射是透明的。比色皿300也可以是透明的，或者可以至少在其一侧具有至少一个透明窗口或开口，从而允许来自源500的光辐射传入比色皿300、流体和生物样品200中。横向距离“A”到“B”可以指示比色皿透明壁的厚度。在此边界处可能会出现折射效应，并且下面将参照图12讨论这种折射的处理。

如前所述，多个光学组件120和140（以及160，如果存在的话）可以被配置成使得每个都将传入辐射聚焦成一条线。由于光学子组件120和160所致的线焦点可能与由于光学子组件140所致的线焦点基本上重叠。因此，所有光学组件120、140和160可以将辐射聚焦到落在生物样品200内的相同线焦点210中。

在比色皿300上方（并且未在图4中示出），检测器可以对样品200成像，以便检测例如当被线焦点210照射时由荧光标签发射的荧光。生物样品200可以放置在水平面（纸面）中，并且检测器可以放置在该平面上方。线焦点210也可以基本上落在该平面中。检测器可以具有包括样品中的线焦点210的视场310，并且还可以包括横向相邻的区域。即，当横向扫描线焦点时，检测器的视场可以包括在其第一方位以及随后的相邻方位中的线210。下面关于图9进一步描述线焦点的横向移动。

图5是具有三个辐射传播的轴线的生物成像设备中的三个重叠线焦点的图示，其中，该图示包括将辐射引导到样品200上的附加光学元件。在图5所示的一个实施例中，辐射可以来自单个源500，并且可以被引导离开三个部分反射和部分透射的反射镜61、62和63。这些反射镜中的每一个都可以将辐射的一部分引导成平行线。这些平行线可以传过下面进一步描述的孔径51，并且然后以平行的方式行进到可移动光学组件100。图5没有示出子组件120、140和160的部件。重要特征是进入包含子组件120、140和160的可移动光学组件100的光以平行的方式进入可移动组件100，使得可移动组件100可以横向移动而不会影响可移动组件100内的光路。该特征对于在穿过样品横向移动线焦点时很重要，并且允许光片显微镜的高分辨率、高度可重复的扫描能力。

因此，可移动光学组件100可以包含光学子组件120、140和160，如图3所示。此外，可移动光学组件100还可以包含两对转向镜53、54、55和56。第一对转向镜53和54可以使平行传入光重新定向，并且沿着其光轴将其引导到光学子组件120中。第二组转向镜55和56可以将传入平行光的下腿沿其光轴重新定向到光学子组件160中。因此，再一次，下腿是上腿的镜像，其是穿过所示的对称轴反射的。

因为传到可移动光学组件100的光是平行的，所以可移动光学组件100可以横向移动，而不改变可移动光学组件100内的射束传播角度、或其聚焦性质。因此，横向运动将横向移动线焦点，使得线可以左右扫描以在样品内横向移动线焦点。因此，在纸平面中，扫描方向可以是横向的。即，可移动光学组件100可以被水平扫描（在纸平面中），以便使线焦点210穿过样品横向偏移。参照图9更彻底地描述了该功能。

图5中还示出了光学元件51。该部件可以是可旋转部件51，其可以配备多个具有特定形状的孔径，这些孔径使传入辐射通过，并且定义其光学性质。在图6中更详细地示出了开槽孔径51。例如，开槽孔径51可以定义系统的光学数值孔径，如下面关于图6、图7和图8详细描述的。如所指示的，开槽孔径51可以快速旋转以使数值孔径适应设备内的不同值。

可旋转孔径51可以用于选择高斯光束性质。特别地，当可旋转孔径被旋转以拦截射束的较大部分并且允许较小部分通过时，具有为系统定义较小数值孔径的效果。

可旋转孔径51还可以阻挡或禁用从转向镜61、62或63中的任一个反射的光束中的一个、两个或全部三个。该选择可以通过将可旋转构件51旋转到这些平行光束中的一个、两个或三个被阻挡的位置来实行。可旋转构件51通常可以被定向在与从转向镜61、62和63反射的射束的光轴垂直的方向上，并且因此可以用来选择（或关掉）61、62或63中的任何一个。

图5中还示出了适用于该图和一般而言适用于多个图的坐标系。坐标系中的轴线x、y和z相对于彼此正交。x轴通常是扫描维度，即，将沿其扫描线焦点的轴线。y轴通常是线焦点的方向，即，焦点沿其而行的方向，并且沿着该方向的辐射强度相对均匀。然而，还应当理解，线焦点的扫描也可以在y方向上实行，即，在与线的长度或范围相同的方向上，而不是与该维度垂直的方向上。z轴通常是查看方向。即，相机和/或检测器将沿着z轴位于x-y-平面的上方。应当理解，这些取向是任意的，诸如“左”、“右”、“上”、“下”和“顶”和“底”的指定也是任意的，并且仅指代相对侧或正面。不失一般性，该设备可以保持在任何取向上。

图6更详细地示出了旋转开槽孔径51。如图6所示，旋转构件51可以被形成有多个形成在其中的矩形通孔52。旋转构件51可以进一步配备多个相交狭槽73。通过旋转这些通孔52和狭槽73，可获得光线的间隙被扩大或缩小。换言之，传入孔径有效地投射了阴影，其用来使透射通过结构的光停下来。在图6b的横截面中示出了这种效果。由于旋转开槽孔径51中的孔径的阻挡效应，辐射可能在z方向上受到限制，因此定义了当射束聚焦成一条线时系统的数值孔径。下面将进一步描述这些效果。

旋转构件51可以通过单个机动轴快速调节，该机动轴可以使可旋转构件51旋转。因为可以为多个射束中的每一个提供多个孔径，所以可以使用例如单个致动器或旋转步进电机快速且廉价地定义整个系统的光学性质。转向镜61、62和63可以将辐射引导到适当的孔径52或狭槽73中。

图6b所示的横截面示出了旋转可旋转部件51的效果。当构件51旋转时，孔径52的前缘遮住射束路径，阻挡光束的上部透射通过孔径52。这然后将光束的下游部分截断到比入射在可旋转构件51上的部分更窄的部分。其效果可能是降低光学系统的数值孔径。

如图6中图示的，旋转构件51可以是具有用于狭槽的切口的圆柱体，并且该圆柱体可以被旋转以定义射束的数值孔径。通过将开槽柱51作为整体旋转，可以利用一个动作定义脱离转向镜61、62和63的所有三个激光束的光束大小。换言之，可能需要单个电动载物台或步进电机（未示出）来定义所有三个射束的数值孔径。由于其圆柱形几何形状，旋转构件51可以具有很小的旋转惯性，所以射束切换可以非常迅速。遮挡部分射束的狭槽也可以消除不均匀的条纹。伸缩柱面透镜70可以确定图像大小和照明区域，如下面将关于图9所描述的。与许多光学支架和载物台一样，旋转构件可以由阳极氧化铝形成，例如通过机械加工形成。

应该注意的是，来自转向镜61、62和63的射束路径长度全部都是不同的，如图5所示。因此，光源500可能需要有限的相干长度以避免干涉效应，诸如相长干涉或相消干涉。在可旋转孔径51内，可以移动楔形板（未示出）来减少相机曝光以下的相干时间。

在另一个实施例中，可以使用一组简单的可调节狭缝，其可以是独立可调节的。使用狭槽或一些其他可选择的孔径也可以减少施加到样品的辐射量，从而减少加热和漂白，但是主要确定数值孔径，并且因此确定成像质量（分辨率、步长等）。然而，通过将所有功能都放在单个柱子上，使得可以通过单个致动器或电机来选择性能和光学属性。

许多射束（诸如以TEM 00模式发射的激光束）具有射束分布，该射束分布具有高斯强度分布。此处描述的光学系统可能就是这种情况。图7图示了射束强度比对射束内的横向方位。图7中所示的强度曲线的形状旨在示出一般的高斯曲线，其中，分布的宽度由参数b表征。曲线上的参数b指示强度下降到峰值强度的l/sqrt(2)的点。像往常一样，射束在分布中心附近达到峰值强度，并且在距中心距离b处以某种特性形状下降到值l/sqrt(2)。b被称为共焦参数。

高斯光束的场的几何相关性由辐射的波长λ（在电介质中，而不是在自由空间中）和以下射束参数控制，所有这些参数如以下部分中详述的那样连接。高斯光束宽度w(x)是射束沿着x方向传播的距离的函数。Wo是束腰，并且b是焦深。高斯光束的性质是众所周知的，并且在此总结这些性质以便于引入将在以下系统设计和操作的讨论中提到的参数。

给定波长λ的高斯光束的形状仅由一个参数控制，即束腰w_o。这是在其焦点的点处的射束大小的量度（上述方程中的x = 0），其中射束宽度w(x) (如上定义的)是最小的（并且同样地，轴上强度(r=0)是最大的）。根据该参数，确定了描述射束几何形状的其他参数。这包括瑞利范围x_R和渐近射束发散θ。在图8a和图8b中图示了这些量。

瑞利距离或瑞利范围x_R是在给定高斯光束的腰部大小的情况下确定的。此处λ是光在传播介质中的波长。在距腰部的距离等于瑞利范围x_R处，射束的宽度w大于其在w=wo的焦点处的宽度，即束腰。这也意味着在那里的轴上(r=0)强度是峰值强度的一半（在x=0处）。沿着射束的这一点也恰好是波前曲率(1/R)最大的地方。高斯光束的数值孔径被定义为

，其中n是光束传播通过的介质的折射率，并且θ是发散角。这意味着瑞利范围与数值孔径按照

有关。两点x=±x_R之间的距离被叫做共焦参数b，或射束的焦深。例如，在https://en.wikipedia.org/wiki/Gaussian_beam中描述了高斯光束。

因此，数值孔径NA〜2w₀/b。NA越小，给定束腰的共焦参数越大。如果需要更高的分辨率，共焦参数b必须更小，所以NA必须更大，并且景深更短。这些性质可以在选择数值孔径时由可旋转构件51的方位来定义。如果代替地，需要更好的对比度并且延长焦距，以获取更好的视场对比度，可以选择较低的放大率（magnification）和较大的共焦参数b（较小的NA）。NA孔径也可以被定制成增加检测器的有用面积。因此，可旋转构件51可以用来延长焦距，通过较低的放大率（较低的NA）获取更好的视场对比度，并且增加检测器的有用面积。可旋转构件51可以用来快速调节系统的宽度和数值孔径。

因此，更紧密的焦点的效果是更短的束腰和更大的发散角θ，换言之，更短的焦深和更高的分辨率。更紧密的聚焦与更大的数值孔径NA相关联。因此，较大的数值孔径NA意味着较小的共焦参数b。因此，更紧密聚焦的射束可以给出更好的分辨率，但是在更短的距离内。

图7是线焦点的强度作为距焦点中心的横向距离的函数的图示。用于连续扫描的典型光强度分布通常可以具有高斯形状，并且遵循如上文讨论的高斯光学。然而，也可以使用其他函数，诸如例如，贝塞尔和拉格朗日形状。

线焦点b的宽度和扫描之间的间隔Δx可以基于样品的属性（大小、厚度、密度等）并且基于性能考虑而相关和挑选。一般而言，分辨率越高，步长就越小，并且完成一次扫描所需的时间就越长。此外，样品将遭受更高的激发强度，并且因此经受更高的温度、漂白和光损伤。换言之，这些变量可能是相关的，使得可能需要进行设计权衡。数值孔径的给定选择可以确定扫描图像的步长和分辨率。这些参数和设计权衡将在下面参考图12和图13进一步讨论。确定聚焦属性的NA的选择也可以确定步长、采集速度和其他重要的系统级操作属性。

图8a是线焦点的强度作为横向距离的函数的图示，以及第一数值孔径NA₁的束腰和瑞利距离的图示。图8b是线焦点的强度作为横向距离的函数的图示，以及第二数值孔径NA₂的束腰和瑞利距离的图示，其中，NA₂ > NA₁。如前所述，瑞利长度由腰部半径w₀和波长λ确定。

因此，在焦点中具有更高光强度的更强烈聚焦的射束与具有更长瑞利长度(即，更大的焦深)的不那么强烈聚焦的射束之间可能存在权衡。减小的NA可以与光片垂直。挑选更宽的狭槽会增加射束的数值孔径，这会降低共焦参数b，并且提高分辨率。相反地，挑选较窄的狭槽可能会降低共焦参数b，并且降低分辨率。因此，如前所述，数值孔径的选择可能会驱动扫描之间的间距Δx，并且因此驱动图像采集的速度和最大样品照射强度。鉴于此，与旋转构件51一起挑选的数值孔径的选择可以是中心设计选择。

图9和图10是举例说明此处描述的光片显微镜的一个重要方面的实施例。这方面是可移动光学组件100和101相对于样品横向移动的能力。由于光学组件120、140和160的线聚焦能力，所有这些都将辐射聚焦成基本上单个线焦点，可以通过来回移动可移动光学组件100和101来横向来回移动该线焦点。应当理解，可以存在能够呈现该特征的各种各样的光学部件布置，其中的可移动光学组件100和101只是其中的两个示例。设想到这些实施例和许多其他实施例，它们具有这种能力，并且实现该目的的多种光学布置由所附权利要求涵盖。

图9是示出了光片在生物样品内的横向水平移动的图示。射束整形也可以借助于狭槽或望远镜独立于z方向进行，以调节射束的y范围。通过在y方向上扩展线焦点210，可以使用图9中所示的伸缩透镜70来放大或扩展照明区域。换言之，线焦点的放大率，或者更确切地说是扩展其横向范围，可以通过来回移动上游柱面伸缩透镜70来调节。

在其他实施例中，放大率不仅可以由一个柱面透镜确定，还可以由适当的光学伸缩透镜系统确定。然而，柱面透镜70可以具有实现简单的优点，并且y中的球面误差可能不会显著影响性能。

应当理解，使用不同激光波长的射束仍然可以使用该光学系统成像，因为部件都是消色差的。因此，线焦点仍将重叠，因为焦点不是波长的性质。焦点仍将全部沿着线的大部分长度重叠，以近似焦点的衍射极限。在光学组件100中，还可以挑选透镜的材料（并且透镜的材料可以是不同的）以减少色差。下面相对于图20进一步讨论了使用不同颜色激光的激发。也可以以在检测器前面的滤光片的适当选择来选择检测颜色，如相对于图19在下面讨论的。

整个可移动光学组件100（或包括在可移动组件100中的所有元件）可以沿在x方向上所示的轴线来回移动，以扫描穿过样品的光片。该扫描方向有效地定义了x轴。由于需要在不更改样品内的焦点条件的情况下横向移动该组件，将光引导到可移动组件100中的转向镜可以被配置成以便在与可移动组件100的移动方向平行的方向上递送光100。在图9和图10中图示了这种情况。

应当理解，此处提到的任何和所有光学元件，包括在图9中出现在生物样品200的左手边的伸缩透镜70、可旋转结构51、转向镜61、62和63，以及光学组件120、140和160也可以被复制并且被设置在样品200的右手边。因此，可以从左侧、右侧或从两侧照射样品。下面参照图11描述该系统。在光片系统左手边的组件用100表示。在光片系统右手边的组件用100'表示。

因此，如图9所示，可移动光学组件100(或100')可以移动距离Δx。如所示的，这导致线焦点210移动与Δx相似或相同的量。

图10图示了可移动组件100和101的两个实施例100。在第一实施例100中，类似于图9的可移动光学组件100，包括光学转向元件，其能够使整个光学组件能够朝向和远离生物样品横向移动。成像光学器件的这种移动的效果是在由光学组件100的移动所定义的平面内横向移动线焦点210。因此，可移动载物台在用于成像设备的生物样品内生成光片的横向水平移动。

图10a所示的实施例100使用三个转向镜61、62和63来将三个平行射束递送到可移动组件100中。顶部射束被其他转向镜74和68重新定向，并且被重新定向到光学子组件120中。类似地，较低射束被两个其他转向镜64至66重新定向，并且被重新定向到较低光学组件160中。第三射束可以直接进入光学子组件140。

在图10a所示的可移动光学组件的第一实施例100中，转向镜61、62和63用于将来自源500的辐射引导到光学子组件120、140和160中。反射镜61使辐射转动大约90度，并且转到可移动组件120中。反射镜62使辐射转动大约90度，并且转到可移动组件140中。反射镜63使辐射转动大约90度，并且转到可移动组件160中。对于可移动组件100，转向镜74、68、64和66分别将射束引导到光学子组件120和160中。对于光学子组件140，辐射可以直接从转向镜62进入。反射镜74、68、64和66可以与图5中的反射镜53、54、56和55类似或相同。

在图10b所示的可移动光学组件的另一个实施例101中，转向镜——单个转向镜61可以用来将单个射束引导到移动光学子组件101中。反射镜61使辐射转动大约90度，并且转到可移动组件100中。在可移动光学组件101内，部分反射/部分透射镜74、65、67和69可以用来将辐射从源500引导到光学子组件120、140和160中。更具体地，可移动组件然后使用可移动光学组件101内的转向镜74将射束引导到部分反射和部分透射镜65、67和69上。这些部分反射和部分透射镜65、67和69中的每一个然后将辐射引导到光学子组件120、140和160中。由于这些子组件120、140和160相对于对称轴和中心光学子组件140以一定角度设置，三个部分反射和部分透射镜64、65和66的角度全部都是不同的，如图10b所示。

如上所述，可移动光学组件101的第二实施例可以使用单个转向镜61来将来自源500的辐射偏转到可移动组件101中。该实施例可以具有比图9所示的实施例更少的转向镜，并且因此可以更便宜或更容易对准。然而，与上述实施例100一样，包括光学转向元件，其可以使得整个光学组件能够朝向和远离生物样品横向移动。成像光学器件的这种移动的效果是横向移动线焦点210，但是是在由光学组件101的移动所定义的平面内移动。因此，可移动载物台在用于成像设备的生物样品内生成光片的横向水平移动。

图11是根据本发明的光片显微镜的较大部分的图示。图11中图示了在左手边的第一可移动光学组件100和在右手边的第二可移动光学组件100'。应当理解，该可移动光学组件100可以是图9中所图示的，或者其可以是图10a或图10b中所图示的，或者它可以是能够在生物样品内横向移动基本上单线焦点的另一个实施例。图11中还示出了设置在生物样品200和比色皿300的相对侧上的第二可移动光学组件100'。因此，生物样品可以从左侧被可移动光学组件100照射，并且从右侧被可移动光学组件100'照射。

如将在下面更详细地解释的，可以通过收集多个相机图像来创建图像，每个相机图像在样品内的不同位置具有线焦点210。在图像采集开始时，部分透射转向镜57可以将辐射从源500引导到镜面挡板（mirrored shutter）58，其可以将源辐射500重新定向到第一可移动光学组件100。可移动光学组件100可以将辐射聚焦在基本上单线焦点中。然后，通过从左到右移动光学组件100，可以首先照亮生物样品的最左边缘，并且然后线焦点连续向右移动，直到线焦点到达样品中间。在此刻，可以移动或缩回挡板58以允许辐射传递到右手可移动光学组件100'。样品可以从那个点开始被右手可移动光学组件100'照亮。在收集这些连续图像中的每一个之后，可以从这些个体扫描中构建单个图像。

因此，照明可以来自任一侧以使光必须穿透的样品材料量最小化。两侧100或100'中的哪一个是工作的可以由挡板或翻转镜58选择。优选地，挡板或翻转镜58位于对称轴上，如所示的，使得右侧和左侧的路径长度相似或相同。

应当理解，右手可移动光学组件100'很大程度上是左手可移动光学组件100的镜像。即，转向镜60'（在100'中的）的角度可以与转向镜60的角度相同，但是是跨图11所示的对称轴反射的。属于镜像光学组件100'的组件用撇号(')标明，以将它们与左手可移动光学组件100区分开。应当理解，可以采用许多其他开关布置来将辐射从源500发送到左手边100或右手边100'。这些替换的光学布置是一种设计选择，并且可能存在多种光学布置来实现在期望的方向上路由射束这一目的。这些替换布置落入所附权利要求的范围中。

图12是描述了对透明液体器皿300的边界处的光束折射进行校正的图示。例如，透明液体器皿300可以是玻璃或石英。由于此处描述的光片显微镜系统的架构，一些光束必须经由透明窗口360和361以稍微倾斜的入射角β进入比色皿300。因此，传入比色皿300中时，辐射必须通过几个边界，并且因此以与入射的角度不同的角度折射。应当理解，最大的折射效应可能发生在外部空气/玻璃边界处，因为该边界将具有最不同的折射率的材料分开。

正如根据斯涅尔定律众所周知的那样，光的折射然后将发生在材料之间的边界处，使得倾斜的光以比它进入的角度稍微浅的角度进入比色皿。因此，由于在玻璃和液体边界处的折射，内部、中心射束140的焦点将出现在x方向上相对于外部射束120和160不同的地点。换言之，如果上腿和下腿之间的角度为2β，辐射以该角度进入透明窗口360和比色皿300，则辐射可以以上腿与下腿之间的不同角度离开。一般而言，出射角稍微小于入射角2β-。因此，重叠线焦点将发生在距透明窗口稍稍更长的距离D处，因为它原本使折射不发生。

为此，将光学组件100和100'移位或偏移一定量以适应焦距的这种变化可能是有利的。使用基本的光学原理，诸如斯涅尔定律，可以很容易地计算出偏移量D。例如，在比色皿外部N=1，在内部n=1.5。sin a/sin b = 1.5。因此，如果原始角度α₁为16度，则出射角可能更接近11度，并且可能会在距标称焦点约n×d处发生聚焦。因此，将可移动光学组件100的放置延迟这个量可能是重要的，以确保线焦点如预期的那样落在生物样品200中。

替换地，部件120和160可以相对于部件140交错，以便适应其倾斜入射光的角度变化。因此，有可能使中间光学器件140相对于外部光学器件120和160前进一定量以计及材料边界处的折射。

可以对右手边光学组件100'中的部件实行这些相同的操作。

替换地，可以调节元件120和160的倾斜以补偿该偏移，使得线在线焦点210处完美重叠，或者基本上重叠到衍射极限，也就是说在衍射极限的大约5倍之内。

在一些实施例中，运行控制器的软件可以被告知透明窗口360和/或流体1000的指数是什么，以便将图像偏移适当的量。这在左手边和右手边照明扫描的混合中可能尤其重要。

因为生物样品200可以浸入澄清流体1000中，所以样品200和澄清流体1000可以包含在如前所述的比色皿300中。由于辐射必须传入比色皿中，所以比色皿的至少一部分可以由透明材料制成，该透明材料诸如是玻璃或石英。与空气相比，透明材料将具有不同的折射率。例如，空气的折射率大约为1，与空气的折射率相比，玻璃的折射率大约为1.5。

由于两种材料之间的折射率不同，可能会发生光的折射，导致光束的聚焦特性发生变化。如上所述，可以对该效果进行校正。

现在讨论转向光片显微镜的计算方面。

图像形成和修复

现在讨论转向可以与上述光片显微镜结合使用的图像处理技术，以获得生物结构的高分辨率三维图像。

图13是示出了像素化检测器的图示，该像素化检测器捕获由光片显微镜从生物样品产生的图像。图13示出了线焦点210与检测器视场310之间的关系。如所示的，可以相对于光轴以一定角度生成线焦点。检测器可以是像素化检测器，诸如CMOS或CCD相机。该图还示出了像素化检测器、线焦点和以下图中使用的坐标系之间的关系。

图13示出了相对于光学组件120或160的光轴成一定角度所生成的线焦点。y维度通常在线焦点的方向上，并且沿着该线。作为横向扫描方向的x方向与y方向正交。相机通常被定位成使得样品图像通常落在检测器视场的中心附近，以便有效地使用检测器内的像素区域。成像显微镜物镜的光轴沿着z轴对准，并且与x和y方向两者正交。

由像素化检测器600获取的数据可以包括模糊、失真和/或光学像差，并且模糊、失真和/或光学像差可以是整个光学系统的可重复特性。激发（激光）可能会表现出其自身独特的特性失真，使得部分记录图像的模糊是由准直激光片

的强度分布引起的，该分布不是完全平坦的，而是3D强度分布，参见图15a。另外，由激发激光器的几何形状定义的x/y平面可能不完全垂直于显微镜转塔的z轴，并且因此不会与显微镜的焦平面对准（术语“焦平面”意味着显微镜在要放大的样品一侧的焦平面），参见图15c以进行完美对准。显微镜导致记录图像的进一步独特和特性失真，其一般而言表现出函数

，该函数将朝向显微镜行进的观察到的3D荧光分布映射成像素化检测器表面上的2D图像（参见图15d：“显微镜图像”)，在那里映射函数

可能会跨x/y平面改变其形状或取向（如图15b所示），这意味着它在空间上是变化的，并且照此它排除了简单的数值解卷积。最后，该2D显微镜图像被像素化检测器600采样和转换，该像素化检测器600可能带有其自己的610特性点扩散函数(PSF)

。

应该理解，术语“点扩散函数”在本文中与术语“强度分布函数”和“激发分布函数”可互换使用。应该将这些术语中的每一个理解成指代成像系统内的可测量且可重复的噪声源。另外，术语“成像系统”应该被理解成可以形成物体的二维图像的光学系统。成像系统的示例是形成图像的光学透镜系统，或者例如是显微镜。

函数

、

、

的知识可能非常有用，因为这些可再现的失真可以从像素化检测器所记录的最终原始图像I中去除，这使用数值3D恢复过程，从而得到恢复的图像F，参见图14。该目标可以通过采用例如迭代最大似然优化过程来实现。替换地，人工智能驱动的过程可以仅基于数据驱动的方法从记录的原始图像I中消除模糊、失真和/或光学像差，该数据驱动的方法可能不需要函数

、

、

的特定知识。两种方法的混合也可能是有益的，尤其是当函数

、

、

仅是近似已知时。由于函数

、

、

构成整个系统矩阵

的一部分，系统矩阵本身也可以通过

的最大似然优化与原始图像I的恢复并行确定。校正原始图像I的简单方法是一个解卷积过程，其可以在频域中执行。上面的解卷积和更复杂的方法是众所周知的，并且具体细节将不在此阐述。下面的讨论主要针对函数

、

、

的采集。

图14示出了激发强度分布

、显微镜映射函数

和像素化检测器的PSF

的示意图。模糊、失真和/或光学像差被简单地示意性地示为框，以指示作为函数

、

、

的效果，传入信号以可预测和可再现的方式被更改或变换。在

、

、

可以被确定或测量的范围内，如下所述，这些可预测的更改可以从原始图像I中由控制器400通过上述过程之一去除。函数

、

、

可以由控制器400基于通过透镜和检测器获取的数据以数值方式计算。控制器400还可以采用这些函数

、

、

来实行恢复过程。结果将产生校正后的图像F，如图14所示。由于

通常与

组合出现，因此在某些情况下，将仅提及

。然而，根据上下文，

可以被理解为也包括

。

如图14所示，函数

、

、

由光片显微镜（激光光学器件、显微镜光学器件、像素化检测器）产生，并且有助于收集数据并且将数据显示为来自生物样品的原始图像I。图14图示了控制器400，其可以控制可移动光学组件100和100'的图像采集、图像处理和移动。

图15描绘了图像形成的不同步骤。图15a示出了x/z平面中的横截面，其示出了激光片的两条等强度线。当击中适当的样品时，该激光片将产生荧光。然而，可移动光学组件100和100'将产生多个光片，并且它们中的每一个最初可能不是完全水平地定向，而是可能沿着x轴或y轴或其两者倾斜。另外，个体光片的初始对准可能是次优的。图15b示出了显微镜的映射函数

的示例，这里被描绘为一系列双锥体，其尾部（被描绘为双锥体连接在一起的点）一般而言定义显微镜的焦平面。在图15b中，焦平面确实被描绘成平坦的，然而，通常它可能会偏离平面并且表现出一定的曲率。焦平面定义了以显微镜的最高分辨率成像的样品结构的工作距离。图15b还示出了映射函数由双锥体的不同取向引起的空间变化的示例。一般而言，也可能发生锥形的变化。图15c示出了显微镜的焦平面和光片的平均层如何对准，以便将最高显微分辨率的平面与最高照射强度的平面相匹配。

图15d概述了在不同方位采用一些点状粒子750的图像形成，这些点状粒子750被激光照射并且因此发射荧光。理解显微镜的成像过程是有用的，就好像它将源自3D样品空间中的特定点状粒子750的荧光映射到其2D图像平面中的斑点（blob）或环状区域（术语“图像平面”意味着在显微镜生成的图像侧面上的显微镜的焦平面）。如果粒子位于焦平面中，映射函数

的最尖锐部分将产生映射的斑点，而远离显微镜焦平面的点状结构将被映射函数的锥壁状部分采样，该映射函数的锥壁状部分在显微镜的图像平面中产生映射环。对于显微镜光轴一侧处的点状结构，映射函数可能会倾斜，并且因此显微镜焦平面外部的粒子将被映射为椭圆。为了生成数字图像，可以使用像素化检测器来检测由显微镜在像素化检测器的表面上形成的图像。利用一些简化，恒定的PSF

可能归因于像素化检测器，从而导致在所得到的所记录的最终原始图像I中产生一些空间不变的模糊。

由于光学缺陷、散射和有限的分辨率（衍射极限），点并没有被成像为点。另外，在激光的线焦点之外，激光在样品越来越宽的z范围内发散并激发荧光，该荧光由显微镜成像，并且由于将样品的相邻z层叠加到显微镜的图像而引入附加的模糊，这被识别为分辨率的损失。

因此，系统可以通过横向和垂直移动激发来测量激发的点扩散函数。这些个体扫描中的每一个可以用来1)将像素子集贡献给合成的总原始图像Ic，以及2)用于计算PSF。这两种技术可以应用于每个横向扫描(x-方向)，并且也可以应用于通过样品的深度(z-方向)逐步进行的每个扫描。

图16是图示了如何从利用不同照明条件拍摄的多个扫描中组装图像的示意图。开始在左手边移动可移动光学组件100，像素化相机以数字方式收集扫描，其中线焦点处于第一方位中。然后横向移动线焦点，并且进行另一个扫描。下面关于图17讨论这些横向扫描中的每一个的数据处理。这一直持续到近似到达样品的中间为止。在此刻，右手可移动光学组件用来从相反侧照亮样品。在图像的中间，在那里照明从左手边可移动光学组件100转移到右手边可移动光学组件100'，使用软件算法以电子方式混合扫描。

该软件算法可以识别在右手扫描和左手扫描中都提供可识别特征的值得注意的像素或像素集合。然后将扫描与该点或与点的集合对准。然后将扫描的图像混合以组装下文中将被称为“合成原始图像Ic”的内容，其中，Ic可以被理解为具有与像素化检测器中的每个像素相关联的混合数据的数字文件。可以对数据应用混合和偏移函数来改进匹配的平滑度和准确性。在从左侧光学组件100到右侧光学组件100'的中间过渡区域中，来自直到过渡之前一直处于活动状态的一侧的贡献可以被给予逐渐减小的权重，而来自线上一侧的贡献被给予逐渐增加的权重。在图16中示出这种转换和所使用的函数。

图17是示出了光片穿过生物样品的逐步横向水平扫描的图示。对于每个图像1、2、3、4和5，通过平移可移动光学组件100来横向偏移线焦点210。利用每个图像中所示的线焦点拍摄图像。尽管在图17中示出了五个线焦点，但是应当理解，可以存在比仅仅五个更多的图像和更多的线焦点方位。横向间隔（即，扫描之间的距离）可以是可以基于如上关于图8和图9所描述的那样进行的数值孔径选择而做出的性能选择。

检测器和计算机可以捕获图像1-5的序列，如图17所示。这些原始图像I可以用作图像恢复的输入，并且也可以用来计算函数

和

。另一方面，它们可以用作组装合成原始图像Ic的输入，该合成原始图像Ic由原始图像I序列的非图像恢复条纹组成。由于图像恢复过程考虑（如果可用的话）扫描线焦点和z方位的所有序列（穿过样品的深度所扫描的），合成恢复图像Fc的组装可以由恢复过程本身实行。下面描述这些技术。

首先，包括被描绘为交叉影线部分的线焦点210的图像部分可以逐条组装成图17的底部处所示的最终合成原始图像Ic。因此，合成原始图像可以具有其中包括的扫描1-5中的每一个的子集。可以选择扫描1-5的那部分，其宽度近似在束腰的瑞利长度z _R （参见图16）内。在合成图像Ic的形成中可以忽略该范围之外的数据，然而，该数据仍然可以有助于如下所述的函数

和

的计算，或者用于图像恢复过程。因此，瑞利长度可以确定顺序扫描的步长。过渡的混合可以像图16所示的左/右过渡那样进行处理。在这些扫描区域上实行混合算法可能会导致出色的均匀性。避免在任何扫描期间调整任何参数可能很重要，使得可以比较像素和匹配区域。

沿着x的条带宽度（即，照明的宽度）可以取决于焦点w ₀ （参见图16）的紧密度，并且因此取决于光学系统的NA。通过增加分辨率（增加NA，并且因此增加焦点w ₀ 的紧密度），人们可以使条带变窄，并且减少用于合成图像的有用像素的数量。典型的是每幅图像10步，其中每步大约为200个像素，从而导致在x方向（扫描方向）上通常是2160个有用像素。AR是1/10或1/15左右。例如，如果纵横比为10，则可能只有200个可用像素/图像。

在一些实施例中，使用相对大的数值孔径并且实行大量步骤是有利的。在其他实施例中，更大的瑞利长度z _R 和更少的步骤是更适当的。这样的细节将取决于应用以及所寻求的数据的类型和数量。

因此，合成原始图像Ic可以从个体扫描1-5来组装。与中心混合算法一样，合成图像可以通过识别扫描序列中的值得注意的特征，并且基于该值得注意的特征的特性拟合数据来进行组装。使用这种方法，可以从一系列顺序重叠的光片扫描重建合成原始图像Ic。然而，如下所述，扫描1-5中的每一个也可以用于计算函数

和

，或者用于图像恢复过程。

然而，此外，来自扫描1-5中的每一个的全部数据也可以被馈送到计算机或控制器，因为具有相同视场的这些多个图像包含关于函数

和

的信息，即，激光的强度分布和显微镜的映射函数。换言之，当线焦点210扫过视场时，高斯光束的不同部分照亮样品的不同部分。因此且重要的是，每次扫描中收集的所有数据都可能对函数

的计算有贡献。该数据然后可以用于从原始图像I形成恢复图像F的恢复过程。

换言之，图像1-5中的每一个可以在交叉影线区域内和别处都包含关于函数

和

的信息。这包括未被线焦点210显著照亮的部分。因此，函数

可以具有来自整个第一图像I₁₁的贡献。它可能具有来自整个第二图像I₁₂的另一个贡献。它可能还具有来自整个第三图像I₁₃的另一个贡献等等。总函数

覆盖了从线焦点的最左侧部分到线焦点的最右侧部分所施加的激光强度分布的完整空间范围，并且显微镜映射函数在显微镜的FOV的整个空间范围内的总函数

可能得自所有个体扫描。然后，该技术也适用于穿过样品的深度完成的扫描，如下所述。

图18是示出了横向维度（x维度，图18a）上的扫描和深度（z维度，图18b）上的扫描的图示，这些扫描用于通过光片显微镜从生物样品产生三维图像。x维度扫描可以通过在x维度上横向移动可移动光学组件100和100'产生，这具有使线焦点210跨生物样品200横向移动的效果。连续扫描之间的间隔可以是d₁。另外，d₁可以与束腰有关，并且因此与光片的数值孔径和瑞利长度z _R 有关。类似地，线焦点的宽度d₂也可能与束腰有关，并且因此与光片的数值孔径和瑞利长度z _R 有关。

然后可以在与显微镜的焦平面正交的z方向上穿过其深度来扫描样品。图18b所示的深度扫描可以通过在z维度上上下移动生物样品，并且然后重复刚才所述的横向扫描来完成。

如利用横向（x方向）扫描所做的那样，合成原始三维图像Ic可以具有其中包括的每一个深度扫描的子集。可以选择扫描中其宽度近似在束腰的瑞利长度内的那部分。过渡的混合可以像图16所示的左/右过渡那样进行处理。在这些扫描区域上实行混合算法可能会导致出色的均匀性。因此，在合成图像Ic的生成中也使用来自所有扫描的所有数据。替换地，来自所有扫描的所有数据，特别是深度扫描的所有数据可以用于计算函数

和

的z变化，即，激光强度分布和显微镜的映射函数的z变化；在完成了函数

、

连同

的测量之后，来自所有扫描的所有数据都可以用作恢复过程的输入。

举个例子，可接受的采集速度和分辨率可能需要大约20个个体扫描。如果B是图像平面的总宽度，如图18所示，则d₁ = B/N，n = 1 到N，通常小于20个个体扫描n。N可以高达100，但是通常小于20。理想情况下，片（sheet）应该重叠，应该记住要被成像的结构的大小来挑选d₁。

在一些实施例中，可以几次处理（address）同一平面。样品的其余部分并不经历锐利的聚焦光。如果人们使用过高的采样，光漂白可能会变得相关，因为激发激光到样品的能量转移随着更小的采样步骤和更紧密的激光聚焦而增长。如果人们使用的样品数量非常少，就变得相当于使用共焦显微镜。

如果使用标准共焦显微镜来处理所有层，则在图像采集期间照亮整个样品。结果，整个样品在扫描期间被反复漂白，还会生成破坏性的热。然而，使用本发明的扫描方法，样品仅被激光特别地在关注的平面中照亮，该关注的平面可以垂直移动到下一个关注的平面。

当线焦点在连续的扫描之间移动的情况下使用几个扫描收集图像时，线焦点就可能重叠。这可以给出改进的性能和准确性，因为图像内的可识别特征可以用来在将扫描合并成最终图像之前准确地对准这些扫描。

最终，人们可以通过函数

和

，即，激光强度分布和显微镜的映射函数的z变化，将所有数据组合起来以获得光学退化过程的整体描述。应该注意的是，可移动光学组件120、140和160中的三个光束中的每一个都表现出相似的函数

，因为它们具有相似的光学性质，但是当三个可移动光学组件120、140和160的几何取向被精心对准时指出益处可能是值得注意的。

恢复过程可以产生更好的信噪比(SNR)和更少的模糊和变形伪影，因为对恢复的所测量的输入处理样品体积中具有x和z方向上的不同激发的每个点。因此，多个扫描可以被视为样品的真实未模糊和未变形3D表示的耦合线性变换系统，该系统可以用来建立目标函数，该目标函数达到样品的该真实3D表示的最小值——其描述了使目标函数最小化以获取样品的恢复图像的通常方法。

对于利用特定样品的测量，人们可以在仅源自光学系统的部分与由于当前样品的影响而产生的部分之间分开函数

和

（即，激光的强度分布和显微镜的映射函数）施加的对光学退化的影响。为了做到这一点，利用理想的样品结构实行测量是有益的，该样品结构例如是玻璃珠（纳米珠），其嵌入在具有与测量特定样品时相似的折射率的优先机械稳定的环境（例如琼脂糖）中。由于这些测量是在具有恒定折射率的周围环境中的点状物体上实行的，可以认为激发光行进通过探头而没有变形。照此，由这些测量得出的函数

和

加上函数

（描述了像素化检测器的PSF）共同表示了激光显微镜的图像形成过程的特性，然而并没有生物样品所诱导的附加退化。

样品本身的影响可能使激发激光偏离它们的主要路径，同时越来越深地行进到样品中。因此，如果激光在没有与样品相互作用的情况下行进，则样品的部分可能会被照亮，这些部分原本将保持未曝光。函数

的这种偏差可以例如通过以下技术来解开，该技术比较来自左手可移动光学组件100和右手可移动光学组件100'的焦线方位的曝光，这两者都应该曝光样品的相同部分，考虑到没有样品本身造成的影响和偏差。关于

，这种偏差不仅可能是激光强度分布的几何变形，而且可能是整体衰减，并且也可能是由某些样品子结构的衰减引起的所谓阴影，这些子结构由于不充分或不可能的探针清除（clearing）而对激光不透明。

样品本身的影响也可能改变显微镜的映射函数

，并且这种偏差一般而言将在从显微镜的视角观察样品所处的z平面的同时发生变化，越来越深入样品内部。这是发射光必须朝向显微镜行进通过样品的路径长度增加的结果。因此，映射函数

可能会以几种方式失真；首先，映射的几何形状（例如在图15中被描绘为双锥体）可以以特定于样品的方式变形。其次，显微镜的焦平面可能会失真，并且可能会引入曲率，这意味着其中局部映射函数具有其尾部的在x/y/z中的方位（被描绘为图15中的双锥体连接在一起的点）可能会改变。函数

的这种偏差可以与例如基于人工智能的方法一起在恢复过程本身期间计算。

一种计算函数

的样品诱导的偏差（以及还有函数

的偏差）的方法可以通过半盲恢复过程来实行，该半盲恢复过程通过最初使用未受干扰的函数

和

开始恢复样品的图像（参见前面的段落），该未受干扰的函数

和

用于解释可以如何测量和计算这些未失真的函数

和

。在一些迭代之后，考虑到数值方法迭代地操作，函数

和

本身可以以使另一个目标函数最小化的方式进行优化，其中当前获得的样品图像作为恒定输入实体而进入。从这个阶段开始，样品的图像和样品失真函数

和

两者都可以通过交替的方法进行优化。应当注意的是，该描述是可以用来优化样品图像和样品失真函数

和

两者的描述其中之一。在又另一个替换方案中，可以在根本不测量任何函数

、

和

的情况下实行全盲恢复。然而，这是非常耗时的，并且可能根本无法递送有意义的结果，因为它一般而言是一个非凸优化问题，其最终可能会出现局部最小值而不是全局最小值。因此，在盲目恢复过程中，人们通常也会对如何构造函数

、

和

做出一些适当的假设。如果这些假设是根据前几段对未受干扰的函数

和

的测量和计算得出的（也可以给出像素化检测器的函数

的起始假设），则人们例如在上述半盲恢复过程中结束。

现在讨论转向光片显微镜的机械和光学方面。

光源和替换光路

图19是示出了可能有利于光片显微镜系统的运行的附加光学部件的图示。光路可以包括至少两个波长或颜色选择器。第一波长选择器可以是辐射源500上的滤光轮550。第二波长选择器可以是检测路径上的另一个滤光轮660。第一滤光轮550可以选择或挑选用于光片显微镜激发和检测的工作波长。通常，检测垂直于（沿垂直轴）激发，但并不一定。

滤光轮可以是布置成圆形、并且由过滤某些波长的光同时允许其他波长通过的材料覆盖的孔径的组件。不同的孔径可以被不同的材料覆盖，并且因此透射不同的波长。因此，可以通过旋转滤光轮来选择透射波长，以在射束路径中放置不同的孔径。一个滤光轮550可以在源500之后使用，并且另一个滤光轮660可以在检测器600前面使用。

图20是示出了用于光片显微镜激发和检测的一些示例性光源的图示。在一个实施例中，可以使用白光源500（图20a），并且然后滤光轮550选择例如八种左右的组成波长中的任一种。滤光轮560可以具有8个彩色滤光片，并且可以用来通过旋转滤光轮550来连续选择要查看哪个波长。滤光轮550可以具有能够通过重要辐射线的设置，这在荧光显微术中是众所周知的。例如，这些线可以包括以488、515、553、591、640、785 nm的六个激发线。

在其他实施例（图20b）中，可以使用单独的光源，例如，激光光源521、激光光源522、激光光源523、激光光源524和激光光源525。每个光源可以具有相关联的转向镜，其将发射的辐射偏转到成像透镜530中，该成像透镜可以准直或聚焦辐射，并且将辐射输入到光纤510中。光纤510可以将准直的辐射传输到另一个部件540，该部件540可以进一步修改辐射，并且最终进入准直透镜580。来自准直透镜580的辐射可以遵循图19所示的路径。换言之，在图20所示的实施例中，单个源500可以被多个以不同波长521-525发射的分立光源替换。如图20所示，可能有5个激光器。五个激光源可以通过所示的二向色元件耦合。然后激光输出可以全部被透镜530聚焦到光纤电缆510中。然后可以通过准直透镜580对发散的光纤输出进行准直。当然，除了被示为521-525的那些之外，可以有更少或更多的分立光源。

替换地，光源可以使用激光组合器或以非常宽的波段450-2000 nm发射的超连续激光。该范围可以覆盖四个或更多个激励线。激光组合器可以被软件控制成添加连续变化数量的任何颜色的激光。

在操作中，可以打开和关闭五个激光器中的每一个。声光调制器可能便于这种切换。五个激光器可以是高速、飞秒脉冲发射器，以便捕获非常短的事件。

图21是示出了光片显微镜的检测路径中的部件的图示。检测器可以包括成像物镜620和另一个滤光轮660。与滤光轮550一样，滤光轮660可以仅通过某些波长的光。例如，可能合期望的是对以例如515 nm发射的所有结构进行成像。在这种情况下，滤光轮660可以旋转，直到通过515的滤光片元件被置于辐射路径中为止。然后，取决于应用，可以通过包括显微镜物镜670的多个其他光学部件将所选波长成像到像素化检测器600上。最后，像素化检测器600可以测量所选波长处和特定像素元件中的光强度。如图21所示，还可以有放大/缩小元件59，其在不改变物镜670的情况下改变成像样品的放大率。应当理解，图21中描绘的像素化检测器600可以与图19中描绘并且在图14中提及的像素化检测器600相似或相同。

替换地，检测器可以使用响应于不同颜色的两个或更多个相机。检测器可以替换地使用彩色相机。

独立运动

这里描述的光片显微镜的主要优点之一是组件可以彼此独立地移动。例如，线焦点可能总是落在由100的运动及其部件120、140和160的放置所定义的单个平面中。这种零件的配置定义了其中放置样品的图像平面，以及线焦点所定义的焦平面。该平面可以保持固定，而许多其他部件相对于该平面移动。因此，一旦建立了平面并且相对于它聚焦或调节了检测，则可能就不需要再次进行这些调节。即使改变样品、或改变成像透镜、或改变澄清流体，这也可能是正确的。可移动样品台可以被配置成始终将样品保持在该平面中。这些有利的特征可以通过使用具有相对于像平面可独立移动的载物台、并且如下所述进行布置的载物台来实现。

图22和图22a（其中包括图22a、图22b和图22c）是示出了光片显微镜的第一重要机械/光学方面的图示。可以使用保持多个物镜的转塔10。这些透镜中的每一个的光轴可以是平行的。使用图22所示的设计，转塔10可以旋转，并且可以选择不同的物镜，而无需移动样品200或任何激发或其他检测光学器件。可以在不移动样品或线焦点的焦平面的情况下完成旋转。这对于在不同放大率下获得可靠、可再现的图像可能很重要。通过使比色皿300成形为具有允许物镜穿透生物样品平面的凹部来适应移动，即使这些透镜未使用时也是如此。这允许以极其容易和快速的方式、以不同放大率对不同区域进行成像。

例如，描述了具有安装在旋转转塔10上的三个物镜1、2和3的显微镜。透镜1、2和3的光轴可以平行，如安装在转塔10中。多个透镜之一（比如说透镜编号3）可以是实际使用的成像透镜。多个透镜中的其他透镜1和2允许挑选不同放大率和视场，但是目前未使用。当拍摄图像时，工作透镜3被降低到生物样品正上方的方位，使得透镜浸没在澄清流体1000中，并且包含在比色皿300的周边内。由于非工作透镜1和2也安装到转塔10，并且因此耦合到相同机构，因此这些透镜1和2也被降低。两个切口或释放区域或弯曲表面或空隙350和351被设计到比色皿中，以允许也降低这些透镜1和2，但是不干扰显微镜中的任何其他结构。因此，当工作透镜被浸没时，至少一个非工作透镜没有被浸没（即，位于容器旁边）。

可以在支撑可移动光学组件100或101的可移动载物台900中制作其他切口950和951。这些切口也可以被定尺寸成接纳透镜1、2或3中的任何一个。例如，切口352和952可以一起接纳透镜2，而切口351连同载物台900中的另一个切口（为了呈现方便而未示出）可以接纳透镜1。如所示的，可移动样品台800可以可移动地放置在比色皿300内。

当需要不同的放大率或视场时，可以升高转塔10直到它离开比色皿300，并且然后转动转塔10来选择不同的工作透镜。在新透镜就位的情况下，转塔再次降低到比色皿300中在样品正上方的方位。由于透镜1和2的缓解区350、351，这些透镜也可以在没有由于切口或缓解区或弯曲表面或空隙350和351所致的机械干扰的情况下降低。

图22a是示出了旋转保持多个物镜的转塔的能力的平面图。图22b是容纳转塔透镜1、2和3的样品台800和比色皿300的透视图。图22c是转塔透镜1、2和3的透视图。转塔10在图22c中被示意性地示为可旋转机构，三个透镜1、2和3附接到该可旋转机构。如图22c所示，不同的透镜可以具有不同的物理尺寸。特别地，透镜1、2或3中的一个可以很大程度上长于其他两个。一个的直径也可以比其他的直径更宽。比色皿300中的切口或缓解区350可以被成形为以便适应该尺寸。切口350可以是圆形的，并且可以接纳工作透镜3。切口351和352可以是圆形的一部分，并且被成形为接纳透镜1、2或3的其他干涉部分，如图22a所示。因此，可以在不移动透镜架以外的任何东西的情况下改变透镜选择，即，在不移动样品200、比色皿300或光片平面或线焦平面210的情况下。如提到的，可以在支撑可移动光学组件100或101的可移动载物台900中制作其他切口950和951。这些切口也可以被定尺寸为接纳透镜1、2或3中的任何一个。例如，切口352和952可以一起接纳透镜2，而切口351连同载物台900中的另一个切口（为了呈现方便而未示出）可以接纳透镜1。如所示的，可移动样品台800可以可移动地放置在比色皿300中。

图23是示出了可以如何独立于转塔物镜显微镜横向移动光片或线焦平面210的另一个平面图23。图23类似于图22，除了还相对于比色皿300示出了可移动光学组件100和100'外。样品架800也在图23中示出，并且其运动也被示意性地示出。上述切口351、352、951和952也在图23中图示，比色皿300和样品台800也是如此。

应当理解，虽然扫描方向（即，线焦点的横向运动方向）被描述为通常在x方向上，并且因此与线焦点的范围正交，但扫描也可以在y方向（即，平行于线焦点的范围）上实行。

软件可以知道每个透镜的焦距，因此可以自动对焦。可以简单地通过在z维度上上下移动工作物镜来获得焦点。这是可能的，因为在此过程中激发平面和样品没有移动。此能力为改变样品提供了极大的便利并且为改变透镜/成像提供了极大的便利。它还适用于机器人或自动化运行。

如图23所示，可移动光学组件100和100'可以在不移动或干扰光片显微镜的任何其他特征的情况下横向移动。转塔10上的转塔透镜1、2和3也可以在不影响或干扰光片显微镜的任何其他特征的情况下移动。如前所述，切口350、351、352、951和952可以用来接纳物镜1、2或3中的每一个和任何一个。最后，样品架800的运动也可以独立移动，并且下面关于图24进一步描述该移动。

因此，对于具有三个物镜的转塔，允许所有透镜都浸入样品平面中。透镜可以通过透镜升高机构升高，新的观察透镜旋转到位，并且最后降低到流体中。因此，运动可以是升高、然后旋转、然后降低。因此，该系统实现了在改变透镜的同时使透镜保持在设置中的目标，而无需移动任何其他部件。转塔10将透镜的光轴保持平行，并且保持在其圆形旋转托盘上。

光片显微镜系统还可以具有其他独立可移动的特征。应当理解，接纳转塔物镜的开口350、351、352、951、952可以在可移动光学组件100、100”中制成，或者它们可以在显微镜主体的其他固体表面中制成，该表面诸如是光学平台和载物台。但是在任何情况下，这些开口350、950和951都形成在光片显微镜的固体材料中，以便允许刚刚所述的移动。

光片显微镜系统还可以具有其他独立可移动的系统。样品台800和比色皿300也可以是可独立于其他系统移动的。在整个这些运动中，光片图像平面210可以保持固定。这种配置可能对于机器人处理和托盘是理想的。这些能力在图24、图25和图26中图示。

图24图示了光片显微镜的另一个可独立移动的特征。用澄清溶液1000支撑比色皿300的比色皿载物台930也可以独立于可移动光学组件100和100'、转塔10上的物镜1、2和3以及样品架800上的样品200而升高和降低。这种能力在图24a和图24b中图示。

在图24a中，工作透镜700在生物样品200的正上方就位。在该方位，工作透镜700浸没在澄清流体1000中。如果需要操纵或改变样品200的澄清溶液，则可以降低支撑比色皿300的载物台930。这种降低可以从澄清流体1000提升或收回生物样品200。如图24b所示，可以在不改变或干扰光片显微镜的任何其他方面的情况下改变或操纵样品200或澄清流体1000。比色皿可以在不影响样品或样品架的情况下降低。这意味着用户可以在不浸入溶液的情况下取出样品。例如，即使样品已经改变，仍然可以调节聚焦。光片平面和检测器可以保持在相同的相对方位。无需其他操作即可将充满液体的器皿移开，或者利用新鲜流体将其放回原位、浸没样品以用于成像。如前所述，透明窗口360和361可以接纳到样品200的辐射。

图25a和图25b示出了样品架800的另外的细节，该样品架也具有一些重要特征。样品架800可以包括可以从支撑点820横向延伸的样品台臂810。该支撑点820可以耦合到可以升高和降低支撑点820的可移动致动器（未示出）。通过移动支撑点，样品200可以升高或降低以进入或离开澄清溶液。图25b的侧视图图示了可移动载物台930、样品台800和比色皿300的关系。样品台800耦合到样品支撑点820。例如，该支撑点820可以通过例如翼形螺钉或齿轮齿条横向或垂直移动。

应当理解，如果样品200被升高，则工作物镜也可能需要被升高以允许间隙。然而，利用可移动的支撑点820，可以在不干扰光片显微镜的任何其他方面的情况下，将样品从澄清流体中去除，并且操纵或交换样品。

比色皿载物台930和样品支撑点820的两个独立运动在图25b中示出。图25a以平面图的形式示出了处于其工作取向中的部件。比色皿300可以在顶面350中具有大圆孔350，其将接纳工作物镜。该孔径350可以允许透镜下降到澄清流体1000中，直到它与生物样品相距合适的距离，使得该结构处于焦点中。然后可以升高工作透镜，直到它离开比色皿300，并且可以旋转透镜组件和转塔以将另一个物镜放置到操作方位中。其他非操作透镜将被降低到剖面表面351、352、951和952中。

如图25所示，生物样品200可以安装在可移动样品台800上。样品台800可以是机动的x、y、z载物台，其可在三个维度上移动。

因此，样品台可以以例如大约30 mm的行程（throw）垂直移动。然而，样品台也可以以大约80 mm的行程横向移动。因此，样品可以相对于可移动光学组件横向移动，但重要的是，它也可以是可垂直移动的。垂直移动可以使得能够实现较早所讨论的三维成像能力。如前面解释的，横向扫描是通过相对于样品横向移动可移动光学组件100和100'而不是横向移动样品来实现的。因此，线焦点的平面（即，线焦点在其中移动的平面）是由可移动光学组件100和100'的运动建立的，并且一般而言在操作期间不会改变。

可移动样品架800允许对大样品进行成像，例如，高达100×100 mm。因此，视场/放大率可以容纳具有大约22 mm的有效面积的检测器。

因此，可以独立于光学器件、流体学器件（fluidics）、激发和检测来操纵样品架。样品可以在平面中垂直移动不同的深度，并且可以针对改变的成像位置横向移动。在不接触激发或检测光学器件的情况下改变样品的能力在易用性方面提供了显著益处。流体容器或比色皿300可以在z方向上独立于样品、检测器和激发垂直移动。因此，可能在不接触光学系统的情况下改变样品是可能的。还有可能在不接触样品架800的情况下改变样品200。

还应当理解，使用例如张量流记录的诸如机器学习和深度学习之类的人工智能技术可以被用来改进最终图像质量。

图26a是图25的平面图中所示结构的侧视图。图26a示出了浸没在比色皿300和澄清流体1000中的样品200。图26b示出了从比色皿300和澄清流体1000中收回的样品200。光片平面210可以相对于除比色皿300以外的一切物体保持就位。

图27是示出了可以如何使用新型样品架处理多个样品的图示。由于大行程（在该横向维度上为25 mm），多个生物样品可以被同时装载到样品架上。在图27中，五个样品810被示为装载到样品架800上。使用横向致动器，这些样品中的每一个都可以被连续带到线焦点平面，并且被成像。因此，多个生物样品可以在不移动光片显微镜中的任何其他结构的情况下成像。无需移动光学器件、检测器、流体学器件、成像系统。结果，拍摄连续图像的条件尽可能接近、相同。这允许特别简单和直接的自动化或机器人操作。

光片显微镜可以通过对铝进行加工和作阳极氧化、例如除了定制零件之外使用公开可用的透镜、激光器、光学元件（诸如转向镜）、可移动载物台、步进器和连续电机的组合来制成。检测器可以是易于从各种源获得的CCD相机。可以使用显微镜中的标准程序以及通过对具有已知属性的材料（诸如玻璃珠）进行成像来校准和聚焦该设备。例如，图像可以显示在机器上的监视器上或通过互联网远程显示。

在所有前述独立运动当中，然而，光片焦平面总是停留在比色皿内且相对于系统的相同方位中。检测锁定到此激发焦平面。

因此，描述了一种用于对设置在样品架上的第一生物样品进行成像的光片显微镜。该显微镜可以包括成像透镜结构，该成像透镜结构包括具有焦平面的工作物镜和至少一个非工作透镜，并且其中，该成像透镜结构可通过可移动第一载物台在与焦平面正交的z方向上移动；以及保持一定量流体的容器，其中，样品架可浸入流体中。该显微镜还可以包括形成焦平面的图像的检测器，其中，图像包括第一生物样品的至少一部分，并且其中，可移动第一载物台具有足够的运动范围，以将工作物镜浸没在保持在容器中的流体中，由此在检测器上形成第一生物样品的图像，并且其中，当成像透镜结构被浸没时，样品架和容器具有接纳成像透镜结构的移动的形状。

工作和非工作透镜都可以具有基本上平行且在z方向上的光轴，并且其中，成像透镜结构在z方向上是可移动的。工作透镜可以在检测器上形成第一生物样品的图像。工作和非工作透镜可以可旋转地安装在定义了成像透镜结构的透镜转塔上，使得非工作透镜可以通过旋转透镜转塔变成工作物镜。

光片显微镜可以进一步包括可移动光学子组件，该可移动光学子组件包括聚焦光学器件，其中，聚焦光学器件被配置成将多个光束聚焦成定义了光片的单个直线，并且其中，光片位于成像光学器件的焦平面中，并且因此在生物样品中；以及保持可移动光学子组件的可移动第二载物台，其中，第二可移动载物台横向移动，并且平行于焦平面、并且垂直于z方向移动，由此将光片移动到生物样品的不同横向相邻区域。

多个光束可以包括分开一定角度的至少三个光束，其中，至少三个光束被可移动光学组件全部聚焦到定义光片的同一直线，并且其中，光片位于焦平面中。多个光束可以包括六个光束，其中六个光束中的三个在生物样品的任一侧上，并且三个射束中的每一个分开一定角度，并且其中每组三个射束被设置在生物样品的任一侧上的两个可移动光学子组件聚焦成单个直线。

多个光束可以均在聚焦光学器件的上游分开一定角度，其中，光束通过聚焦光学器件聚焦成单条线，其中，该单条线定义了光片，并且其中，光片被设置在焦平面中并且照射样品，并且其中，焦平面与z方向正交；并且其中，工作物镜浸没在第一生物样品和样品台上方的流体中，以对被照射的样品成像。

光片可以基于可移动第二载物台的移动在焦平面内横向移动，以在不影响透镜转塔或样品架的方位的情况下，照射跨第一生物样品横向隔开的多个区域。通过在z方向上向下移动透镜转塔，或者通过在z方向上向上移动容器，可以将工作物镜浸没在流体中。容器和样品架可以被提供有直径的尺寸为大约4 cm的开口，并且其中，透镜转塔中的每一个透镜具有不同的尺寸和放大率，并且其中，开口具有接纳具有最大直径的透镜的尺寸。在不移动焦平面或透镜结构的情况下，第一生物样品可以从样品架去除，并且被另一个生物样品替换。

容器可以独立于样品架和焦平面两者在容器台上在z方向上移动。可以通过移动容器台以暴露第一生物样品，在不干扰样品架、透镜转塔和焦平面中的任一个的情况下，在样品架上放置另一个生物样品，以代替第一生物样品。样品架可以具有至少50 mm的横向尺寸，提供容纳具有高达大约100×100 mm的尺寸的第一生物样品、或者至少两种不同的生物样品的表面。光片显微镜可以进一步包括：耦合到样品架的可移动第三载物台，其被配置成在z方向上移动样品架中的第一生物样品，以利用光片照射第一生物样品中的多个深度。

光片可以基于可移动第三载物台的移动而相对于第一生物样品在z方向上移动，以在不影响透镜转塔或样品架的方位的情况下照射第一生物样品内的不同深度处的多个区域。可移动第一载物台、可移动第二载物台和可移动第三载物台都可以具有单独且解耦的移动机构，并且都可以独立于焦平面并且不干扰焦平面地运动。可移动第一载物台、可移动第二载物台和可移动第三载物台都具有分离且解耦的移动机构，并且都可以独立于焦平面且不干扰焦平面地移动。通过在z方向上移动容器，样品架可以是可浸入流体中的。

还公开了一种使用具有旋转转塔的光片显微镜的方法，该旋转转塔上具有设置在其上的多个成像透镜。该方法可以包括：通过调节工作物镜的方位在检测器上形成图像，其中工作物镜的光轴在与焦平面垂直的z方向上，并且其中，焦平面包括样品架的至少一部分，其中，样品架将生物样品保持在澄清流体中，并且工作物镜浸没在澄清流体中，在z方向上移动工作物镜以从澄清流体中取出工作物镜，以及旋转该旋转转塔，以在不改变焦平面或样品架的方位的情况下将另一个成像透镜移动到成像方位中。

该方法可以进一步包括：将另一个成像透镜降低到澄清流体中，并且通过另一个成像透镜获得设置在样品架上的样品的图像。替换地，该方法可以进一步包括：降低澄清流体以从澄清流体中去除工作物镜。在其他实施例中，该方法可以包括：在不改变焦平面或样品架的情况下改变生物样品。

虽然已经结合以上概述的示例性实现方式描述了各种细节，但是各种替代、修改、变型、改进和/或实质等同物，无论是已知的还是目前可能无法预见的，都可能在审查上述公开内容后变得显而易见。因此，以上阐述的示例性实现方式意图是说明性的，而非限制性的。

Claims (24)

1.一种用于对放置在样品架上的第一生物样品进行成像的光片显微镜，其包括：

成像透镜结构，包括具有焦平面的工作物镜和至少一个非工作透镜，并且其中，成像透镜结构可通过可移动第一载物台在与焦平面正交的z方向上移动；

保持一定量流体的容器，其中，样品架可浸入流体中；以及

形成焦平面的图像的检测器，其中，图像包括第一生物样品的至少一部分，并且其中，可移动第一载物台具有足够的运动范围以将工作物镜浸没在保持在容器中的流体中，由此在检测器上形成第一生物样品的图像，并且其中，样品架和容器具有当成像透镜结构被浸没时接纳成像透镜结构移动的形状。

2.根据权利要求1所述的光片显微镜，其中，工作透镜和非工作透镜都具有基本上平行且在z方向上的光轴，并且其中，成像透镜结构在z方向上是可移动的。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的光片显微镜，其中，工作透镜在检测器上形成第一生物样品的图像。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的光片显微镜，其中，工作透镜和非工作透镜可旋转地安装在定义了成像透镜结构的透镜转塔上，使得通过旋转所述透镜转塔，非工作透镜可以成为工作物镜。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的光片显微镜，进一步包括：

包括聚焦光学器件的可移动光学子组件，其中，聚焦光学器件被配置成将多个光束聚焦成定义了光片的单个直线，并且其中，光片位于成像光学器件的焦平面中，并且因此在生物样品中；以及

保持可移动光学子组件的可移动第二载物台，其中，第二可移动载物台横向移动，并且平行于焦平面、并且垂直于z方向移动，由此将光片移动到生物样品的不同横向相邻区域。

6.根据权利要求5所述的光片显微镜，其中，多个光束包括分开一定角度的至少三个光束，其中，至少三个光束被可移动光学组件全部聚焦到定义光片的同一直线，并且其中，光片位于焦平面中。

7.根据权利要求5或6所述的光片显微镜，其中，所述多个光束包括六个光束，其中六个光束中的三个在生物样品的任一侧上，并且三个射束中的每一个分开一定角度，并且其中每组三个射束被设置在生物样品的任一侧上的两个可移动光学子组件聚焦成单个直线。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的光片显微镜，其中，所述多个光束均在聚焦光学器件的上游被分开一定角度，其中，光束通过聚焦光学器件聚焦成单条线，其中，所述单条线定义了光片，并且其中，光片被设置在焦平面中并且照射样品，并且其中，焦平面与z方向正交；并且其中，工作物镜浸没在第一生物样品和样品台上方的流体中，以对被照射的样品成像。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的光片显微镜，其中，所述光片基于可移动第二载物台的移动在焦平面内横向移动，以在不影响透镜转塔或样品架的方位的情况下，照射跨第一生物样品横向隔开的多个区域。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的光片显微镜，其中，通过在z方向上向下移动透镜转塔，或者通过在z方向上向上移动容器来将工作物镜浸没在流体中。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的光片显微镜，其中，所述容器和样品架被提供有直径的尺寸为大约4 cm的开口，并且其中，透镜转塔中的每一个透镜具有不同的尺寸和放大率，并且其中，开口具有接纳具有最大直径的透镜的尺寸。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的光片显微镜，其中，在不移动焦平面或透镜结构中的任何一个的情况下，第一生物样品可以从样品架去除，并且被另一个生物样品替换。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的光片显微镜，其中，所述容器独立于样品架和焦平面两者在容器台上在z方向上移动。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的光片显微镜，其中，可以通过移动容器台以暴露第一生物样品，在不干扰样品架、透镜转塔和焦平面中的任一个的情况下，在样品架上放置另一个生物样品，以代替第一生物样品。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的光片显微镜，其中，样品架具有至少50 mm的横向尺寸，提供容纳具有高达大约100×100 mm的尺寸的第一生物样品、或者至少两种不同的生物样品的表面。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的光片显微镜，进一步包括：

耦合到样品架的可移动第三载物台，其被配置成在z方向上移动样品架中的第一生物样品，以利用光片照射第一生物样品中的多个深度。

17.根据权利要求16所述的光片显微镜，其中，所述光片基于可移动第三载物台的移动而相对于第一生物样品在z方向上移动，以在不影响透镜转塔或样品架的方位的情况下照射第一生物样品内的不同深度处的多个区域。

18.根据权利要求16-17中任一项所述的光片显微镜，其中，可移动第一载物台、可移动第二载物台和可移动第三载物台都具有单独且解耦的移动机构，并且都可以独立于焦平面且不干扰焦平面地移动。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的光片显微镜，其中，可移动第一载物台、可移动第二载物台和可移动第三载物台都具有独立且解耦的移动机构，并且都可以独立于焦平面且不干扰焦平面地移动。

20.根据权利要求1-18中任一项所述的光片显微镜，其中，通过在z方向上移动容器，样品架可浸入流体中。

21.一种使用具有旋转转塔的光片显微镜的方法，所述旋转转塔上具有设置在其上的多个成像透镜，所述方法包括：

通过调节工作物镜的方位在检测器上形成图像，其中工作物镜的光轴在与焦平面垂直的z方向上，并且其中，焦平面包括样品架的至少一部分，其中，样品架将生物样品保持在澄清流体中，并且工作物镜浸没在澄清流体中；

在z方向上移动工作物镜以从澄清流体中取出工作物镜；

旋转所述旋转转塔，以在不改变焦平面或样品架的方位的情况下将另一个成像透镜移动到成像方位中。

22.根据权利要求36所述的方法，进一步包括：

将另一个成像透镜降低到澄清流体中；以及

通过另一个成像透镜获得设置在样品架上的样品的图像。

23.根据权利要求36所述的方法，进一步包括：

降低澄清流体以从澄清流体中去除工作物镜。

24.根据权利要求36所述的方法，进一步包括：

在不改变焦平面或样品架的情况下改变生物样品。

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