CN106574899A - 用于样品的显微镜检查的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于显微镜检查样品(5)的方法。该方法包括如下步骤：使样品(5)与具有比样品(5)更高的折射率的光学透明介质(12)接触，产生辐照光束(13)，并且引导辐照光束(13)通过聚焦辐照光束的辐照透镜(1)。随后，使用布置在检测透镜(2)上的偏转部件在待检查的样品(5)的方向上偏转辐照光束(13)，从而使得辐照光束(13)照射光学透明介质(12)和样品(5)之间的界面(10)，并且在界面(10)完全反射以用于样品(5)的倏逝辐照。最后，对由样品(5)发射并通过检测透镜(2)的荧光进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及用于样品的显微镜检查的方法，还涉及用于执行这种方法的装置。
背景技术
在样品的显微镜荧光检查的范围内，通常直接用辐照光束辐照样品，从而在受辐照区域内光学激发样品并且随后检测由样品发射的荧光。在扫描显微镜中，通常使用可控光束偏转部件引导辐照光束的焦点以蜿蜒的模式越过或通过样品，并且以这种方式每次扫描样品的一个点，所述可控光束偏转部件可以包括例如一个或多个倾斜反射镜。
作为直接样品辐照的替代方案，也可以倏逝地辐照样品。这里，激发光在边界表面上被全反射至样品，由此样品被随穿透深度减小的倏逝电磁场激发。对于这种类型的样品检查已经建立了术语TIRFM(全内反射荧光显微术)。
德国专利申请DE 10344410 A1公开了一种利用倏逝样品辐照的扫描显微镜。该扫描显微镜包括光源，光源的光耦合至盖玻片中以使得光可以通过全内反射在盖玻片的表面上传播，并且可以辐照布置在盖玻片上的样品的大的表面积。此外，扫描显微镜具有点检测器，用于接收由样品的扫描点发射的检测光，扫描显微镜还具有布置在检测光的光束路径中的光束偏转部件，用于移动样品中的扫描点的位置。但是，该装置具有如下缺点，即辐照光到盖玻片的耦合不是非常有效，因此只有减少量的光可用于倏逝地辐照样品。
此外，当提到样品的倏逝辐照时，从现有技术已知的方法和装置通常具有不能灵活且足够精确地设置样品辐照的精确位置的缺点。
此外，从现有技术已知的方法和装置带来的缺点是，在倏逝辐照的显微镜检查之前，样品必须被费力地布置和准备在特殊的样品室中或者盖玻片之间，然后才能将样品室或者机械地夹持有样品的盖玻片结构放置在显微镜的载物台上。通常情况下，位于本应发生全反射的边界表面处的样品的边缘区域恰好被连续压力应力损坏，使得随后的显微镜检查受到最小负面的影响或甚至完全不可能实施。
发明内容
本发明的目的在于提出一种用于样品的显微镜检查的方法，该方法可以灵活地用于不同的样品和样品布置，特别是可以以不伤样品的方式实施。
该目的通过包括以下步骤的方法实现：
a.使样品与折射率比所述样品更高的光学透明介质接触，
b.产生辐照光束，
c.引导所述辐照光束穿过聚焦所述辐照光束的辐照物镜，
d.使已经通过辐照物镜的辐照光束在待检查样品的方向上偏转，这是使用布置在检测物镜上的偏转部件实现的，从而使得辐照光束照射光学透明介质和样品之间的边界表面并在该边界表面处全反射以倏逝地辐照样品，
e.例如使用产生与荧光灯的光输出成比例的电信号的检测器来检测由样品发射并且通过检测物镜的荧光。
本发明的另一个目的是提出一种装置，其可以使用上述方法在倏逝辐照下对显微镜样品进行成像。
该目的通过具有辐照物镜和检测物镜的装置来实现，检测物镜上布置有偏转部件以将辐照光束偏转到光学透明介质和样品之间的边界表面上。
本发明具有以下优点：可以高效地实现倏逝样品辐照。这尤其可以归因于以下事实：由于在辐照光束已经通过辐照物镜之后发生的利用偏转部件的偏转，辐照光束可以容易且可靠地以必要的入射角被引导，从而实现在光学透明介质和样品之间的边界表面上的全内反射。
此外，本发明具有额外的特殊优点，即可以容易地改变照射到光学透明介质和样品之间的边界表面上的位置，并且没有无意中越过全反射临界角的风险，这将在下文更详细地解释。
此外，根据本发明的方法也可以有利地以这样的方式进行，以使得样品可以在待检查的边缘区域上根本没有任何压力应力地放置在检查位置中，并且使得直到即将产生显微图像之前，其不与光学透明介质接触，结果，使得可能对实际上未受应力的样品进行显微镜检查。这同样在下文更详细地解释，特别是结合几个实施例。
为了使辐照光束可靠地以全内反射所需的入射角取向，并且为了使辐照光束照射在样品和光学透明介质之间的边界表面上，边界表面优选地以相对于辐照物镜和/或检测物镜的光轴的不为零的角度取向。可以以特别灵活和通用的方式应用的实施例是其中样品和光学透明介质之间的边界表面垂直于辐照物镜和/或检测物镜的光轴取向的实施例。特别地，这种取向使得可以从不同方向，特别是每次以相同的入射角辐照样品，特别是同一个样品区域。例如，这是为了根据辐照光的偏振，特别是根据辐照光的线偏振平面的取向来检查样品的荧光特性。
特别地，为此目的，在辐照光束已经偏转之后，其在相对于辐照物镜的光轴的角度不为零的平面内延伸。例如，辐照光束以这样的方式偏转，以使得其以55°至70°范围内的入射角，特别是以60°至64°范围内的入射角照射样品和光学透明介质之间的边界表面。在这些范围内，可以实现以足够的穿透深度实现大多数生物样品的倏逝样品辐照。
在根据本发明的方法的特别有利的实施例中，在显微镜检查过程中，辐照光束在样品和光学透明介质之间的边界表面上的照射位置和/或入射角和/或入射方向被改变。
改变照射位置使得例如可以连续地辐照和检查不同的样品区域，因为由这些样品区域发射的荧光被发送至例如CCD检测器的表面检测器，从而获取二维图像，该过程生成每个特定样品区域的图像。特别地，例如可以沿着扫描路径系统地扫描与光学透明介质接触的样品的边缘表面，并将每个扫描的样品区域与表面图像相关联。然后，根据所获取的图像信息，可以针对各个样品区域重建样品的总图像。例如，辐照光束在样品和光学透明介质之间的边界表面上的照射位置可以沿着扫描路径，特别是具有曲折路线的路径连续地改变。以这种方式，可以确信的是，辐照的表面积通常小于检测物镜的视场。可以通过排列不同样品区域的若干图像来利用检测物镜的整个视场。
然而，这种方法实际上用于特殊应用，而且通常仅产生足够大的辐照焦点，以使得可以同时倏逝地辐照整个感兴趣的样品区域，并且使得可以同时由诸如例如CCD检测器的表面检测器产生样品区域的图像，从而获取二维图像。
为了获得可能的最大辐照光斑，辐照光束的焦点在辐照光的传播方向上应当尽可能长，并且应当具有可能的最大焦点直径。在辐照光的传播方向上的长的焦点是重要的，因为由于辐照光束照射边界表面的大的入射角，光学透明介质和样品之间的边界表面上的辐照光斑被拉长。在横截面垂直于传播方向的圆形辐照光束的情况下，在光学透明介质和样品之间的边界表面上的照射表面实质上是椭圆形的。因此，焦点长度应当优选地大于照射表面的椭圆的长半轴的两倍。大的焦点直径在短半轴的方向上具有特别好的效果。
为了能够在传播方向上产生尽可能大的焦点直径和尽可能长的焦点，辐照物镜优选具有例如0.05的小数值孔径。仅作为近似并且依赖于其它参数，例如相对于光学透明介质和样品之间的边界表面的选定入射角，这样的物镜可以辐照总计大约100μm乘10μm的照射表面。
为了实现照射表面的扩大，特别是在短半轴方向上的扩大，也可以使用合适定向的光带(即横截面垂直于传播方向的细长辐照光束)或者准光带代替圆形辐照光束被耦合到辐照物镜中，这将在下文更详细地解释。
在特定实施例中，作为照射位置的改变的替代或补充，改变辐照光束在样品和光学透明介质之间的边界表面上的入射角。以这种方式，例如可以改变倏逝场在样品中的穿透深度和/或由辐照光束辐照的光斑的尺寸。
作为照射位置的改变和/或入射角的改变的替代或补充，可以改变辐照光束在样品和光学透明介质之间的边界表面上的入射方向。特别地这样做以使得如果例如要检查取决于线偏振方向的样品特性，照射边界表面的光的线偏振方向与入射方向同时旋转。
为了能够改变辐照光束在样品和光学透明介质之间的边界表面上的照射位置和/或入射角和/或入射方向，特别可能的是采用可调节偏转角的光束偏转部件。该光束偏转部件可以包括例如能够围绕不同的旋转轴线旋转的万向(cardanically)悬挂的倾斜反射镜或两个倾斜反射镜。特别地，光束偏转部件可以用于使辐照光束相对于辐照物镜和/或偏转部件移动。
作为使用可调节光束偏转部件的替代或补充，也可以通过相对辐照物镜和/或相对于辐照光束移动样品来改变辐照光束在样品和光学透明介质之间的边界表面上的照射位置和/或入射角和/或入射方向。为此，特别地，可以使用可以优选在三个空间方向上移动的载物台。
除了改变照射位置、入射角和/或入射方向的上述可能性之外，还可以通过相对于样品移动偏转部件来改变这些参数。这可以作为使用光束偏转部件和/或作为移动样品的替代或补充。在特定实施例中，偏转部件不可移动地附接到检测物镜。特别地，为了能够改变照射位置和/或入射角和/或入射方向，偏转部件可以有利地布置在检测物镜上，特别是附接至检测物镜。
在特定实施例中，偏转部件被布置在前区域中和/或前透镜附近。
在特定实施例中，偏转部件被配置为具有多个面的反射镜。特别地，这样的实施例使得可以改变辐照光束在样品和光学透明介质之间的边界表面上的照射位置和/或入射角和/或入射方向，因为例如通过可调节光束偏转部件或者通过移动偏转部件，不同的面被连续地辐照。在此，多个面在空间上不同地取向，从而在不同情况下实现不同的空间方向上的反射。作为替代，例如，偏转部件也可以具有截头锥形反射镜表面。这种实施例使得可以连续地并且围绕穿过照射位置的轴旋转辐照光束，以便勾勒锥形表面。
如所解释的，根据本发明的方法提供了用于设置照射位置和/或入射角和/或入射方向的多种可能性，这具有非常特殊的优势，即用户可以将该方法单独地适应特定样品或特定检查的需求。
如果照射位置被改变，特别是如果光学透明介质和样品之间的边界表面被扫描，那么在每种情况下，照射的特定位置可以与样品区域相关联，从而产生由若干图像组成的总图像。
特别地，考虑入射角和/或样品的折射率和/或光学透明介质的折射率和/或辐照光束的波长和/或照射位置的直径，针对每个照射位置确定相关联的样品区域。在这种确定的范围内，优选地校正或补偿误差，特别是系统相关的误差。特别地，可以根据几何光学原理，例如效应进行辐照光束的实际路线相对于可预期的光束路径的空间偏差的补偿或校正。
优选地，还对由光学透明介质(特别是盖玻片)的厚度与设定厚度的偏差引起的误差进行补偿或校正。例如，盖玻片的实际厚度与至少170μm的标准厚度之间的显著偏差是并不罕见的。这种补偿和这种校正因子的应用的优点是可以实现待检查样品的图像的特别好的分辨率。
在有利的实施例中，通过检测在每个特定照射位置的辐照期间由样品发射的检测光而获取的至少一个特定(特别是二维)的图像与每个照射位置和/或每个相关联的样品区域相关联。
术语“图像”特别是指以可以例如在PC上显示的数据的形式和/或肉眼可见的图像的形式的样品或样品的一部分的再现。
检测器可以特别地以这样的方式配置，即对于每个像素，检测器产生与接收的检测光的光输出成比例的电信号。特别地，检测器还可以同时或顺序地接收不同波长的特定荧光，并且在每种情况下产生相应的电检测信号。例如，检测器可以是CMOS传感器，其能够根据波长彼此独立地检测不同层(通道)中的荧光。作为替代，检测器可以包括若干CCD检测器，到达每个检测器的不同波长范围的检测光由二向色分束器提供。特别地，为了检测不同波长的荧光，激发光束可以包括例如多色激光器或多个单独激光器或白色光源的多个激发光波长。
如已经提到的，辐照光束的横截面可以是圆形的。在这样的实施例中，在光学透明介质和样品之间的边界表面上的照射位置被拉长并且实质上椭圆形的。然而，如已经提到的，辐照光束也可以是光带的形式。这种光束形式例如可以通过布置在辐照光束的光束路径中的圆柱形光学系统来实现。作为替代，也可以产生准光带，因为光束偏转部件用于使具有基本圆形横截面的辐照光束在一个空间方向上快速地来回移动，使得其不再能够与由圆柱形光学系统产生的光带区分开。
使用光带形式的辐照光束使得可以辐照光学透明介质和样品之间的边界表面的大的表面积。
当辐照物镜的光轴和检测物镜的光轴彼此平行或同轴地取向，从而优选地检测物镜和辐照物镜的前透镜彼此面对时，获得用于执行根据本发明的方法的布置，其非常灵活地使用并且精确地运行。利用这样的实施例，待检查的样品可以被布置在辐照物镜和检测物镜之间的空间中，由此有利地留下大量空间来操纵和引导辐照光束，特别是为了实现从不同方向或以不同入射角辐照边界表面。这具有特别的优势，即存在使检查条件适应特定需求的多种可能性。
在根据本发明的方法的特别有利的实施例中，使用相同的装置但是使用不同的检查方法来检查相同的样品。这种方法具有非常特别的优势，即可以彼此独立地使用不同的检查方法来获取关于样品的信息，例如为了将这些条信息彼此比较或者为了收集关于样品的尽可能多的信息。这里，样品优选地保留在辐照物镜和检测物镜之间的空间中。
除了上述倏逝地辐照样品的检查之外，可以有利地进行SPIM(单平面辐照显微镜)检查，其中，特别地以光带或准光带形式的辐照光束被直接地并且没有全反射地引导至并且通过样品。这种光带或准光带完全透射样品的层，由此检测由该层垂直发射并由检测物镜准直的检测光。为了能够接收与层上的单个样品位置有关的位置信息，优选地使用例如CCD检测器的表面检测器。通过光带相对于样品的连续移动，可以一层接一层地透射并产生空间分辨的检测信号的层堆叠，因此可以产生样品的三维重建。
特别地对于SPIM检查，有利地是在辐照光束已经通过辐照物镜之后，辐照光束被布置在辐照物镜上的另一偏转部件直接偏转到样品上。这优选以这样的方式进行，即光带以相对于检测物镜的光轴的不为零的角度传播，特别是以相对于检测物镜的光轴90°的角度传播。优选地，偏转的光带或准光带的传播平面垂直于检测物镜的光轴取向。这种取向允许非常精确的图像重建，其很大程度上避免了费力的几何校正计算。
在特定实施例中，至少两个偏转部件被布置在检测物镜上，其中一个偏转部件用于偏转辐照光束以便倏逝地辐照样品，而另一偏转部件用于偏转特别地为了SPIM检查目的被成形为光带或准光带的辐照光束。
为了能够在倏逝样品辐照和直接样品辐照之间来回切换，偏转部件可以可移动地布置在检测物镜上，从而使得根据需要，一个偏转部件或者另一偏转部件可以被引入到辐照光束的光束路径中。作为替代或补充，还可以通过使用可调节偏转角的光束偏转部件将辐照光束引导至特别设想的偏转部件上。
通常有利的是，辐照光束以这样的方式耦合到辐照物镜中，以使得其偏心地通过辐照物镜，因为这样的光束路径使得将样品定位到辐照物镜和/或检测物镜的光轴上或者至少其附近成为可能，由此确保样品可以从完全不同的方向被辐照。
在适于执行根据本发明的方法的装置的非常特别的实施例中，光学透明介质本身是偏转部件或偏转部件的至少一部分。特别地，这样的实施例使得可以首先将样品定位在辐照物镜和检测物镜之间以使其在机械上完全不受应力(例如在充满水的培养皿中)，由此辐照物镜优选地被布置在空间上位于样品下方的倒转显微镜布置中，而检测物镜位于样品上方。在这种布置中，只有在实际检查之前，光学透明介质才能与检测物镜一起在样品的方向上移动直到其与样品接触，从而满足倏逝样品辐照的先决条件。以这种方式有效地防止了样品在实际检查之前已经经历了长时间的压力应力，例如因为样品被夹在盖玻片之间，结果可以确切地发生对待检查样品的边缘区域的持久损伤，这是一个巨大的缺点，特别是在活样品的情况下。
偏转部件可以特别地具有由透明材料制成的块，特别是棱镜。这里，例如，从辐照物镜发射的辐照光束通过棱镜的斜边表面耦合到棱镜中并且在棱镜的短反射面上反射向样品，样品与斜边表面接触，从而使得辐照光束在作为边界表面的斜边表面上被全反射至样品。由样品发射的荧光穿过棱镜到达检测物镜，检测物镜然后准直检测光。
在如上所述可以由例如由透明材料制成的块构成的光学透明介质和检测物镜之间，优选地具有用于适配折射率的部件，例如浸没油。
这种布置特别地使得可以相对于样品和相对于由透明材料制成的相邻块移动检测物镜，为此目的，可以存在合适的调节部件用于设置由透明材料制成的块相对于检测物镜的距离。这种调节能力(例如利用螺纹驱动器)具有可以补偿在倏逝辐照期间发生的效应(诸如效应)的有益效果。
在另一个有利的实施例中，同时用作偏转部件的光学透明介质特别地直接耦合到检测物镜的前透镜。可以例如使用在检测物镜的前透镜和由透明材料制成的配合块之间的光学套件来实现耦合。例如，前透镜可以被配置为半球形透镜，具有半球形凹形耦合表面的配合块例如通过光学套件耦合到该半球形透镜上。作为替代方案，还可以提供同时用作偏转部件的包括检测物镜的前透镜的光学透明介质，和/或提供用作检测物镜的前透镜的偏转部件。这些方案具有非常特别的优点，即可以避免或至少最小化在检测光的光路上经由光学透明介质和检测物镜的前透镜的不期望的反射造成的检测光的损失。
如已经提到的，有利的是，偏转部件具有由透明材料制成的块，块的至少一个外表面，特别是被配置和布置为与样品接触的块的外表面，用作耦合入辐照光束的窗口。
如同样已经提到的，块的另一外表面优选地被配置为反射镜或具有反射镜，以便偏转辐照光束。如已经提到的，特别是对于使用不同检查方法对相同样品的检查，可以存在用于偏转辐照光束，特别是以光带或准光带的形式的辐照光束的另一偏转部件，其特别地布置在检测物镜上。特别地，一个偏转部件和/或另一个偏转部件可以可移动地附接至检测物镜，例如为了能够改变辐照光束的照射位置和/或入射角和/或入射方向和/或为了能够进行几何校正，例如为了校正效应。特别是为了这些目的，如已经提到的，用于执行根据本发明的方法的装置可以具有可调节偏转角的光束偏转部件。
特别地，光束偏转部件也可以是扫描显微镜(特别是共焦扫描显微镜)的光束偏转部件。
适合于实施根据本发明的方法的装置可以有利地基于扫描显微镜、尤其是共焦扫描显微镜来构造。在这里，它特别适合使用倒转显微镜支架。因此，特别有利的是使用扫描显微镜(其可能已经在实验室中以任意方式可用)来执行根据本发明的方法。
附图说明
本发明的主题在附图中示意性地示出，并且在下文参照附图进行描述，其中相同或等同功能的元件通常由相同的附图标记表示。其中：
图1是用于实施根据本发明的方法的装置的第一实施例的详细视图，其具有带有反射镜的偏转部件，
图2是用于实施根据本发明的方法的装置的第二实施例的详细视图，其中，偏转部件被配置为由透明材料制成的块，
图3是用于实施根据本发明的方法的装置的第三实施例的详细视图，其中，偏转部件另外地承担检测物镜的前透镜的功能，
图4是第四实施例的详细视图，其中，可以进行倏逝样品辐照和直接样品辐照。示出了用于倏逝样品辐照的设置。
图5是第四实施例的详细视图，其示出用于SPIM检查的直接样品辐照光束的设置，
图6a和6b是示出辐照光束的照射表面的示意图，
图7a和7b是示出辐照光束的照射位置的改变的示意图，
图8是具有包含面反射镜的偏转部件的实施例的详细视图，
图9是具有包含截头锥形反射镜的偏转部件的实施例的详细视图，以及
图10是光束偏转部件的实施例的详细视图，光束偏转部件用于改变照射位置和/或入射角和/或入射方向。
具体实施方式
图1示出了装置的第一实施例的详细视图，下文将基于该视图解释根据本发明的方法的可构想的实施例。
该装置具有辐照物镜1和被配置为油物镜的检测物镜2。辐照物镜1和检测物镜2的光轴彼此同轴，并且它们面向相反的方向。偏转部件3附接至检测物镜2，并且具有截头锥形反射镜表面4。
待检查的样品5被布置在第一盖玻片6和第二盖玻片7之间的含水营养介质中。盖玻片6、7相对于彼此被环绕的垫圈9密封以使得含水营养介质8不能逸出。
在面对检测物镜2的盖玻片6和检测物镜2之间，存在浸没油11，偏转部件3也浸没在浸没油11中。
面对检测物镜2的盖玻片6用作折射率比样品5更高的光学透明介质12。辐照光束13通过辐照物镜1聚焦，并且在从辐照物镜1的前透镜出射之后通过盖玻片6、7而不与样品5相互作用，并且最终到达偏转部件3。然后，偏转部件3使辐照光束13在待检查的样品5的方向上偏转，并且使得辐照光束13照射光学透明介质12和样品5之间的边界表面10，并在边界表面10上发生全反射以倏逝地辐照样品5。
由样品5发射的荧光14穿过检测物镜2，并且随后到达例如CCD检测器的表面检测器(这里未示出)以获取二维图像。光束偏转部件(这里未示出)可以在截头锥形反射镜表面4的不同位置处引导辐照光束13，以将辐照光束13从不同入射方向引导至光学透明介质12和样品5之间的边界表面10。在图中，仅用虚线示意性地示出辐照光束13的改变的光束路径。
特别地，为了实现良好的分辨率，重要的是辐照光束13的焦点精确地位于光学透明介质12和样品5之间的边界表面10上，特别是考虑几何校正，例如为了补偿效应或者为了补偿光学透明介质12(特别是盖玻片6)的厚度与设定厚度的偏差。为了精确地设置，可以在Z方向上相对于辐照物镜1一起调节盖玻片6、7和样品5。为此，例如，可以使用在Z方向上可调节的平移台。
此外，也可以使盖玻片6、7与放置在它们之间的样品5一起在X方向和/或Y方向上移动，从而可以选择辐照光束13在边界表面10上的照射位置。作为替代或补充，也可以通过可调节偏转角的光束偏转部件来改变照射位置和/或入射角和/或入射方向。
特别地，为了确保检测物镜2的数值孔径也用于收集检测光14，同样可以在Z方向和/或在X-Y方向上相对于样品调节检测物镜2。
图2示出了第二实施例的详细视图，其中光学透明介质12被配置为棱镜，该棱镜具有用于偏转来自辐照物镜1的辐照光束13的反射表面15和被构造和布置成与样品5接触的外表面16，从而使得在外表面16和样品5之间形成用于辐照光束13的全内反射的边界表面10。
样品5布置在容器17中，容器17填充有含水营养介质8并且朝向检测物镜2开口。这样的实施方式具有非常特殊的优点，即在实际检查之前样品5仅与光学透明介质12接触，使得其仅在实际检查之时才承受压力应力。这避免或至少大大减少了在实际检查之前连续压力应力对样品5的损伤。
与图1所示的实施例的情况一样，检测光14通过检测物镜2到达例如CCD检测器的表面检测器(这里未示出)以获取二维图像。
在图2所示的实施例中，考虑所讨论的检查，例如还可以使用可调节偏转角的光束偏转部件，以灵活地调节辐照光束13在样品5和光学透明介质12之间的边界表面10上的照射位置和/或入射角和/或入射方向。
在该实施例中，光学透明介质12例如通过光学套件或浸没油直接耦合至检测物镜2的前透镜。为了检查样品5，将光学透明介质12浸入水8中并置于样品5之上。
图3示出了与图2所示的实施例不同的第三实施例的详细视图，其中光学透明介质12被配置为使得其可以另外承担检测物镜2的前透镜的功能。特别地，光学透明介质12可以包括前透镜和用作偏转部件并且具有用于置于样品5上的外表面的块，两者制成一体并且一起制成。这样的实施例是非常坚固的并且不是非常易于出错。
图4和图5分别示出了用于执行根据本发明的方法的装置的第四实施例的详细视图。该装置具有第一偏转部件18和另一偏转部件19。第一偏转部件18以及另一偏转部件19连接至检测物镜2。第一偏转部件18完全光学透明介质20，其具有用于偏转辐照光束13的反射表面21。此外，光学透明介质20还具有外表面22，该外表面22被构造和布置成与样品5接触，以形成实现全内反射的边界表面10。
图4示出了装置的两种可能设置中的一种，即利用倏逝样品辐照进行检查的设置。同样通过这种设置，综上所述，可以改变辐照光束13在边界表面10上的照射位置和/或入射角和/或入射方向。
该装置被另外地配置为通过不同的检查方法(例如特别是SPIM)对相同的样品5进行检查。为此目的，辐照光束13，特别是以光带或准光带形式的辐照光束13被引导至另一偏转部件19。另一偏转部件19具有第二反射镜表面23。
另一偏转部件19以这样的方式偏转辐照光束13，以使得辐照光束13在偏转之后在垂直于检测物镜2的光轴的平面内传播。以这种方式，样品5的层被透射，并且由样品发射并通过检测物镜2的检测光14被检测，优选地被空间分辨检测。表面检测器，例如特别是CCD检测器或SCMOS检测器，可以用于执行样品5发射的检测光14的空间分辨检测以获取二维图像。为了更清楚起见，在图中未示出检测器。
为了设置正确的聚焦位置和/或补偿特别是在利用倏逝样品辐照时可能发生的类型的特殊几何效应，第一偏转部件18和另一偏转部件19附接至检测物镜2以使得它们相对于检测物镜2的相对位置是可移动和可调节的。可调节的附接部件24用于此目的。
同样在该实施例中，例如为了正确地设置聚焦位置和/或设置照射位置和/或入射角和/或入射方向，各个部件的空间位置可以相对于彼此进行调节是有利的。
图6a和6b示出了对于倏逝样品辐照，辐照光束13在光学透明介质12和样品5之间的边界表面10上的照射表面25的示意图。
为了获得可能的最大辐照光斑25，辐照光束13的焦点在辐照光的传播方向上尽可能长，并且具有大的焦点直径。在横截面垂直于传播方向的圆形辐照光束的情况下，在光学透明介质12和样品5之间的边界表面10上的照射表面25实质上是椭圆形的。因此，焦点长度应当优选地大于照射表面25的椭圆的长半轴26的两倍，特别是通过使用具有低数值孔径的辐照物镜1。焦点直径对应于椭圆形照射表面25的短半轴27的大约两倍。在该方向上，可以通过使用以光带或准光带形式的辐照光束13来代替具有圆形横截面的辐照光束13来实现照射表面25的扩大。
图7a和7b示出了辐照光束13在光学透明介质12和样品5之间的边界表面10上的照射位置28变化的示意图。
通过例如使用可调节的载物台相对于辐照光束13移动样品5和/或通过例如使用可调节偏转角的偏转部件相对于样品5移动辐照光束13，和/或通过移动偏转部件3，照射位置28可以连续地改变，也就是说，照射表面25可以相对于样品移动。这样做例如是为了获取不同样品区域的若干二维图像，这些二维图像随后可以被组合以形成总图像。例如，如果样品5垂直于辐照光束13移动(如从图7a的绘图平面所看到的)，如图7b中示意性示出的照射位置28可以排成一行，并且可以针对每个照射位置产生二维图像。
图8示出具有包含面反射镜29的偏转部件3的实施例的详细视图。面反射镜29包含若干具有不同空间位置和取向的不同的面。
待检查的样品5被布置在第一盖玻片6和第二盖玻片7之间的含水营养介质8中。盖玻片6、7相对于彼此通过环绕的垫圈9密封以使得含水营养介质8不能逸出。
在该实施例中，例如通过光束偏转部件(在该图中未示出)，辐照光束13可以对准不同的面30，以使得辐照光束13在不同的照射位置28和/或以不同的入射角和/或以不同的入射方向照射样品5和光学透明介质12(即盖玻片6)之间的边界表面10。作为替代，代替改变辐照光束13的空间位置和/或取向，也可以例如借助于定位单元(在该图中未示出)相对于辐照光束13移动面反射镜29。
图9示出了具有包含截头锥形反射镜31的偏转部件3的实施例的详细视图，为了更清楚起见，仅示出了其截面。
待检查的样品5被布置在第一盖玻片6和第二盖玻片7之间的含水营养介质8中。盖玻片6、7相对于彼此被环绕的垫圈9密封以使得含水营养介质8不能逸出。
截头锥形反射镜31使得例如可以特别地连续地并且围绕穿过照射位置28的轴旋转辐照光束13，以便勾勒锥形表面。
图10示出了具有光束偏转部件32的实施例的详细视图，光束偏转部件32可以调节偏转角，并且可以包括例如多个检流计反射镜，以改变辐照光束13在样品5和光学透明介质12(即盖玻片6)之间的边界表面上的照射位置28和/或入射角和/或入射方向。
在该实施例中，光束偏转部件3被配置为平面反射镜33。通过改变辐照光束13在平面镜33上的照射位置，可以改变辐照光束13在样品5和光学透明介质12之间的边界表面10上的照射位置28和/或入射角和/或入射方向。
为了说明辐照条件的改变的原理，辐照物镜1和辐照光束13的路线仅在该图中示意性地示出，但是未被完全切合实际地示出。
附图标记列表
1 辐照物镜
2 检测物镜
3 偏转部件
4 截头锥形反射镜表面
5 样品
6 第一盖玻片
7 第二盖玻片
8 含水营养介质
9 垫圈
10 边界表面
11 浸没油
12 光学透明介质
13 辐照光束
14 检测光
15 反射表面
16 外表面
17 容器
18 第一偏转部件
19 其他偏转部件
20 光学透明介质
21 反射表面
22 外表面
23 第二反射镜表面
24 附接部件
25 照射表面
26 长半轴
27 短半轴
28 照射位置
29 面反射镜
30 面
31 截头锥形反射镜
32 可调节光束偏转部件
33 平面反射镜
Claims (19)
1.一种用于样品(5)的显微镜检查的方法，其特征在于以下步骤：
a.使所述样品(5)与折射率比所述样品(5)更高的光学透明介质(12)接触，
b.产生辐照光束(13)，
c.引导所述辐照光束(13)通过聚焦所述辐照光束(13)的辐照物镜(1)，
d.使已经通过所述辐照物镜(1)的辐照光束(13)在待检查的样品(5)的方向上偏转，并且这使用布置在检测物镜(2)上的偏转部件来实现，以使得所述辐照光束(13)照射所述光学透明介质(12)和所述样品(5)之间的边界表面(10)并在所述边界表面(10)上全反射以倏逝地辐照所述样品(5)，
e.检测由所述样品(5)发射并通过所述检测物镜(2)的荧光。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
a.所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)以相对于所述辐照物镜(1)和/或所述检测物镜(2)的光轴的不为零的角度取向，或者在于
b.所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)垂直于所述辐照物镜(1)和/或所述检测物镜(2)的光轴取向。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
a.所述辐照光束(13)在偏转之后，在相对于所述辐照物镜(1)的光轴的角度不为零的平面内延伸，和/或在于
b.所述辐照光束(13)以这样的方式偏转：使得其以55°至70°范围内的入射角照射所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)，和/或在于
c.所述辐照光束(13)以这样的方式偏转：使得其以60°至64°范围内的入射角照射所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：
a.所述辐照光束(13)在所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)上的照射位置(28)和/或入射角和/或入射方向被改变，和/或在于
b.所述辐照光束(13)在所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)上的照射位置(28)和/或入射角和/或入射方向沿着扫描路径被连续地改变，和/或在于
c.所述辐照光束(13)在所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)上的照射位置(28)和/或入射角和/或入射方向通过能够调节偏转角并作用在所述辐照光束(13)上的光束偏转部件来改变，和/或在于
d.所述辐照光束(13)在所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)上的照射位置(28)和/或入射角和/或入射方向通过相对于所述辐照物镜(1)移动所述样品(5)来改变，和/或在于
e.所述辐照光束(13)在所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)上的照射位置(28)和/或入射角和/或入射方向通过移动所述偏转部件来改变，和/或在于
f.所述偏转部件(3)被配置为具有多个面的反射镜，并且所述辐照光束(13)在所述样品(5)和所述光学透明介质(12)之间的边界表面(10)上的照射位置(28)和/或入射角和/或入射方向由于不同的面被连续地辐照而改变。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
a.样品区域与每个照射位置(28)相关联，和/或在于
b.考虑入射角和/或所述样品(5)的折射率和/或所述光学透明介质(12)的折射率和/或所述辐照光束(13)的波长和/或所述照射位置(28)的直径，针对每个照射位置(28)确定样品区域。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，通过检测在每个特定照射位置(28)的辐照期间由所述样品(5)发射的检测光而获取的图像与每个照射位置(28)和/或每个相关联的样品区域相关联。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，从不同方向连续辐照相同的照射位置(28)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述辐照光束(13)的横截面是圆形的，或者所述辐照光束(13)以光带或准光带的形式。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述辐照物镜(1)的光轴和所述检测物镜(2)的光轴彼此平行或同轴地取向，和/或所述检测物镜(2)和所述辐照物镜(1)面对相反的方向并且彼此相对地布置。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，
a.相同的样品(5)经历另一检查，其中，利用所述辐照光束(13)直接地并且在所述边界表面(10)上没有全反射地进行辐照，和/或在于
b.相同的样品(5)经历另一检查，其中，利用所述辐照光束(13)直接地并且在所述边界表面(10)上没有全反射地进行用于SPIM(单平面辐照显微镜)检查的辐照，和/或在于
c.相同的样品(5)经历另一检查，其中，利用被成形为光带或准光带的辐照光束(13)直接地并且在所述边界表面(10)上没有全反射地进行辐照。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，为了另一检查的目的，在所述辐照光束(13)已经通过所述辐照物镜(1)之后，通过布置在所述辐照物镜(2)上的另一偏转部件将所述辐照光束(3)偏转至所述样品(5)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述辐照光束(13)以这样的方式耦合到所述辐照物镜(1)中：使得其偏心地通过所述辐照物镜(1)。
13.一种用于执行根据权利要求1至12中任一项所述的方法的装置，具有辐照物镜(1)和检测物镜(2)，偏转部件(3)布置在所述检测物镜上以将辐照光束(13)偏转到光学透明介质(12)和样品(5)之间的边界表面(10)上。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述光学透明介质(12)是偏转部件(3、18)或偏转部件(3、18)的一部分。
15.根据权利要求13或14所述的装置，其特征在于：
a.所述偏转部件(3、18)具有由透明材料制成的块，特别是棱镜，和/或在于
b.所述偏转部件(3、18)耦合至，特别是直接地耦合至，所述检测物镜(2)的前透镜，或者所述偏转部件包括所述检测物镜(2)的前透镜，和/或在于，
c.所述偏转部件(3、18)具有由透明材料制成的块，其中所述块的至少一个外表面被配置成反射镜，和/或在于
d.所述偏转部件(3、18)具有由透明材料制成的块，其中所述块的一个外表面被配置和布置成用于耦合入所述辐照光束(13)的窗口。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的装置，其特征在于：
a.存在用于另一检查的另一偏转部件(19)，其中，利用所述辐照光束(13)直接地并且在所述边界表面(10)上没有全反射地辐照所述样品(5)，和/或在于
b.在所述检测物镜(2)上布置用于另一检查的另一偏转部件(19)，其中，利用所述辐照光束(13)直接地并且在所述边界表面(10)上没有全反射地辐照所述样品(5)。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的装置，其特征在于：
a.一个偏转部件(3)或另一偏转部件被配置为反射镜或面反射镜(29)，或者在于
b.一个偏转部件(3)或另一偏转部件具有至少一个反射镜或面反射镜(29)，和/或在于
c.一个偏转部件(3)或另一偏转部件具有包含截头锥形反射镜表面的反射镜。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的装置，其特征在于，一个偏转部件(3、18)和/或另一偏转部件(19)被布置为能够在所述检测物镜(2)上移动。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的装置，其特征在于，具有能够调节偏转角的光束偏转部件(32)以改变所述辐照光束(13)在所述边界表面(10)上的照射位置(28)和/或入射角和/或入射方向。
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