DE19923563C2

DE19923563C2 - Vorrichtung zur tiefenauflösenden Totalreflexionsfluorometrie mikroskopischer Proben

Info

Publication number: DE19923563C2
Application number: DE1999123563
Authority: DE
Inventors: Karl Stock; Herbert Schneckenburger; Reinhard Sailer; Wolfgang S L Straus; Rudolf Steiner
Original assignee: STIFTUNG fur LASERTECHNOLOGIE
Current assignee: STIFTUNG fur LASERTECHNOLOGIE
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2002-09-19
Anticipated expiration: 2019-05-22
Also published as: DE19923563A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur tiefenauflösenden Totalreflexionsfluorometrie im Grenzflächenbereich mikroskopischer Proben.

Totalreflexionsfluorometrie ist ein Meßverfahren, bei dem ein aus einem ersten optischen Medium kommender Lichtstrahl an der Grenzfläche zu einem zweiten optischen Medium total reflektiert wird. Hierbei dringt ein evaneszentes elektromagnetisches Feld in das zweite Medium ein und regt grenzflächennahe Moleküle einer Probe zur Fluoreszenz an. Diese Fluoreszenz wird mit einem Mikroskopobjektiv detektiert. Die Eindringtiefe des evaneszenten elektromagnetischen Feldes ändert sich mit dem Winkel des eingestrahlten Lichts, so daß Moleküle in unterschiedlicher Tiefe der Probe zur Fluoreszenz angeregt werden können (D. Axelrod, J. Cell Biol. 89: 141-145, 1981; J. S. Burmeister et al., J. Microsc. 173: 39-51: 1994). In der Zellbiologie handelt es sich hierbei um Fluorophore (z. B. Stoffwechselindikatoren, Tumormarker) aus dem Extrazellularraum, der Zytoplasmamembran, sowie den angrenzenden Bereichen des Zytoplasmas. Eine Auswertemethode zur tiefenauflösenden Totalreflexionsfluorometrie ist von B. P. Ölveczky et al. (Biophys. J. 73: 2836-2847, 1997) beschrieben.

Als Vorrichtungen zur Totalreflexionsfluorometrie sind bekannt:

1. mikroskopische Aufbauten mit einem hochaperturigen Objektiv und ringförmiger Beleuchtung der Proben, wobei der Einstrahlwinkel größer ist als der Grenzwinkel der Totalreflexion (A. L. Staout and D. Axelrod, Appl. Opt. 28: 5237-5242, 1989). Hierbei ist jedoch keine Variation des Einstrahlwinkels und damit keine Tiefenauflösung möglich;
2. Aufbauten, bei denen ein Laserstrahl an der Oberfläche eines Objektträgers, der sich in Kontakt mit der Probe befindet und auf ein Glasprisma mit rechteckigem oder trapezförmigem Querschnitt aufgesetzt ist, total reflektiert wird, wie u. a. von W. S. L. Strauss et al. beschrieben (Photochem. Photobiol. 67: 363-369, 1998). Hierbei erfolgt die Beleuchtung der Probe über einen winkeleinstellbaren Spiegel, jedoch verschiebt sich der Auftreffpunkt des Lichts auf die Probe bei Veränderung des Einstrahlwinkels, so daß die Tiefenauflösung an einem vorgegebenen Probenbereich nicht möglich ist;
3. ein Scanning-Aufbau mit mehreren rotierenden Spiegeln und Platten (B. P. Ölveczky et al., Biophys. J. 73: 2836-2847, 1997). Dieser Aufbau ist jedoch äußerst aufwendig, weil zwei Spiegel und eine transparente Platte gleichzeitig bewegt werden müssen, um den Auftreffpunkt des Laserstrahls auf der Probe bei Veränderung des Einstrahlwinkels konstant zu halten
4. ein Aufbau, bei dem ein Laserstrahl auf die im Zentrum eines Prismas, das gemeinsam mit einem Glasträger einen Halbzylinder bildet, lokalisierte Probe gerichtet wird. Der Laserstrahl wird hierbei mit Hilfe eines akustooptischen Modulators so abgelenkt, dass definierte Probenbereiche unter verschiedenen Einstrahlwinkeln beleuchtet werden können, und somit eine Tiefenauflösung möglich ist (M. Oheim et al., Eur. Biophys. J. 28: 91-101, 1999). Auch dieser Aufbau ist sehr komplex und erfasst nur eben Teil des durch Totalreflexion bedingten Winkelbereichs. Außerdem führt die gewählte optische Abbildung eines Lichtpunkts im akustooptischen Modulator in die Probenebene zu einer inhomogenen Lichtverteilung und gleichzeitig, aufgrund der endlichen Länge des Modulators, zu einer Unschärfe. Beides bedeutet einen Verlust der Strahlqualität des eingestrahlten Lichts. Darüber hinaus ist der Strahlengang mit chromatischen Aberrationen, bedingt durch die abbildenden Linsen, behaftet. Diese Linsen sind außerdem nicht für jede interessierende Wellenlänge geeignet.

Im Gegensatz hierzu liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur tiefenauflösenden Totalreflexionsfluorometrie im Grenzflächenbereich mikroskopischer Proben bei vorgegebenem Probenbereich zu schaffen, die eine kompakte Einheit bildet, an ein vorhandenes Mikroskop ansetzbar ist und die Einstrahlung über den gesamten durch die Totalreflexion bedingten Winkelbereich ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst.

Dadurch, daß als winkeldispersives Element ein einstellbarer Spiegel und als Abbildungsoptik ein Hohlspiegel verwendet wird, ist die Einstrahlung von Licht beliebiger Wellenlänge möglich, ohne daß die störende chromatische Aberration oder unterschiedliche Absorption des Lichts in Linsen auftreten. Gleichzeitig ergibt sich der Vorteil eines kompakten Aufbaus durch Faltung des Strahlengangs. Die Verwendung von Hohlspiegeln für die optische Abbildung in der Fluoreszenzspektroskopie ist bekannt (R. Uhl, DE 42 28 366 A1); sie erfolgt jedoch im Falle der Totalreflexionsfluorometrie erstmalig. Gegenüber der Verwendung eines akustooptischen Modulators (B. P. Ölveczky et al., Biophys. J. 73: 2836-2847, 1997; M. Oheim et al., Eur. Biophys. J. 28: 91-101, 1999) bleibt beim einstellbaren Spiegel die Strahlqualität des eingestrahlten Lichts erhalten.

Die Vorrichtung wird anhand der Figur näher erläutert. Die Probe 1 (Zellmonolayer) befindet sich in Kontakt zum Objekträger 2, der gemeinsam mit dem Glasprisma 3 einen Halbzylinder bildet. Objektträger und Glasprisma sind durch eine dünne Schicht einer Immersionsflüssigkeit optisch gekoppelt. Als winkeldispersives Element dient der einstellbare Spiegel 4, von dem ein Lichtpunkt mit dem Hohlspiegel 5 über die Strahlumlenkung 6 auf die im Zentrum des Halbzylinders liegende Probe 1 abgebildet wird. Diese Anordnung erlaubt, einen vorgegebenen Bereich der Probe 1 unter unterschiedlichen Winkeln zu beleuchten. Ist der Beleuchtungswinkel größer als der Grenzwinkel der Totalreflexion, so wird der Lichtstrahl total reflektiert und in der Strahlfalle 7 absorbiert. Die durch das evaneszente elektromagnetische Feld in der Probe 1 angeregte Fluoreszenzstrahlung wird mit dem Mikroskopobjektiv 8 aufgenommen und anschließend räumlich, spektral und/oder zeitlich aufgelöst erfaßt. Der Einstrahlwinkel und damit die Eindringtiefe des evaneszenten elektromagnetischen Feldes wird durch die Stellung des einstellbaren Spiegels 4 bestimmt. Dies erfolgt über den Schrittmotor 9 und die aufgesetzte Kulisse 10. Im Ausführungsbeispiel handelt es sich hierbei um einen schräg geschnittenen Zylinder, der beim Umlauf des Schrittmotors über einen Hebel 11 einen sinusförmigen Vorschub des einstellbaren Spiegels verursacht. Durch Positionierung des Schrittmotors über einen angeschlossenen Rechner kann dieser Spiegel und damit der Einstrahlwinkel eingestellt werden. Durch diese Ausgestaltung des Spiegelstelltriebs wird ermöglicht, daß der Spiegel nicht über den Winkelbereich der Totalreflexion hinaus bewegt werden muß.

Die Einkopplung des Lichts der Lichtquelle 12 (Spektrallampe oder Laser) erfolgt über eine Multimode- oder Monomodefaser 13, sowie eine daran angepaßte Kollimatorlinse 14, deren hinterer Brennpunkt am Faserende liegt. Das eingekoppelte Licht fällt somit als Parallelstrahl auf den einstellbaren Spiegel. Faserende und Kollimatorlinse sind in einen Adapter 15 integriert. Hierfür bietet die Beleuchtungseinheit eine zentrierbare Aufnahme, die die Einkopplung zahlreicher Lichtquellen im sichtbaren, nahen ultravioletten oder nahen infraroten Spektralbereich erlaubt. Bedingt durch die geringe Anzahl der notwendigen Komponenten und die Faltung des Strahlengangs läßt sich die Beleuchtungseinheit derart verkleinern, daß sie anstelle eines Kondensors an ein Mikroskop ansetzbar ist.

Claims

1. Vorrichtung zur tiefenauflösenden Totalreflexionsfluorometrie im Grenzflächenbereich einer mikroskopischen, auf einem Objektträger angeordneten Probe, mit
einer Lichtquelle,
einem winkeleinstellbaren Spiegel zum Einstellen eines Lichteinstrahlwinkels auf die Probe,
einem Hohlspiegel und einer Strahlumlenkung als Abbildungsoptik,
einem aus Glas oder Quarz bestehenden Prisma, das zusammen mit dem Objektträger einen Halbzylinder oder eine Halbkugel bildet,
wobei
von dem winkeleinstellbaren Spiegel mit dem Hohlspiegel über die Strahlumlenkung auf einen vorgegebenen Bereich der im Zentrum des Halbzylinders oder der Halbkugel liegenden Probe ein Lichtpunkt abgebildet wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Prisma beim Einstellvorgang des Probenbereichs mit Durchlichtbeleuchtung verwendet wird.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der winkeleinstellbare Spiegel in einem durch den Winkelbereich der Totalreflexion vorgegebenen Bereich einstellbar ist.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle ein Laser oder eine Spektrallampe in einem Spektralbereich vom nahen Ultraviolett bis zum nahen Infrarot ist.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichteinkopplung über eine Monomode- oder eine Multimodefaser mit jeweils daran angepaßter Kondensorlinse erfolgt.