JP2017522603A - 試料を顕微鏡検査する方法及び装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料（５）を顕微鏡検査する方法に関する。当該方法は、試料（５）を、この試料（５）よりも高い屈折率を有する光学的に透明な媒体（１２）に接触させるステップと、照明光束（１３）を形成するステップと、照明光束（１３）をフォーカシングする照明対物レンズ（１）を通して、照明光束（１３）を案内するステップとを含む。続いて、照明光束（１３）が、検出対物レンズ（２）に配置された偏向手段によって、光学的に透明な媒体（１２）と試料（５）との界面（１０）へ入射してそこでの全反射により試料（５）のエバネセント照明を生じさせるよう、検査すべき試料（５）の方向へ偏向される。さらに、試料（５）から出て検出対物レンズ（２）を通って走行する蛍光が検出される。

Description

本発明は、試料を顕微鏡検査する方法に関する。

本発明はさらに、こうした方法を実行する装置に関する。

試料の蛍光顕微鏡検査では、照明領域にある試料を光学的に励起し、続いて試料から出る蛍光を検出するために、大抵の場合、照明光束によって試料が直接に照明される。走査型顕微鏡では、照明光束の焦点は、大抵の場合、例えば１つもしくは複数の傾動鏡を含むことのできる調整可能なビーム偏向装置によって、試料の上方を又は試料中を通過するようにメアンダ状に案内され、これにより試料点ごとに試料が走査される。

直接試料照明に代えて、試料をエバネセント照明することもできる。この場合、励起光は試料への界面で全反射され、試料の励起は侵入深さとともに減衰するエバネセント電磁場によって行われる。こうした形式の試料検査として、ＴＩＲＦＭ（total internal reflection fluorescence microscopy）の概念がすでに知られている。

独国特許出願公開第１０３４４４１０号明細書（ＤＥ１０３４４４１０Ａ１）から、エバネセント試料照明を行う走査型顕微鏡が公知である。走査型顕微鏡は、カバーガラスへ光を入力する光源を含み、これにより、内部全反射によって光が平面状に拡大し、カバーガラス上に配置された試料を大面積でエバネセント照明することができる。また、走査型顕微鏡は、試料の走査点から出る検出光を受信する点状検出器と、検出光の光路に配置された、試料の走査点の位置をオフセットするためのビーム偏向装置とを有する。ただし、当該装置は、カバーガラスへの照明光の入力があまり効率的でなく、そのためエバネセント試料照明のための光量が僅かしか得られないという欠点を有する。

また、従来技術から公知の方法及び装置は、エバネセント試料照明に関して、試料照明の位置が厳密に定められていてフレキシビリティがなく、充分な精度で調整できないという欠点をしばしば有する。

さらに、従来技術から公知の方法及び装置は、エバネセント照明での顕微鏡検査の前に試料を特別な試料チャンバ又はカバーガラス間に配置してプレパラートを用意しなければならないため煩雑であり、その後でないと、試料チャンバ又は試料を機械的に挟んだカバーガラス装置を顕微鏡の対物テーブルに載置できないという欠点を有する。試料のうち、全反射が生じる界面に接する縁領域は、まさに、持続的な圧力負荷を受けることが多く、これにより、続く顕微鏡検査が少なくとも負の影響を受けたり、又は、完全に不可能になったりする。

本発明の課題は、種々の試料及びその装置に対してフレキシブルに使用可能であって、特に試料に優しく構成可能な、試料を顕微鏡検査する方法を提供することである。

この課題は、
ａ．試料を、この試料よりも高い屈折率を有する光学的に透明な媒体に接触させるステップと、
ｂ．照明光束を形成するステップと、
ｃ．照明光束をフォーカシングする照明対物レンズを通して、照明光束を案内するステップと、
ｄ．照明対物レンズを通過した照明光束を、検出対物レンズに配置された偏向手段によって、照明光束が光学的に透明な媒体と試料との界面へ入射してそこでの全反射により試料のエバネセント照明を生じさせるよう、検査すべき試料の方向へ偏向するステップと、
ｅ．例えば蛍光の光エネルギに比例する電気信号を形成する検出器により、試料から出て検出対物レンズを通って走行する蛍光を検出するステップと
を含む方法により、解決される。

本発明のさらなる課題は、上述した方法にしたがってエバネセント照明のもとで顕微鏡検査の試料を結像できる装置を提供することである。

この課題は、照明対物レンズと検出対物レンズとが設けられており、光学的に透明な媒体と試料との界面へ照明光束を偏向する偏向手段が検出対物レンズに配置されている装置によって解決される。

本発明は、エバネセント試料照明が特に大きな効率で可能となるという利点を有する。これは特に、照明対物レンズを通過した後に行われる、偏向手段による偏向に基づいて、簡単かつ確実に、光学的に透明な媒体と試料との界面へ、内部全反射の形成に必要な入射角で、照明光束を案内可能であることに帰せられる。

また本発明は、光学的に透明な媒体と試料との界面への入射位置を、簡単に、かつ、全反射の限界角を誤ってトラバースしてしまうおそれなく変化させることができるというさらなる特別の利点を有する。このことについては後に詳細に説明する。

本発明の方法は、さらに有利には、検査すべき縁面の圧力負荷が全くない状態で、試料を検査位置へ移動させることができ、顕微鏡での結像形成の直前にはじめて光学的に透明な媒体に接触させることにより、一貫して負荷なしに試料の顕微鏡検査が可能になるという方式でも実行可能である。このことについても、特に幾つかの実施形態に関連して後に詳細に説明する。

照明光束を内部全反射に必要な入射角で試料と光学的に透明な媒体との界面へ確実に配向できるようにするために、好ましくは、この界面は、照明対物レンズの光軸及び／又は検出対物レンズの光軸に対して０°とは異なる角度で配向される。試料と光学的に透明な媒体との界面が照明対物レンズの光軸及び／又は検出対物レンズの光軸に対して垂直に配向される実施形態は、特にフレキシブルかつ多様に使用可能である。特に、こうした配向により、試料及び特にその同一の試料領域を種々の方向から特にそれぞれ同じ入射角度で照明できる。このことは、例えば、照明光の偏光状態に依存して、特に照明光の直線偏光平面の配向状態に依存して、試料の蛍光特性を検査するために行われる。

このために特に、偏向後の照明光束が照明対物レンズの光軸に対して０°とは異なる角度を有する平面を走行するように有利に構成できる。例えば、照明光束が試料と光学的に透明な媒体との界面へ５５°から７０°までの領域の入射角で、特に６０°から６４°までの入射角で入射するように偏向を設定できる。当該領域内では、多くの場合に生体である試料のエバネセント試料照明を充分な侵入深度で行える。

本発明の方法の特に有利な実施形態では、試料と光学的に透明な媒体との界面への照明光束の入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向が、顕微鏡検査中に変化される。

入射位置を変化させることにより、例えば、試料領域から出た蛍光を、２次元画像を検出する平面状検出器、例えばＣＣＤ検出器へ供給してそれぞれの試料領域の結像を形成することにより、連続する種々の試料領域を照明及び検査することができる。特に例えば、光学的に透明な媒体に接触する試料の縁面を走査路に沿って体系的に走査し、その際走査される試料領域のそれぞれに１つずつ平面状結像を対応させることができる。この場合、個々の試料領域に対して得られた画像情報から、試料の全体結像が再構成される。例えば、試料と光学的に透明な媒体との界面への照明光束の入射位置は、特にはメアンダ状の走査路に沿って、連続的に変化しうる。こうした手段により、照明面積がふつうは検出対物レンズの観察野よりも小さくなるという事実を考慮できる。種々の試料領域の複数の結像を連続させることにより、検出対物レンズの観察野全体を利用することができる。

ただし、こうした手段はむしろ特別な適用形態のために設けられたものであり、関心試料領域全体を一斉にエバネセント照明して、２次元画像を形成する平面状検出器、例えばＣＣＤ検出器へ一斉に供給して試料領域の結像を形成するには、大抵の場合、充分に大きな唯一の照明焦点を形成すればよい。

できるだけ大きな照明点を得るには、照明光束の焦点を照明光伝搬方向においてできるだけ長くし、できるだけ大きな焦点直径を有するようにしなければならない。照明伝搬方向で焦点を長くすることが重要であるのは、光学的に透明な媒体と試料との界面での照明点が照明光束の界面への大きな入射角に基づいて長く引き延ばされるからである。照明光束が伝搬方向に対して垂直な断面で見て円形となる場合、光学的に透明な媒体と試料との界面での入射面は、自然法則に則って楕円形となる。このことに関して、焦点距離は、好ましくは、入射面の楕円形の長半軸の２倍より大きくなければならない。大きな焦点距離は、特に、短半軸の方向に見られる。

できるだけ大きな焦点直径と伝搬方向にできるだけ長い焦点を形成するために、照明対物レンズは、好ましくは、例えば０．０５の小さい開口数を有する。こうした対物レンズによれば、きわめて不確実に、かつ、光学的に透明な媒体と試料との界面への選択された入射角などの他のパラメータに依存して約１００μｍ×１０μｍの入射面が照明されることがある。

特に、短半軸の方向で入射面の拡大を達成するには、円形の照明光束に代えて、相応に配向された光条又は擬似光条、すなわち、伝搬方向に対して垂直な断面で見て細長い照明光束を、照明対物レンズに入力できる。このことについては後に詳細に説明する。

特別な実施形態では、入射位置を変化させることに代えて又はこれに加えて、試料と光学的に透明な媒体との界面への照明光束の入射角が変化される。このようにすると、例えば、試料へのエバネセント場の侵入深度及び／又は照明光束によって照明される点の大きさを変化させることができる。

入射位置の変化及び／又は入射角の変化に代えてもしくはこれらに加えて、試料と光学的に透明な媒体との界面への照明光束の入射方向を変化させることもできる。これは特に、例えば直線偏光方向に依存する試料特性を検査する場合に、入射方向と界面に入射する光の直線偏光方向とを同時に回転させるためにも行うことができる。

試料と光学的に透明な媒体との界面への照明光束の入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させられるようにするために、特には、偏向角を調整可能なビーム偏向装置を使用することができる。当該ビーム偏向装置は、例えば、カルダン懸架された傾動鏡、又は、異なる回転軸を中心として回転可能な２つの傾動鏡を含むことができる。特には、照明光束がビーム偏向装置によって照明対物レンズに対して相対的に及び／又は偏向手段に対して相対的に運動されるように構成可能である。

調整可能なビーム偏向装置を使用することに代えて又はこれに加えて、照明対物レンズに対して相対的に及び／又は照明光束に対して相対的に試料を運動させることによって、試料と光学的に透明な媒体との界面への照明光束の入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向が変化されるように構成してもよい。このために特に、好ましくは３つの空間方向に移動可能な試料テーブルを使用することができる。

入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させる上述の手段のほか、試料に対して相対的に偏向手段を運動させることによってこれらのパラメータを変化させることもできる。これは、ビーム偏向装置の使用及び／又は試料の運動に代えてもしくはこれらに加えて行うことができる。特別な一実施形態では、偏向手段は検出対物レンズに可動に固定される。特に、入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させられるようにするために、有利には偏向手段を検出対物レンズに可動に取り付け、特に可動に固定することができる。

特別な一実施形態では、偏向手段は前部領域及び／又は前部レンズの近傍に配置される。

特別な一実施形態では、偏向手段は複数のファセット面を有する鏡として構成される。特にこうした実施形態により、（例えば調整可能なビーム偏向装置を用いて、又は、偏向手段の運動によって）連続する種々のファセット面を照明することで、試料と光学的に透明な媒体との界面への照明光束の入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させることができる。この場合特に、そのつど異なる空間方向への反射を生じさせるため、各ファセット面が空間的に種々に配向されるように構成可能である。これに代えて、例えば、偏向手段が錐台状の鏡面を有するように構成してもよい。こうした実施形態により、照明光束を連続的に、かつ、入射位置を通って延在する軸線を中心として球面を描くように回転させることができる。

上述したように、本発明の方法は、入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を調整する一連の手段を提供する。これにより、ユーザが本発明の方法をそのつどの試料に特有の要求もしくは検査に特有の要求に合わせて個別に適合化できるという特段の利点が得られる。

入射位置が変化する場合、特に、光学的に透明な媒体と試料との界面の走査が行われる場合にも、複数の結像を組み合わせて成る試料の全体結像を形成するために、各入射位置を各試料領域に割り当てることができる。

特には、各入射位置に対し、入射角及び／又は試料の屈折率及び／又は光学的に透明な媒体の屈折率及び／又は照明光束の波長及び／又は入射位置の直径を考慮して対応する試料領域が求められるように、構成可能である。こうした計算では、好ましくは、エラー、特にシステムに起因するエラーが補正もしくは補償される。特に、幾何光学系の基本法則にしたがって予測されるビーム特性に対する、照明光束の実際の特性の空間偏差、例えばGoos-Haenchen効果による空間偏差を、補償又は補正することができる。

好ましくは、光学的に透明な媒体、特にカバーガラスの目標厚さからの厚さの偏差に起因するエラーの補償又は補正も行われる。例えば、カバーガラスの実際の厚さは、大抵のケースで１７０μｍである標準厚さから著しく偏差していることがしばしばである。こうした補償及び補正係数の考慮は、検査すべき試料の結像に特に良好な分解能が得られるという利点を有する。

有利な一実施形態では、各入射位置及び／又は対応する各試料領域に対し、各入射位置の照明中に試料から出る検出光を検出することで得られた少なくとも１つの固有の結像、特に２次元の結像が、１つずつ割り当てられる。

結像なる概念は、特に、例えばＰＣによって表示可能なデータの形態及び／又は目に見える画像の形態での、試料もしくはその一部の再現のことであると理解されたい。

検出器は、特に、各ピクセルに対して１つずつ、受信された検出光の光出力に比例する電気信号を形成するように構成可能である。また特に、検出器は（同時に又は連続的に）種々の波長の固有の蛍光を受信し、そのつど対応する電気検出信号を形成するようにも構成可能である。例えば、検出器は、波長に依存して種々の層（チャネル）において相互に独立に蛍光を検出するように構成されたＣＭＯＳセンサであってよい。これに代えて、検出器は、複数のダイクロイックビームスプリッタによって種々の波長領域の検出光がそのつど供給される複数のＣＣＤ検出器を含んでもよい。特に、種々の波長の蛍光を検出するために、励起光束は、例えばマルチカラーレーザーもしくは複数の個別レーザーもしくは白色光源の複数の励起光波長を含むことができる。

上述したように、照明光束の断面は円形であってよい。こうした実施形態では、光学的に透明な媒体と試料との界面への入射面が自然法則に則って細長く引き延ばされ、楕円形となる。ただし、これも上述したが、照明光束が光条の形態を有してもよい。こうしたビーム形状は、例えば、照明光束の光路に配置された円筒状光学系によって達成可能である。またこれに代えて、断面で見てほぼ円形となる照明光束を、例えばビーム偏向装置によって、所定の空間方向において、円筒状光学系で形成される光条と異なってしまわないように迅速に往復させることで擬似光条を形成することもできる。

光条の形態の照明光束の使用により、光学的に透明な媒体と試料との界面を照明することができる。

特にフレキシブルに使用可能であって正確に動作する、本発明の方法を実行するための装置は、照明対物レンズの光軸と検出対物レンズの光軸とが相互に平行に又は共軸に配向される場合に実現され、ここで好ましくは、検出対物レンズと照明対物レンズとは、それぞれの前部レンズの箇所で、相互に向かい合わせにされる。こうした実施形態では、検査すべき試料を照明対物レンズと検出対物レンズとの中間空間に配置でき、有利には、特に種々の方向からの界面の照明又は種々の入射角での界面の照明に関して照明光束を誘導及び案内するための大きな空間を残すことができる。このことは、検査条件をそのつどの要求に合わせて適合化する複数の手段が得られるという特別の利点を有する。

本発明の方法の特に有利な一実施形態では、同じ試料が同じ装置で異なる検査手法により検査される。このような手段により、例えば情報を相互に補償するため又は試料情報をできるだけ多く収集するために、種々の検査手法によって相互に独立した試料情報を得ることができるという特別の利点が得られる。この場合、試料は、好ましくは照明対物レンズと検出対物レンズとの中間空間に残される。

上述したようなエバネセント試料照明が行われる検査に加えて、有利には、特に光条もしくは擬似光条の形態の照明光束が直接に全反射なしで試料へ到達してこれを通過するように案内される、ＳＰＩＭ検査（ＳＰＩＭ：Single Plane Illumination Microscopy）を行うことができる。こうした光条もしくは擬似光条によって、試料層が完全に照明され、この層から垂直に出て検出対物レンズを通してコリメートされる検出光を検出することができる。この場合、層の個々の試料位置に関する位置情報を得られるようにするために、好ましくは、平面状検出器、例えばＣＣＤ検出器が使用される。光条を試料に対して相対的に連続移動させることにより、各層を通した照明、及び、位置分解性の検出信号ひいては３次元の試料の再構成のための積層体を形成することができる。

特にＳＰＩＭ検査のために、有利には、照明対物レンズに配置された別の偏向手段により、照明対物レンズの通過後に照明光束が直接に試料へ偏向されるように構成可能である。好ましくは、光条は、検出対物レンズの光軸に対して０°とは異なる角度、特に検出対物レンズの光軸に対して９０°の角度で、伝搬される。好ましくは、偏向された光条もしくは擬似光条が伝搬する平面は、検出対物レンズの光軸に対して垂直に配向される。このような配向により、煩雑な幾何学的補正の計算を一貫して回避でき、そのうえ特に正確な画像再構成を行うことができる。

特別な一実施形態では、検出対物レンズに少なくとも２つの偏向手段が配置され、偏向手段のうち一方はエバネセント試料照明のための照明光束の偏向に用いられ、他方は特に光条もしくは擬似光条に対して形成された、ＳＰＩＭ検査用の照明光束の偏向に用いられる。

エバネセント試料照明と直接の試料照明との切り替えを可能にするために、偏向手段は、一方もしくは他方の偏向手段を選択的に照明光路のビーム路に導入できるよう、検出対物レンズに可動に配置できる。これに代えてもしくはこれに加えて、偏向角を調整可能なビーム偏向装置を用いて照明光束をそのつどの所望の偏向角へ偏向してもよい。

大抵の場合、照明光束が照明対物レンズを偏心して通過するようにこの照明光束を照明対物レンズに入力すると有利である。なぜなら、こうしたビーム特性により、試料を照明対物レンズ及び／又は検出対物レンズの光軸上又は少なくともその近傍に配置して、試料を種々の方向から照明できる手段が確保されるからである。

本発明の方法を実行するのに適した装置の特に有利な実施形態では、光学的に透明な媒体そのものが偏向手段又は少なくともその一部である。特に、こうした実施形態により、試料をまず機械的に完全に無負荷で、例えば照明対物レンズと検出対物レンズとの間の水の充填されたペトリ皿に配置することができ、この場合、好ましくは、倒立型顕微鏡装置の照明対物レンズが空間的に試料の下方に配置され、これに対して検出対物レンズが試料の上方に配置される。このような配置では、本来の検査の直前、検出対物レンズとともに、光学的に透明な媒体を、この媒体が試料に接してエバネセント試料照明のための条件が達成されるまで試料の方向へ移動させることができる。こうした手段により、本来の検査のだいぶ前から既に試料が例えばカバーガラス間への挟み込みによって圧力負荷されて、このために、検査すべき試料の縁領域が持続的な損傷を受け、このことが特に生体試料において重大な欠点となるおそれを、有効に回避できる。

偏向手段は、特に、透明材料から成るブロック、特にプリズムを有することができる。この場合、例えば、照明対物レンズから出た照明光束がプリズムの斜面を通ってこのプリズムへ入力され、プリズムの斜面に接する試料の方向へ反射される。なおこの反射は、照明光束が試料への界面としての斜面で全反射されるように行われる。試料から出た蛍光は、プリズムを通って、検出光をコリメートする検出対物レンズへ走行する。

上述したように、例えば透明材料のブロックから形成可能な光学的に透明な媒体と、検出対物レンズとの間に、好ましくは、浸漬オイルなどのような、屈折率を適合化する手段が設けられる。

こうした装置は特に、試料に対して相対的にかつ透明材料から成るブロックに対して相対的に、検出対物レンズを移動させることができ、このために、透明材料のブロックから検出対物レンズまでの相対距離を調整する相応の調整装置を設けることができる。こうした調整手段は例えばねじ伝達装置を備え、エバネセント試料照明で生じる効果、例えばGoos-Haenchen効果を補償できるという利点を有する。

別の有利な一実施形態では、偏向手段としても機能する光学的に透明な材料が、検出対物レンズの前部レンズに直接に結合される。当該結合は、例えば、検出対物レンズの前部レンズと、対応形状に成形された透明材料のブロックとの間の光学キットを用いて実現できる。例えば前部レンズは半球レンズとして構成可能であり、この前部レンズに、対応形状に成形されて半球凹状の結合面、例えば光学キットを有する透明材料のブロックが結合される。またこれに代えて、偏向手段としても機能する光学的に透明な媒体が検出対物レンズの前部レンズを含むように、及び／又は、偏向手段が検出対物レンズの前部レンズとして機能するように構成してもよい。これらの手段は、意図しない反射によって検出光の光路に生じる検出光損失を、光学的に透明な媒体及び検出対物レンズの前部レンズを介して回避又は少なくとも最小化できるので、特に有利である。

上述したように、有利には、偏向手段が透明材料のブロックを有し、ブロックの少なくとも１つの外面、特に試料に接するように構成及び配置されたブロックの外面が、照明光束の入力窓として機能するように、構成可能である。

さらに上述したように、照明光束を偏向するために、ブロックの外面、好ましくは他の外面を鏡として構成するか、又は、これらの外面が鏡を有するように構成可能である。上述したように、特に、他の検査手法に基づいて同じ試料を検査するために、特に光条もしくは擬似光条の形態の照明光束を偏向する別の偏向手段を、特に検出対物レンズに配置することができる。特に、偏向手段及び／又は別の偏向手段は、例えば照明光束の入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させられるようにするため、及び／又は、幾何学的補正、例えばGoos-Haenchen効果の補正を行えるようにするために、検出対物レンズに可動に固定可能である。特にこの目的のために、上述したように、本発明の方法を実行する装置は、偏向角を調整可能なビーム偏向装置を有することができる。

特に、ビーム偏向装置は、走査型顕微鏡、特にコンフォーカル走査型顕微鏡のビーム偏向装置であってよい。

本発明の方法を実行するのに適した装置は、有利には、走査型顕微鏡、特にコンフォーカル走査型顕微鏡をベースとして構成可能である。この場合特に、倒立型顕微鏡の架台が使用される。ここで（研究室内に存在する可能性が高い）走査型顕微鏡を本発明の方法の実行に使用すると、特に有利である。

本発明の対象を概略的に図示し、以下に図に即して説明する。ここで、同じ要素もしくは同様の機能を有する要素には多くの場合に同じ参照番号を付してある。

鏡を含む偏向手段を用いて本発明の方法を実行する装置の第１の実施形態を示す詳細図である。 透明材料から形成されるブロックとしての偏向手段を用いて本発明の方法を実行する装置の第２の実施形態を示す詳細図である。 検出対物レンズの前部レンズの機能を担当する偏向手段を用いて本発明の方法を実行する装置の第３の実施形態を示す詳細図である。 エバネセント試料照明及び直接試料照明の双方が可能な第４の実施形態を示す詳細図である。図示されているのはエバネセント試料照明に対する位置である。 第４の実施形態における、ＳＰＩＭ検査のための直接試料照明に対する調整を示す詳細図である。 ａ，ｂとも、照明光束の入射面を示す概略図である。 ａ，ｂとも、照明光束の入射位置の変更手段を示す概略図である。 ファセット鏡を含む偏向手段を用いた実施形態を示す詳細図である。 錐台状の鏡を含む偏向手段を用いた実施形態を示す詳細図である。 入射位置及び／又は入射角度及び／又は入射方向を変化させるビーム偏向装置を用いた実施形態を示す詳細図である。

図１には、第１の実施形態の装置の詳細が示されており、この装置に即して本発明の方法の可能な一実施形態を以下に説明する。

当該装置は、オイル対物レンズとして構成された照明対物レンズ１及び検出対物レンズ２を有する。照明対物レンズ１及び検出対物レンズ２は、その光軸に関して、相互に共軸かつ反対向きに配置されている。検出対物レンズ２には、部分球状の鏡面４を有する偏向鏡３が固定されている。

検査すべき試料５は、液状栄養媒体に含まれた状態で、第１のカバーガラス６と第２のカバーガラス７との間に配置されている。カバーガラス６，７は、液状栄養媒体８が漏出するおそれがないよう、周囲のパッキン９によって相互に封止されている。

検出対物レンズ２に近い側のカバーガラス６と検出対物レンズ２との間には、偏向手段３が浸漬された浸漬オイル１１が存在している。

検出対物レンズ２に近い側のカバーガラス６は、試料５よりも高い屈折率を有する光学的に透明な媒体１２として用いられる。照明光束１３は、照明対物レンズ１によってフォーカシングされ、照明対物レンズ１の前部レンズから出た後、試料５との相互作用を起こすことなくカバーガラス６，７を通過し、続いて偏向手段３に達する。そこから、照明光束１３は検査すべき試料５の方向へ偏向されるが、この偏向は、照明光束１３が光学的に透明な媒体１２と試料５との界面１０へ入射し、そこで全反射されてエバネセント照明を生じるように行われる。

試料５から出た蛍光１４は検出対物レンズ２を通過し、続いて、図示されていない、２次元画像を検出する平面状検出器、例えばＣＣＤ検出器へ達する。（図示されていない）ビーム偏向装置により、照明光束１３を光学的に透明な媒体１２と試料５との界面１０へ種々の入射方向から案内するために、照明光束１３を錐台状の鏡面４の種々の位置へ案内できる。ただし、このことは、図では、破線で描かれた、照明光束１３の変化したビーム特性によって概略的に示されているのみである。

良好な分解能にとっては、特に、幾何学的補正、例えばGoos-Haehnchen効果の補償のための補正、又は、目標厚さからの、光学的に透明な媒体１２の厚さの偏差、特にカバーガラスの厚さの偏差を補償するための補正を考慮して、照明光束１３の焦点が光学的に透明な媒体１２と試料５との界面１０上に正確に位置することが重要である。これを正確に調整するために、カバーガラス６，７を、試料５とともに、照明対物レンズ１に対して相対的に、Ｚ方向へ位置合わせすることができる。このために、例えばＺ方向に調整可能なシフトテーブルを設けることができる。

さらに、照明光束１３の入射位置を界面１０へ調整できるようにするために、カバーガラス６，７を、その間に導入された試料５とともに、Ｘ方向及び／又はＹ方向へシフトすることもできる。これに代えてもしくはこれに加えて、偏向角を調整可能なビーム偏向装置を用いて、入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させてもよい。

特に、検出光１４を集光する検出対物レンズ２の開口数を確実に活用できるようにするために、検出対物レンズ２をＺ方向でも及び／又はＸ‐Ｙ方向でも同様に試料に対して相対的に位置合わせできる。

図２には、光学的に透明な媒体１２がプリズムとして構成されている第２の実施形態の詳細図が示されている。ここでのプリズムは、照明対物レンズ１から到来する照明光束１３を偏向させる鏡面１５と、試料５に接触するように構成及び配置された外面１６と、の双方を有しており、これにより、外面１６と試料５との間に照明光束１３の内部全反射のための界面１０が形成される。

試料５は、液状栄養媒体８が充填されかつ検出対物レンズ２に向かって開放された容器１７内に配置されている。こうした実施形態では、本来の検査の直前になってはじめて、試料５と光学的に透明な媒体１２との接触ひいては圧力負荷が行われるという特別の利点が得られる。この手段により、本来の検査前の持続的な圧力負荷による試料５の損傷が、回避されるか、又は、少なくとも大幅に低減される。

図１に示されている実施形態と同様に、検出光１４は、検出対物レンズ２を通して、図示されていない、２次元画像を検出する平面状検出器、例えばＣＣＤ検出器へ走行する。

図２に示されている実施形態においても、例えば偏向角を調整可能なビーム偏向装置を用いて、照明光束１３の入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を、光学的に透明な媒体１２と試料５との界面１０へ、正確にかつそのつどの検査に対してフレキシブルに適合させて、調整できる。

当該実施形態では、光学的に透明な媒体１２が、例えば光学キットによって、又は、浸漬オイルによって、直接に検出対物レンズ２の前部レンズに結合される。試料５を検査するために、光学的に透明な媒体１２は水８のなかに浸漬され、試料５に接する。

図３には第３の実施形態の詳細図が示されており、これは、光学的に透明な媒体１２が付加的に検出対物レンズ２の前部レンズの機能を担当できるように構成されている点で、図２に示されている実施形態と異なる。特に、光学的に透明な媒体１２は、偏向手段として機能しかつ試料５への載置のための外面を有するブロックを含み、これら双方は一体形に同時に製造される。こうした構成は特にローバストであり、障害を受けにくい。

図４，図５には、それぞれ、本発明の方法を実行する装置の第４の実施形態の詳細図が示されている。当該装置は、第１の偏向手段１８と別の偏向手段１９とを有する。第１の偏向手段１８も別の偏向手段１９も検出対物レンズ２に固定されている。第１の偏向手段１８は、照明光束１３を偏向する鏡面２１を有する光学的に透明な媒体２０を含む。また、光学的に透明な媒体２０は、内部全反射のために試料５に接触する界面１０を形成するように構成及び配置された外面２２を有する。

図４には、当該装置、すなわちエバネセント照明の場合に検査を実行するための、可能な２つの設定のうち１つが示されている。この設定においても、上述したように、照明光束１３の界面１０への入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向の変更を行うことができる。

当該装置は付加的に、同じ試料５を別の検査手法、特にＳＰＩＭによって検査するように構成される。このために、照明光束１３は特に光条もしくは擬似光条の形態で、別の偏向手段１９へ案内される。別の偏向手段１９は第２の鏡面２３を有する。

別の偏向手段１９と照明光束１３とは、偏向後、検出対物レンズ２の光軸に対して垂直な平面を伝搬する。このようにすれば、試料５の層が照明され、試料から出て検出対物レンズ２を通過する検出光１４、好ましくは位置分解検出光が検出される。試料５から出た検出光１４での位置分解検出のために、例えば、２次元画像を検出する平面状検出器、特にＣＣＤ検出器又はＳＣＭＯＳ検出器を用いることができる。なお、検出器はわかりやすくするために図には示していない。

正確な焦点位置を調整するため、及び／又は、特にエバネセント試料照明の際に生じうるような特に幾何学的な効果を補償するために、第１の偏向手段１８及び別の偏向手段１９は、可動に、かつ、検出対物レンズ２に対する相対位置の点で調整可能に、検出対物レンズ２に固定されている。このために、調整可能な固定装置２４が用いられる。

当該実施形態においても、例えば焦点位置を正確に調整するため、及び／又は、入射位置及び／又は入射角及び／又は入射方向を調整できるようにするために、個々の素子が相互の空間位置の点で位置合わせ可能であると有利である。

図６のａ，ｂには、エバネセント試料照明のための、光学的に透明な媒体１２と試料５との間の界面１０への照明光束１３の入射面２５が概略的に示されている。

できるだけ大きな照明点２５を得るために、照明光束１３の焦点は、照明光伝搬方向においてできるだけ長く、大きな焦点直径を有するように構成される。照明光束が伝搬方向に対して垂直な断面で見て円形である場合、光学的に透明な媒体１２と試料５との間の界面１０への入射面２５は自然法則にしたがって楕円形となる。ここで、焦点距離は、特に低い開口数を有する照明対物レンズ１を使用することにより、好ましくは、入射面２５の楕円形の長半軸２６の２倍より大きくすべきである。焦点直径は、楕円形の入射面２５の短半軸２７のおよそ２倍に相当する。当該方向での入射面２５の拡大は、例えば、断面で見て円形の照明光束１３に代えて、光条もしくは擬似光条の形態の照明光束１３を使用することにより、達成可能である。

図７のａ，ｂには、光学的に透明な媒体１２と試料５との界面１０への照明光束１３の入射位置２８を変化させる概略図が示されている。

例えば調整可能な試料テーブルを用いて、照明光束１３に対して相対的に試料５を運動させることにより、及び／又は、例えば偏向角を調整可能なビーム偏向装置を用いて、試料５に対して相対的に照明光束１３を運動させることにより、及び／又は、偏向手段３を移動させることにより、入射位置２８を連続的に変化させ、ひいては試料に対して相対的に入射面２５を移動させることができる。これは、例えば、種々の試料領域の複数の２次元結像を取得し、続いてこれらを全結像へ合成するようにして行われる。例えば試料５が、図７のａを基準として図平面に対して垂直に、照明光束１３に対して相対的に移動される場合、図７のｂに概略的に示されているように、各入射位置２８を一列に配列し、全ての入射位置に対して１つの２次元結像を形成することができる。

図８には、ファセット鏡２９を有する偏向手段３を用いた実施形態の詳細が示されている。ファセット鏡２９は、種々の空間位置及び配向状態を有する複数の異なるファセットを有する。

検査すべき試料５は、液状栄養媒体８に含まれた状態で、第１のカバーガラス６と第２のカバーガラス７との間に配置されている。カバーガラス６，７は、周囲のパッキン９によって相互にパッキンされているので、液状栄養媒体８が漏出するおそれはない。

当該実施形態では、例えば（図示されていない）ビーム偏向装置によって、種々の入射位置２８で及び／又は種々の入射角で及び／又は照明光束１３の種々の入射方向で、照明光束１３を試料５と光学的に透明な媒体１２すなわちカバーガラス６との界面１０へ入射させるために、この照明光束１３を種々のファセット面３０へ案内することができる。代替的に、照明光束１３の空間位置及び／又は配向に代えて、ファセット鏡２９を例えば（図示されていない）位置決めユニットによって照明光束１３に対して相対的に運動させることもできる。

図９には、錐台状の鏡３１を有する偏向手段３を用いた実施形態の詳細が示されている。ただし、鏡３１はわかりやすくするために一部しか図示していない。

検査すべき試料５は、液状栄養媒体８に含まれた状態で、第１のカバーガラス６と第２のカバーガラス７との間に配置されている。カバーガラス６，７は、周囲のパッキン９によって相互にパッキンされているので、液状栄養媒体８が漏出するおそれはない。

錐台状の鏡３１により、例えば、照明光束１３を、特には連続的にかつ球面を描くように、入射位置２８を通って延在する軸を中心として回転させることができる。

図１０には、偏向角を調整可能なビーム偏向装置３２を用いた実施形態の詳細が示されており、このビーム偏向装置は、試料５と光学的に透明な媒体１２すなわちカバーガラス６との界面への照明光束１３の入射位置２８及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させるために、例えば１つもしくは複数のガルバノメータ鏡を含むことができる。

当該実施形態では、偏向手段３は平坦な鏡３３として構成されている。平坦な鏡３３への照明光束１３の入射位置を変化させることにより、試料５と光学的に透明な媒体１２との界面への照明光束１３の入射位置２８及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させることができる。

照明対物レンズ１及び照明光束１３の特性は、図中、照明条件の変化の基本方式を例示するために、単に概略的に示したものであり、実情に完全に対応してはいない。

１ 照明対物レンズ
２ 検出対物レンズ
３ 偏向手段
４ 錐台状の鏡面
５ 試料
６ 第１のカバーガラス
７ 第２のカバーガラス
８ 液状栄養媒体
９ パッキン
１０ 界面
１１ 浸漬オイル
１２，２０ 光学的に透明な媒体
１３ 照明光束
１４ 検出光
１５，２１ 鏡面
１６，２２ 外面
１７ 容器
１８ 第１の偏向手段
１９ 別の偏向手段
２３ 第２の鏡面
２４ 固定装置
２５ 入射面
２６ 長半軸
２７ 短半軸
２８ 入射位置
２９ ファセット鏡
３０ ファセット面
３１ 錐台状の鏡
３２ 調整可能なビーム偏向装置
３３ 平坦な鏡

Claims (19)

1. 試料（５）を顕微鏡検査する方法において、
   ａ．前記試料（５）を、該試料（５）よりも高い屈折率を有する光学的に透明な媒体（１２）に接触させるステップと、
   ｂ．照明光束（１３）を形成するステップと、
   ｃ．照明光束（１３）をフォーカシングする照明対物レンズ（１）を通して、照明光束（１３）を案内するステップと、
   ｄ．前記照明対物レンズ（１）を通過した照明光束（１３）を、検出対物レンズ（２）に配置された偏向手段によって、該照明光束（１３）が前記光学的に透明な媒体（１２）と前記試料（５）との界面（１０）へ入射してそこでの全反射により前記試料（５）のエバネセント照明を生じさせるよう、検査すべき前記試料（５）の方向へ偏向するステップと、
   ｅ．前記試料（５）から出て前記検出対物レンズ（２）を通って走行する蛍光を検出するステップと、
   を含む、
   ことを特徴とする方法。
2. ａ．前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）を、前記照明対物レンズ（１）の光軸及び／又は前記検出対物レンズ（２）の光軸に対して０°とは異なる角度をなすように配向する、又は、
   ｂ．前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）を、前記照明対物レンズ（１）の光軸及び／又は前記検出対物レンズ（２）の光軸に対して垂直となるように配向する、
   請求項１記載の方法。
3. ａ．偏向後の照明光束（１３）を、前記照明対物レンズ（１）の光軸に対して０°とは異なる角度を有する平面に走行させる、及び／又は、
   ｂ．照明光束（１３）を、前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）に５５°から７０°までの領域の入射角で入射するように偏向する、及び／又は、
   ｃ．照明光束（１３）を、前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）に６０°から６４°までの領域の入射角で入射するように偏向する、
   請求項１又は２記載の方法。
4. ａ．前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）への照明光束（１３）の入射位置（２８）及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させる、及び／又は、
   ｂ．前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）への照明光束（１３）の入射位置（２８）を、走査路に沿って連続的に変化させる、及び／又は、
   ｃ．前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）への照明光束（１３）の入射位置（２８）及び／又は入射角及び／又は入射方向を、偏向角を調整可能な、照明光束（１３）に作用するビーム偏向装置によって変化させる、及び／又は、
   ｄ．前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）への照明光束（１３）の入射位置（２８）及び／又は入射角及び／又は入射方向を、前記照明対物レンズ（１）に対して前記試料（５）を相対的に運動させることにより変化させる、及び／又は、
   ｅ．前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）への照明光束（１３）の入射位置（２８）及び／又は入射角及び／又は入射方向を、前記偏向手段を運動させることにより変化させる、及び／又は、
   ｆ．前記偏向手段（３）を複数のファセット面を有する鏡として構成し、前記試料（５）と前記光学的に透明な媒体（１２）との前記界面（１０）への照明光束（１３）の入射位置（２８）及び／又は入射角及び／又は入射方向を、連続する種々のファセット面を照明することによって変化させる、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. ａ．各入射位置（２８）に試料領域を対応させる、及び／又は、
   ｂ．各入射位置（２８）に対し、入射角及び／又は前記試料（５）の屈折率及び／又は前記光学的に透明な媒体（１２）の屈折率及び／又は照明光束（１３）の波長及び／又は入射位置（２８）の直径を考慮して、試料領域を求める、
   請求項４記載の方法。
6. 各入射位置（２８）及び／又は対応する各試料領域に、各入射位置（２８）の照明中に前記試料（５）から出る検出光を検出することで得られた結像を１つずつ割り当てる、
   請求項４又は５記載の方法。
7. それぞれ同じ入射位置（２８）を時間的に連続して種々の方向から照明する、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 照明光束（１３）の断面を円形とする、又は、
   照明光束（１３）が光条もしくは擬似光条の形状を有するようにする、
   請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
9. 前記照明対物レンズ（１）の光軸及び前記検出対物レンズ（２）の光軸を相互に平行に又は共軸に配向する、及び／又は、
   前記検出対物レンズ（２）及び前記照明対物レンズ（１）を相互に対向させ、相互に反対向きとなるように配向する、
   請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
10. ａ．同じ試料（５）を、該試料（５）の照明が照明光束（１３）によって直接に前記界面（１０）での全反射なしに行われるさらなる検査にかける、及び／又は、
    ｂ．同じ試料（５）を、該試料（５）の照明がＳＰＩＭ検査（Single Plane Illumination Microscopy）のために照明光束（１３）によって直接に前記界面（１０）での全反射なしに行われるさらなる検査にかける、及び／又は、
    ｃ．同じ試料（５）を、該試料（５）の照明が光条もしくは擬似光条として形成された照明光束（１３）によって直接に前記界面（１０）での全反射なしに行われるさらなる検査にかける、
    請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
11. 照明光束（１３）が前記照明対物レンズ（１）を通過した後、該照明光束（１３）を、前記さらなる検査のために、前記検出対物レンズ（２）に配置された別の偏向手段によって前記試料（５）へ偏向する、
    請求項１０記載の方法。
12. 照明光束（１３）が前記照明対物レンズ（１）の中心を外れて走行するように、該照明光束（１３）を前記照明対物レンズ（１）へ入力する、
    請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
13. 請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法を実行する装置であって、
    照明対物レンズ（１）と検出対物レンズ（２）とが設けられており、
    光学的に透明な媒体（１２）と試料（５）との界面（１０）へ照明光束（１３）を偏向する偏向手段（３）が前記検出対物レンズ（２）に配置されている、
    装置。
14. 前記光学的に透明な媒体（１２）は前記偏向手段（３，１８）であるか又は前記偏向手段（３，１８）の一部である、
    請求項１３記載の装置。
15. ａ．前記偏向手段（３，１８）は、透明材料から形成されるブロック、特にプリズムを有する、及び／又は、
    ｂ．前記偏向手段（３，１８）が、特には直接に、前記検出対物レンズ（２）の前部レンズに結合されているか、又は、前記偏向手段が、前記検出対物レンズ（２）の前部レンズを含み、及び／又は、
    ｃ．前記偏向手段（３，１８）が透明材料から形成されるブロックを有し、該ブロックの少なくとも１つの外面が鏡として形成されている、及び／又は、
    ｄ．前記偏向手段（３，１８）が透明材料から形成されるブロックを有し、いずれかの外面が照明光束（１３）の入力窓として構成及び配置されている、
    請求項１３又は１４記載の装置。
16. ａ．別の偏向手段（１９）が、前記試料（５）の照明光束（１３）による照明を直接にかつ前記界面（１０）での全反射なしに行うさらなる検査のために設けられている、及び／又は、
    ｂ．別の偏向手段（１９）が、前記試料（５）の照明光束（１３）による照明を直接にかつ前記検出対物レンズ（２）が配置された前記界面（１０）での全反射なしに行うさらなる検査のために設けられている、
    請求項１３から１５までのいずれか１項記載の装置。
17. ａ．前記偏向手段（３）もしくは前記別の偏向手段が、鏡もしくはファセット鏡（２９）として構成されている、又は、
    ｂ．前記偏向手段（３）もしくは前記別の偏向手段が、少なくとも１つの鏡もしくはファセット鏡（２９）を有する、又は、
    ｃ．前記偏向手段もしくは前記別の偏向手段が、錐台形状の鏡面を有する鏡を有する、
    請求項１３から１６までのいずれか１項記載の装置。
18. 前記偏向手段（３，１８）及び／又は前記別の偏向手段（１９）が可動に前記検出対物レンズ（２）に固定されている、
    請求項１３から１７までのいずれか１項記載の装置。
19. 前記界面（１０）への照明光束（１３）の入射位置（２８）及び／又は入射角及び／又は入射方向を変化させるために、偏向角を調整可能なビーム偏向装置（３２）が設けられている、
    請求項１３から１８までのいずれか１項記載の装置。

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