JP2016519331A - 顕微鏡試料の撮像および操作方法、ならびに光学配置 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料が操作光により操作され、照明光シート型の照明光、特に、蛍光励起のための励起光を用いた照明の下、SPIM技術により撮像される方法に関する。本方法は、操作光と照明光の両者が、対物レンズ作用点に配置される同じ対物レンズ、または対物レンズ作用点に継続的に持ち込まれる異なる対物レンズにより集約されるという事実により注目に値する。また、対物レンズ通過後の操作光かつ／または照明光が、対物レンズの光軸に対し０度とは異なる角度で伝搬するというような方法で、偏向素子により偏向されるという事実により注目に値する。

Description

本発明は、試料が、操作光と共に操作され、照明光シートによる照明光を伴う照明の下、SPIM法により撮像される方法に関する。(この照明光は)特に、蛍光励起に対する励起光である。
更に本発明は、試料を操作し、照明光シートによる照明光を伴う照明の下、SPIM法により撮像するための光学配置に関する。(この照明光は)特に、蛍光励起に対する励起光である。

試料が複数の層で照らされるSPIM(single plane illumination microscopy：一平面照明顕微鏡)技術は、例えば、試料のスポット走査よりも速く、かつより試料影響の少ない感知で、データを撮像できる。SPIM技術の知られた応用域の一つに、蛍光顕微鏡の分野がある。(この蛍光顕微鏡は、)試料内の蛍光色素分子がレーザー光により励起されるものである。SPIM技術において、励起は、照明光シート(「ライトストリップ」とも呼ばれる)においてのみ起こる。他面での照明光による試料への損傷は、これにより回避される。

SPIM法により操作する光学装置は、DE 102 57 423 A1公報に記載されている。この顕微鏡では、照明ライトストリップ面に垂直方向で観察する際、試料は薄いライトストリップで照らされる。分離光学系を持つ2つの分離光学ビームパスを経て、照明(光)と探知(光)がここに発生する。(この分離光学系は、)特にお互いに垂直な2つの分離した対物レンズを有する。ライトストリップは照明対物レンズによって、かつその前方に位置する円柱光学系によって生成される。画像取得目的で、平面ディテクターを用いて層内に蛍光、かつ／または散乱光を得るため、試料はディテクターに関して固定されるライトストリップを通って移動する。これによって得られた層画像データは、試料の3次元画像に対応したデータセットに組み込まれる。試料の操作については、この文献に開示はない。

DE 20 2011 110 077 U1公報は、SPIM顕微鏡環境下での試料照明用配置について開示している。この配置は、光束生成、光束からのライトストリップ生成法、直接または間接的に試料からディテクターに進む探知光を運び具体化する光学系を含む少なくとも一つの対物レンズ用光源、からなる。更にこの配置は、ライトストリップ変換用で、対物レンズ光学系後方に位置させる変換装置からなる。

SPIM技術と光学試料操作の組み合わせは、原理的に大変魅力的である。試料への影響が低く、高速なSPIM技術は、特に比較的大きな生体の操作に関する効果を観察するのに大変適している。

追加操作光源を使用可能とできることがDE 10 2007 047 464 A1公報に示されている。(この追加操作光源は、)操作光が、照明対物レンズを通した照明ビームパスの中に、レンズ配置とミラー配置を通じて結合されるものである。あるいは、同文献は、更にダイクロイックミラーによる探知ビームパスの中への、操作光の結合と、試料上の探知対物レンズを通じての方向付けも提案する。

操作光は、照明ビームパスおよび探知ビームパスの両者を通じて、試料に運ばれる、この種の実施例においては、3つのビームスプリッターと2つの隔壁が、入念にビームパス内に挿入されなければならない。

この設定の利点は、操作が2方向からできることである。その一方、少なくとも照明側での複雑な光学系構造と、光損失を招く。

科学技術文献「発展生体学における選択平面照明顕微鏡技術」Huiskenら、Development 136、1963-1975(2009)は、この種の装置を開示している。(この装置は、)光が試料上の探知対物レンズを経て集約される光操作レーザーを更に提供するものである。大部分が同様である配置が「光シート基盤顕微鏡(SPIM)における3次元レーザー顕微鏡手術」Engelbrechtら、Optica Express 6420、第15巻No.10(2007)に示されている。Yanikらによる記事「小型脊椎動物および無脊椎動物の顕微鏡操作、撮像、表現型検査技術」Biomed.Eng年報2011;13;185-217にも、毛細血管を通じて試料が汲み上げられる同様の装置と方法が開示されている。

ドイツ国特許出願第20 2011 110 077号

本発明の目的は、特に多用途で可変な、試料操作と試料撮像を可能とする方法を述べることにある。

この目的は、以下にように集約された操作光と照明光の両方により、
a.対物レンズ作用点において配置された同じ対物レンズによる、または、
b.対物レンズ作用点に継続的に送り込まれる異なる対物レンズによる、；
かつ、対物レンズの光軸に対し、０度とは違う角度で伝搬するといった方法で、対物レンズを通過後の操作光かつ／または照明光が、偏向素子により偏向されることにより特徴付けられた方法によって達成される。

本発明の更なる目的は、特に多用途で可変な試料操作と試料撮像を、単一の光学配置を用いて可能とするような、この種の前記光学配置を述べることにある。

この目的は、以下にように集約された操作光と照明光の両方により、
a.対物レンズ作用点において配置された同じ対物レンズによる、または、
b.対物レンズ作用点に継続的に送り込まれる異なる対物レンズによる、；
かつ、対物レンズ作用点にある対物レンズから下流方向に、操作光かつ／または照明光が偏向素子により偏向されることにより特徴付けられた光学配置によって達成される。

本発明では、試料が、極めて柔軟に操作、観察され、特殊な応用に対しても、この方法を個別に適合できる。特に、異なる方向からの操作光により、試料上入射が可能となる。例えば、全く異なる方向からの操作光により、一つでかつ重要な同じ試料域上に、単一中心でかつ望むなら定期的である、繰り返し入射をすることもまた可能である。；この件については、後に詳述する。本発明はまた、特に重要試料域の同時照明である干渉も可能とする。

また、特に有利なのは、腫瘍処置のための放射線治療等に用いられるような定位放射線照射に類似した方法で、操作光により重要試料域上に入射させることもできることである。試料域は、例えば適当な移動段階の補助により試料を移動させて、試料が載せられた全3空間方向の好ましい場所へ配置することができる。特に、移動段階はモータ駆動様式に適合して具体化されうる。

本発明は更に、照明光と操作光が異なる方向から試料に入射できるという非常に特別な利点を有する。例えば、対物レンズに関する偏向素子配置の結果として、かつ／または操作光かつ／または照明光に対する調整ビーム偏向装置使用の結果として、試料上可能な入射角と方向についての制限がほとんどない。特に、使用者が、対物レンズの光学系軸に沿ってまたは垂直に、専ら操作光かつ／または照明光により、試料上に入射させることに制限はない。

念頭にあるのと同じように、特に、本発明は非常に特別な利点を有する。すなわち、例え本発明による配置の多様性が、既存技術から知られる配置より事実上大きいとしても、長い副ビームパスと操作光の入出結合のための多数のダイクロイックミラー間の面倒な切り替えは、はっきりと分離することができるのである。長く異なるビームパスが用いられるとき、必然的に生起する追加コストや不安定性はこれにより回避される。

本発明に従って光学配置を生成するため、かつ／または本発明に従って方法を実施するため、大きな技術的支出をすることなく、操作顕微鏡、特に共焦点型顕微鏡に変更することが事実上可能であることは有利である。

非常に正確で、侵襲を最小限とした顕微鏡操作は、例えば、光学試料操作によりなされる。例えば、波長かつ／または光パワーレベルかつ／または強度かつ／または1またはそれ以上の操作光束の幾何学形状に関する操作光の特性は、特殊な応用にも好ましく適合することである。例えば、操作光のパルス化である。また、非パルス化操作光の使用も可能である。

本発明に従った配置は、この状況で特に前記権利に関し、特殊な応用に適合または対応した光源、特にレーザー光源を含むことが好ましい。本発明に従った光学配置の環境で、例えば、1の同様の照明素子は操作光と照明光の両方を生成するよう使用することが可能である。一方、異なる光源が操作光と照明光を生成するよう存在することも可能である。

紫外(UV)光は、例えば、細胞切除、DNAカッティング、検鏡試片化に使用できる高エネルギー光である。一方、405nmの通常波長も光活性化や光変換に使用できる。可視(VIS)光は、蛍光染料(FRAP: fluorescence recovery after photobleaching: 光褪色後蛍光回復) での褪色実験に使用可能である。一方、可視光はまた光活性化や光変換にも使用可能である。赤外(IR)光を使用すると、非常に小さな容積内で赤外光が入射し、急激に温度、例えば水温、が上昇することにより、高操作性、非常に低影響、局所限定の形で、損害が発生する。同様に細胞による直接吸収が可能である。赤外光はまた光ピンセットと共に用いられる。加えて、生体が、多光子(MP)主励起を通じて、赤外操作光と相互に作用するという事実により、赤外操作光は、細胞切除、光褪色、光活性化や光変換のような既述のプロセスに対しても使用可能である。

本発明により、特に既存技術で知られる装置に対しても、必要に応じ、明らかに単なる2方向以上に試料を操作することも可能であることは有利である。調整ビーム偏向装置の使用(例えばX方向に偏向されたものとY方向のものという一連に連接した2つのガルバノミラー)は、例えば点、線、任意に選択可能な領域の操作照明といった操作をも可能にする。特に操作光の入射による制御方式において、重要試料域(ROI)の操作も可能である。

例えば、この偏向素子は1またはそれ以上のミラーからなる。特にこのミラーは平坦化が可能である。しかし、例えば照明光かつ／または操作光が鏡面に沿って継続的に移動する場合、かつ／または、追加の焦点合わせを行う場合、このミラーは曲面にもできる。反対にまたは更に、偏向素子は少なくとも1のプリズムまたは少なくとも1のダイクロイックビームスプリッターからなることも可能である。

可能な一実施形態として、操作光と照明光の両者が、対物レンズ作用点に配置された同じ対物レンズを通じて、試料上へ収束されるものを提供する。このような実施形態は、特に操作光や照明光と同時に試料に入射すること、および操作後すぐに生起する試料反応を観察すること、を可能にする。

この種の実施形態は、同じ開口数の対物レンズが、照明光と操作光に作用し、望むなら操作光は照明光と同じ発散を示すことが可能という特別な利点を有する。

一方、同じ対物レンズが操作光と照明光に使用される場合、試料は操作光と照明光に時間をおいて入射されることもまた可能である。

時間をおいて入射する場合、特に偏向素子により偏向されることなく試料に直接作用し、対物レンズを通過後、操作光を発生させることも可能である。一方、対物レンズを通過すれば、照明光は対物レンズの光軸に対し0度とは異なる角度、特に非常に特別な角度である10度より大きい角度で伝搬するといった方法で偏向素子により偏向される。しかし、ここで考慮しなければならないのは、照明光と操作光の焦点は対物レンズから同一の距離ではないということである。例えば、これは操作光と照明光の入射間で切り替える際、光軸に沿った距離差に等しい総和によって、対物レンズを位置変更して補正することができる。

操作光と照明光の入射間で切り替える際、前述の距離差を回避するため、特に対物レンズ作用点に個別に必要な対物レンズを導入することにより、異なる対物レンズ間の切替えも可能である。この状況では、対物レンズの屈折力は、操作光が偏向素子を通じて処理されないので、対物レンズ作用点に関する各焦点距離が偏向素子を通じて処理される照明光に対して同等であるという方法が選択される。

この実施形態はさておき、異なる屈折力によらず、かわりに例えば光軸に沿った(既述した)対物レンズの位置変更によって距離差が補正される方法を含むという他の理由でも、対物レンズの変更が可能である。

対物レンズの位置変更や可動性は、電動モータや機械駆動によって実現可能である。例えば、X、Yかつ／またはZ方向の可動性は圧電素子、又は従来の駆動技術で実現できる。

例えば、照明光に対するものよりも高開口数で、点、線、任意に選択可能な領域の操作照明による操作の実施が望まれるならば、本発明の可能な一実施形態に従い、操作のためにより高開口数を持つ照明対物レンズの回転により、かつ照明光による照明と観察のためより低開口数を持つ元の照明対物レンズへの逆回転により、これは達成される。通常照明でも起こる同じ焦点域での操作を可能にするため、照明光軸に沿った位置変更は対物レンズの交換で行わねばならない。

高開口数対物レンズの有用性として、照明光シートかつ／または操作光束の形態が特に薄くできるという特別な利点があげられる。SPIM撮像に関しては、これにより解像度が増す。

例えば、点、線、任意に選択可能な領域の照明により照明と操作の実施を望むならば、特に高開口数を持つ同じ対物レンズを使い、これにより偏向素子がまだ衝突するのを確認し、事前に決めた量だけ操作光と照明光を側方(例えば、後軸に対し横方向)に集約させた対物レンズを移動させた、本発明の可能な一実施形態により達成される。その理由は、高開口数を有する対物レンズが、一般に、例えば、より小さな走査域の高倍率対物レンズでもあるからである。しかし、更にまだ偏向素子間にあるよりも大きな目的物と偏向素子の大空隙に位置することを望むならば、照明対物レンズは走査ビームにより偏向素子が衝突するような特別量だけ側方にオフセットされなければならない。照明対物レンズの倍率が2の要因により増加するならば、照明対物レンズの側方移動は、以下に計算される量によりなされなければならない。：

[(より低い倍率の走査域)−(より高い倍率の走査域)] ÷2

偏向素子を経由せず、かわりに直接操作を行う、かつ偏向素子を経由して照明をする間、焦点面を操作する意図があるならば、対物レンズは特別量だけ、光軸に沿って移動しなければならない。；この量は一般に偏向素子の空隙ｍｍで)の半分で計算される。しかし、他の試料分野を操作したいならば、別の値を用いることも可能である。

例えば光シートは、例えば円断面を有する(例えばレーザーの)光束といった円柱光学系を用いて生成される。本発明の目的のため、「円柱光学系」は、非点収差光学系であり、かつ／または光の伝搬方向に垂直でない方向よりも光の伝搬方向に垂直な一方向において、より強く収束すると解される。

一方、非常に特殊な利点を有する実施形態として、照明光シートが疑似光シートであるものが提供される。(この疑似光シートは)照明光束が継続して光シート面前後に移動して生成される。この目的のため、例えば光学装置は、偏向角に配置できるビーム偏向装置からなる。この偏向角により、速やかに照明光シートが照明光面に実際に存在するよう、照明光束は照明面で可動自在である。；かつ／または、試料から進む光の探知に供するディテクターでも、顕微鏡の下流側評価装置でも、照明は、例えば円柱光学系で継続的に照明光シートが生産されることから区別できないことを意味する。；かつ／または、得られた画像データは、継続的に照明光シートで照明が生成されるデータとは区別できないかまたは、実質的に区別できない。

この種のビーム偏向素子は、例えば少なくとも1のガルバノミラーから構成される。特に、光学配置が操作顕微鏡の改良により製造される場合、または本発明が操作顕微鏡の補助に用いられるようにした方法の場合、例えば特に、走査顕微鏡のビーム偏向装置、特にどのような場合にも存在する共焦点型走査顕微鏡も使用可能である。

特に光シート形状が配置可能なとき、ビーム偏向装置が、例えば、XガルバノミラーとYガルバノミラー、または配置可能な他の偏向法であり、特に相互に垂直な異なる偏光面で偏向されるのが好ましい複数のガルバノミラーで構成されるならば、特に有利である。複数の偏向法の利点は、特に1またはそれ以上の曲面偏向ミラーからなる偏向装置を用いた平面疑似光シートの生成例を用いることにより明らかになる。：曲面偏向ミラーが、1つの面で照明光ビームを偏向することにより単独で照明されるならば、その時点で(曲面偏向ミラーの照明光ビームの軌跡は必然的に曲がるため)、非平坦で湾曲した疑似光シートになる。一方、異なる偏光面で2つのガルバノミラー偏向を使用することにより、結果が平面疑似光シートというような方法で、照明光ビームの軌跡を偏向ミラー上に描くことが可能となる。

反対に(平面偏向ミラーを使用する状況でさえ)、望むならば、ガルバノミラーの適正制御により大構造疑似光シートの製造も可能である。

偏向照明光シートの伝搬における光束面は、照明対物レンズのかつ／または探知対物レンズの光軸に水平方向にまっすぐであることが望ましい。

記述のとおり、照明光かつ／または操作光が対物レンズを通り、かつ偏向素子上の更なる光学要素を経て、選択的に指向するよう提供できるのは有利である。

特に、照明光かつ／または操作光が、同時にまたは経時的に、複数の偏向法を有する偏向素子を用いて偏向するよう提供できるのは有利である。(この複数の偏向法には)特に対物レンズ作用点に位置する、対物レンズの下流側素子である偏向ミラーがある。

偏向法は特に、異なる配置、かつ／または異なる方向、かつ／または異なる型とできる。例えば、特に偏向角に配置可能なビーム偏向装置により、操作光かつ／または照明光が相互に異なる位置決め、かつ／または方向付けされた偏向法に交互に向かうように提供できる。各偏向法では、試料、特に同じ試料域上に操作光かつ／または照明光が偏向する。それゆえ、1つの同一試料域では、異なる方向から操作光が入射することが可能になる。

これは、特に1つの同一試料域への単一中心、かつ／または定位入射を可能とする。これにより、重要な試料域には、例えば、入射操作光効果が試料域外に発生するため周辺域に残存されつつ、操作光が集中的に入射することができる。特に、例えば操作光ビームを構成する操作光は、特に偏向角度に配置可能なビーム偏向装置を用いて、特に複数の偏向法からなる対物レンズから下流方向の偏向素子を経由して、円錐面上に移動することが可能である。

特殊な応用として、例えば、違う試料域が異なるように操作され、操作中かつ／またはビーム偏向中、操作光のパワーレベルが変更できるものがある。

偏向素子が複数の偏向法；または、照明光かつ／または操作光が試料上、特に重要な試料域上の異なる方向から方向付けできるような方法、による形状、特に湾曲した形状とすることも可能である。

1つの可能な実施形態として、試料で処理された探知光が、照明光を集約した対物レンズを通過する、かつ／または視準するものがある。

しかし、試料で処理された探知光が、探知対物レンズを通過する、かつ／または視準するのが望ましい。(探知対物レンズは) 照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズとは異なる。

特に、照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズの光軸と探知対物レンズの光軸は、相互平行に、かつ／または同一線形状に、配置するよう提供できるのは有利である。この種の実施形態は、光学装置を特に小型で強固な形状にでき、特に試料照明域への接続を容易にできるが、試料照明域への迅速で正確な連続試料誘導も可能とする、特別な利点を有している。

特に照明光シートがまず照明対物レンズを通って垂直方向に進み、次に試料層を照明するため偏向素子を用いて水平方向に偏向する、という特別な利点を有している。照明層からの光、特に蛍光は、探知対物レンズを通って垂直方向に進むことが望ましい。この種の形状は、本発明による光学機器を製造に、標準的な直立または倒立顕微鏡スタンドを用いることを可能とする。

特に極めて有利な実施形態として、照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズと、例えば、1またはそれ以上の偏向ミラーで構成される偏向素子とが互いに連動するものが提供できる。偏向素子が選択的または追加的に照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズに可動に固定され、かつ／または偏向素子が探知対物レンズに可動に固定されるものも提供できる。これらの実施形態は、照明光かつ／または操作光が試料に直接当たるか、偏向素子を経由するかの配置が容易である点で、有利である。

加えて、偏向素子と、照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズ間の相対位置に配置することにより、試料上の照明光かつ／または操作光入射の方向が変更できる。

偏向素子を、選択的または追加的に探知対物レンズ周りかつ／または探知対物レンズ、特に探知対物レンズに固定した光軸周り、に回転自在に配置することも可能である。このような実施形態は、例えば試料上の照明光かつ／または操作光の入射方向の変更、配置を容易にする。

操作光かつ／または照明光を用いて、2つの光子励起をもたらすよう提供できるのは有利である。この点について、本発明による光学配置は、操作光かつ／または照明光を生成するため、パルスレーザー、特にピコ秒またはフェムト秒レーザーを構成できるのは有利である。

既述の通り、本発明による光学配置は、走査顕微鏡、特に共焦点型走査顕微鏡の偏向によって生成される。本発明による光学配置は、操作顕微鏡、特に共焦点型走査顕微鏡、望ましくは独自にSPIM画像生成からの上記配置が操作顕微鏡としても機能する方法を含むことも可能である。

既述の通り、特に簡易設計型では、偏向素子は、探知素子の探知側へ探知対物レンズを配置できる。光シートの製造に要する偏向素子を確実に位置決めするため、探知対物レンズにおける既存の構成要素が使用されるのは、素晴らしいことである。光学配置の使用環境での異なる要求に対する、特に高柔軟性と簡易適応性の利益として、偏向素子は、特に非破壊的可動型では、探知対物レンズに配置することが可能である。

換言すれば、偏向素子は照明光シートを用いた顕微鏡の応用に、探知対物レンズを配置でき、異なる要求照明に探知対物レンズを移動可能である。加えて、異なる次元の偏向素子は、交互に使用でき、損害事象発生時、簡単に交換できる。

例えば、偏向素子は、複数の反射要素かつ／または少なくとも1のプリズムかつ／または少なくとも1つのディックホリックビームスプリッターを持つミラー配置からなるのが好ましい。また、単純型では、偏向素子は探知対物レンズの正面に配置することができる。

単純型では、ミラー配置は、2つの平面で相互に反対に位置する、2側面からの試料照明かつ／または操作の反射要素からなる。特に信頼可能な試料域でのシャドーイング回避では、ミラー配置は、事前定義可能な長さの円弧に沿って配置できる複数の平面または曲面反射要素からなる。個々の反射要素は、お互いの反射要素の相対位置がミラーアタッチメントの製造において事前定義できるよう、単一のミラーアッタッチメントに取り付けることができる。

更なる利点として、球面反射要素の曲率半径は、反射要素から反射する全てのビーム、または事前定義可能な数のビームが焦点に集約されるといった方法で、選択可能である。このとき、最大ビーム負荷が焦点に位置する。；すなわち、試料中心に提供可能である。単一焦点でのこの種の焦点合わせのため、曲率半径は、試料中心から円弧に沿って配置された、反射要素円弧へと伸びる半径と等しい。光シートを用いた照明のため、曲率半径は、試料中心から円弧への2半径より大きくなければならない。

発明の要旨は、模式的に図示されており、以下、図に従って説明する。図において、同一の機能要素には、同じ参照記号が付している。

図1は、本発明の光学配置を例示した実施形態の模式側面図である。 図2は、図1のものとは異なった位置の照明対物レンズを有する、本発明の光学配置を例示した実施形態の模式側面図である。 図3は、照明目的物が外側にオフセットした、本発明の他の光学配置を例示した実施形態の模式側面図である。 図4は、可能な偏向素子を模式的に示したものである。 図5は、他の可能な偏向素子を明示した模式図である。 図6は、円弧に沿って配置された複数の曲面反射要素を有する、可能な偏向素子を示した模式図である。 図7は、複数の曲面反射要素を有する、更に可能な偏向素子を示した模式図である。

図1は、試料1の操作、および照明光シート5で、特に蛍光励起のための励起光である照明光による照明の下で、SPIM技術を用いた試料撮像に対する、本発明の光学配置を例示した実施形態の模式側面図である。照明光は、光源(図示せず)によって生成され、ビームスプリッター10を通って、調整ビーム偏向装置8に到り、走査レンズ11とチューブレンズ12を経由して、対物レンズ9の照明光を収束させて、作用点に配置された入口孔15に達する。照明光は、対物レンズ9を通過した後、対物レンズ9の光軸に対し0度とは異なる角度で広がるという方法により、偏向ミラー7からなる偏向素子4により偏向される。

ビーム偏向装置8は、2つの異なる方向(特にX方向とY方向)で相互、別々に事象光を偏向するため、特に例示可能である。例えば、ビーム偏向装置8は、回転軸が相互に垂直面で配置された2つのガルバノミラーを含むことができる。一方、ビーム偏向装置8は、例えば、ジンバル載置ミラーからなることもできる。

図で模式的にのみ示した照明光シート5は、照明光束の形の光源(図示せず)から発される照明光が、ビーム偏向装置8により速やかに前後に移動するという事実から、疑似光シートであることが望ましい。それにより特に同種の強度分布が達成される。一方、照明光シート5は、非点収差光学系により生成することも可能である。

照明光シート5で照明される試料層からの探知光操作は、探知装置3を用いて探知されるものである。探知光は、探知対物レンズ6により視準され、そのとき、例えば、領域ディテクター、特にCCDカメラやCMOS基盤センサーとして例示できる、ディテクター14上の光学系13により撮像される。ディテクターは、モニター上に試料を提供するために用いられる(選択的に電気処理後)電気信号を発生させる。対物レンズの光軸に沿って試料を移動させることにより、継続して3次元描画の構築を可能とする2次元画像積層を得ることができる。

この型で、例えば、更なる画像生成のために再度可視化する効果を持つ操作を(後述のように)実施するために、最初は試料の、または少なくとも1の試料層の、または特別重要な試料域の第一画像を得ることが可能である。

光学装置は、更に操作光を発する光源2からなる。光源2によって生成される操作光は、ビームスプリッター10によってビーム偏向装置8に偏向され、走査レンズ11とチューブレンズ12を経由して対物レンズの作用点に配置された対物レンズ9に到る。対物レンズ9は、また操作光を集約する。しかし、ビーム偏向装置8は事前に照明光をなすものとしての偏向ミラー7の一つには進まないが、かわりに対物レンズ9を通過した後に試料1に当たるといった方法で操作光に進む。

ここで、照明光シートの焦点で事前に照明された領域は、操作光焦点を用いて操作できないため、照明光と操作光の焦点が試料内の異なる位置にある、という事実に考察を加えなければならない。

これは、二重矢印によって図示するように、光軸に沿って対物レンズ9を置換することにより補正される。置換移動は対物レンズに関する焦点空間の原差異と同程度の大きさであることが望ましい。

図2は、試料−対物レンズ空間の増大に伴う、操作実施に必要な位置を示すものである。しかし、前記詳述の通り、補償は方法の相違、例えば追加の光学系(特に、例えば遠距離光源2とビームスプリッター10の間で専ら操作光が伝搬するビームパスの一部)の使用、かつ／または照明と操作用の異なる対物レンズ使用することにも影響される。

一旦操作が行われると、目的物は前記の方法で、試料、特に操作試料域の画像再構成のため、戻って再置換可能である。

偏向素子4は、探知対物レンズ6上に配置可能である。偏向素子4は、2側面から選択的に試料を照明できるよう2つの偏向ミラー7からなる。これは特に、例えば他の側面からの光が入射できず、または不十分に入射してしまい、試料自体の一部による影ができるので、それを構築する1側面から照明するものである。

作用点に位置する対物レンズ9により、更に試料から進んだ探知光16を視準すること、ディテクター(図示せず)に送ることも可能である。ビームスプリッター10は、この状況の下、探知光16が通過可能な方法により例示したものである。

図3は、高開口数を有する対物レンズ9が用いられた本発明の他の光学配置を例示した実施形態の模式側面図である。高開口数を有する対物レンズは一般に高解像度である利点を有するが、(走査域)視野が狭い。それゆえ、図示の配置の場合、高開口数を有する対物レンズ9が用いられた時のみ、偏向素子が積層するため、(二重矢印と2つの対物レンズ9の図で示す)後の対物レンズ9の移動が予測される。横方向の置換に加えて、対物レンズ9の光軸に沿った置換は、照明と探知の幾何学的配置を維持するために望ましく、追加的になされるものである。

あるいは、別々に操作光と照明光を生成する2つの光源にかわり、操作光と照明光の両方が同じ光源により生成されることが予想できる。例えば、光源2である。特殊な応用として、光源2がUVかつ／またはIRかつ／または可視光を生成することが例示できる。

図4から7は、対物レンズ9の光軸に沿った平面図内で、偏向ミラー7の異なる例示である異なる配置と、操作光かつ／または照明光の可能なビームパスを有する偏向素子4の異なる例示の実施形態を示している。

図4は、相互に反対に配置された、2つの偏向ミラー7を有する、1つの可能な偏向素子4の模式的側面を示している。偏向ミラーは、試料または少なくとも試料の一部が位置する視野17の照明のため、照明光シートとして例示される照明光を偏向する。視野17は、ディテクター、特に2次元ディテクター上で撮像される領域に対応することが望ましい。もちろん、選択的または追加的に、操作光が偏向ミラー7により試料上へ進むことも可能である。

図5は、円弧に沿って各々反対側面に位置するよう配置された複数の偏向ミラー7を有する、他の可能な偏向素子の模式図を明示したものである。図6、7にも示される偏向素子のように、この種の偏向素子4は、複数の異なる領域からの単一中心かつ／または定位入射に特に好適である。

図6は、円弧に沿って配置された複数の曲面偏向ミラー7を有する、1つの可能な偏向素子4の模式図である。偏向ミラー7の曲率半径は、円弧の半径ｒの2倍以上と同等であることが望ましい。

図7は、事前定義可能な長さの円弧に沿って、互いに反対に配置された曲面偏向ミラー7を有する、偏向素子4の模式図であり、更に有利である。偏向ミラー7の曲率半径は、反射要素7により反射された光の焦点が、円弧によって形成された円中心に存在するので、円弧の半径に対応する。すべての反射ビームは最大負荷が定位照明により選択された試料域で起こるため、中心に収束する。例えば、試料域は、試料が載せられる全3空間方向に正確に配置された置換段階補助を伴う試料の置換により、中心に位置付けることができることが望ましい。この置換段階は特に、動力方式に適合するよう構成される。

光学配置の多様な使用が、図5から7に示した偏向素子を基本として確認できる。個別偏向要素の具体的な配置と型によらず、各偏向素子は事前梱包アタッチメント、特に対物レンズかつ／または探知対物レンズに固定された事前梱包アタッチメントとして例示される。ミラー要素配置を有するアタッチメントは、異なる応用間での変更のため、交換されることを要する。

繰り返しを避けるため、読者は、本発明の光学配置の更に有利な実施形態に関し、明細書の一般記述部分と添付した特許請求の範囲を参照されたい。

最後に、前記例示実施形態は、請求項説明の議論用であり、例示実施形態に限定されるものではないことに明示的に注意されたい。

１ 試料
２ 光源
３ 探知装置
４ 偏向素子
５ 照明光シート
６ 探知対物レンズ
７ 偏向ミラー
８ 調整ビーム偏向装置
９ 対物レンズ
１０ ビームスプリッター
１１ 走査レンズ
１２ チューブレンズ
１３ 光学系
１４ ディテクター
１５ 入口孔
１６ 探知光
１７ 視野

Claims (27)

1. 操作光と照明光の両方が、
   a.対物レンズ作用点において配置された同じ対物レンズにより、または、
   b.対物レンズ作用点に継続的に送り込まれる異なる対物レンズにより、；
   かつ、対物レンズの光軸に対し、０度とは違う角度で伝搬するといった方法で、対物レンズ通過後の操作光かつ／または照明光が偏向素子により偏向されることにより集約されることを特徴とする、
   試料が操作光により操作され、かつ照明光シートの形式において、照明光、特に蛍光励起のための励起光による照明の下、SPIM技術により撮像される方法。
2. 操作光と照明光が異なる方向から試料に進むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. a.照明光シートが、継続的に前後に移動する照明光束によりなる疑似光シートである、または
   b.照明光シートが、偏向角に調整可能なビーム探知装置を用いた、継続的に前後に移動する照明光束によりなる疑似光シートである、または
   c.照明光シートが円筒光学系の使用によりなる
   ことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
4. 試料が操作光および照明光と同時に照明されることを特徴とする、請求項１乃至３記載の方法。
5. a.試料が、当初操作光により、その後照明光により継続的に照明される、または
   b.試料が、当初照明光により、その後操作光により継続的に照明される、または
   c.試料が、照明光と操作光により交互に照明される
   ことを特徴とする、請求項１乃至３記載の方法。
6. 対物レンズ通過後、操作光が偏向なしに試料に向かう一方、一旦対物レンズを通過すると、対物レンズの光軸に対して０度とは異なる角度、特に１０度より大きな角度、特に直角で、伝搬するといったような方法で、照明光が偏向素子により偏向される
   ことを特徴とする、請求項１乃至５記載の方法。
7. 照明光かつ／または操作光が、偏向角に調整可能なビーム偏向素子を用いて偏向素子に進む
   ことを特徴とする、請求項１乃至６記載の方法。
8. a.偏向素子が、複数の偏向方法、特に複数の偏向ミラーからなる、かつ／または
   b.偏向素子が、複数の異なるかつ／または、異なって配置されたかつ／または、異なった偏向方法、特に複数の偏向ミラーで並んだ
   ことを特徴とする、請求項１乃至７記載の方法。
9. a.試料、特に1つでかつ操作される同じ試料域が複数の異なる方向から操作光により入射する、かつ／または
   b.操作される試料域が単一中心かつ／または定位に操作光により入射する、かつ／または
   c.操作光束からなる操作光が、特にビーム偏向素子を用いて、かつ少なくとも1つの対物レンズから下流方向の偏向素子を経由して、円錐表面上を移動する、かつ／または
   d.操作光のパワーレベルが、操作中かつ／またはビーム偏向中、変更される
   ことを特徴とする、請求項１乃至８記載の方法。
10. a.試料から進む探知光が通過する、かつ／または照明光を集約する対物レンズにより視準される、または
    b.試料から進む探知光が通過する、かつ／または、照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズとは異なる探知対物レンズにより視準される
    ことを特徴とする、請求項１乃至１０記載の方法。
11. 照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズの光軸と探知対物レンズの光軸が、互いに平行、かつ／または円錐状に並んでいる
    ことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
12. a.偏向素子と照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズが互いに可動に配置された；かつ／または
    b.偏向素子が照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズに可動に固定された；かつ／または
    c.偏向素子が探知対物レンズに可動に固定された；かつ／または
    d.偏向素子が探知対物レンズかつ／または探知対物レンズの光軸周りに回動可能に配置された
    ことを特徴とする、請求項５乃至１１記載の方法。
13. 操作光かつ／または照明光を用いて、２つの光子励起がもたらされる
    ことを特徴とする、請求項１乃至１２記載の方法。
14. 操作光と照明光の両方が、
    a.対物レンズ作用点において配置された同じ対物レンズにより、または、
    b.対物レンズ作用点に継続的に送り込まれる異なる対物レンズにより、；
    集約され、かつ、対物レンズ作用点にある対物レンズからの下流方向が照明光かつ／または操作光が偏向素子により偏向される少なくとも１つの偏向素子であることを特徴とする、
    試料を操作し、かつ照明光、特に蛍光励起のための励起光による照明の下、SPIM技術により撮像する光学配置。
15. 照明光と操作光が異なる方向から試料に進むことを特徴とする、請求項１５記載の光学配置。
16. a.照明光シートが、継続的に前後に移動する照明光束によりなる疑似光シートである、または
    b.照明光シートが、偏向角に調整可能なビーム探知装置を用いた、継続的に前後に移動する照明光束によりなる疑似光シートである、または
    c.照明光シート生成の円筒光学系が存在する
    ことを特徴とする、請求項１５または１６記載の光学配置。
17. 試料が操作光および照明光と同時に照明されることを特徴とする、請求項１４乃至１６記載の光学配置。
18. a.試料が、当初操作光により、その後照明光により継続的に照明される、または
    b.試料が、当初照明光により、その後操作光により継続的に照明される、または
    c.試料が、照明光と操作光により交互に照明される
    ことを特徴とする、請求項１４乃至１７記載の光学配置。
19. 対物レンズ通過後、操作光が偏向なしに試料に向かう一方、一旦対物レンズを通過すると、対物レンズの光軸に対して０度とは異なる角度、特に１０度より大きな角度、特に直角で、伝搬するといったような方法で、照明光が偏向素子により偏向される
    ことを特徴とする、請求項１乃至４記載の光学配置。
20. 照明光かつ／または操作光が、偏向角に調整可能なビーム偏向素子を用いて偏向素子に進む
    ことを特徴とする、請求項１４乃至１９記載の光学配置。
21. 偏向素子は、照明光が対物レンズ作用点に位置する対物レンズに集約され、かつ／または操作光が対物レンズ作用点に位置する対物レンズに集約される偏向のため、複数の異なるかつ／または、異なって配置されたかつ／または、異なった偏向方法、特に複数の偏向ミラーで並んだ
    ことを特徴とする、請求項１４乃至２０記載の光学配置。
22. a.試料、特に1つでかつ操作される同じ試料域が複数の異なる方向から操作光により入射する、かつ／または
    b.操作される試料域が単一中心かつ／または定位に操作光により入射する、かつ／または
    c.操作光束からなる操作光が、特にビーム偏向素子を用いて、かつ少なくとも1つの対物レンズから下流方向の偏向素子を経由して、円錐表面上を移動する、かつ／または
    d.パワーレベル変更装置が、ビーム偏向中、操作光のパワーレベルを変更する
    ことを特徴とする、請求項１４乃至２１記載の光学配置。
23. a.試料から進む探知光が通過する、かつ／または照明光を集約する対物レンズにより視準される、
    またはb.試料から進む探知光が通過する、かつ／または、照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズとは異なる探知対物レンズにより視準される
    ことを特徴とする、請求項１４乃至２２記載の光学配置。
24. 照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズの光軸と探知対物レンズの光軸が、互いに平行、かつ／または円錐状に並んでいることを特徴とする、請求項２３記載の光学配置。
25. a.偏向素子と照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズが互いに可動に配置された；かつ／または
    b.偏向素子が照明光かつ／または操作光を集約する対物レンズに可動に固定された；かつ／または
    c.偏向素子が探知対物レンズに可動に固定された；かつ／または
    d.偏向素子が探知対物レンズかつ／または探知対物レンズの光軸周りに回動可能に配置された
    ことを特徴とする、請求項１４乃至２４記載の光学配置。
26. a. 操作光かつ／または照明光を用いて、2つの光子励起がもたらされる；かつ／または
    b. パルスレーザー、特にピコ秒またはフェムト秒レーザーが照明光かつ／または操作光生成のために存在する
    ことを特徴とする、請求項１４乃至２５記載の光学配置。
27. 光学装置は、走査顕微鏡、特に共焦点型走査顕微鏡への変換により製造され；かつ／または光学配置は、走査顕微鏡、特に共焦点型走査顕微鏡を含む
    ことを特徴とする、請求項１４乃至２６記載の光学配置。

Images