JP2013235271A - レーザー顕微解剖装置及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】厚い及び／又は水性の試料を確実に解剖することができるレーザー顕微解剖装置を提案する。
【解決手段】切断すべき試料（３）を担持する顕微鏡ステージ（２）、レーザービーム（６）を生成するレーザー光源（５）、レーザービームを試料上に合焦させる対物レンズ（８）、及びレーザービーム焦点（７）が対物レンズの主軸（９）と垂直なＸ−Ｙ方向に移動するように、レーザービームを偏向させる光学レーザー走査装置（１０）、を有し、Ｚ方向にステージを移動させるステージ用のＺ変位装置（４）及び／又はＺ方向にレーザービームの焦点を移動させる光学レーザー焦点シフト装置（１５）が設けられ、レーザービーム焦点がＸ−Ｙ−Ｚ方向に３次元切断線（２０）に沿って試料内を移動するように、Ｚ変位装置及び／又はシフト装置が光学レーザー走査装置とともに制御可能であることを特徴とするレーザー顕微解剖装置により解決される。
【選択図】図１

Description

本発明は、請求項１のプレアンブル部分の特徴を有するレーザー顕微解剖装置、及びこれに対応するレーザー顕微解剖方法に関するものである。

公知のレーザー顕微解剖装置が、本出願人の独国特許出願である特許文献１に詳細に記載されている。そこでは、レーザー顕微解剖装置は、切断すべき試料を担持する顕微鏡ステージ、入射光装置、レーザー光源、及びレーザー光源のレーザー光を試料上に収斂させる顕微鏡対物レンズを有する。人間又は動物の組織サンプル、また植物サンプルも、切断すべき試料として使用できる。しかしながら、原則として、人工織物やプラスチック（ＰＥＮ，ＰＥＴ，ＰＰＳ，ＰＯＬ、フルオロカーボン）、ガラス、或る薄い金属又は石のサンプルも使用できる。通常、ＵＶレーザー光が使用され、通常、レーザービームはパルス化される。レーザービームの焦点で発生した高エネルギー密度が、選択された試料領域を残りの試料から切断する（解剖する）のに使用される。レーザーパルスが使用されるとき、レーザーパルスの吸収により試料に小さい穴が作られる。次いで、この穴の適切な連続配置によって切断線が創出される。パルスエネルギーはサンプル硬さに依存する。速い切断や微細な切断線の生成のために、高いパルス周波数が使用される。

特許文献１から公知のレーザー顕微解剖装置では、顕微鏡ステージは切断の間Ｘ−Ｙ方向（一般に水平面）に対して固定して配置される。入射光装置に配置されているのは、２枚の厚いガラスウェッジプレートからなるレーザー走査装置である。該プレートは光軸に対して傾斜しており、光軸周りに相互に独立して回転可能である。レーザービームは、これらのガラスウェッジプレートを通ってガイドされ、結局偏向角αだけ光軸に対して偏向される。偏向角は光軸周りにウェッジプレートを回転させることで調節、変更可能である。全ての偏向角αに対して顕微鏡対物レンズのレンズ瞳の中心が当たるように、ガラスウェッジプレートの厚さと傾斜度は設計される。

光軸に対するレーザービームの偏向角αは、光軸周りに互いに対してガラスウェッジプレートを回転させることで調節できる。結局、レーザービームの焦点は試料のＸ−Ｙ平面内の任意の所望の位置に導かれる。このために、レーザービームが視野の端まで偏向されるように、最大偏向角αは寸法決めされる。これは、倍率によらず全ての対物レンズに同時に当てはまる。そこで記載されているレーザー顕微解剖装置は、高価な電動Ｘ−Ｙステージを用いずに間に合う。顕微鏡ステージは切断操作の間固定されているので、ユーザーは試料内で切断操作を観察・監視することができる。ガラスウェッジプレートは好ましくは、互いに対してガラスウェッジプレートの相対回転を実行するステッピングモーターにより制御され、特定の方位角で特定の偏向角αが確立される。それにより、試料の水平面（Ｘ−Ｙ方向）内で先に定められた切断線がレーザービームの焦点により追跡される。

そこで記載されているレーザー顕微解剖装置の構造と機能に関する詳細と、そこで使用されるガラスウェッジプレートの詳細については前述の特許文献１を参照されたい。その文献から詳細を繰り返す必要なく、この点の開示は完全に本願に明らかに組み込まれる。本発明は特に、特許文献１に係るレーザー顕微解剖装置に由来する。本発明の原理は他のタイプの解剖装置にも適用でき、そこで実施できる。

同様に作動するレーザー顕微解剖装置が本出願人の特許文献２から知られている。この装置は、サンプルへ導かれる照明ビーム経路と、サンプルを結像する結像ビーム経路とを有する顕微鏡を有する。さらに、顕微鏡は、励起フィルターを有する蛍光装置、ダイクロイックビームスプリッター、及びブロッキングフィルターを有する。ダイクロイックビームスプリッター及びブロッキングフィルターはスペクトル的にレーザービームを透過させ、それによりレーザービームはダイクロイックビームスプリッター及びブロッキングフィルターを通ってサンプルに導かれる。そのためにレーザービームガイドが蛍光装置の照明ビーム経路と部分的に結合されてもよい。蛍光装置と、レーザービームを用いたサンプルの切断（顕微解剖）が、同時に活性化され得る。

Molecular Machines and Industries AGの特許文献３は、生物学的物質の層セグメントを絶縁する方法を記述している。まず、生物学的物質の層は試料スライド上に配置され、薄い（保護）フィルムで覆われる。接着層を有するストリップは該フィルム上に貼られる。組織サンプルに合焦したレーザービームにより、組織サンプルからセグメントが切断され、同時に対応するセグメントが切断線に沿って、（組織サンプルを覆って組織サンプルセグメントと融合する）フィルムから切断される。切断されたセグメントは接着ストリップを持ち上げることで周囲から離される。接着ストリップは切断片コレクタのカバーの内側に配置され得る。カバーを試料スライドから持ち上げると、切断された組織試料セグメントも取り除かれ、蓋が閉じられた後に切断片コレクタ内に配置される。倒立顕微鏡を有するレーザー解剖装置がここでは顕微解剖のために使用される。ＵＶ吸収タイプのＰＥＴフィルム又はＰＥＮフィルムが（保護）フィルムとして使用される。

公知のレーザー顕微解剖装置及び方法を用いた、厚い及び／又は水性の試料の顕微解剖は、しばしば問題が生じることが分かった。厚いサンプルでは、レーザービーム切断線を用いた解剖がしばしば不十分で、直立顕微鏡（アップライト顕微鏡）の場合に重力の作用により周囲から切断片を分離できず、倒立顕微鏡の場合に切断片をその場面（射出（カタパルト）や融解など）に必要な付加的な移動ステップのために適切に調製することができない。水はレーザービームの焦点はずれを起こし、よって適切な結果を実現するのに高いレーザーエネルギーを必要とするため、水性のサンプル又は多量の水を含んだサンプルは問題がある。厚くて水性のサンプルは前述の問題の組み合わせを有する。高いレーザーエネルギーでの切断は、周囲のサンプル領域（組織）に負の影響を与える。「厚い」サンプルは３０μｍ厚以上のものと理解し、「水性の」サンプルは脱水されていないもの又は再水和されたもの（サンプルが長時間使用されたとき、雰囲気の湿気の結果、再水和は生じ得る）と理解されたい。水性のサンプルの例は、特に臓器向性部分培養、細胞培養のための天然の外された組織部分、又は脱水されず調製された試料である。

ＤＥ１００１８２５３Ｃ２ ＤＥ２００５００８９２５Ａ１ ＵＳ２０１１／０１９２５３４Ａ１

ゆえに、本発明の課題は、特に前述の不都合を回避しながら、特に厚い及び／又は水性の試料を確実に解剖することができるレーザー顕微解剖装置及び方法を記述することである。特に、レーザー顕微解剖が倒立顕微鏡と直立顕微鏡の両方に実施され得ることを意図している。

本発明は、切断すべき試料を担持する顕微鏡ステージ、レーザービームを生成するレーザー光源、レーザービームを試料上に合焦させる顕微鏡対物レンズ、及びレーザービーム焦点が顕微鏡対物レンズの主軸と垂直なＸ−Ｙ方向（通常、水平面内）に移動するように、レーザービームを偏向させる光学レーザー走査装置、を有するレーザー顕微解剖装置に関する。このレーザー顕微解剖装置に関連して、Ｚ方向に、すなわち前記Ｘ−Ｙ方向と垂直に顕微鏡ステージを移動させるために、顕微鏡ステージ用のＺ変位装置が設けられる。それに代えて又は加えて、Ｚ方向にレーザービームのレーザービーム焦点を移動させる光学レーザー焦点シフト装置がある。レーザービーム焦点がＸ−Ｙ−Ｚ方向に３次元切断線に沿って試料内を移動するように、顕微鏡ステージ用のＺ変位装置及び／又は光学レーザー焦点シフト装置が光学レーザー走査装置とともに制御可能である。さらに、本発明の主題は請求項９に係る対応する方法である。有利な実施形態はそれぞれの従属請求項と後続の記載から明らかである。

本発明によれば、３次元空間内の任意に定義可能な切断線に沿って試料を解剖することが可能になる。切断線は、特に数学的意味で遮断されておらず、すなわち連続的である。それは、３次元空間における関数、すなわちＸ，Ｙ，Ｚ座標系の関数として表現され得る。先に述べたように、サンプルを切断するために、レーザービーム焦点が切断線に沿って移動し又はレーザービームパルスが切断線にほぼ沿って配置される。Ｘ，Ｙ方向の対応する偏向が公知の光学レーザー走査装置によって行われる。装置としては、例えばミラースキャナー又は検流計スキャナーであるが、特に、回転可能なウェッジプリズム（楔プリズム）やガラスウェッジプレートを有する走査装置である。

軸の周りに互いに独立して回転可能な２つの厚いガラスウェッジプレートを有する、特に適切なレーザー走査装置が、先に議論した特許文献１から知られている。ここでは特に、ガラスウェッジプレートの厚さ及び傾斜の結果、レーザービームが顕微鏡対物レンズの光軸又は主軸に対してラテラルビームオフセット（ビームの側方のずれ）Δを有するように、ガラスウェッジプレートは設計されている。Ｘ−Ｙ方向のビーム経路の全ての偏向に対して顕微鏡対物レンズのレンズ瞳の中心が当たる。レーザービームのビームオフセットΔ及び、一方でレーザービームと他方で顕微鏡対物レンズの光軸（主軸）によって囲まれそれで定義される角度αへの、ガラスウェッジプレートの厚さ及び傾き（傾斜）の影響と、それに関連する各ガラスウェッジプレートのウェッジ角度の影響は、前述の特許文献１の図２ａ，２ｂと関連する記載から集められる。反復を避けるために、開示のためにここに組み込まれると想定される当該文献の関連する記述を特に参照されたい。

３次元切断線に沿ってレーザービーム焦点をガイドするのに必要なＺ方向の動きは、本発明によれば３通りで実施可能である。

一方で、切断すべき、つまり顕微鏡ステージ上にある試料は、顕微鏡ステージ用のＺ変位装置を介してＺ方向に移動できる。従ってこの場合、試料に合焦されたレーザービームは顕微鏡ステージに対して移動し、よってＺ方向に試料に対しても移動する。顕微鏡ステージ用のＺ変位装置、すなわち顕微鏡対物レンズの主軸と平行に顕微鏡ステージを移動させる電動駆動ユニットが、従来技術から知られている。

これに代えて、顕微鏡ステージに対する、従ってその上にある試料に対するＺ方向のレーザービーム焦点の相対運動は、レーザービーム焦点をＺ方向に移動させる光学焦点シフト装置により実現されてもよい。この種の光学焦点シフト装置は、特にレーザービーム伝播方向に対して顕微鏡対物レンズの前に配置され、１又は複数のレンズで構成される。少なくとも１つのレンズはレーザービーム伝播方向に移動可能に搭載される。（レンズ群を含むようにも意図される）関連するレンズが移動すると、Ｚ方向に、すなわちレーザービームが通って導かれている顕微鏡対物レンズの主軸と平行に、レーザービーム焦点が移動することになる。

最後に、顕微鏡ステージに対してＺ方向にレーザービーム焦点を移動させるための２つの前述の能力、すなわち顕微鏡ステージの変位と光学焦点シフト装置による変位は、次の場合に同時に使用することができる。それは例えば、一方の能力の移動範囲が消耗され、それにより移動範囲が他方の能力により拡張される場合、又は２つの能力の一方が大きめの移動により適しているのに対し、他方の能力が小さい移動により適している場合である。

特に、顕微鏡ステージが切断の際Ｘ−Ｙ方向に対して固定して配置されていると有利である。その理由は、これにより、受け取る試料の像がカメラの像取得平面内で移動しないので、切断操作の間カメラを介して試料を容易に見ることができるからである。加えて、高価なＸ−Ｙ走査ステージがこの実施形態では必要でない。

レーザービームを試料に合焦させる顕微鏡対物レンズが、試料から出てくる観察ビーム経路のための（従来の）顕微鏡対物レンズとして同時に具体化されると、特に有益である。言い換えれば、少なくとも一部の試料を結像するための従来の顕微鏡対物レンズは、顕微解剖のためのレーザービームを合焦するために同時に使用される。

ＵＶＡ放射はＲＮＡ又はＤＮＡを破壊しないので、ＵＶレーザー、特にＵＶＡレーザーはレーザー光源として使用される。これは、遺伝子工学調査には重大である。同時に、高レベルのレーザーエネルギーがＵＶＡスペクトル領域で利用可能になる。また、赤外及び可視スペクトル領域で放射するＩＲ又はＶＩＳレーザーもそれぞれ好適である。

例えば、ＵＶレーザーにより作動するレーザー顕微解剖装置には、所謂「ＵＶオフセット」光学系が存在し、可視スペクトル領域内にある顕微鏡焦点にレーザー焦点を適合させる。このオフセット光学系は本発明のために使用されてもよい。この目的のために、該光学系は焦点補正のためでなくＺ方向にレーザー焦点を移動させるために使用される。

レーザービームガイド装置が試料を照明するための（入射光）装置と少なくとも部分的に組み合わされると有利である。この種の装置は、例えば特許文献１と特許文献２から知られており、この点についてはこれらの文献が明示的に開示している。

本発明は、再び特許文献１から知られているように直立顕微鏡への利用に限定されず、従来技術から公知のものと同様に倒立顕微鏡に同様の方法で適している。

本発明は、厚い及び／又は水性の試料を切断するのに顕著に好適である。厚い試料は一般的に、３０μｍより大きい切断すべき層厚さを有する。本発明はもちろん薄い試料に対しても使用できる。導入部で既に議論したように、水性の試料は脱水されていない又は再水和された試料である。この種の水性の試料は一般的に３０％以上の含水量を有する。本発明によれば、３次元切断線は関連する試料を通って配置され得る。結局、幾つかのケースでレーザービームが繰り返し沿って通る単一の切断線を用いて関連する試料領域を解剖しようと試みる必要はもはやない。これに関連する不都合は前述したとおりである。

試料から任意の所望の輪郭の解剖片を切ることが可能である。簡単なケースでは、例えば、切断されている試料に適合する特定のピッチを有する螺旋又は渦巻き形の切断線を用いて、円柱形の解剖片が切り出されてもよい。円錐形又は他の形状の解剖片も本発明を用いて作られてもよい。可能な形状についての唯一の制限は、次の調査に利用できるように、解剖片がその周囲から分離されなければならないことである。

本発明はさらに、試料に合焦されるレーザービームによって切断線に沿って試料を切断するための対応するレーザー顕微解剖方法であって、切断すべき試料は顕微鏡ステージにより担持され、レーザービームが顕微鏡対物レンズにより試料に合焦され、レーザービーム焦点が光学レーザー走査装置によって顕微鏡対物レンズの主軸と垂直なＸ−Ｙ方向に移動される方法に関する。Ｚ方向への顕微鏡ステージの付加的な変位及び／又はＺ方向にレーザービームのレーザービーム焦点を移動させる付加的な光学レーザー焦点シフト装置によって、本発明によれば、レーザービーム焦点がＸ−Ｙ−Ｚ方向に３次元切断線に沿って移動し得る。

本発明に係る方法の詳細と実施形態について、本発明に係るレーザー顕微解剖装置に関連する上述の説明を参照されたい。これらの記述は同様に、再び詳細には議論しないクレームされている方法にも当てはまる。

本発明のさらなる利点と実施形態は明細書と付属の図面から明らかである。

上述の特徴と以下で説明する特徴は、示されたそれぞれの組み合わせだけでなく、本発明の範囲を逸脱せずに、他の組み合わせにおいて又は別個に使用可能である。

本発明を例示の実施形態に基づいて図面に図式に描き、図面に則して以下に詳細に説明する。

本発明の実施形態に係るレーザー顕微解剖装置の構造を概略的に示す図である。 光学レーザー焦点シフト装置の機構とともに、本発明に係るレーザー顕微解剖装置を有する顕微鏡を概略的に示す図である。 顕微鏡ステージ用のＺ変位装置の機構とともに、本発明に係るレーザー顕微解剖装置を有する図２の顕微鏡を概略的に示す図である。 本発明に係るレーザー顕微解剖装置により生成されるレーザービーム焦点の様々な移動方向（図４Ａ）と様々な切断線（図４Ｂ〜図４Ｄ）を示す図である。

図１は、顕微鏡３０に一体化されたレーザー顕微解剖装置１を示す。顕微鏡ステージが２で示され、顕微鏡対物レンズが８で示され、鏡筒が３４で示されている。この例示の実施形態によれば、レーザー顕微解剖装置１の要素は以下のとおりである。レーザービーム６を生成するレーザー光源５、偏向要素３１，３２、負のレンズ１９、正のレンズ１８、通常はフィルターの位置に応じて強度を低減するフィルターである、レーザービーム用の移動可能な（二重矢印）減衰器１７、（後に議論する）光学レーザー焦点シフト装置１５、開口装置３６、レーザー走査装置１０、及び別な偏向要素３３である。また、顕微鏡ステージ２をＺ方向（二重矢印）に移動させるために、顕微鏡ステージ２用のＺ変位装置４が描かれている。

顕微鏡対物レンズ８の主軸は９で示されている。Ｚ方向は主軸９と平行に延在している。「Ｘ−Ｙ方向」は主軸９に垂直な平面内の一方向を指す。該平面はここでは顕微鏡３０の顕微鏡ステージ２の水平面に一致する。レーザービーム伝播軸は６ａで示されている。レーザー顕微解剖装置１のレーザー偏向ユニットは１３で示されている。照明光源と、入射光装置の照明光学系の別な要素は描かれていない。レーザー顕微解剖装置の照明ビーム経路（図示せず）は、顕微鏡ステージ２上の、顕微鏡３０により結像される試料を照明するよう機能する。鏡筒３４上の対応するインターフェースを介して、特に切断走査の間に、試料が直接視覚により及び／又はカメラによって観察される。

図１に示したレーザー顕微解剖装置１に関する更なる詳細は、既に導入部で詳細に議論した本出願人の独国特許である特許文献１から集められる。特にそこに含まれているのは、図１に概略的に描かれたレーザー走査装置１０の構造及び操作方法に関する詳細な記述である。この装置は、（ここではレーザービーム伝播軸６ａに一致する）光軸１４に対して傾斜したプレートであって、その軸の周りに互いに独立して回転可能な２枚の厚いガラスウェッジプレート１１，１２を有する。これらガラスウェッジプレート１１，１２を通ってガイドされるレーザービーム６は、光軸１４に対して偏向角αだけ偏向される。この偏向角は、ガラスウェッジプレート１１及び／又は１２を回転させることで調節又は変更される。全ての偏向角αに対して顕微鏡８の対物レンズ瞳の中心が当たるように、ガラスウェッジプレート１１，１２の厚さ及び傾斜度は設計される。このレーザー走査装置１０の更なる利点は、顕微鏡ステージが切断操作の間固定されたままであるので、Ｘ−Ｙ走査ステージが顕微鏡ステージ２として使用される必要がないことである。これは、顕微鏡対物レンズ８を介して試料３上又は内に合焦されるレーザービーム６の動きが、レーザー走査装置１０によりＸ−Ｙ方向にのみ生じるからである。開口装置３６はレーザービーム開口を適切に調節する。図１に描かれているレーザー顕微解剖装置１の光学要素は、試料を切断するのに特に適切な好適な直径及び好適な強度でレーザービーム焦点７を試料にて利用可能にするように機能する。

概略的に描かれた光学レーザー焦点シフト装置１５は、レーザービーム伝播軸６ａの方向に移動可能な、（レンズ要素又はレンズ群を含むように意図されてもいる）少なくとも１つのレンズ１６を包含する。これに対応する動きが二重矢印によって示されている。この種のレンズの動きはレーザービーム焦点７をＺ方向に移動させるよう機能する。レーザービーム焦点７と試料３又は顕微鏡ステージ２の間の相対運動は、対応するＺ変位装置４による顕微鏡ステージ２のＺ変位によっても実現される。

最後に挙げられる、顕微鏡ステージ２に載置された試料３に対してレーザービーム焦点７を相対運動させるための能力は、図２及び図３に示されている。

顕微鏡３０（その基本的なビーム経路は既に議論した図１に描かれている）が、図２の左側に再び図式的に描かれている。光学レーザー焦点シフト装置１５は、顕微鏡対物レンズ８とその下に位置する試料３の一部とともに、図２の右側に拡大尺で概略的に描かれている。

図２は、顕微鏡ステージ２、対物レンズ８、鏡筒３４、図１に概略的に既に再現された要素を有する顕微鏡３０を示す。目視のための接眼レンズ及びカメラモニターが見てとれ、鏡筒３４に連結している。レーザー顕微解剖装置は１として全体を示されている。顕微鏡ステージ２上にある試料３から顕微解剖片を切断するのに使用されるレーザービームは、再び６で示されている。図２は単に、レーザービーム焦点７がＺ方向に移動するように、光学レーザー焦点シフト装置１５を制御する能力を説明するのに役立つ。

光学レーザー焦点シフト装置１５内に存在するレンズ１６は、レーザービーム伝播軸６ａに沿ってシフト可能に搭載されている。シフト（移動）は二重矢印の方向に実行される。レーザービーム６の焦点７は、シフトに依存して、Ｚ方向に（Ｚ方向の二重矢印参照）、特に試料３内でＺ方向に移動する。ここでは、円柱部分の試料のみ示されている。試料３は顕微鏡ステージ２上に配置されている。

所定の様式でＸ−Ｙ方向にレーザービーム焦点７を移動させる光学レーザー走査装置１０（図１）に制御をさらに適用することで、光学レーザー焦点シフト装置１５を制御することにより、Ｘ−Ｙ−Ｚ方向に試料３内で３次元切断線に沿ってレーザー焦点７を移動させることが可能である。この種の３次元切断線は、特に数学的意味で遮断されておらず、すなわち連続的である。

図３は、試料３内部でのレーザービーム焦点７のＺ移動のための別な可能性を示す。
この目的のために、関連する記載とともに図１，２の全体を参照されたい。図３は、右側に、顕微鏡ステージ２用のＺ変位装置４（図１参照）の操作方法を概略的に示す。

より良い理解のために、図２の光学レーザー焦点シフト装置１５は活性化されていない又は図３に存在しないと仮定する。試料３は顕微鏡ステージ２上に位置している。顕微鏡ステージ２はＺ変位装置４（図１参照）によってＺ方向に移動可能である。そこから生じる可能なシフト範囲は、図３の右側に（単に概略的に）描かれている。初期位置では、顕微鏡対物レンズ８により合焦されたレーザービーム６は、円柱部分のみ示された試料３の内部に進行すると考えられる。顕微鏡ステージ２がＺ方向に上方へ移動するとき、顕微鏡ステージ２は試料が３’で示された位置に達する。顕微鏡ステージ２がＺ方向に下方へ進行するとき、顕微鏡ステージ２は試料が３’’で示された位置に達する。図示された２つの位置３’，３’’では、レーザービーム焦点７は試料３の外側に位置している。結局、Ｚ方向の小さめのシフト距離に関連して、レーザービーム焦点７はＺ方向に試料３の高さ以上にシフトし得る。図１に関連して説明した光学レーザー走査装置１０の適用に伴い、試料３にＸ−Ｙ−Ｚ方向の３次元切断線を生成することが可能である。繰り返すが、この切断線は特に遮断されておらず、すなわち連続的である。

最後に、図２及び図３からの２つの機構が一緒に利用されてもよい。適用例と光学構造に依存して、２つのＺシフト能力のうちの１つは、細かい又は粗いＺ変位のためにそれぞれ使用され得る。さらに、２つのＺシフト能力は互いに補足し合う。例えば、一方の能力の変位範囲が消耗された場合、他方の能力が利用されて変位範囲が拡張される。

図４は、３つの空間方向Ｘ，Ｙ，Ｚ、顕微鏡対物レンズ８、レーザービーム焦点７に加えてレーザービーム、及びレーザー焦点７の可能な移動方向を再び概略的に示している。先の図では、Ｘ−Ｙ方向は顕微鏡ステージ２の水平面内の方向に一致したのに対して、Ｚ方向はそれと垂直な、顕微鏡対物レンズ８の主軸９と平行に延在する方向に一致した（図１参照）。図４Ａの３つの矢印は、３次元空間内でのレーザービーム焦点７の可能な移動方向を示す。つまり、２つの湾曲矢印はＸ−Ｙ方向の移動を概略的に示すのに対し、二重矢印はＺ方向の移動を示す。図４Ｂ〜４Ｄに描かれた切断線２０はこれらの移動方向から生成される。ここで描かれた切断線２０は特に、試料からチューブ又は円柱セグメントを解剖するために機能する。特に組織は厚く、ここで「厚い」はＺ方向の寸法を意味する。切断線２０は３０μｍより大きい寸法に特に好適である。

図４Ｂでは、切断線は様々なＺ座標でＸ−Ｙ方向のそれぞれの円を描いており、個々の円はＺ座標を変化させることで互いに接続している。切断線２０全体が進行している間、レーザービーム焦点７はアクティブに切断する。図４Ｂでは、略四分円の回転によって次の平面へのＺ方向の平面の変化が生じる。図４Ｃは、ここでは完全な螺旋移動によって平面の変化が生じることを除いて、同様の切断線を示す。

螺旋移動しか使用されない場合、切断線２０は図４Ｄに描かれるようになる。切断線２０の勾配は図４Ｄにおいて自由に選択可能であり、また移動の間変更可能である。

原則として、３次元空間内の任意の形状を有する切断線２０が生成可能である。例えば、錐体、楕円面、正方形及びこれら基本図形の組み合わせが可能である。

図４Ｂから図４Ｄに描かれた切断線は特に、厚い及び／又は水性の試料３から円柱形セグメントを解剖するのに適している。顕微解剖は特に比較的低いレーザーエネルギーを用いて実行され得る。切断線２０に沿うＺ方向の試料の結合が非常に低く、周囲のサンプルから解剖片を切り離したり、それが重力に反応して落ちたりできるように、エネルギーの大きさは設定されるべきである。

１ レーザー顕微解剖装置
２ 顕微鏡ステージ
３，３’，３’’ 試料
４ Ｚ変位装置
５ レーザー光源
６ レーザービーム
６ａ レーザービーム伝播軸
７ レーザービーム焦点
８ 顕微鏡対物レンズ
９ 顕微鏡対物レンズの主軸
１０ レーザー走査装置
１１ ガラスウェッジプレート
１２ ガラスウェッジプレート
１３ レーザー偏向ユニット
１４ 光軸
１５ 光学焦点シフト装置
１６ レンズ
１７ 減衰器
１８ レンズ
１９ レンズ
２０ 切断線
３０ 顕微鏡
３１ 偏向要素
３２ 偏向要素
３３ 偏向要素
３４ 鏡筒
３６ 開口装置

Claims (12)

1. 切断すべき試料（３）を担持する顕微鏡ステージ（２）、
   レーザービーム（６）を生成するレーザー光源（５）、
   レーザービーム（６）を試料（３）に合焦させる顕微鏡対物レンズ（８）、及び
   レーザービーム焦点（７）が顕微鏡対物レンズ（８）の主軸（９）と垂直なＸ−Ｙ方向に移動するように、レーザービーム（６）を偏向させる光学レーザー走査装置（１０）
   を有するレーザー顕微解剖装置（１）において、
   Ｚ方向に顕微鏡ステージ（２）を移動させる顕微鏡ステージ（２）用のＺ変位装置（４）及び／又はＺ方向にレーザービーム（６）のレーザービーム焦点（７）を移動させる光学レーザー焦点シフト装置（１５）が設けられ、
   レーザービーム焦点（７）がＸ−Ｙ−Ｚ方向に３次元切断線（２０）に沿って試料（３）内を移動するように、顕微鏡ステージ用のＺ変位装置（４）及び／又は光学レーザー焦点シフト装置（１５）が光学レーザー走査装置（１０）とともに制御可能であることを特徴とするレーザー顕微解剖装置。
2. 光学レーザー走査装置（１０）が、レーザービーム伝播軸（６ａ）に対して傾斜したプレートであって、該軸の周りに互いに独立して回転可能な２枚の厚いガラスウェッジプレート（１１，１２）を有することを特徴とする請求項１に記載のレーザー顕微解剖装置。
3. ガラスウェッジプレート（１１，１２）の厚さ及び傾斜の結果、レーザービーム（６）が、光学レーザー走査装置（１０）からの出口において顕微鏡対物レンズ（８）の主軸（９）に対してラテラルビームオフセット（Δ）を有するように、ガラスウェッジプレート（１１，１２）は設計され、レーザービーム（６）の全ての偏向に対して顕微鏡対物レンズ（８）のレンズ瞳の中心が当たることを特徴とする請求項２に記載のレーザー顕微解剖装置。
4. 顕微鏡ステージ（２）が切断の際Ｘ−Ｙ方向に対して固定して配置されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のレーザー顕微解剖装置。
5. レーザービーム（６）を試料（３）上に合焦させる顕微鏡対物レンズ（８）が、試料（３）から出てくる観察ビーム経路のための顕微鏡対物レンズとして同時に具体化されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のレーザー顕微解剖装置。
6. 光学レーザー焦点シフト装置（１５）は、レーザービーム伝播軸（６ａ）の方向にシフト可能な少なくとも１つのレンズ（１６）を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のレーザー顕微解剖装置。
7. レーザー光源（５）はＵＶ，ＩＲ又はＶＩＳレーザーであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のレーザー顕微解剖装置。
8. 顕微鏡対物レンズ（８）及び顕微鏡ステージ（２）は倒立顕微鏡又は直立顕微鏡（３０）の構成要素であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のレーザー顕微解剖装置。
9. 切断すべき試料（３）が厚い及び／又は水性の試料であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のレーザー顕微解剖装置。
10. 試料（３）に合焦されるレーザービーム（６）によって切断線（２０）に沿って試料（３）を切断するためのレーザー顕微解剖方法であって、
    切断すべき試料（３）は顕微鏡ステージ（２）により担持され、
    レーザービーム（６）が顕微鏡対物レンズ（８）により試料（３）に合焦され、及び
    レーザービーム焦点（７）が光学レーザー走査装置（１０）によって顕微鏡対物レンズ（８）の主軸（９）と垂直なＸ−Ｙ方向に移動される方法において、
    さらに、Ｚ方向への顕微鏡ステージ（２）の変位及び／又はＺ方向にレーザービーム（６）のレーザービーム焦点（７）を移動させる光学レーザー焦点シフト装置（１５）によって、レーザービーム焦点（７）がＸ−Ｙ−Ｚ方向に３次元切断線（２０）に沿って移動することを特徴とするレーザー顕微解剖方法。
11. 顕微鏡ステージ（２）が切断の際Ｘ−Ｙ方向に対して固定して配置されていることを特徴とする請求項１０に記載のレーザー顕微解剖方法。
12. 光学レーザー焦点シフト装置（１５）は、レーザービーム伝播軸（６ａ）の方向にシフト可能な少なくとも１つのレンズ（１６）を有し、該レンズはレーザービーム伝播軸（６ａ）の方向にシフトし、レーザービーム焦点（７）をＺ方向に移動させることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のレーザー顕微解剖方法。

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