JP3636683B2 - レーザーマイクロジセクション方法および装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料ホールダに取り付けられている試料の試料観察・検査領域をレーザーマイクロジセクション(Laser-Mikrodissektion)する方法及び装置に関するものである。
なお、以下の説明では、「試料観察・検査領域」とは試料の観察、検査の対象になる領域ばかりでなく、広い意味で観察者または検査者等の利用者の関心の対象となる領域を意味するものとする。
【０００２】
【従来の技術】
生物学および医学の分野では、通常平坦な試料（たとえば細胞或いは組織切片）から微細なフォーカシングされたレーザー光線を用いて小片を切り取る方法をレーザーマイクロジセクションという。切り取られた小片は、その後生物学的または医学的検査（たとえば組織学的検査）に提供される。
【０００３】
米国特許第５９９８１２９号公報はこの種のレーザーマイクロジセクション方法および装置を記載している。試料は位置固定の平らな担持体上に配置され、たとえば実験室で汎用されているスライドガラスを介して固定されたポリマー担持フォイル上に配置されている。上記公報に記載されている方法は２つのステップで行なわれる。第１のステップでは、レーザー光線により、試料の試料観察・検査領域（その上にたとえば選択された細胞群或いは組織学的切片がある）が切り取られる。このため、レーザー光線の切断線は試料観察・検査領域のまわりに閉じた曲線を描く。このステップの実施後、切り取られた試料観察・検査領域はまだその基盤上にあり、すなわち基盤に付着している。このため、第２ステップで補助的なレーザーショットを試料観察・検査領域へ指向させ、これにより試料観察・検査領域をレーザー光線の方向へ投擲させて捕獲容器に捕獲させる。
【０００４】
この方法の欠点は、方法の第１ステップの際に生じる。切断線が閉じる直前の段階では、切り取られる試料観察・検査領域は幅狭のウェブだけで周囲の試料と結合されているにすぎない。切断のこの段階では、ウェブへの電気的な負荷または機械的な応力のために、依然に切り取った試料観察・検査領域が押しやられることがあり、すなわちレーザー光線の合焦面から逸脱したり、残っている担持フォイルの背後へ押しやられることがある。押しやられた試料観察・検査領域の切片の形成は不可能である。というのは、試料観察・検査領域の折り返し部分が切断線のなかへ突出し、よってさらに切断しようとすると損傷するからである。したがって、切り取られた試料観察・検査領域のレーザーショットによる搬送も困難であり、或いは不可能である。なぜなら、レーザーショットを作用させるための十分な作用面がないからである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、レーザーマイクロジセクション方法及び装置において、試料観察・検査領域を試料から合目的に切り離すことができ、試料観察・検査領域の折り返しを阻止する前記方法および装置を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、方法においては、
ａ）試料観察・検査領域を取り囲みウェブにより中断されている切断線に沿ってレーザー光線によりウェブを含むパーフォレーションを形成するステップであって、パーフォレーションが、切断線を中断させている少なくとも２つのウェブを有し、これらのウェブが、試料観察・検査領域を、該観察・検査領域を取り囲んでいる試料と接続させている前記ステップと、
ｂ）試料観察・検査領域に指向されデフォーカスされた１つのレーザーパルスによりパーフォレーションのウェブを切除して、試料観察・検査領域を試料から切り離すステップと、
を含んでいることを特徴とするものである。
【０００７】
また装置においては、顕微試料をレーザー切断するための装置であって、試料観察・検査領域を備えた試料を観察するための少なくとも１つの対物レンズにして、光軸を決定している前記少なくとも１つの対物レンズを備えた顕微鏡と、レーザー光線を生じさせるレーザーと、レーザー光線を対物レンズにカップリングさせる少なくとも１つの光学系とを有している前記装置において、
ａ）顕微鏡に、レーザー光線と試料との間に相対運動を生じさせるための切断線制御ユニットが付設されていること、
ｂ）試料観察・検査領域を取り囲みウェブによって中断されている切断線に沿ってレーザー光線によりウェブを含むパーフォレーションを形成する手段が設けられ、パーフォレーションが少なくとも２つのウェブを有し、これらのウェブが、試料観察・検査領域を、該観察・検査領域を取り囲んでいる試料と接続させていること、
ｃ）パーフォレーションのウェブを切除する切除手段が設けられ、該切除手段により、試料観察・検査領域に指向される１つのレーザーパルスで試料観察・検査領域を試料から切り離すようにしたこと、
を特徴とするものである。
【０００８】
本発明による方法においては、試料観察・検査領域が切り取られる観察対象試料または検査対象試料は、非常に薄いプラスチックフィルムにプレパラート化される。このプラスチックフィルムの厚さは１μｍないし２μｍのオーダーである。たとえばPETフィルムが使用される。しかし、PENフィルムを使用すれば最善の切断結果が得られる。これにより、幅狭で安定なウェブを生じさせることが可能である。本発明に対し特に好ましいのは、ほぼ１μm幅のウェブである。プラスチックフィルムは公知の態様で試料ホールダを介して緊張状態で固定される。これはたとえば実験室で汎用されているスライドガラスであってよい。しかし、他の試料ホールダ（形状、材料）も可能である。試料ホールダは、試料の種々の領域を観察し、選定するのを可能にするXYテーブル上にある。本発明による装置は、通常どおり、切り取った試料観察・検査領域を試料の近くで捕獲する少なくとも１つの容器を有している。
【０００９】
本発明による装置の１実施形態によれば、位置固定のレーザー光線が設けられ、切断線制御ユニットは移動可能なXYテーブルを有し、XYテーブルはパーフォレーションを作成するときに試料を位置固定のレーザー光線に対し相対的に移動させる。この場合、正確な切断線を生じさせるために、XYテーブルの位置決め精度に対しては非常に高度な要求が立てられる。XYテーブルはモータで移動させるのが有利である。
【００１０】
本発明による装置の他の実施形態によれば、切断性制御ユニットはレーザースキャン装置を有している。レーザースキャン装置は、パーフォレーションの作成時にレーザー光線を位置固定の試料に対し相対的に移動させる。このため、パーフォレーション作成時、試料ホールダおよび試料を載置したXYテーブルは移動しない。パーフォレーションの切断線は、試料を介してレーザー光線を偏向させることで生じる。
【００１１】
装置の実施形態において、パーフォレーションを形成するための手段が、レーザーの作動パラメータを制御するレーザー制御ユニットを有しているのが特に有利である。これらの作動パラメータはたとえばレーザー出力、レーザーパルス時間、或いはレーザー切断幅である。パーフォレーション形成手段は、補助的に、レーザーのためのオートフォーカス装置を有していてよい。これによりパーフォレーション過程の自動化が可能である。
【００１２】
さらに、パーフォレーションのウェブを切除する手段は、切断線制御ユニットとレーザー制御ユニットを制御するためのパーフォレーション制御ユニットを有していてよい。さらに、パーフォレーション制御ユニットは、補助的にレーザーをデフォーカシングするための手段を有していてもよい。この場合、装置の利用者は、ウェブを切除するためにレーザーを手動でデフォーカスさせる必要はない。このデフォーカシングは、本発明による方法の重要な部分である。というのも、これによりレーザー光線が拡大され、そのエネルギーがより大きな面に配分されるからである。これにより試料観察・検査領域で切断は行なわれず、レーザーパルスはウェブを切除するために使用される。
【００１３】
引き続き、他の試料観察・検査領域をレーザーマイクロジセクションするため、オートフォーカス装置を用いて非常に迅速に且つ確実にレーザーのフォーカシングを行なうことができる。これにより方法全体の自動化が可能である。
【００１４】
本発明による装置の他の実施形態では、利用者により切断線を選択するための手段または切断線とウェブの位置を選択するための手段が設けられている。付加的に、利用者によりウェブの幅を選択しウェブの位置を選択する手段を設けてもよい。このように選択ができることにより、利用者はパーフォレーションを形成させる前に正確な試料観察・検査領域を合目的に選択することができ、同時に試料の重要な部位を損傷から保護することができる。たとえば、ウェブの領域には試料観察・検査領域とこれを取り囲んでいる試料との間に亀裂構造が生じるが、利用者はたとえばウェブを試料の問題とならない細胞構造部に設定できるので、試料観察・検査領域内の問題となる細胞の観察・検査構造部はこの種の亀裂構造から保護される。
【００１５】
本発明による方法の利点は、切断時の試料観察・検査領域の折り返しが阻止されていることである。これにより試料の支障のない切断が可能である。さらに、切り取られた試料観察・検査領域の確実な取り出しが可能である。本発明による方法および装置の自動化は、実験室での慣例的な作業での適用を可能にする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施形態を添付の図面を用いて詳細に説明する。
図１はレーザー切断装置を示すもので、レーザー切断装置は、位置固定のレーザー光線と、これに対し相対的に移動せしめられる試料とで作動する。レーザー切断装置は顕微鏡１を有し、顕微鏡１は、モータで走行可能なXYテーブル２を備えている。XYテーブル２は試料ホールダ３を受容するために用いる。試料ホールダ３上には、検査対象または切断対象である試料４が載置されている。さらに照明系５とレーザー６が設けられている。レーザー６は、試料４を切断するために試料４にフォーカシングされるレーザー光線７を生じさせる。XYテーブル２は切断線制御ユニットとして用いられ、切断過程の間にレーザー光線７と試料４との間に相対運動を生じさせる。
【００１７】
図示した顕微鏡１は透過光顕微鏡であり、照明系５はXYテーブル２と試料４の下方に位置するように顕微鏡スタンド８に配置されている。顕微鏡１の少なくとも１つの対物レンズ９はXYテーブル２と試料４の上方に配置されている。対物レンズ９は光軸１０を決定し、光軸１０は照明系５の光軸と整列している。
【００１８】
ここで説明する配置構成では、試料４は透過光照明で観察される。レーザー切断を倒立顕微鏡を用いて行なってもよく、この場合には照明系５はXYテーブル２の上方に配置され、少なくとも１つの対物レンズ９はXYテーブル２の下方に配置される。
【００１９】
照明系５から放射された光は、集光器１１により下側から、XYテーブル２上に配置されて試料４を担持している試料ホールダ３のほうへ指向せしめられる。試料４を透過した光は顕微鏡１の対物レンズ９へ達する。顕微鏡１の内部において光は図示していないレンズおよびミラーを介して顕微鏡１の少なくとも１つの接眼レンズ１２へ誘導され、接眼レンズ１２を通して観察者はXYテーブル１上に配置されている試料４を観察することができる。
【００２０】
顕微鏡１の顕微鏡スタンド８内には、対物レンズ９の光軸１０上に光学系１３が設けられている。光学系１３はたとえば二色性スプリッターである。光学系１３を複数個の光学要素から構成するようにしてもよい。このようなケースは、レーザー光線７を複数回反転させねばならないような場合である。さらにレーザー光線７内には絞り１４が設けられ、レーザー光線７の径を適当に制限できるようになっている。絞り１４はたとえば固定絞りとして構成されていてよい。有利な実施形態では、複数個の固定絞り１４をレボルバーディスクまたはリニアスライダの上に配置して、これら固定絞りの１つをその都度必要な絞り１４として光路内へ挿入するようにしてもよい。レーザー光線７内への挿入は操作者が手動で行なうか、或いはモータで行なってもよい。
【００２１】
ここに図示した実施形態では、絞り１４は可変絞りとして構成され、たとえばアイリス絞りとして構成され、その径は絞りモータ１５を介して制御される。絞りモータ１５はコンピュータ１６から、必要とする絞り径を設定するために必要な制御信号を得る。
【００２２】
顕微鏡１はさらにカメラ１７を備えている。カメラ１７は、切断対象である試料４の像を撮影する。この像は、コンピュータ１６と接続されているモニター１８で表示することができる。コンピュータ１６とカメラ１７とモニター１８から成っているシステムは、本実施形態ではパーフォレーションを作成するための手段である。このシステムを使用すると、レーザー６で行なわれる切断過程を観察し、監視することができる。すなわちコンピュータ１６はレーザー６に、レーザーパルスを発生させ、レーザー出力を制御するためのトリガー信号を送り、絞りモータ１５を制御し、レーザー６のためのオートフォーカス装置（図示せず）を制御する。
【００２３】
さらに、モニター１８上では、試料４の、切断対象である試料観察・検査領域を、マウスで移動させて、これにより所望の切断線を決定することができる。ウェブ(Steg)の位置は、コンピュータ１６内のソフトウェアにより自動的に決定される。しかしながら、操作者がウェブの位置と幅をマウスクリックにより予め決定できるようにするのも有利である。このようにすると、次の切除段階で裂け目が生じてもかまわないような領域にウェブを設定でき、試料観察・検査領域の情報を破壊させることがない。次に、このようにして特徴づけた切断線に沿って切断過程をレーザー６を用いて行ない、所望のパーフォレーションを作成する。レーザー光線７の径は、パーフォレーションの作成の間一定であるのが有利である。
【００２４】
ウェブを切除する手段として、本実施形態では、レーザー６を自動的にデフォーカスするための制御部がコンピュータ１６内に組み込まれて設けられている。補助的に、コンピュータ１６内のソフトウェアにより、予め選定した切断線から、試料観察・検査領域の中心を決定することができる。その後、XYテーブル2を移動させて、ウェブの切除の際に、デフォーカスされた固定のレーザー光線７を上記算出した中心に指向させることができる。
【００２５】
試料４の下方には、切り取った試料観察・検査領域を捕獲するための少なくとも１つの捕獲容器１９が配置されている。
次に、図２を用いて本発明による方法を説明する。
【００２６】
図２は、多数の細胞２２を備えた試料４のカメラ画像である。試料４のほぼ中心には試料観察・検査領域２３があり、試料観察・検査領域２３内には変異性細胞構造２４、たとえば癌細胞と考えられる細胞構造がある。この試料観察・検査領域２３を試料４から取り出して、さらに検査を行うものである。
【００２７】
このため利用者は、適当なソフトウェアを使用して、作成するパーフォレーションのための所望の基準切断線をコンピュータのマウスを用いてカメラ画像内にマーキングする。さらに、パーフォレーションのウェブの数量と位置をマーキングする。
【００２８】
レーザー光線７の実際の設定切断幅に応じて、コンピュータ１６は、所定の基準切断線に対し、試料４上でのレーザー光線の基準位置の数量を算出する。この場合、レーザー光線７の互いに連なっている切断位置は所望の切断線を生じさせる。
【００２９】
パーフォレーションを作成するため、テーブルを歩進的に移動させて、レーザー光線７が上記算出した基準位置において順次試料４にあたるようにする。各基準位置においては、コンピュータ１６によりそれぞれ１つのトリガー信号が生成されてレーザー６に送られ、レーザー６から対応的にレーザーパルスが放射される。このようにして、レーザー６を用いて、試料観察・検査領域２３の周囲に図示したようなパーフォレーションを生成する。パーフォレーションはウェブ２６,２７,２８によって中断された切断線２５からなっている。試料観察・検査領域２３は３つのウェブ２６,２７,２８だけで周囲の試料４と接続されているにすぎない。
【００３０】
最後の方法ステップで、これらのウェブ２６,２７,２８を、試料観察・検査領域２３の中心に指向されているレーザーパルスを用いて切除する。このようにしてジセクションした試料観察・検査領域２３は、その下に配置されている捕獲容器（図２には図示せず）のなかに落下する。試料観察・検査領域内での生物学的変化をできるだけ避けるには、ウェブ２６,２７,２８を切除するためのレーザーパルスは明確にデフォーカスされたレーザー光線７で実施するのが有利である。特に、拡大されたレーザー光線により、試料観察・検査領域内部でのパーフォレーションが阻止される。
【００３１】
図３は、切断時に、固持されている試料を介してレーザー光線を移動させる本発明による方法を実施するための本発明によるレーザーマイクロジセクション装置を示すものである。
【００３２】
レーザーマイクロジセクション装置は、移動可能なXYテーブル２を備えた顕微鏡１を有し、XYテーブル２上に試料ホールダ３が配置されている。試料ホールダ３の下面には、切断対象である試料４がある。XYテーブル２の下には、試料４を照明する照明系５と集光器１１が配置されている。XYテーブル２は、切断過程時には水平方向に移動せず、すなわちx方向とy方向には移動しない。試料４の下方には、切り取られた試料観察・検査領域を捕獲するための少なくとも１つの捕獲容器１９が配置されている。
【００３３】
レーザー６（この実施形態ではUVレーザーである）からはレーザー光線７が出て、レーザー光線７は照明光路２０にカップリングされる。照明光路２０内にはレーザースキャン装置３１が配置されている。レーザー光線７はレーザースキャン装置３１を通過し、光学系１３を介して対物レンズ９に達する。対物レンズ９はレーザー光線７を試料４上に合焦させる。光学系１３は、試料４から対物レンズ９を通って出た結像光路２１を少なくとも１つの接眼レンズ１２へ到達させる二色性スプリッターとして構成するのが有利である。
【００３４】
レーザースキャン装置３１の調整、よって試料４上でのレーザー光線７の位置調整は、本実施形態では、レーザースキャン装置３１に付設されているモータ３２と、制御ユニット３３と、コンピュータ１６とを含んでいるパーフォレーション作成手段を用いて行なう。モータ３２は制御ユニット３３と接続されている。制御ユニット３３はモータ３２を制御するための制御信号を送る。制御ユニット３３は、モニター１８に接続されているコンピュータ１６と接続されている。
【００３５】
レーザースキャン装置３１自身は、切断過程の間にレーザー光線７と試料４との間に相対運動を生じさせる切断線制御ユニットとして用いる。レーザー光線７のフォーカシングは、XYテーブル２を手動で高さ方向に移動させ、これと同時に利用者がカメラ画像をビジュアルコントロールすることで行なう。しかし、レーザー光線７のためのオートフォーカス装置（図示せず）を有する装置の実施形態のほうが操作性がある。
【００３６】
レーザースキャン装置３１を制御することにより、レーザースキャン装置３１の出力部にレーザー光線７が異なる偏向角度で現れる。この場合、この偏向角度を変えることによって、レーザー光線７を対物レンズ９の視野範囲内にある試料４の任意の位置へ案内することができる。レーザースキャン装置３１を適宜制御することにより、試料４上に切断線が生成される。試料４の切り取られた部分は、試料４の下方においてXYテーブル２上に配置されている捕獲容器１９に落下する。
【００３７】
モニター１８には、カメラ１７によって撮影された試料４の画像が表示される。試料観察・検査領域を切り離す準備段階として、コンピュータのマウスを用いて、または他の任意のカーソル制御装置を用いて、モニター１８上で切断線を定義することができる。さらにコンピュータ１６はレーザー光源６と接続されており、切断を実施する場合にだけこれにトリガー信号を送って、レーザーパルスを発生させる。
【００３８】
試料でのレーザーの切断幅は、たとえばレーザー出力およびレーザー光線７のアパーチャーのようなレーザーパラメータに依存している。この切断幅は予め決定されるか、或いはレーザーパラメータに依存してコンピュータ１６内のテーブルにファイルされている。実際に設定された切断幅に応じて、決定された基準切断線に対し、試料４上でのレーザー光線の基準位置の数量が算出され、その際レーザー光線７の互いに連なっている切断位置は所望の切断線を生じさせる。
【００３９】
次に、試料４上の基準位置に順次レーザースキャン装置３１を接近させる。試料４上でのレーザー光線の基準位置がレーザースキャン装置３１を用いて準備されたとき、または設定されたときに、コンピュータ１６はレーザー光源６にトリガー信号を送ってレーザーパルスを発生させる。このようにして歩進的に切断線が生成される。
【００４０】
第２の方法ステップでは、ウェブがただ１つのレーザーパルスで切除される。ウェブを切除するための手段としては、この実施形態では、コンピュータに組み込まれている、レーザー６を自動的にデフォーカシングさせるための制御部が設けられている。補助的に、コンピュータ１６内のソフトウェアにより、予め選定した切断線から、試料観察・検査領域の重心を決定することができる。その後、XYテーブル2を移動させて、ウェブの切除の際に、デフォーカスされた固定のレーザー光線７を上記算出した重心に指向させることができる。
【００４１】
以上、本発明を上記実施形態に関し説明したが、請求の範囲の権利範囲を逸脱することなく、変更、改変を行なえることは当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】レーザー光線を位置固定したレーザー切断装置を示す図である。
【図２】パーフォレーションと試料観察・検査領域を併せて図示した試料を示す図である。
【図３】レーザー光線可動型のレーザー切断装置を示す図である。
【符号の説明】
１ 顕微鏡
２ XYテーブル
３ 試料ホールダ
４ 試料
５ 照明系
６ レーザー
７ レーザー光線
８ 顕微鏡スタンド
９ 対物レンズ
１０ 光軸
１１ 集光器
１２ 接眼レンズ
１３ 光学系
１４ 絞り
１５ 絞りモータ
１６ コンピュータ
１７ カメラ
１８ モニター
１９ 捕獲容器
２０ 照明光路
２１ 結像光路
２２ 細胞
２３ 試料観察・検査領域
２４ 変異性細胞構造
２５ 切断線
２６,２７,２８ ウェブ
３１ レーザースキャン装置
３２ モータ
３３ 制御ユニット

Claims (4)

1. 試料ホールダ（３）に取り付けられている試料（４）の試料観察・検査領域（２３）をレーザーマイクロジセクションする方法において、
   ａ）試料観察・検査領域（２３）を取り囲みウェブ（２６,２７，２８）により中断されている切断線（２５）に沿ってレーザー光線（７）によりウェブ（２６，２７，２８）を含むパーフォレーションを形成するステップであって、パーフォレーションが、切断線（２５）を中断させている少なくとも２つのウェブ（２６,２７,２８）を有し、これらのウェブが、試料観察・検査領域（２３）を、該観察・検査領域を取り囲んでいる試料（４）と接続させている前記ステップと、
   ｂ）試料観察・検査領域（２３）に指向されデフォーカスされた１つのレーザーパルスによりパーフォレーションのウェブ（２６,２７,２８）を切除して、試料観察・検査領域（２３）を試料（４）から切り離すステップと、
   を含んでいることを特徴とする方法。
2. 顕微試料（４）をレーザー切断するための、請求項１に記載の方法を実施するための装置であって、試料観察・検査領域（２３）を備えた試料（４）を観察するための少なくとも１つの対物レンズ（９）にして、光軸（１０）を決定している前記少なくとも１つの対物レンズ（９）を備えた顕微鏡（１）と、レーザー光線（７）を生じさせるレーザー（６）と、レーザー光線（７）を対物レンズ（９）にカップリングさせる少なくとも１つの光学系（１３）とを有している前記装置において、
   ａ）顕微鏡（１）に、レーザー光線（７）と試料（４）との間に相対運動を生じさせるための切断線制御ユニット（２；３１）が付設されていること、
   ｂ）試料観察・検査領域（２３）を取り囲みウェブ（２６,２７,２８）によって中断されている切断線に沿ってレーザー光線（７）によりウェブ（２６,２７,２８）を含むパーフォレーションを形成する手段（１６,１７,１８；１６,１７,１８,３１,３２）が設けられ、パーフォレーションが少なくとも２つのウェブ（２６,２７,２８）を有し、これらのウェブが、試料観察・検査領域（２３）を、該観察・検査領域を取り囲んでいる試料（４）と接続させていること、
   ｃ）パーフォレーションのウェブを切除する切除手段が設けられ、該切除手段により、試料観察・検査領域（２３）に指向される１つのレーザーパルスで試料観察・検査領域（２３）を試料（４）から切り離すようにしたこと、
   を特徴とする装置。
3. レーザー光線（７）が位置固定され、切断線制御ユニットが移動可能なXYテーブル（２）を有し、XYテーブル（２）はパーフォレーションを形成するときに試料（４）を位置固定のレーザー光線（７）に対し相対的に移動させることを特徴とする、請求項２に記載の装置。
4. 切断線制御ユニットがレーザースキャン装置（３１）を有し、レーザースキャン装置（３１）は、パーフォレーションを形成するときにレーザー光線（７）を位置固定の試料（４）に対し移動させることを特徴とする、請求項２に記載の装置。

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