JPH11242164A

JPH11242164A - レーザ走査型顕微鏡及びレーザ走査光学系の調整方法

Info

Publication number: JPH11242164A
Application number: JP10057341A
Authority: JP
Inventors: Kei Horie; 圭堀江
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1998-02-24
Filing date: 1998-02-24
Publication date: 1999-09-07

Abstract

(57)【要約】【課題】レーザ走査光学系において簡易・確実に光軸
調整を行うこと。【解決手段】レーザ光源５１４からのレーザ光をレー
ザ走査光学系５１５を介して光学顕微鏡の光路に導き、
対物レンズ５０５を介して試料に照射する。ビームスプ
リッタ５０７は、対物レンズ５０５を通過した透過照明
系５２６，５０２，５０３からの照明光と、レーザ走査
光学系５１５を通過したレーザ光とを同一光路に合成す
る。ビームスプリッタ５０７で重ね合わされた照明光と
レーザ光とは、レンズ５１０で集光された後、ＣＣＤ５
１６に投影される。制御回路５１７は、ＣＣＤ５１６か
らの信号に応じて、照明光とレーザ光との焦点面内にお
ける位置ずれとレーザ光のスポット径との少なくとも一
方を検出し、ガルバノミラー５１５の角度やリレーレン
ズ５１５の位置を調整してレーザ走査光学系の光軸調整
を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ走査型顕微
鏡及びそのレーザ走査光学系の調整方法に関し、特に、
顕微鏡の透過照明光学系を利用したレーザ走査型顕微鏡
の光学調整に関する。

【０００２】

【従来の技術】図１にレーザ走査型顕微鏡のレーザ光走
査部の概略図を示す。レーザ光源１１５から出射された
レーザ光１１６はビームエキスパンダ１１４によって光
束が広げられたのちスキャナミラー１１３で反射され、
リレーレンズ１１１、１１０によって顕微鏡（ここで
は、倒立型顕微鏡）の本体部１１７に導入される。この
レーザ光１１６は対物レンズ１０７によって試料面１０
６に照射されるが、ここでスキャナミラー１１３の面を
傾けることにより、試料面上１０６でビーム１１６を２
次元的に走査することが出来る。スキャナミラーは通
常、水平走査用と垂直走査用の２つが接近して配置され
ているが、図１においては便宜上１つのミラーとして図
示している。

【０００３】さて、図１をもとにレーザ走査型顕微鏡に
おける光学調整を考えると、この調整ではまず顕微鏡部
の対物レンズ１０７の光軸中心にレーザ光１１６の光軸
中心（スキャン停止時）をぴったり合致させることが必
要である。また対物レンズ１０７の瞳面１０８はミラー
１０９とリレーレンズ１１０、１１１によって位置１１
２に投影されるが、スキャナミラー１１３は対物レンズ
１０７の瞳面１０８と共役になるこの位置１１２になけ
ればならない。

【０００４】このような条件を満たさない場合、レーザ
光１１６をスキャンさせたときにある角度によってはレ
ーザ光１１６が対物レンズ１０７の瞳面（入射瞳）１０
８によってケラレてしまい、試料面１０６に充分な光を
照射することが出来ない。その結果、視野周辺に行くに
従って画像が暗くなってしまう（シェーディング）。ま
た対物レンズ１０７の中心がレーザ光１１６の中心と合
っていない場合、通常の透過観察における視野とレーザ
走査で得られる視野の位置がずれてしまう。

【０００５】そこでスキャナミラー１１３あるいは顕微
鏡の位置、リレーレンズ１１０，１１１の位置等を微妙
に変化させ、これらの条件を満たすように調整しなけれ
ばならない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら対物レン
ズ１０７の光軸中心とレーザ光１１６の光軸との位置関
係や、対物レンズ１０７の瞳面１０８がスキャナミラー
１１３のどこに投影されているかを確認することは難し
く、調整のためには幾つかの基準工具（ターゲット）や
コリメータ等の測定装置を要するなど、大変煩わしい作
業が必要であった。

【０００７】そこで、本発明は、簡易・確実に光軸調整
を行うことができるレーザ走査型顕微鏡及びレーザ走査
光学系の調整方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
めに本発明は、レーザ光源からのレーザ光をレーザ走査
光学系を介して光学顕微鏡の光路に導き、光学顕微鏡の
対物レンズを介して試料に照射するレーザ走査型顕微鏡
において、光学顕微鏡は透過照明系を有しており、その
透過照明系から発せられ対物レンズを通過した照明光
と、レーザ走査光学系を通過したレーザ光源からのレー
ザ光とを同一光路に合成する光路合成手段と、光路合成
手段によって合成された照明光とレーザ光とを集光する
集光手段と、集光手段によって集光された照明光とレー
ザ光とを集光手段の焦点面内で２次元的に受光する受光
手段と、受光手段からの信号に応じて、照明光とレーザ
光との位置ずれとレーザ光のスポット径との少なくとも
一方を検出する検出手段と、を有することを特徴とする
ものである。

【０００９】また、本発明は、レーザ光源からのレーザ
光をレーザ走査光学系を介して光学顕微鏡光路に導き、
対物レンズを介して試料に照射するレーザ走査型顕微鏡
におけるレーザ走査光学系の調整方法において、光学顕
微鏡の透過照明系からの照明光を対物レンズを介して所
定のターゲット上にスポット光として照射し、レーザ走
査光学系からのレーザ光を対物レンズを介さずにターゲ
ット上にスポット光として照射し、ターゲット上におけ
る照明光のスポット光とレーザ光のスポット光との位置
ずれに応じてレーザ走査光学系の光軸を調整することを
特徴とするものである。

【００１０】本発明では、顕微鏡の透過観察用照明光を
参照光とし、検出手段やターゲットを利用してこの参照
光の光軸にレーザ光の光軸を一致させることにより、対
物レンズの光軸中心とレーザ走査光学系の光軸とを一致
させることを特徴とするものである。市販されている顕
微鏡は、一般に照明光学系の光軸と対物レンズの光軸と
が正確に一致するよう設計されており、照明光を基準光
線とすることによって正確な光軸調整を行うことが出来
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】予め、図２を用いて本発明の具体
的な原理を示す。顕微鏡の本体部に設けた透過照明用の
ケーラー照明光学系の光源２０１から出射された光は、
コレクタレンズ２０２によって集められ、視野絞り２０
３、開口絞り２０４を通過後コンデンサレンズ２０５に
よって観察試料２０６上に照射される。この光は観察試
料（標本）２０６を透過し、透過後の照明光は対物レン
ズ２０７によって集められ、瞳面（入射瞳）２０８を通
過して、ミラー２０９で反射され、リレーレンズ２１
０、２１１によって走査光学系であるスキャナミラー２
１３へと導かれる。

【００１２】ここで視野絞り２０３を絞り込むことによ
って照明光束を細くすることが出来るので、これを対物
レンズ２０７の光軸２１４とみなすことができる。そこ
で、照明光束を基準としてレーザ走査型顕微鏡のレーザ
ビームがこの照明光束（光軸２１４）と一致するように
調整を行うことにより、容易且つ正確に光軸調整を行う
ことが出来る。

【００１３】また照明部はケーラー照明光学系であるた
め、視野絞り２０３が試料面２０６上に結像するように
調整されているならば、コンデンサレンズ２０５の開口
絞り２０４と対物レンズ２０７の瞳面２０８とは共役の
位置にあるはずである。そこで開口絞り２０４を絞りこ
めば、対物レンズの瞳面２０８と共役の位置２１２にお
いて、開口絞り２０４の像が観察される。そこで位置２
１２にスキャナミラー２１３面を一致させればシェーデ
ィングを最低限に抑えることが出来る。

【００１４】〔第１実施形態〕この原理を用いた第１実
施形態のレーザ走査型顕微鏡の光学調整を図２、３を参
照して説明する。図２において、まず通常のケーラー照
明光学系の調整を行い、コンデンサレンズ２０５の開口
絞り２０４と対物レンズ２０７の瞳面２０８を共役の位
置にする。次に試料２０６を置かないで開口絞り２０４
を開けたまま視野絞り２０３を絞り込むと、照明光が細
い光束となって対物レンズ２０７を通過し、ミラー２０
９によってスキャナミラー２１３の方向に反射される。
この時対物レンズ２０７の瞳２０８によって照明光束が
ケラレないよう、瞳径の大きな低倍率の対物レンズ２０
７を用いる。この照明光束の光軸にレーザビームの光軸
が重なるように調整すれば、顕微鏡の本体部（照明系２
０１，２０２，２０３，２０４，２０５及び対物レンズ
２０７）とレーザ光線との光軸が一致する。調整箇所と
してはリレーレンズ２１０、２１１や顕微鏡の位置を変
化させるなどが考えられるが、本実施例ではスキャナミ
ラー２１３の位置を動かすことにより調整を行う。

【００１５】例えば、図３（ａ）のように照明光束３０
１がターゲットであるミラー２０９上で反射されている
反射点３０３や、図３（ｂ）のようにリレーレンズ２１
０，２１１間にターゲットであるスリガラス３０８等を
配置して観察されるスポット３０７上をレーザビーム３
０４が通過するように、スキャナミラー２１３が取り付
けられているガルバノメータ３０６の位置を調整してや
ればよい。

【００１６】次に、図２において視野絞り２０３を開け
て開口絞り２０４を絞り込むと、上述の原理により図４
のスキャナミラー２１３近辺において、開口絞りの像１
２１３が観察される。この開口絞りの像１２１３がスキ
ャナミラー２１３面で最もくっきりと見える位置、即ち
対物レンズ２０７の瞳面２０８と共役になるスキャナミ
ラー２１３の位置にガルバノメータ３０６の位置を調整
する。この方法によれば、スキャナミラー２１３に映る
開口絞りの像１２１３を目で確認しながら調整ができる
ため、従来の方法に比べて非常に簡単に光学調整を行な
うことができる。

【００１７】以上の調整方法により、従来の方法よりも
非常に容易で、特別な工具が無くとも的確に顕微鏡の本
体部の対物レンズ２０７の中心にレーザ光の光軸中心を
合致させ、対物レンズ２０７の瞳面２０８とスキャナミ
ラー２１３とを共役の位置にすることができる。

【００１８】〔第２実施形態〕本発明の第２実施形態を
以下に示す。先の第１実施形態では、機器設置時等にお
いて設置者が手動で調整を行うものである。これに対し
第２実施形態は、機器動作時において微調整の必要が生
じたとき、それを自動的に行う。

【００１９】生物試料の観察を目的としたレーザ走査型
顕微鏡では、試料の特性に応じて内部で用いられている
ダイクロイックミラーやフィルタ等を交換することが度
々行われる。その際ミラーもしくはフィルタ面の角度が
微妙に異なるため、励起光の光軸が顕微鏡本体の光軸に
対し傾いてしまう。通常フィルタ面の角度はある一定の
範囲に収まるよう設計されているが、完全に一致してい
るわけではないため微小な傾きが発生する。これによっ
て対物レンズの瞳面を充分に満たせなくなったり、対物
レンズを上下させるなど深さ方向の焦点位置を動かした
ときに斜めに動いてしまう問題が発生する。

【００２０】そこで本実施例では、透過照明光の光軸と
励起ビームの光軸をモニタリングし、２つの光軸がずれ
ている場合は自動的に透過照明光の光軸を基準としてこ
れに励起ビームの光軸が一致するよう、レンズ位置もし
くはスキャナミラーの振れ角度中心を傾ける。

【００２１】図５に本実施形態におけるレーザ走査型顕
微鏡の概略構成図を示す。顕微鏡の本体部に透過照明用
に設けたケーラー照明光学系の光源５０１から出射され
た光はバンドパスフィルタ５２６によって励起ビーム光
と同じ波長の光がカットされ、コレクタレンズ５０２に
よって集められたのち視野絞り５２２、開口絞り５２３
を通過し、コンデンサレンズ５０３によって観察試料５
０４上に照射される。この光は試料５０４を透過後、対
物レンズ５０５によって集められ、瞳面１５０５を通過
し、リレーレンズ５０６、光路合成用のビームスプリッ
タ５０７を透過してミラー５０９によって反射され、集
光手段であるレンズ５１０により画像検出用のＣＣＤ５
１６の光電面（焦点面）上に結像される。ここでＣＣＤ
５１６の光電面とレンズ５１０の位置関係は、光電面上
での透過光スポットが最小となるように調整されている
ものとする。ビームスプリッタ５０７は通常観察時に使
用されるミラー（ダイクロイックミラー）５０８ととも
にスライド式ホルダ５２５にセットされており、調整時
にはビームスプリッタ５０７に切り換えられる。ビーム
スプリッタ５０７は、図６に示すように、励起ビーム光
の波長を反射するが、バンドパスフィルタ５２６を透過
した試料５０４側からの光を透過するような光学特性を
持っている。尚、図５においては便宜上、ビームスプリ
ッタ５０７とミラー５０８とを図５の紙面に平行な方向
に切換えているように図示しているが、実際はビームス
プリッタ５０７とミラー５０８とは図５の紙面に垂直な
方向に配置されていて、この方向に移動して切換えるよ
う構成されている。

【００２２】また、通常観察時においては、励起用のレ
ーザ光源５１４から射出された励起ビームはエキスパン
ダ部５１２、５１３によってビーム径を拡げられるが、
ここで述べる調整時にはエキスパンダ部のレンズ５１３
を光軸方向に動かすことにより、励起ビームをスキャナ
ミラー５１５上に集光させる。ＵＶ励起に対応したレー
ザ走査型顕微鏡では、光学系の色収差を補正するため、
レンズ５１３が可動式となっているものが多い。このレ
ンズ５１３を利用して励起ビームをスキャナミラー５１
５上に集光させれば、特別なレンズを使用しなくても済
むので便利である。この光はリレーレンズ系５１１を通
ってビームスプリッタ５０７に入射するが、この光の波
長は励起ビーム光の波長となるため、ここで反射され
る。その後は照明光と同様の経路でＣＣＤ５１６の光電
面上に結像される。

【００２３】なお、通常観察時にミラー５０８を光路上
に配置した場合、励起ビームはこのミラー５０８で反射
されて観察試料５０４に入射する。また、観察試料５０
４を透過した透過照明光及びこれから発生した励起光
は、観察試料５０４の下方に出射してミラー５０８を通
過して最終的にＣＣＤ５１６に導かれる。

【００２４】通常観察時においては、ＣＣＤ５１６によ
って得られた観察試料５０４の像は図示を省略するディ
スプレイに表示される。一方、調整時においては、ＣＣ
Ｄ５１６によって得られた画像は画像専用メモリ５１８
に取り込まれ、制御回路５１７によって透過光の結像位
置と励起ビーム光の結像位置が計算される。この制御回
路５１７は、例えばパーソナルコンピュータ等を用いる
ことができる。ここでもし励起光の光軸が対物レンズの
光軸に対して傾いていた場合、光軸方向における励起ビ
ーム光の結像位置は透過光の結像位置と異なることにな
る。ずれている量と方向は制御回路５１７によって算出
され、その結果が調整手段であるガルバノメータドライ
バ５２０に送られ、ガルバノミラー５１５の角度を変化
させる。その後再び励起ビーム光の結像位置を算出し、
２つの結像位置が同じになるまでガルバノミラー５１５
の角度がフィードバック制御される。画像取得のために
レーザ光を走査するときは、ここで設定したガルバノミ
ラーの角度を振れ角中心とすれば、レーザ走査光学系の
光軸と対物レンズの光軸とを一致させることができる。

【００２５】またガルバノミラー５１５が対物レンズ５
０５の瞳面１５０５と共役な位置に無い場合、励起ビー
ムの結像位置はＣＣＤ５１６の検出面からずれることに
なり、スポット径が大きくなる。そこで、制御回路５１
７は調整手段である駆動装置５１９を介してピエゾアク
チュエータ５２１によってリレーレンズ５１１を光軸方
向に動かし、スポット径が最小となるように修正する。

【００２６】この制御は、具体的には図７のようなアル
ゴリズムで行われる。

【００２７】図７（ａ）は、制御の内容を説明するフロ
ーチャートであり、図７（ｂ）は、リレーレンズ５１１
の位置と励起ビームの結像状態との関係を示すグラフで
ある。

【００２８】図７（ａ）に示すように、まず、リレーレ
ンズ５１１の位置を検出しつつこれを予め記憶した初期
位置にＺ₀に移動させ、現在位置Ｚとしてこの位置Ｚ₀を
入力するとともに、位置パラメータＺ _minを仮に現在位
置Ｚ（＝Ｚ₀）と設定する（ステップＳ１）。次に、Ｃ
ＣＤ５１６の検出面上に投影されるスポット径φ_Zを算
出してこれを仮に径パラメータφ_minとする（ステップ
Ｓ２）。次に、リレーレンズ５１１を予め定めたステッ
プ量ｄＺだけ移動させる（ステップＳ３）。次に、ステ
ップ移動後における検出面上のスポット径φ_Zを計算す
る（ステップＳ４）。次に、径パラメータφ_minとステ
ップＳ４で算出したスポット径φ_Zとを比較する（ステ
ップＳ５）。ステップＳ５で移動後のスポット径φ_Zが
それ以前に得た径パラメータφ_minよりも大きいと判断
された場合、スポット径φ_Zを径パラメータφ_minに代入
するとともに、移動後の現在位置Ｚを位置パラメータＺ
_minに代入する（ステップＳ６）。ステップＳ５で移動
後のスポット径φ_Zが径パラメータφ_min以下と判断され
た場合、及び、ステップＳ６でのパラメータ更新が終了
した場合、移動後の現在位置Ｚと上限位置Ｚ_limとを比
較する（ステップＳ７）。現在位置Ｚが上限位置Ｚ_lim
以下であれば、ステップＳ３に戻って、ステップＳ７ま
でのステップ移動とそれに伴う処理とを繰り返す。一
方、現在位置Ｚが上限位置Ｚ_lim以下より大きければ、
ステップ移動を終了して、径パラメータφ_minの最終値
を与えたリレーレンズ５１１の位置（位置パラメータＺ
_minに対応する位置）にリレーレンズ５１１を戻す（ス
テップＳ８）。

【００２９】これら一連の動作は、フィルタ・ミラーを
交換するたびに行うよう、制御回路５１７のハードウェ
ア制御ソフトにプログラミングされている。

【００３０】本実施例によれば、通常観察時であっても
フィルタやミラー交換によって発生する光軸ズレを補正
し、常に最適な光学位置を得ることが出来る。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、レーザ走査型顕微鏡に
おいて顕微鏡本体部とレーザ光との光軸を一致させる際
に、容易かつ的確に光軸調整を行うことが出来る。この
発明では顕微鏡本体の透過照明光を用いることにより本
体部の正確な光軸を簡単に知ることができる。また対物
レンズの瞳面の投影像を実際に確認しながら調整できる
ため、特別な工具を必要とせずに従来よりもはるかに精
度の高い調整が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】一般的なレーザ走査型顕微鏡の概略構成を示す
図である。

【図２】本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の第１実施形
態の原理を説明する図である。

【図３】図３（ａ）、（ｂ）ともに、第１実施形態にお
けるレーザ走査光学系の光軸調整を説明する図である。

【図４】レーザ走査光学系におけるスキャナミラーの位
置調整を説明する図である。

【図５】本発明のレーザ走査型顕微鏡における第２実施
形態の概略構成を示す図である。

【図６】ビームスプリッタの分光透過特性を示す図であ
る。

【図７】第２実施形態における制御アルゴリズムを示す
図であり、（ａ）はその処理内容のフローチャートであ
り、（ｂ）はレンズ位置と結像状態との関係を示すグラ
フである。

【符号の説明】

２０１、５０１・・・光源２０３、５２２・・・視野絞り２０４、５２３・・・開口絞り２０７、５０５・・・対物レンズ２０９、５０８、５０９・・・ミラー２１０、２１１、５１１、５１２・・・リレーレンズ２１３、５１５・・・スキャナミラー２１４・・・レーザ光５１４・・・レーザ光源５１６・・・ＣＣＤ５１７・・・制御回路５１８・・・画像専用メモリ５１９・・・駆動装置５２０・・・ガルバノメータドライバ５２１・・・ピエゾアクチュエータ５２５・・・スライド式ホルダ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】レーザ光源からのレーザ光をレーザ走査
光学系を介して光学顕微鏡の光路に導き、前記光学顕微
鏡の対物レンズを介して試料に照射するレーザ走査型顕
微鏡において、前記光学顕微鏡は透過照明系を有し、前記対物レンズを通過した前記光学顕微鏡の透過照明系
からの照明光と、前記レーザ走査光学系を通過した前記
レーザ光源からのレーザ光とを同一光路に合成する光路
合成手段と、前記光路合成手段によって合成された前記照明光と前記
レーザ光とを集光する集光手段と、前記集光手段によって集光された前記照明光と前記レー
ザ光とを前記集光手段の焦点面内で受光する受光手段
と、前記受光手段からの信号に応じて、前記照明光と前記レ
ーザ光との前記焦点面内における位置ずれと前記レーザ
光のスポット径との少なくとも一方を検出する検出手段
と、を有することを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【請求項２】前記検出手段からの位置ずれ情報に基づ
いて、前記レーザ走査光学系の光軸を調整する調整手段
をさらに有することを特徴とする請求項１記載のレーザ
走査顕微鏡。
【請求項３】前記検出手段は、前記レーザ光のスポッ
ト径の情報に基づいて、前記レーザ走査光学系を構成す
る光学部材の光軸方向における位置を調整する調整手段
をさらに有することを特徴とする請求項１又は２に記載
のレーザ走査顕微鏡。
【請求項４】レーザ光源からのレーザ光をレーザ走査
光学系を介して光学顕微鏡光路に導き、対物レンズを介
して試料に照射するレーザ走査型顕微鏡におけるレーザ
走査光学系の調整方法において、前記光学顕微鏡の透過照明系からの照明光を前記対物レ
ンズを介して所定のターゲット上にスポット光として照
射し、前記レーザ走査光学系からのレーザ光を前記対物レンズ
を介さずに前記ターゲット上にスポット光として照射
し、前記ターゲット上における前記照明光のスポット光と前
記レーザ光のスポット光との位置ずれに応じて前記レー
ザ走査光学系の光軸を調整することを特徴とするレーザ
走査光学系の調整方法。
【請求項５】前記レーザ走査光学系の走査ミラー上に
前記透過照明系からの照明光を照射し、前記ミラー上に前記照明光の絞り像が合焦するように前
記レーザ走査光学系を構成する光学部材の光軸方向にお
ける位置を調整する工程をさらに有することを特徴とす
る請求項４記載のレーザ走査光学系の調整方法。