DE102006030195A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Laser-Mikrodissektion und zum Lasercatapulting - Google Patents
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Abstract
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion und zum Laser-Pressure-Catapulting (LMPC). Für das Laser-Pressure-Catapulting werden entsprechend einer Laser-Mikrodissektion biologische Objekte aus einer biologischen Masse zumindest weitgehend herausgeschnitten und dann mit einem gezielten Laserschuss bzw. Laserimpuls in einen Auffangbehälter katapultiert. Ein direktes Katapultieren interessierender Bereiche der biologischen Masse ohne verheriges Ausschneiden ist ebenfalls möglich, wobei in diesem Fall das katapultierte Gebiet maßgeblich von der Strahlintensität und dem Strahlprofil eines verwendeten Laserstrahls abhängt. Eine derartige Vorrichtung bzw. ein derartiges Verfahren ist beispielsweise aus der
DE 100 15 157.4 der Anmelderin bekannt und wird unter der Bezeichnung MicroBeam vertrieben. - Problemstellung
- Welches Problem löst die Erfindung
- Der MicroBeam Verwendet sowohl zum Ausschneiden als auch zum Katapultieren denselben Laser. Das von der Strahlquelle vorgegebene Strahlprofil wird im gegenwärtigen Zustand sowohl für den Mikrodissektionsprozess als auch für den Katapult-Vorgang im Wesentlichen unverändert eingesetzt. Allerdings müssen die Laserparameter für den jeweiligen Vorgang und auf das jeweilige Präparat eingestellt werden: Während des Schneideprozesses befindet sich der fokale Punkt des Lasers auf der Objektebene. Für den Katapult-Vorgang hingegen wird der Laserstrahl defokussiert eingesetzt. Somit ergibt sich eine starke Abhängigkeit der LMPC von der Qualität und Geometrie des Ausgangsstrahls: Für das Schneiden eignen sich Strahlprofile mit enger Gauss-Verteilung, die jedoch für das Katapultieren nachteilig sind.
- Welche Nachteile weisen bekannte Lösungen auf
- Nicht-optimale Kompromiss-Lösung für die LMPC-Prozesse Schneiden und Katapultieren
- Die zurzeit angewandte Strahlfokus-Anpassung über Beamexpander und Grauwert-Abschwächer stellt einen Kompromiss zwischen den gegenläufigen Anforderungen des Schneidens (optimal: enger Gauss mit hoher Amplitude) und des Katapultierens (optimal: flat-top) her. Neben der Abhängigkeit vom Ausgangsstrahl ergeben sich daher vor allem Probleme für das Katapultieren der Probe: mit der herkömmlichen Lösung wird der „Transfer-Impuls" über Defokussierung des Laserstrahls erreicht. Dies hat zur Folge, dass ein Großteil der zur Verfügung stehenden Energie nicht dem Transfer zugute kommt, sondern nur die Basis des gauss-verteilten Strahlprofils. Die restliche Energie „verpufft" entweder unterhalb der Objektebene ungenutzt oder aber wird in die Objektebene übertragen und führt zur unnötigen Belastung der Probe (Durchschuss der Probe). Dies führt zur zeitaufwändigen Praxis bei schwierig zu bearbeitenden Proben für den Schneideprozess hochnumerische Objektive einzusetzen und für den Katapultvorgang zu niedernumerischen Objektiven zu wechseln. Hinzu kommt, dass bei Verwendung z. B. Femtosekundenlaser das Katapultieren schwierig und nur begrenzt durchführbar ist, da die übertragene Energie nur auf eine sehr kleine Oberfläche verteilt werden kann.
- Lösung
- Dieses Problem wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und eine Vorrichtung nach Anspruch 8. Die abhängigen Ansprüche definieren bevorzugte oder vorteilhafte Ausführungsbeispiele.
- Durch Einsatz von refraktiver/defraktiver Optik kann der Strahl beliebig „geformt" werden, so dass er sowohl fein fokussiert zum Schneiden oder zur Mikroinjektion eingesetzt als auch mit einer breiten Strahlfront zum optimierten Katapultieren verwendet werden kann. Eine Abhängigkeit der Laserquelle wird somit vermindert. Zudem kann der Laserstrahl sehr schnell auf die jeweilige Anforderung moduliert werden, ohne das Veränderungen in Fokus- und Energiewerten erfolgen müssen. Des Weiteren kann auf einen Objektivwechsel zwischen Schneiden und Katapultieren auch bei schwierigen Proben verzichtet werden.
- Weitere Vorteile:
-
- – Aufgrund der optimierten Energieverteilung kann im Katapultiermodus mehr Energie auf eine größere Fläche übertragen werden, wodurch vor allem mit Objektiven mit geringerer Vergrößerung größere Probenareale transferiert werden können. Dies bringt auch für auf Glasobjektträgern aufgebrachte Proben Vorteile, da über die größere Flächenverteilung größere Areale ohne unterliegende Transfer-Membran befördert werden können.
- – Hierdurch wird erreicht, dass der Energieeintrag in die Probe minimiert wird, was vor allem im Lebendzell-Bereich von Bedeutung ist. Des Weiteren können somit Durchschüsse der Membran verhindert werden.
- – Der über refraktive/defraktive Optik modulierte Strahl hat nach der Umformung eine rechteckige Bestrahlungsfläche und kann daher für eine Bestrahlung der Fläche ohne Überlappungsbereiche genutzt werden (z. B. bei AutoLPC von direkt au Glasobjektträgern aufgebrachten Proben).
- In
1A und1B ist ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt, wobei1A den Strahlengang und1B ein vollständiges Mikroskopsystem zeigt. Bis auf die nachfolgend noch zu erläuternden Elemente entspricht das Mikroskopsystem von1B einem herkömmlichen System zur Laser-Mikrodissektion und zum Laser-Pressure-Catapulting (LMPC), wie es beispielsweise in derDE 103 58 565 der Anmelderin beschrieben ist. - Zur Einstellung eines gewünschten Laserstrahlprofils insbesondere für das Katapultieren dient ein Strahlformungselement
100 , welches durch einen Schrittmotor wie durch einen Pfeil110 angedeutet in den Strahlengang gefahren werden kann bzw. aus diesem heraus gefahren werden kann. Statt eines Schrittmotors sind auch andere Bewegungsmittel zum Bewegen des Strahlformungselements100 in den Strahlengang oder aus dem Strahlengang heraus denkbar. Der Schrittmotor weist bevorzugt eine hohe Positioniergenauigkeit auf, um das Strahlprofil präzise einstellen bzw. das Strahlformungselement100 präzise positionieren zu können. Eine mögliche Positioniergenauigkeit ist beispielsweise 0,1 mm. - Das Strahlformungselement
100 kann insbesondere ein Beugungselement sein oder ein solches enthalten. Beispiele für Beugungselemente sind in den weiteren Figuren dargestellt. - Das Beugungselement kann beispielsweise eine so genannte Asphäre sein, ein asphärisches Element, welches beispielsweise durch Lithographie wie in
9 dargestellt hergestellt werden kann. Durch ein derartiges Verfahren kann ein Beugungsgitter erzeugt werden. Mit derartigen Beugungsgittern können gewünschte Strahlprofile erzeugt werden, dafür wird das gewünschte Strahlprofil vorgegeben und nach den bekannten der Wellenoptik das nötige Beugungsprofil ermittelt. Derartige Beugungselemente sind beispielsweise auch aus derDE 102 45 558 A1 bekannt. - Asphärische Beugungselemente können dabei auch aus einer Kombination einer sphärischen Linse mit einem auf der Linse aufgebrachten Beugungsgitter bestehen.
-
2 und3A ,3B zeigen dabei Strahlprofile für eine derartige Asphäre, d. h. die Intensität des Strahls in Abhängigkeit von dem Ort. Mit z wird dabei eine Fokussierung in der jeweiligen Objektebene des Mikroskops aus1B bezeichnet. Eine derartige Fokussierung kann entweder durch ein entsprechendes Mikroskopobjektiv oder durch eine Optik16 in1B erreicht werden. Wie zu sehen ist, kann mit einer derartigen Asphäre ein breites relativ homogenes Strahlprofil erzeugt werden, welches zum Katapultieren gut geeignet ist. -
4 zeigt schließlich den Einfluss einer Profiltiefe der Asphäre auf die Intensitätsverteilung. - Eine weitere Möglichkeit zur Strahlformung ist ein Array, beispielsweise ein Linsenarray. Ein derartiges Linsenarray ist in
10 schematisch dargestellt und kann durch Reflexion über Spiegel beleuchtet werden.10 zeigt dabei ein an den Mikrolinsenabstand angepasstes Kohärenz-Management durch zwei gekreuzte Stufenspiegel.5 und6 zeigen Intensitätsverteilungen ähnlich2 und3 für ein derartiges Array. Auch in einem Array können zusätzlich oder alternativ zu Linsen Beugungselemente zum Einsatz kommen. - Bei derartigen Arrays kann es durch die regelmäßige Anordnung der Linen zu Interferenzerscheinungen kommen. Um dies zu vermeiden, kann als Strahlformungselement
100 auch ein so genanntes statistisches Array vorgesehen sein, welches eine Feldverteilung im Wesentlichen ohne Interferenzen ermöglicht, da bei einem derartigen statistischen Array keine für eine Interferenz nötige feste Phasenbeziehung zwischen einer Mehrzahl von Strahlen besteht. Derartige statistische Arrays sind beispielsweise in L. Erdmann et al., „MOEMS-based Lithography for the Fabrication of Mirco-Optical Components", Journal of Microlithography, Microfabrication and Microsystems, Vol. 4, Issue 4, 2005 beschrieben. - Es können sowohl zur Herstellung der Strahlformungselemente
100 als auch für die Strahlformungselement100 selbst so genannte DMD-Elemente verwendet werden, welche aus der Projektionstechnik bekannt sind. Hierbei handelt es sich um eine große Anzahl von in einer Matrix angeordneten gegebenenfalls teildurchlässigen Mikrospiegel, welche einzeln angesteuert werden können. - Es ist zu bemerken, dass das Strahlformungselement
100 auch aus mehreren optischen Elementen, beispielsweise einer Kombination aus Beugungselementen und Linsen, bestehen kann. -
9 zeigt das simultane Strukturieren des gesamten optischen Elements durch holgrafische Lithografie. Dabei liegt ein geblaztes Oberflächenprofil für hohe räumliche Sequenzen vor. Aufgrund der begrenzten Profiltiefe in dem Fotolack wird ein zusätzlicher Ionen-Ätzprozess zum Einstellen der Profiltiefe verwendet. - Es ist möglich, für die Laser-Mikrodissektion, also für einen Schneidvorgang, den unveränderten Laserstrahl zu verwenden und zum Katapultieren das Strahlformungselement
100 in den Strahlengang zu bewegen. Es sind jedoch auch zwei verschiedene Strahlformungselemente100 denkbar, wobei eines für das Schneiden und eines für einen Katapultvorgang in den Strahlengang gefahren wird, um jeweils ein optimales Strahlprofil zu erzeugen.
Claims (10)
- Verfahren zur Laser-Mikrodissektion und zum Katapultieren eines biologischen Objekts, wobei das biologische Objekt mit einem Laserstrahl bestrahlt wird, wobei zumindest zur Dissektion oder zum Katapultieren ein Strahlformungselement (
100 ) in den Strahlengang des Laserstrahls bewegt wird. - Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Dissektion kein Strahlformungselement in den Strahlengang bewegt wird, und wobei zum Katapultieren ein Strahlformungselement in den Strahlengang bewegt wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei zur Dissektion ein erstes Strahlformungselement in den Strahlengang bewegt wird, und wobei zum Katapultieren ein zweites Strahlformungselement in den Strahlengang bewegt wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Strahlformungselement ein Beugungselement umfasst.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Strahlformungselement ein Brechungselement umfasst.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Strahlformungselement ein asphärisches Beugungselement, ein Linsenarray und/oder ein statistisches Array umfasst.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei, wenn sich das Strahlformungselement im Strahlengang befindet, eine Intensitätsverteilung des Laserstrahls breiter ist als ohne das Strahlformungselement.
- Vorrichtung zur Mikrodissektion und zum Katapultieren von biologischen Objekten, mit einem Laser zur Erzeugung eines Laserstrahls, und mit einem Strahlformungselement, welches in einen Strahlengang des Laserstrahls bewegbar ist.
- Vorrichtung nach Anspruch 8, mit einem Schrittmotor zum Bewegen des Strahlformungselements in den Strahlengang.
- Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 ausgestaltet ist.
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