DE102022103051A1

DE102022103051A1 - Vorrichtung für die mikroskopie mit strukturierter beleuchtung, verfahren zum beleuchten einer probe und verfahren zur mikroskopie mit strukturierter beleuchtung

Info

Publication number: DE102022103051A1
Application number: DE102022103051.2A
Authority: DE
Inventors: Jörg Siebenmorgen; Ingo Kleppe; Ralf Netz
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2022-02-09
Filing date: 2022-02-09
Publication date: 2023-08-10
Also published as: US20230266246A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung, mit einem Beleuchtungsstrahlengang zum Bestrahlen einer Probe unter Winkeln, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion mit Anregungslicht mit einem zweidimensionalen Beleuchtungsmuster, wobei der Beleuchtungsstrahlengang mindestens aufweist ein Beleuchtungsobjektiv, über welches die Probe bestrahlt wird, eine erste Auftrenneinrichtung zum Auftrennen des Anregungslichts in einer ersten linearen Koordinatenrichtung in einer Pupillenebene und eine Verschiebeeinrichtung zum lateralen Verschieben des Beleuchtungsmusters in einer Probeebene, mit einem Detektionsstrahlengang enthaltend mindestens ein Mikroskopobjektiv zum Leiten von von der Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht abgestrahltem Emissionslicht auf eine Kamera, mit der Kamera zum Aufnehmen von Bildern der Probe, mit einer Steuereinheit zum Berechnen von mikroskopischen Bildern der Probe unter Verwendung von für verschiedene Positionen des Beleuchtungsmusters in der Probenebene aufgenommenen Teilbildern der Probe. Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass zum variablen Auftrennen des Anregungslichts unabhängig von dem Auftrennen in der ersten linearen Koordinatenrichtung in der Pupillenebene in einer zweiten linearen Koordinatenrichtung, die von der ersten linearen Koordinatenrichtung unabhängig ist, eine zweite Auftrenneinrichtung vorhanden ist, die einstellbar ist. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Beleuchten einer Probe für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung und ein Verfahren zur Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein Verfahren zum Beleuchten einer Probe für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 26. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung.
Eine gattungsgemäße Vorrichtung für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung ist beispielsweise in US10222599B2 beschrieben und weist zunächst einen Beleuchtungsstrahlengang auf zum Bestrahlen einer Probe unter Winkeln, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion mit Anregungslicht mit einem zweidimensionalen Beleuchtungsmuster. Der Beleuchtungsstrahlengang beinhaltet mindestens ein Beleuchtungsobjektiv, über welches die Probe bestrahlt wird, eine erste Auftrenneinrichtung zum Auftrennen des Anregungslichts in einer ersten linearen Koordinatenrichtung in einer Pupillenebene und eine Verschiebeeinrichtung zum lateralen Verschieben des Beleuchtungsmusters in einer Probeebene. Sodann ist ein Detektionsstrahlengang vorhanden mindestens mit einem Mikroskopobjektiv zum Leiten von von der Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht abgestrahltem Emissionslicht auf eine Kamera. Schließlich enthält die gattungsgemäße Vorrichtung die Kamera zum Aufnehmen von Bildern der Probe und eine Steuereinheit zum Berechnen von mikroskopischen Bildern der Probe unter Verwendung von für verschiedene Positionen des Beleuchtungsmusters in der Probenebene aufgenommenen Teilbildern der Probe.
Bei einem gattungsgemäßen Verfahren zum Beleuchten einer Probe für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung werden folgende Schritte durchgeführt: eine Probe wird mit einem Beleuchtungsstrahlengang unter Winkeln, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion, über ein Beleuchtungsobjektiv mit Anregungslicht mit einem zweidimensionalen Beleuchtungsmuster bestrahlt, wobei das Anregungslicht zum Bereitstellen des Beleuchtungsmusters in separate Beleuchtungspunkte in eine Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs gestrahlt wird und wobei das Anregungslicht in der Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs in einer ersten linearen Koordinatenrichtung aufgetrennt wird.
Ein Verfahren zum Beleuchten einer Probe für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung mit diesen Merkmalen ist ebenfalls in US10222599B2 offenbart.
Mit der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) kann die optische Auflösung eines Mikroskops in allen drei Raumdimensionen verbessert werden. Eine Probe, insbesondere eine Fluoreszenz-Probe, wird mit einem Beleuchtungsmuster, mithin mit räumlich strukturiertem Licht, beleuchtet und das Beleuchtungsmuster wird mehrfach relativ zur Probe phasenverschoben, bis alle Beleuchtungslücken aufgefüllt sind. Aus den so gewonnenen Bildern wird ein hochaufgelöstes Bild berechnet oder, wie man auch sagt, rekonstruiert.
Unter Anwendung von sichtbarem Beleuchtungslicht kann beispielsweise eine laterale Auflösung von ca. 105nm und eine axiale Auflösung von ca. 300nm erreicht werden. Um die axiale Auflösung weiter zu steigern, kann SIM mit TIRF-Mikroskopie (TIRF = Total Internal Reflexion Fluorescence) kombiniert werden. Bei der TIRF-Mikroskopie wird die Probe nur evaneszent, also exponentiell abklingend, in einer Schichtdicke von ca. 100 nm am Übergang Deckglas-Probe mit Anregungslicht anregt. Das aus dem Deckglas kommende Anregungslicht trifft sehr schräg unter einem Winkel, der größer ist als der Totalreflexionswinkel, auf die Probe. Der größte Anteil des Beleuchtungslichts wird am Übergang Deckglas-Probe in Richtung Objektiv zurückreflektiert. Um die für Totalreflexion notwendige sehr schräge Beleuchtung zu erreichen, muss das Beleuchtungslicht in der Objektivpupille sehr weit außen positioniert werden. Dazu als Beispiel das Objektiv alpha-Plan-Apo 63x / 1.46 Oil:

• Durchmesser Objektivpupille: 7.62 mm
• TIRF-Radius-Bereich Objektiv-Pupille 3.47 mm bis 3.81 mm
• TIRF-Winkel-Bereich in Zwischenbildebene vor der Tubuslinse 1.11 ° bis 1.33°
• TIRF-Winkel-Bereich im Objektraum vor dem Objektiv 61.18° bis 74.11 °

Die Zahlen zeigen, dass die TIRF-Beleuchtungsspots in der Objektivpupille flexibel einstellbar sein müssen. Wenn SIM mit TIRF kombiniert wird, sind mindestens zwei Spots in der Objektivpupille notwendig, um eine eindimensionale Strukturierung zu erreichen. Für eine zweidimensionale Strukturierung (beispielsweise für Lattice-SIM bei dem Produkt „Elyra 7“ von Carl Zeiss) sind mindestens drei Spots in der Objektivpupille notwendig, die nicht kollinear sind und die alle die TIRF-Bedingung erfüllen müssen und dann gemeinsam ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster (2D-Beleuchtungsmuster) in der Probe erzeugen. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um die Beleuchtungsspots, die auch als TIRF-Spots bezeichnet werden, in der Objektivpupille zu positionieren: z.B. durch die Erzeugung eines Neigungswinkels des Beleuchtungsstrahls zwischenbildnah mittels Spiegel oder direkte Parallelverschiebung des Beleuchtungsspots in der Pupille oder in der Nähe einer Pupille mit planparallelen Platten (GE Healthcare).
Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Beleuchten einer Probe für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung anzugeben, bei denen die Beleuchtung im Vergleich zum Stand der Technik mit einem einfacherem Aufbau verwirklicht wird.
Diese Aufgabe wird durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 25 gelöst. Beansprucht wird außerdem das Verfahren zur Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung mit den Merkmalen des Anspruchs 30.
Vorteilhafte Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung und bevorzugte Varianten der erfindungsgemäßen Verfahren werden im Folgenden insbesondere mit Bezug auf die abhängigen Ansprüche und die Figuren beschrieben.
Die Vorrichtung der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass zum variablen Auftrennen des Anregungslichts unabhängig von dem Auftrennen in der ersten linearen Koordinatenrichtung in der Pupillenebene in einer zweiten linearen Koordinatenrichtung, die von der ersten linearen Koordinatenrichtung unabhängig ist, eine zweite Auftrenneinrichtung vorhanden ist, die einstellbar ist.
Das Verfahren der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass das Anregungslicht zum Bilden der Beleuchtungspunkte mit einem Beleuchtungswinkel für Totalreflexion unabhängig von dem Auftrennen in der ersten linearen Koordinatenrichtung in einer zweiten linearen Koordinatenrichtung, die von der ersten linearen Koordinatenrichtung unabhängig ist, variabel aufgetrennt wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung wird eine Probe nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Anregungslicht strukturiert beleuchtet, von der Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht abgestrahltes Emissionslicht wird in einem Detektionsstrahlengang, der mindestens ein Mikroskopobjektiv aufweist, auf eine Kamera geleitet, das Beleuchtungsmuster wird in einer Probenebene lateral verschoben, für verschiedene Positionen des Beleuchtungsmusters in der Probenebene wird jeweils ein Teilbild der Probe aufgenommen und aus den Teilbildern der Probe ein mikroskopisches Bild der Probe berechnet.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtung ist insbesondere zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet.
Mit dem Begriff des Beleuchtungsstrahlengangs werden alle optischen strahlführenden und strahlverändernden Komponenten bezeichnet, beispielsweise Linsen, Spiegel, Prismen, Gitter, Filter, Blenden, Strahlteiler, mit denen und über welche das Anregungslicht von einer Lichtquelle, beispielsweise einem Laser, bis auf die zu untersuchende Probe geleitet wird. Der Beleuchtungsstrahlengang beinhaltet mindestens die erste und die zweite Auftrenneinrichtung und ein Beleuchtungsobjektiv. Das Beleuchtungsobjektiv kann ein Mikroskopobjektiv grundsätzlich bekannter Natur sein. Mit dem Begriff des Winkels für Totalreflexion ist derjenige Winkel gemeint, bei dem Totalreflexion beginnt. D. h., dass Licht total reflektiert wird, wenn es unter einem Winkel relativ zur optischen Achse eingestrahlt wird, der gleich oder größer ist als der Winkel für Totalreflexion. Um die Bestrahlungswinkel, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion, zu erreichen, kommen zweckmäßig Beleuchtungsobjektive mit hoher numerischer Apertur zum Einsatz.
Mit dem Auftrennen des Anregungslichts in einer Pupillenebene ist wesentlich ein räumliches Auftrennen gemeint. Mit variablem Auftrennen des Anregungslichts ist gemeint, dass das Ausmaß oder die Größe der Auftrennung variabel ist und eingestellt werden kann.
Mit der ersten und der zweiten linearen Koordinatenrichtung sind jeweils Koordinatenrichtungen eines rechtwinkligen linearen Koordinatensystems im dreidimensionalen Ortsraum gemeint, die sich in einer Pupillenebene, also quer oder senkrecht zu einer optischen Achse erstrecken.
Mit einer Auftrennung in der zweiten Koordinatenrichtung unabhängig von der ersten linearen Koordinatenrichtung ist gemeint, dass eine eventuell vorhandene Auftrennung in der ersten Koordinatenrichtung unverändert bleibt, wenn das Auftrennen in der zweiten Koordinatenrichtung erfolgt.
Wenn in den Ansprüchen davon die Rede ist, dass das Anregungslicht in der Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs in einer bestimmten Koordinatenrichtung aufgetrennt wird oder dass zum Auftrennen des Anregungslichts in der Pupillenebene in einer bestimmten Koordinatenrichtung eine Auftrenneinrichtung vorhanden ist, so handelt es sich dabei um Merkmale, die die Position der separaten Beleuchtungspunkte in der Pupillenebene betreffen, nämlich deren Auftrennen in bestimmten Koordinatenrichtungen. Diese Merkmale enthalten keine Aussagen darüber, wo die Mittel, mit welchen die Beleuchtungspunkte in der Pupillenebene manipuliert werden, also die Auftrenneinrichtungen, im Strahlengang angeordnet sind. Die Auftrenneinrichtungen können demgemäß grundsätzlich an beliebigen Orten im Strahlengang strahlaufwärts der Pupillenebene, in der sich die zu manipulierenden Beleuchtungspunkte befinden, angeordnet sein.
Mit einem zweidimensionalen Beleuchtungsmuster ist ein Beleuchtungsmuster gemeint, welches in zwei linearen räumlichen Koordinatenrichtungen, insbesondere periodisch, strukturiert ist. Typischerweise kommen gitterartige Beleuchtungsmuster zum Einsatz, die beispielsweise mit vier separaten Beleuchtungsspots in der Pupillenebene, entsprechend einer Überlagerung von vier ebenen Wellen, verwirklicht werden können.
Mit dem lateralen Verschieben des Beleuchtungsmusters in einer Probeebene, das mit der Verschiebeeinrichtung bewerkstelligt wird, ist das Verschieben des Beleuchtungsmusters in der Probenebene in Richtungen quer oder senkrecht zur optischen Achse gemeint. Wenn man die optische Achse als die Richtung der z-Achse definiert, bedeutet das laterale Verschieben also ein Verschieben in x- und/oder y-Richtung.
Typischerweise wird das zweidimensionale Beleuchtungsmuster an etwa 9 oder, wenn auch Licht der nullten Beugungsordnung verwendet wird, 13 verschiedene Positionen in einer Einheitszelle des zweidimensionalen Beleuchtungsmusters, also an ca. 3 bis 5 verschiedene Positionen in jeder linearen Koordinatenrichtung, verschoben. Für verschiedene Positionen des Beleuchtungsmusters in der Probenebene werden jeweils Bilder aufgenommen, die als Teilbilder bezeichnet werden. Aus der Gesamtheit der Teilbilder, typischerweise aus etwa 9 oder 13 Bildern, wird ein mikroskopisches Bild der Probe rekonstruiert, also berechnet.
Von der zu untersuchenden Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht ausgesandtes Licht wird als Emissionslicht bezeichnet und gelangt über den Detektionsstrahlengang auf die Kamera. Mit dem Begriff des Detektionsstrahlengangs werden alle strahlführenden und strahlverändernden optischen Komponenten, beispielsweise Linsen, Spiegel, Prismen, Gitter, Filter, Blenden, Strahlteiler, bezeichnet, mit denen und über welche das Emissionslicht von der zu untersuchenden Probe bis auf die Kamera geleitet wird. Der Detektionsstrahlengang enthält mindestens ein Mikroskopobjektiv. Die Kamera ist ein optischer Detektor mit einer zweidimensional ortsauflösenden Sensorfläche zum Aufnehmen von Bildern der Probe. Die Kamera kann beispielsweise eine sCMOS Kamera sein. Die Kamera kann von der Steuereinheit, insbesondere abgestimmt auf die Ansteuerung der Verschiebeeinrichtung, angesteuert werden.
Mit dem Begriff der Steuereinheit werden alle Hardware- und Softwarekomponenten bezeichnet, die mit den Komponenten des erfindungsgemäßen Mikroskops zu dessen bestimmungsgemäßer Funktion zusammenwirken. Insbesondere kann die Steuereinheit eine Recheneinrichtung, beispielsweise einen PC, und eine Kamerasteuerung aufweisen, die zum Auslesen der Pixel der Sensorfläche und zum Berechnen eines Bildes der Probe aus den aufgenommenen Teilbildern in der Lage ist.
Als Pupillenebenen des Beleuchtungsstrahlengangs werden die hintere Brennebene des Beleuchtungsobjektivs und dazu optisch konjugierte Ebenen bezeichnet.
Mit dem Begriff eines Beleuchtungspunkts oder Beleuchtungsspots wird eine punktartige Intensitätsverteilung, insbesondere in einer Pupillenebene, bezeichnet, deren Durchmesser insbesondere nur durch Beugung begrenzt sein kann, also eine Breite eines Airy-Scheibchens aufweisen kann.
Eine Probenebene ist eine Ebene in der Probe quer oder senkrecht zur optischen Achse, die insbesondere eine Brennebene des Beleuchtungsobjektivs ist und als solche optisch konjugiert ist zu Zwischenbildebenen im Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang. Typischerweise kann sich die Sensorfläche einer Kamera in einer Zwischenbildebene befinden.
Eine räumliche Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der hinteren Brennebene des Beleuchtungsobjektivs hängt mit der räumlichen Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der probenseitigen Brennebene, also der Probenebene, in grundsätzlich bekannter Weise über eine Fouriertransformation zusammen.
Mit dem Begriff der ersten und zweiten Auftrenneinrichtung sind jeweils diejenigen optischen Komponenten gemeint, mit denen die räumliche Auftrennung des Lichts bewerkstelligt wird.
Das Anregungslicht ist elektromagnetische Strahlung, insbesondere im sichtbaren Spektralbereich und angrenzenden Bereichen. An das kontrastgebende Prinzip ist für die vorliegende Erfindung nur insoweit eine Anforderung gestellt, als dass die Probe infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht Emissionslicht abstrahlt. Typischerweise kann das Emissionslicht Fluoreszenzlicht sein, welches die Probe, insbesondere dort vorhandene Farbstoffmoleküle, infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht abstrahlt oder abstrahlen.
Als eine wesentliche Idee der Erfindung kann zunächst angesehen werden, das räumliche Auftrennen des Anregungslichts in den beiden unabhängigen Koordinatenrichtungen jeweils mit separaten Komponenten zu bewerkstelligen. Eine weitere wesentliche Idee der Erfindung ist sodann, dass das Auftrennen in der zweiten Koordinatenrichtung quantitativ variabel ist und dass die quantitative Einstellung der Auftrennung, also insbesondere eines Abstands der Beleuchtungsspots in der Pupille, mit derselben Einrichtung durchgeführt werden kann, die auch die Auftrennung als solche in der zweiten Koordinatenrichtung leistet.
Als ein wesentlicher Vorteil der Erfindung kann angesehen werden, dass im Vergleich zum Stand der Technik, bei dem für das Auftrennen als solches einerseits und das quantitative Einstellen der Abstände der Beleuchtungsspots in der Pupille andererseits separate Komponenten notwendig sind, Vereinfachungen erreicht werden.
Bei der vorliegenden Erfindung weisen die zweidimensionalen Beleuchtungsmuster in der Regel in den beiden unabhängigen linearen Koordinatenrichtungen eine verschiedene Periodizität auf. Die Erfindung hat erkannt, dass der Rechenaufwand zu Berechnung der rekonstruierten Bilder für solche Beleuchtungsmuster akzeptabel ist.
Grundsätzlich können unterschiedliche physikalische Wirkprinzipien, beispielsweise Brechung, teilweise Reflexion, für das Auftrennen des Anregungslichts in der ersten Koordinatenrichtung angewendet werden. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die erste Auftrenneinrichtung eine auf Lichtbeugung beruhende Einrichtung auf. Beispielsweise kann die erste Auftrenneinrichtung ein, insbesondere eindimensional strukturiertes, Gitter oder einen Spatial-Light-Modulator aufweisen.
Grundsätzlich reicht es für die Verwirklichung der Erfindung aus, wenn eine erste Auftrenneinrichtung vorhanden ist, mit der ein einziger quantitativer Wert der Aufspaltung in der ersten Koordinatenrichtung erreicht wird. Um in dieser Hinsicht flexibler zu sein, ist es von Vorteil, wenn mehrere, insbesondere eindimensional strukturierte, Gitter vorhanden sind, zum wahlweisen Einbringen als erste Auftrenneinrichtung in den Beleuchtungsstrahlengang. Beispielsweise können die Gitter zum wahlweisen Einführen in den Beleuchtungsstrahlengang in einem Linearschieber oder einem Revolver angeordnet sein.
Beispielsweise ist ein herkömmliches Beugungsgitter mit Gitterstäben ein eindimensional strukturiertes Gitter.
Grundsätzlich reicht es für die Verwirklichung der Erfindung aus, wenn die zweite Auftrenneinrichtung in dem Sinn einstellbar ist, dass quantitativ verschiedene Werte der Auftrennung in der zweiten Koordinatenrichtung erreicht werden können. Bei einer bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung, ist die zweite Auftrenneinrichtung kontinuierlich einstellbar. Damit ist gemeint, dass die Auftrennung in der zweiten Koordinatenrichtung mindestens in einem Werteintervall kontinuierlich, also stufenlos, oder jedenfalls in sehr kleinen Schritten eingestellt werden kann.
Auch für das Auftrennen des Anregungslichts in der zweiten Koordinatenrichtung können grundsätzlich unterschiedliche physikalische Wirkprinzipien, beispielsweise Brechung, teilweise Reflexion, zum Einsatz kommen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die zweite Auftrenneinrichtung mindestens eine auf Lichtbeugung beruhende Einrichtung auf.
Die Einstellbarkeit der zweiten Auftrenneinrichtung kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden. Beispielsweis kann eine Gitterkonstante der auf Lichtbeugung beruhenden Einrichtung einstellbar sein, wie etwa bei einem SLM. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die auf Lichtbeugung beruhende Einrichtung im Beleuchtungsstrahlengang zum Ausrichten von gebeugtem Licht relativ zur optischen Achse verschwenkbar. Dazu kann beispielsweise ein Antrieb, etwa ein motorischer Antrieb oder ein Piezo-Antrieb, insbesondere ein von der Steuereinheit anzusteuernder Antrieb, vorhanden sein.
Im Hinblick auf die Anordnung der ersten und der zweiten Auftrenneinrichtung im Beleuchtungsstrahlengang besteht grundsätzlich Gestaltungsfreiheit. Die zweite Auftrenneinrichtung zum einstellbaren Auftrennen des Anregungslichts in der zweiten linearen Koordinatenrichtung kann im Beleuchtungsstrahlengang mindestens teilweise strahlaufwärts vor der ersten Auftrenneinrichtung angeordnet sein. Alternativ oder gleichzeitig ist es auch möglich, dass die zweite Auftrenneinrichtung zum einstellbaren Auftrennen des Anregungslichts in der zweiten linearen Koordinatenrichtung im Beleuchtungsstrahlengang mindestens teilweise strahlabwärts nach der ersten Auftrenneinrichtung angeordnet ist.
Bevorzugt weist die zweite Auftrenneinrichtung ein, insbesondere eindimensional strukturiertes, und insbesondere verschwenkbares, Gitter auf.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein zweidimensional strukturiertes und verschwenkbares Gitter vorhanden, welches zur ersten Auftrenneinrichtung und zur zweiten Auftrenneinrichtung gehört.
Dieses zweidimensional strukturierte Gitter kann in einer ersten und einer zweiten linearen Koordinatenrichtung strukturiert sein und um eine Achse verschwenkbar sein, die parallel ist zur ersten Koordinatenrichtung. Durch die Strukturierung in der ersten Koordinatenrichtung kann die Funktion der ersten Auftrenneinrichtung verwirklicht sein und durch die Strukturierung in der zweiten Koordinatenrichtung kann die Auftrennfunktion der zweiten Auftrenneinrichtung verwirklicht sein. Die Variabilität der Auftrennung durch die zweite Auftrenneinrichtung kann wie bei dem zuvor beschriebenen Ausführungsbeispiel erreicht werden durch die Verschwenkbarkeit des zweidimensional strukturierten Gitters und durch eine Variation des Einstrahlwinkels, beispielsweise mit einem verschwenkbaren Spiegel, des Lichts auf das zweidimensional strukturierte Gitter.
Zum Variieren eines Einfallswinkels auf das verschwenkbare Gitter kann im Beleuchtungsstrahlengang vor dem Gitter bevorzugt ein einstellbares Strahlumlenkelement, insbesondere ein verschwenkbarer Spiegel, vorhanden sein.
Im Hinblick auf die zu verwendenden Anteile des gebeugten Lichts besteht grundsätzlich Wahlfreiheit. Wegen der in der Regel höheren verfügbaren Intensität wird aber bevorzugt eher Licht von niedrigen Beugungsordnungen verwendet. Beispielsweise kann das verschwenkbare Gitter relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs dergestalt positioniert sein und das auf das Gitter einfallende Anregungslicht kann dergestalt relativ zu dem Gitter orientiert sein, dass Licht der nullten Beugungsordnung und Licht der ersten Beugungsordnung und/oder einer höheren Beugungsordnung in die hintere Brennebene des Beleuchtungsobjektivs gestrahlt wird. Bei der entsprechenden Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für die Bestrahlung der Probe Anregungslicht der nullten Beugungsordnung und Licht der ersten Beugungsordnung verwendet.
Dieses kann beispielsweise verwirklicht werden, wenn das verschwenkbare Gitter unter einem Winkel φ_g gegen die optische Achse geneigt ist, der gegeben ist durch: $cos (φ_{g}) = \frac{m λ}{2 sin (φ_{T}) Λ}$
worin λ die Wellenlänge des Anregungslichts, φ_T der Winkel des verwendeten gebeugten Lichts gegen die optische Achse, Λ die Gitterkonstante des Gitters und m die Beugungsordnung des verwendeten Lichts ist.
Zum geeigneten Einstellen der Intensitäten des Anregungslichts in den einzelnen Beleuchtungsspots in der Pupillenebene kann in einer Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs oder in der Nähe einer Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs ein, insbesondere einstellbarer und/oder ortsauflösender, Abschwächer vorhanden sein. Dieser Abschwächer kann insbesondere mit der Steuereinheit ansteuerbar sein. Wenn Licht der nullten Beugungsordnung nicht erwünscht ist, kann es mit einem solchen Abschwächer ausgeblendet werden.
Das Gitter kann aber auch so gefertigt sein, dass die nullte Beugungsordnung und die erste Beugungsordnung von vornherein, die gewünschten relativen Intensitätsverteilungen, insbesondere gleiche Intensitäten aufweisen.
Ergänzend oder vor allem alternativ kann das verschwenkbare Gitter relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs dergestalt positioniert sein und das auf das Gitter einfallende Anregungslicht dergestalt relativ zu dem Gitter orientiert sein, dass Licht der ersten Beugungsordnung und Licht der minus ersten Beugungsordnung in die hintere Brennebene des Beleuchtungsobjektivs gestrahlt wird. Dabei kann gegebenenfalls der Vorteil erreicht werden, dass die genutzten Beugungsordnungen von vornherein die gleiche Intensität aufweisen. Bei der entsprechenden Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für die Bestrahlung der Probe Anregungslicht der ersten Beugungsordnung und Licht der minus ersten Beugungsordnung verwendet.
Dieses kann verwirklicht werden, wenn das Anregungslicht unter einem Einfallswinkel φ auf das verschwenkbare Gitter einfällt, der gegeben ist durch: $| {sin}^{- 1} (\frac{λ}{Λ} - sin (φ)) - {sin}^{- 1} (- \frac{λ}{Λ} - sin (φ)) | = 2 φ_{T}$
worin λ die Wellenlänge des Anregungslichts, φ_T der Winkel des verwendeten gebeugten Anregungslichts gegen die optische Achse und Λ die Gitterkonstante des Gitters ist.
Grundsätzlich kann aber auch Licht höherer Beugungsordnungen verwendet werden. Bei solchen Varianten ist das verschwenkbare Gitter relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs dergestalt positioniert und das auf das Gitter einfallende Anregungslicht ist dergestalt relativ zu dem Gitter orientiert, dass mindestens für Teile des in die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs gestrahlten Lichts gilt: |m| > 1, worin m die Beugungsordnung an dem Gitter ist.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und den erfindungsgemäßen Verfahren kann die Geometrie des Gitters und dessen Beleuchtung so eingestellt werden, dass die genutzten Beugungsordnungen symmetrisch um die optische Achse liegen.
Die genutzten Beugungsordnungen nehmen einen Winkel zur optischen Achse ein, der in der Probeneben einem Einfallswinkel entspricht, der größer ist als der Winkel für Totalreflexion und insbesondere einem TIRF-Winkel entspricht. Für den Einfallswinkel des Anregungslichts auf das Gitter bezogen auf die optische Achse muss das nicht gelten. Die Winkel der genutzten Beugungsordnungen sind mindestens in einem kleinen Bereich einstellbar.
Bei weiteren Varianten der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die zweite Auftrenneinrichtung mindestens einen Strahlteiler, insbesondere einen Neutralteiler, auf. Eine Variabilität der Auftrennung kann erreicht werden, indem die zweite Auftrenneinrichtung, insbesondere strahlausgangsseitig und insbesondere in einer Richtung parallel zur optischen Achse, linear verschiebbar ist. Beispielsweise kann die zweite Auftrenneinrichtung eine linear verschiebbare beschichtete keilförmige oder prismatische Komponente, insbesondere mit einem internen Strahlteiler, aufweisen.
Für die Verschiebeeinrichtung kommt es darauf an, dass sie ein Verschieben des Beleuchtungsmusters hinreichend definiert, also beispielsweise in hinreichend kleinen Schritten und über einen hinreichenden Verschiebehub jeweils in den beiden linearen Koordinatenrichtungen senkrecht zur optischen Achse erlaubt. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die Verschiebeeinrichtung mindestens einen verschwenkbaren Spiegel, insbesondere einen zweiachsigen Scannerspiegel, auf oder ist durch mindestens einen verschwenkbaren Spiegel gebildet. Solche verschwenkbaren Spiegel können bevorzugt in einer Pupillenebene oder in der Nähe einer Pupillenebene angeordnet sein.
Grundsätzlich ist es auch möglich, dass die Verschiebeeinrichtung mindestens ein, insbesondere ansteuerbares und/oder programmierbares, Mikrospiegelarray aufweist oder durch mindestens ein, insbesondere ansteuerbares und/oder programmierbares, Mikrospiegelarray gebildet ist.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Verschiebeeinrichtung durch eine, insbesondere galvanometrisch zweiachsig verschwenkbare, Glasplatte gebildet. Allgemein kann die Verschiebeeinrichtung zweckmäßig von der Steuereinheit angesteuert werden.
Grundsätzlich kommt es für die Verwirklichung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der erfindungsgemäßen Verfahren zwar nicht auf den Polarisationszustand des Anregungslichts an. Der Modulationskontrast und damit die letzten Endes erreichbare Auflösung können aber durch die Verwendung von polarisiertem Licht gesteigert werden. Bei einer bevorzugten Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist im Beleuchtungsstrahlengang, insbesondere in einer Zwischenbildebene oder in der Nähe einer Zwischenbildebene, ein Linearpolfilter zum linearen Polarisieren des Anregungslichts vorhanden. Damit können Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens verwirklicht werden, bei denen das Anregungslicht im Wesentlichen linear polarisiert auf die Probe gestrahlt wird. Bevorzugt wird eine lineare Polarisation in Richtung der zweiten linearen Koordinatenrichtung eingestellt, also in der Richtung, in der auch der Abstand der Beleuchtungsspots in der Pupille einstellbar ist und insbesondere maximal ist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird eine sogenannte azimutale Polarisation verwendet. Dabei ist die Polarisation grundsätzlich überall linear und die Polarisationsvektoren liegen jeweils auf den Koordinatenlinien des Azimutwinkels, also auf Kreisringen um den Koordinatenursprung, also um die optische Achse.
Bei einer anderen Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann im Beleuchtungsstrahlengang, insbesondere in einer Zwischenbildebene oder in der Nähe einer Zwischenbildebene, ein Zirkularpolfilter zum zirkularen Polarisieren des Anregungslichts vorhanden sein. Damit können Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens verwirklicht werden, bei denen das Anregungslicht im Wesentlichen zirkular polarisiert auf die Probe gestrahlt wird.
Grundsätzlich können das Beleuchtungsobjektiv und das Mikroskopobjektiv unterschiedliche Objektive sein. Das wäre beispielsweise der Fall, wenn eine Probe im Durchlicht beobachtet würde. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist aber das Beleuchtungsobjektiv und das Mikroskopobjektiv ein und dasselbe Objektiv.
Zum Abtrennen von Anteilen des Anregungslichts im Emissionslicht kann in grundsätzlich bekannter Weise ein Hauptfarbteiler vorhanden sein. Um im Hinblick auf die Verwendung von Anregungslicht mit unterschiedlichen Wellenlängen flexibel zu sein, können beispielsweise mehrere austauschbare Hauptfarbteiler vorhanden sein, die zum wahlweisen Einführen in den Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang in einem Linearschieber oder einem Revolver angeordnet sind.
Zum Variieren eines Abstands zwischen der Probe und dem Beleuchtungsobjektiv und/oder dem Mikroskopobjektiv kann ein, insbesondere motorisch angetriebener, z-Verschub vorhanden sein. Dieser z-Verschub kann von der Steuereinheit ansteuerbar sein.
Zwischen dem Beleuchtungsobjektiv und der Probe kann ein Immersionsmedium, beispielsweise ein Immersionsöl, zur Anpassung der Brechungsindizes vorhanden sein.
Zum Variieren eine Vergrößerung des auf die Kamera abgebildeten Bildes der Probe können im Detektionsstrahlengang mehrere austauschbare Tubuslinsen vorhanden sein. Die austauschbaren Tubuslinsen können zum wahlweisen Einführen in den Detektionsstrahlengang in einem Linearschieber oder einem Revolver angeordnet sein.
Die Steuereinheit kann eingerichtet sein zum Ansteuern von einer oder mehreren der folgenden Komponenten, insbesondere teilweise oder vollständig abgestimmt aufeinander:

• einstellbares Strahlumlenkelement, insbesondere Spiegel;
• zweite Auftrenneinrichtung, insbesondere verschwenkbares Gitter;
• Verschiebeeinrichtung, insbesondere verschwenkbare Glasplatte;
• ortsauflösender Abschwächer;
• Verschiebeeinrichtung zum Variieren eines Abstands zwischen der Probe und dem Beleuchtungsobjektiv und/oder dem Mikroskopobjektiv;
• Kamera.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten Figuren erläutert. Darin zeigt:

1: ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
2: ein Diagramm zur Erläuterung eines Ausführungsbeispiels der zweiten Auftrenneinrichtung und einer ersten Verfahrensvariante;
3: ein Diagramm zur weiteren Erläuterung der im Zusammenhang mit 2 beschriebenen Verfahrensvariante;
4: ein Diagramm zur Erläuterung einer zweiten Verfahrensvariante unter Verwendung der in 2 gezeigten Auftrenneinrichtung;
5: ein Diagramm zur weiteren Erläuterung der im Zusammenhang mit 4 beschriebenen Verfahrensvariante;
6: eine schematische Darstellung der Beleuchtungssituation in einer Pupillenebene;
7: Darstellungen von zweidimensionalen Beleuchtungsmustern bei Zirkularpolarisation des Anregungslichts (a) und bei linearer horizontaler Polarisation des Anregungslichts (b);
8: ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung und
9: ein drittes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Generell sind gleiche und gleichwirkende Komponenten in den Figuren in der Regel jeweils mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit dieser Vorrichtung möglich sind, werden im Zusammenhang mit den 1 bis 7 erläutert.
Die in 1 schematisch dargestellte Vorrichtung 200 für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung weist als wesentliche Bestandteile zunächst einen Beleuchtungsstrahlengang 10 und einen Detektionsstrahlengang 40 auf. Der Beleuchtungsstrahlengang 10 dient zum Bestrahlen einer Probe S mit Anregungslicht 13. Der Detektionsstrahlengang 40 dient dazu, Emissionslicht 38, welches die Probe S infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht 13 abstrahlt, auf eine Kamera 90 zu leiten. Die Kamera 90 dient zum Aufnehmen von Bildern der Probe S. Zum Berechnen von mikroskopischen Bildern der Probe S unter Verwendung von für verschiedene Positionen des Beleuchtungsmusters in der Probenebene aufgenommenen Teilbildern der Probe S ist eine Steuereinheit 100, beispielsweise ein PC, vorhanden. Zum Halten der Probe ist im Beispiel der 1 eine Probenhalterung 42 vorhanden.
Im Einzelnen gelangt das Anregungslicht 13 von einer nicht dargestellten Lichtquelle, beispielsweise einem Laser, über eine optische Faser 11 und eine Linse 12 auf den verschwenkbaren Spiegel 14, der auch als TIRF-Spiegel bezeichnet werden kann. Mit dem Spiegel 14 kann ein Winkel des Anregungslichts 13 relativ zur optischen Achse 18 eingestellt werden. Über weitere Linsen 16 und 22, zwischen denen eine Pupillenebene 20 gebildet ist, gelangt das Anregungslicht 13 auf das Beugungsgitter 24, welches in diesem Ausführungsbeispiel die erste Auftrenneinrichtung verwirklicht. Zum Anpassen an verschiedene Wellenlängen sind weitere Beugungsgitter 24a, 24b vorhanden, die über einen Linearschieber wahlweise in den Strahlengang eingebracht werden können. Das Beugungsgitter 24 dient erfindungsgemäß dazu, das Anregungslichts 13 in einer ersten linearen Koordinatenrichtung y in einer Pupillenebene 34 aufzutrennen. Die Gitterstäbe des Beugungsgitters 24 verlaufen dazu parallel zur Ebene der Zeichnung. Die Auftrennung erfolgt dementsprechend in einer Richtung senkrecht zur der Ebene der Zeichnung und damit in der Koordinatenrichtung y in 6.
Das durch das Beugungsgitter 24 in der ersten Koordinatenrichtung y (siehe 6) aufgetrennte Anregungslicht 13 gelangt sodann auf das Beugungsgitter 26, welches zusammen mit dem verschwenkbaren Spiegel 14 in dem Ausführungsbeispiel der 1 die zweite Auftrenneinrichtung verwirklicht. Der Spiegel 14 und das Beugungsgitter 26 sind beide um eine Achse verschwenkbar, die senkrecht zur Zeichnungsebene orientiert ist. Das Anregungslicht 13 ist nunmehr in den beiden linearen Koordinatenrichtungen x und y aufgetrennt, besteht also aus vier Strahlbündeln. Licht der nullten Beugungsordnung wurde geblockt. Über eine Tubuslinse 30 und den Hauptfarbteiler 32 gelangen diese Strahlenbündel in die hintere Brennebene 34 eines Beleuchtungsobjektivs 36 und bilden dort vier Beleuchtungspunkte.
Die Beleuchtungssituation in der Pupillenebene 34 ist schematisch in 1 links unterhalb vom Beleuchtungsobjektiv 36 dargestellt. Die Pupille weist die Form einer Kreisscheibe auf. Der äußere Kreisring entspricht dabei Winkeln in der Ebene der Probe S, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion. Schematisch dargestellt sind in diesem äußeren Kreisring die vier Beleuchtungspunkte, durch die ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster in der Probe S generiert wird. Wie die Beleuchtungspunkte in der Pupillenebene 34 mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung 200 generiert werden, wird weiter unten, insbesondere im Zusammenhang mit 6, beschrieben.
Das Anregungslicht 13 wird sodann als zweidimensionales Beleuchtungsmuster unter Winkeln, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion, auf die Probe S eingestrahlt.
Zwei Beispiele eines zweidimensionales Beleuchtungsmusters sind in 7 dargestellt. Unter a) ist in 7 ein Beleuchtungsmuster gezeigt, bei dem das Anregungslicht 13 mit zirkularer Polarisation auf die Probe S eingestrahlt wird. Unter b) ist in 7 ein Beleuchtungsmuster gezeigt, bei dem das Anregungslicht 13 mit linearer horizontaler Polarisation parallel zur x-Richtung (siehe 6) auf die Probe S eingestrahlt wird. Bei der linearen horizontalen Polarisation ist der Modulationskontrast etwas besser. Die für das Erreichen der gewünschten Polarisation notwendigen Polarisationsfilter sind in 1 nicht dargestellt. Sie sind zweckmäßig in einer Zwischenbildebene oder in der Nähe einer Zwischenbildebene angeordnet.
Zum lateralen Verschieben des Beleuchtungsmusters in der Probeebene ist eine Verschiebeeinrichtung vorhanden, die in dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel als galvanometrisch zweiachsig verschwenkbare Glasplatte 28 gebildet ist. Die Glasplatte 28, die zwischen dem verschwenkbaren Gitter 26 und der Tubuslinse 30 in einer Zwischenbildebene oder in der Nähe einer Zwischenbildebene angeordnet ist, ist um eine Achse, die zur Ebene der Zeichnung senkrecht orientiert ist, verschwenkbar und außerdem verschwenkbar um eine Achse, die in der Zeichnungsebene liegt und senkrecht zur optischen Achse 18 orientiert ist. Durch geeignetes Verschwenken der Glasplatte 28 um diese Achsen kann das zweidimensionale Beleuchtungsmuster lateral in beiden linearen Koordinatenrichtungen x, y in der Probenebene verschoben werden. Solche verschwenkbaren Glasplatten werden auch als Wackelplatten-Phasen-Shifter bezeichnet.
Typischerweise wird das Beleuchtungsmuster pro Periode des Beleuchtungsmusters auf beispielsweise 3 bis 5 Positionen verschoben, sodass insgesamt aus etwa 9 Teilbildern ein mikroskopisches Bild der Probe berechnet wird.
Erfindungsgemäß ist zum variablen Auftrennen des Anregungslichts 13 in der Pupillenebene 34 in einer zweiten linearen Koordinatenrichtung x, die von der ersten linearen Koordinatenrichtung y unabhängig ist, eine zweite Auftrenneinrichtung vorhanden, die einstellbar ist. In dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ist die zweite Auftrenneinrichtung gebildet aus einem verschwenkbaren Spiegel 14 und einem ebenfalls verschwenkbaren Beugungsgitter 26, dessen Gitterstäbe senkrecht zur Zeichnungsebene orientiert sind.
Der Detektionsstrahlengang 40 verläuft in dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel über das Mikroskopobjektiv 36, welches identisch ist mit dem Beleuchtungsobjektiv, über den Hauptfarbteiler 32, der Anteile des Anregungslichts 13 aus dem von Probe S infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht 13 abgestrahlten Emissionslicht 38 abtrennt, über einen weiteren Emissionsfilter 44, eine Tubuslinse 46 und einen Spiegel 48 zur Kamera 90. Zum Variieren der Vergrößerung stehen in einem Linearschieber mehrere unterschiedliche Tubuslinsen 46, 46a, 46b zur Verfügung, die wahlweise in den Detektionsstrahlengang 40 eingebracht werden können.
Die Wirkung des Beugungsgitters 24 und des verschwenkbaren Beugungsgitters 26 wird mit Bezug auf 6 näher erläutert. 6 zeigt in a) und b) jeweils Darstellungen der Pupillenebene 34. Die Pupille weist wegen der Zylindersymmetrie des Beleuchtungsobjektivs 36 eine Kreisform auf, wobei die Punkte in den dargestellten äußeren Kreisringen denjenigen Punkten entsprechen, die zu Beleuchtungswinkeln in der Probenebene gehören, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion. Zunächst soll die Situation ohne das Beugungsgitter 24 und ohne das verschwenkbare Beugungsgitters 26 betrachtet werden. Wären die Beugungsgitters 24 und 26 nicht vorhanden und wäre der Spiegel 14 außerdem so eingestellt, dass das Anregungslicht 13 den Beleuchtungsstrahlengang 10 unter einem Winkel von 0° relativ zur optischen Achse 18 durchläuft, würde das Anregungslicht 13 von der Tubuslinse 30 in einen Punkt im Zentrum der Pupillenebene 34 fokussiert. Durch die Wirkung des Beugungsgitters 24 erfolgt nun eine Aufspaltung in der ersten linearen Koordinatenrichtung y, d. h. vertikal in 6. Diese Aufspaltung ist in der Skizze unter a) in 6 durch die beiden schwarzen Punkte, die beide auf der y-Achse liegen, mithin jeweils eine x-Koordinate von null aufweisen, dargestellt. Durch die Wirkung des verschwenkbaren Gitters 26 zusammen mit dem verschwenkbaren Spiegel 14 erfolgt sodann die Aufspaltung in der zweiten linearen Koordinatenrichtung x, so dass im Ergebnis insgesamt vier Beleuchtungsspots im äußeren Ring der Pupille vorhanden sind. Aus dem oberen Beleuchtungsspot auf der y-Achse werden so die Beleuchtungsspots 1. und 2., aus dem unteren Beleuchtungsspot auf der y-Achse entstehen entsprechend die Beleuchtungsspots 3. und 4.
In der Skizze unter b) in 6 sind Beleuchtungsspots dargestellt, mit denen ein Beleuchtungswinkel, der kleiner ist als der Winkel für Totalreflexion noch erreicht werden kann. Im Fall der vier schwarzen innen liegenden Beleuchtungsspots wird der Winkel für Totalreflexion gerade erreicht. Mit diesem Punktmuster wird bei der gegebenen Aufspaltung in y-Richtung die maximale Periode des Beleuchtungsmusters in der y-Richtung erreicht. Mit den vier außen an der Grenze der numerischen Apertur liegenden Beleuchtungsspots (Kreise) wird bei der gegebenen Aufspaltung in y-Richtung die minimale Periode des Beleuchtungsmusters in der y-Richtung erreicht. Zwischen den Extremfällen der vier schwarzen innenliegenden Beleuchtungsspots (schwarze Punkte) und den vier außenliegenden Beleuchtungsspots (schwarze Kreise) kann das Beleuchtungsmuster mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingestellt werden. Der Polarisationsvektor erstreckt sich bei diesem Beispiel jeweils parallel zur x-Richtung, was als linear horizontale Polarisation bezeichnet wird.
Eine erste Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der Licht der nullten und der ersten Beugungsordnung verwendet wird, wird mit Bezug auf die 2 und 3 erläutert.
2 zeigt schematisch das verschwenkbare Beugungsgitter 26, das in der gezeigten Situation um einen Winkel φ_g relativ zur optischen Achse 18 verkippt ist. Die Gitterstäbe des Beugungsgitters 26 erstrecken sich senkrecht zur Ebene der Zeichnung. Der Winkel φ_g kann durch Verschwenken des Beugungsgitters 26, gegebenenfalls durch Ansteuerung mit der Steuereinheit 100, verstellt werden. Das Anregungslicht 13 wird auf das Beugungsgitter 26 unter einem Winkel φ relativ zu dessen Flächennormale eingestrahlt. Es ist: $φ = φ_{g} + φ_{T}$
worin φ_T der Winkel des Anregungslichts 13 relativ zur optischen Achse 18 ist, der durch Einstellung des Spiegels 14, gegebenenfalls durch Ansteuerung mit der Steuereinheit 100, variiert werden kann.
Eingetragen sind in 2 außerdem die Strahlen der nullten Beugungsordnung O.BO und der ersten Beugungsordnung 1.BO. Der Strahl der nullten Beugungsordnung O.BO nimmt relativ zur optischen Achse 18 einen Winkel von -φT und relativ zur Flächennormale des Beugungsgitters 26 einen Winkel von -φ ein. Dieses folgt aus dem Winkel des Anregungslichts 13 relativ zur optischen Achse 18 beziehungsweise relativ zur Flächennormale des Beugungsgitters 26.
Der Strahl der ersten Beugungsordnung 1.BO nimmt relativ zur optischen Achse 18 einen Winkel φ₁ und relativ zur Flächennormale des Beugungsgitters 26 einen Winkel φ' ein. Es ist: $φ_{1} = φ' - φ_{g}$
Damit, wie gewünscht die durch die Strahlen O.BO und 1.BO gebildeten Beleuchtungsspots in der hinteren Brennebene 34 des Mikroskopobjektivs 36 symmetrisch zur y-Achse liegen, muss gelten: $φ_{1} = φ_{T}$
Mit der allgemeinen Gittergleichung $sin (φ') + sin (φ) = \frac{m λ}{Λ}$
folgt gemäß der Geometrie der Abbildung $sin (φ_{1} - φ_{g}) + sin (φ_{T} + φ_{g}) = \frac{m λ}{Λ}$
worin λ die Wellenlänge des Anregungslichts 13, Λ die Gitterperiode des Beugungsgitters 26 und m die Beugungsordnung ist.
Mit φ₁ = φ_T folgt daraus $2 \times sin φ_{T} cos φ_{g} = \frac{m λ}{Λ}$
oder, umgestellt, $cos (φ_{g}) = \frac{m λ}{2 sin (φ_{T}) Λ}$
was eine Art Bragg-Bedingung darstellt.
Aus einer gewünschten Periode des Beleuchtungsmusters folgt eine Position der Beleuchtungsspots in der hinteren Brennebene 34 des Mikroskopobjektivs 36 und daraus wiederum ergibt sich der entsprechende Winkel φ_T. Mit der Gitterperiode Λ als Parameter kann φ_g unter Verwendung von $cos (φ_{g}) = \frac{m λ}{2 sin (φ_{T}) Λ}$
berechnet werden. Dabei kann Λ variiert werden, bis ein optimaler Bereich für φg gefunden ist.
In dem Diagramm der 3 sind der Winkel -φ_T des Strahls der nullten Beugungsordnung O.BO (gestrichelte Kurve) und der Winkel φ₁ des Strahls der ersten Beugungsordnung 1,B0 (durchgezogene Kurve) auf der vertikalen Achse gegen den Gitterwinkel φ_g auf der horizontalen Achse aufgetragen für einen vorgegebenen Winkelbereich für φ_T für das Objektiv „alpha PLAN Apo 63x/1.46 Oil“. Für das gezeigte Beispiel ist Λ = 22,5 µm und λ = 488 nm. Die Beugungswinkel liegen wie ersichtlich im Bereich derjenigen Winkel, die kleiner sind als der Winkel für Totalreflexion.
Der Gitterwinkel φ_g variiert in dem Beispiel über etwa 10°, wenn φ_T variiert wird. Abhängig vom Design des Beugungsgitters 26 kann, falls notwendig, das Intensitätsverhältnis zwischen der nullten und der ersten Beugungsordnung ausgeglichen werden, beispielsweise durch einen pupillennahen Abschwächer.
Allgemein gilt aber, dass auch von vornherein Beugungsgitter verwendet werden können, die das gewünschte Intensitätsverhältnis der verwendeten Beugungsordnungen liefern. Im Beispiel wären gleiche Intensitäten der nullten und der ersten Beugungsordnung erwünscht, was durch geeignetes Design des Beugungsgitters 26 erreicht werden kann.
Bei einer zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Licht der ersten und der minus ersten Beugungsordnung verwendet, um das zweidimensionale Beleuchtungsmuster zu erzeugen. Dieses wird mit Bezug auf die 4 und 5 beschrieben.
4 zeigt wieder das verschwenkbare Beugungsgitter 26 und das darauf einfallende Anregungslicht 13. Das Beugungsgitters 26 ist um einen Winkel φ_g relativ zur optischen Achse 18 verkippt. Das Anregungslicht 13 fällt unter einem Winkel φ relativ zur Flächennormale des Beugungsgitters 26 auf das Beugungsgitter 26 ein. Dargestellt sind außerdem die aus dem Beugungsgitter 26 austretenden Strahlen der ersten Beugungsordnung 1.BO und der minus ersten Beugungsordnung -1.BO, sowie der Strahl der nullten Beugungsordnung. In der in 4 dargestellten Situation sind das Beugungsgitter 26 und die Richtung des Anregungslichts 13 bereits so gedreht, sodass die Strahlen der ersten Beugungsordnung 1.BO und der minus ersten Beugungsordnung -1.BO symmetrisch zur optischen Achse 18 liegen. Der Strahl der ersten Beugungsordnung 1.BO liegt in einem Winkel von φ'₁ relativ zur Flächennormale des Beugungsgitters 26. Der Strahl der minus ersten Beugungsordnung -1.BO liegt in einem Winkel von φ'_-1 relativ zur Flächennormale des Beugungsgitters 26. Der Strahl der nullten Beugungsordnung liegt in einem Winkel von - φ relativ zur Flächennormale des Beugungsgitters 26.
Der Winkel φ_g muss mit den gegebenen Parametern des Beugungsgitters 26 so bestimmt werden, dass für die Differenz der Beugungswinkel zwischen der ersten und der minus ersten Beugungsordnung gilt: $φ'_{- 1} - φ'_{1} = 2 φ_{T}$
worin φ_Twieder derjenige Winkel ist, den die verwendeten Beugungsordnungen relativ zur optischen Achse 18 einnehmen müssen, um in der hinteren Brennebene 34 des Mikroskopobjektivs 36 Beleuchtungsspots an den gewünschten Positionen zu erzeugen.
Das Beugungsgitter 26 und die Richtung des Anregungslichts 13 müssen so gedreht werden, dass die Mitte zwischen den Strahlen der ersten Beugungsordnung 1.BO und der minus ersten Beugungsordnung -1.BO mit der optischen Achse 18 zusammenfällt. Es muss also sein: $(φ'_{- 1} + φ'_{1}) / 2 = - φ_{g}$
Aus der Differenz des Einfallswinkels φ und des Mittenwinkels (φ'_-1+ φ'₁)/2 ergibt sich der Winkel φ_diff des Anregungslichts 13 relativ zur optischen Achse 18.
Weil φ_diff klein ist, ist das Beugungsgitter 26 nahezu um den Mittenwinkel (q'_-1+ φ'₁)/2 oder den Einfallswinkel φ gegen die optische Achse 18 verdreht.
Zur Bestimmung der optimalen Winkeleinstellungen des Beugungsgitters 26 kann wie folgt vorgegangen werden:

1. Der Winkel φ_T wird vorgegeben, siehe oben;
2. Der Einfallswinkel φ wird variiert;
3. Für jedes φ werden die Beugungswinkel φ'₁ und φ'_-1 gemäß Gittergleichung mit der Wellenlänge λ und Gitterperiode λ als Parameter berechnet;
4. die Differenz (φ'_–1 - φ'₁) wird berechnet und mit dem Zielwert 2φ_T verglichen. Wenn Übereinstimmung erzielt wurde, ist das geeignete φ bestimmt;
5. man kann dabei Λ so einstellen, dass für den Durchstimmbereich von φ_T der Variationsbereich von φ möglichst klein ist, Λ_min ist dabei gegeben durch λ/sin (φ_T, _min).

Dieses entspricht dem Bestimmen von φ mit der Gleichung $| {sin}^{- 1} (\frac{λ}{Λ} - sin (φ)) - {sin}^{- 1} (- \frac{λ}{Λ} - sin (φ)) | = 2 φ_{T}$
Das Auflösen dieser Gleichung nach φ reduziert sich mit den Additionstheoremen der arcsin-Funktion auf das Auffinden von Nullstellen eines Polynoms.
5 zeigt ein Diagramm, in dem für das Objektiv „alpha-Plan-Apo 63x / 1.46 Oil“, λ = 488 nm und Λ = 40 µm der Winkel (φ'_–1- φ'₁) zwischen den Strahlen der ersten Beugungsordnung 1.BO und der minus ersten Beugungsordnung -1.BO und der Winkel φ_diff zwischen der Einfallsrichtung des Anregungslichts 13 und der optischen Achse 18 aufgetragen ist gegen den Einfallswinkel φ des Anregungslichts 13 bezogen auf die Flächennormale des Beugungsgitters 26.
Wie ersichtlich, liegt der Winkel (φ'_-1-φ'₁) zwischen den Strahlen der ersten Beugungsordnung 1.BO und der minus ersten Beugungsordnung -1.BO wie gewünscht im Bereich von 2φ_T.
Nachdem eine Methode zur Realisierung einer variablen Distanzeinstellung zwischen den Beleuchtungsspots in der Objektivpupille in der x-Richtung (siehe 6) für den TIRF-Modus ausgewählt wurde, muss berücksichtigt werden, dass für eine in zwei Dimensionen strukturierte Beleuchtung erforderlich ist, dass beispielsweise vier Beleuchtungsspots in der hinteren Brennebene 34 des Mikroskopobjektivs 36 in den außenliegenden Ring (siehe 6) geschoben werden können.
Um den Aufbau zu vereinfachen, sind bei den hier erläuterten Varianten die vier Beleuchtungsspots in der hinteren Brennebene 34 des Mikroskopobjektivs 36, wie im 6 erläutert, nur horizontal, also in x-Richtung, im Abstand veränderbar. Die Aufspaltung in y-Richtung ist durch das verwendete Gitter 24 vorgegeben. Dieses hat zur Folge, dass sich die Modulationsfrequenzen der strukturierten Beleuchtung am Ort der Probe S in x- und y-Richtung leicht unterscheiden können. Die laterale Auflösung wird dadurch aber nur marginal beeinflusst.
Beispiele für die Einstellung der vier Beleuchtungsspots, mit der Option, die horizontale Lage der Beleuchtungsspots, mithin die Aufspaltung in der x-Richtung, einstellen zu können, sind in 6 gezeigt.
Die Beleuchtungsintensität in der Probenebene wird auch von der Polarisation der Beleuchtungsspots beeinflusst (7). Einfach herzustellen sind die Polarisationszustände linear horizontal, linear vertikal und zirkular. Für diese Polarisationszustände haben Simulationen ergeben, dass der Modulationskontrast in x/y-Richtung am besten ist für die linear horizontale Polarisation, also in der x-Richtung, in der auch der Abstand der Beleuchtungsspots einstellbar ist. Konkret lieferten die Simulationen folgende Werte für den x/y-Modulationskontrast: linear horizontale Polarisation: 23% / 72%; zirkulare Polarisation: 25% / 51 %. Vorteilhaft kann auch eine azimutale Polarisation verwendet werden. Dabei ist die Polarisation grundsätzlich überall linear und die Polarisationsvektoren liegen jeweils auf den Koordinatenlinien des Azimutwinkels, also auf Kreisringen um den Koordinatenursprung.
Ein zweites Ausführungsbeispiel für eine erfindungsgemäße Vorrichtung 300 wird mit Bezug auf 8 erläutert. Beschrieben werden hier nur die wesentlichen Unterschiede im Vergleich zum ersten Ausführungsbeispiel der 1, die sich hauptsächlich im Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs 10 vor dem Hauptstrahlteiler 32 finden.
Über eine optische Faser 11, eine Linse 12 und eine Lambda/2-Platte 15 gelangt das Anregungslicht 13 auf das Beugungsgitter 25, durch welches in diesem Ausführungsbeispiel die erste Auftrenneinrichtung verwirklicht ist. Das Anregungslicht 13 wird durch das Beugungsgitter 25 in einer Richtung senkrecht zur Ebene der Zeichnung, also in der ersten linearen Koordinatenrichtung y, aufgetrennt. Über eine weitere Linse 27 gelangt das in der Richtung senkrecht zur Ebene der Zeichnung aufgespaltene Anregungslicht 13 auf einen linear verschiebbaren beschichteten Keil 70, durch den im Ausführungsbeispiel der 8 die zweite Auftrenneinrichtung verwirklicht ist. Der Keil 70 kann auch als Prisma, Doppelprisma oder Strahlteiler-Doppelprisma bezeichnet werden. Die Lichtbündel des aufgetrennten Anregungslichts 13 treten nahezu senkrecht und nahezu vollständig in den Keil 70 ein und werden dann in dessen Mitte an einem 50:50-Strahlteiler im wesentlichen mit symmetrischer Intensitätsverteilung, wie durch die Pfeile 74 angedeutet, aufgetrennt. Durch lineare Verschiebung des Keils 70 in Richtung der Pfeile 72 kann die Aufspaltung quantitativ eingestellt werden. Mit Verschiebung des Keils 70 nach links nimmt die Aufspaltung in Richtung der Pfeile 74 zu und entsprechend nimmt sie mit Verschiebung des Keils 70 nach rechts ab. Die so aufgetrennten Lichtbündel des Anregungslichts 13 gelangen sodann über eine weitere Linse 27, die verschwenkbare Glasplatte 28 und die Tubuslinse 30 auf den Hauptstrahlteiler 32 und von dort in die hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs 36. Über ein Spiegel-Prisma 29 kann hier optional noch Beleuchtungslicht für die Weitfeldmikroskopie eingekoppelt werden.
Ein drittes Ausführungsbeispiel für eine erfindungsgemäße Vorrichtung 400 wird mit Bezug auf 9 erläutert. Hier werden nur die wesentlichen Unterschiede im Vergleich zum dritten Ausführungsbeispiel der 8 erläutert, die sich hauptsächlich im Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs 10 vor dem verschiebbaren Keil 70 finden.
Der wesentliche Unterschied des Ausführungsbeispiels der 9 im Vergleich zu 8 ist, dass die erste Auftrenneinrichtung durch einen Spatial-Light-Modulator 80 verwirklicht ist. Konkret gelangt das Anregungslicht 13 auf einen ersten Teilbereich 82 des Spatial-Light-Modulators 80, der sich in oder jedenfalls nahe einer Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs 10 befindet. In dem ersten Teilbereich 82 wird der Spatial-Light-Modulator 80 im Wesentlichen so angesteuert, dass eine Linsenfunktion (Fourier-Transformation) verwirklicht wird. Das dergestalt manipulierte Anregungslicht 13 gelangt sodann auf einen Spiegel 86 und wird von diesem zurück auf einen zweiten Teilbereich 84 des Spatial-Light-Modulators 80 gestrahlt, der sich in oder jedenfalls nahe einer Zwischenbildebene des Beleuchtungsstrahlengangs 10 befindet. Durch diesen zweiten Teilbereich 84 des Spatial-Light-Modulators 80 wird im Ausführungsbeispiel der 9 die erste Auftrenneinrichtung verwirklicht, d. h. das Anregungslicht 13 wird in der Richtung senkrecht zur Ebene der Zeichnung, mithin in der ersten linearen Koordinatenrichtung y, aufgetrennt. Der Spiegel 86 kann auch ein sphärischer Hohlspiegel sein, wobei in diesem Fall die Linsenfunktion im Teilbereich 82 des Spatial-Light-Modulators 80 nicht notwendig ist. Über eine Lambda/2-Platte und eine Linse 17 treffen die Lichtbündel des in der Richtung senkrecht zur Ebene der Zeichnung aufgetrennten Anregungslichts 13 sodann wieder auf den linear verschiebbaren Keil 70, mit dem, wie bei dem Ausführungsbeispiel der 8, die variable Auftrennung in der zweiten linearen Koordinatenrichtung bewerkstelligt wird.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein alternativer Ansatz zur variablen Positionierung von Beleuchtungsspots des Anregungslichts in einer Pupillenebene beschrieben.
Bezugszeichenliste

10: Beleuchtungsstrahlengang
11: optische Faser, Lichtleitfaser
12: Linse
13: Anregungslicht
14: verschwenkbarer Spiegel, TIRF-Spiegel, Teil der zweiten Auftrenneinrichtung
15: Lambda/2-Platte
16: Linse
17: Linse, Tubuslinse
18: optische Achse
20: Pupillenebene
22: Linse, Kollimatorlinse
24: Beugungsgitter, insbesondere in oder nahe Zwischenbildebene, insbesondere auf Linearschieber, erste Auftrenneinrichtung
24a: Beugungsgitter, alternativ zu Beugungsgitter 24, insbesondere auf Linearschieber
24b: Beugungsgitter, alternativ zu Beugungsgitter 24, insbesondere auf Linearschieber
25: Beugungsgitter, erste Auftrenneinrichtung
26: verschwenkbares Beugungsgitter, Teil der zweiten Auftrenneinrichtung
27: Linse
28: verschwenkbare Glasplatte, Wackelplatten-Phasen-Shifter, Verschiebeeinrichtung
29: Spiegel-Prisma
30: Tubuslinse im Beleuchtungsstrahlengang
32: Hauptstrahlteiler, insbesondere in Reflektorrevolver
34: hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs 36, Pupillenebene
36: Beleuchtungsobjektiv, Mikroskopobjektiv
38: Emissionslicht
40: Detektionsstrahlengang
42: Probenhalterung, Probentisch
44: Emissionsfilter
46: Tubuslinse im Detektionsstrahlengang 40, insbesondere auf Linearschieber
46a: Tubuslinse im Detektionsstrahlengang 40, alternativ zu Tubuslinse 46, insbesondere auf Linearschieber
46b: Tubuslinse im Detektionsstrahlengang 40, alternativ zu Tubuslinse 46, insbesondere auf Linearschieber
48: Spiegel
70: verschiebbarer beschichteter Keil, Prisma, Doppelprisma, Strahlteiler-Doppelprisma
72: Verschieberichtung
74: durch Verschieben einstellbarer Abstand der aufgetrennten Strahlen
80: Spatial-Light-Modulator (SLM)
82: erster Teil des Spatial-Light-Modulators 80, insbesondere in oder nahe Pupillenebene
84: zweiter Teil des Spatial-Light-Modulators 80, insbesondere in oder nahe Zwischenbildebene
86: Spiegel, eben oder sphärischer Hohlspiegel
90: Kamera, z.B. sCMOS-Kamera
100: Steuereinheit, beispielsweise PC
200: erfindungsgemäßes Mikroskop
300: erfindungsgemäßes Mikroskop
400: erfindungsgemäßes Mikroskop
S: Probe

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 10222599 B2 [0002, 0004]

Claims

Vorrichtung für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung, mit einem Beleuchtungsstrahlengang (10) zum Bestrahlen einer Probe (S) unter Winkeln, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion mit Anregungslicht (13) mit einem zweidimensionalen Beleuchtungsmuster, wobei der Beleuchtungsstrahlengang (10) mindestens aufweist ein Beleuchtungsobjektiv (36), über welches die Probe (S) bestrahlt wird, eine erste Auftrenneinrichtung (24) zum Auftrennen des Anregungslichts (13) in einer ersten linearen Koordinatenrichtung (y) in einer Pupillenebene (34) und eine Verschiebeeinrichtung (28) zum lateralen Verschieben des Beleuchtungsmusters in einer Probeebene, mit einem Detektionsstrahlengang (40) enthaltend mindestens ein Mikroskopobjektiv (36) zum Leiten von von der Probe (S) infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht (13) abgestrahltem Emissionslicht (38) auf eine Kamera (90), mit der Kamera (90) zum Aufnehmen von Bildern der Probe (S), mit einer Steuereinheit (100) zum Berechnen von mikroskopischen Bildern der Probe (S) unter Verwendung von für verschiedene Positionen des Beleuchtungsmusters in der Probenebene aufgenommenen Teilbildern der Probe (S), dadurch gekennzeichnet, dass zum variablen Auftrennen des Anregungslichts (13) unabhängig von dem Auftrennen in der ersten linearen Koordinatenrichtung (y) in der Pupillenebene (34) in einer zweiten linearen Koordinatenrichtung (x), die von der ersten linearen Koordinatenrichtung (y) unabhängig ist, eine zweite Auftrenneinrichtung (14, 26) vorhanden ist, die einstellbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Auftrenneinrichtung (24) eine auf Lichtbeugung beruhende Einrichtung aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Auftrenneinrichtung ein, insbesondere eindimensional strukturiertes, Gitter (24) oder einen Spatial-Light-Modulator (80) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere, insbesondere eindimensional strukturierte, Gitter (24, 24a, 24b) vorhanden sind zum wahlweisen Einbringen in den Beleuchtungsstrahlengang (10) als erste Auftrenneinrichtung.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Auftrenneinrichtung (14, 26) kontinuierlich einstellbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Auftrenneinrichtung mindestens eine, insbesondere verschwenkbare, auf Lichtbeugung beruhende Einrichtung (26) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die auf Lichtbeugung (26) beruhende Einrichtung im Beleuchtungsstrahlengang (10) zum Ausrichten von gebeugtem Licht relativ zur optischen Achse (18) verschwenkbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Auftrenneinrichtung ein, insbesondere eindimensional strukturiertes, und insbesondere verschwenkbares, Gitter (26) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweidimensional strukturiertes und verschwenkbares Gitter vorhanden ist, welches zur ersten Auftrenneinrichtung und zur zweiten Auftrenneinrichtung gehört.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zum Variieren eines Einfallswinkels auf das verschwenkbare Gitter (26) im Beleuchtungsstrahlengang (10) vor dem Gitter (26) ein einstellbares Strahlumlenkelement, insbesondere ein verschwenkbarer Spiegel (14), vorhanden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das verschwenkbare Gitter (26) relativ zur optischen Achse (18) des Beleuchtungsstrahlengangs (10) dergestalt positioniert ist und das auf das Gitter (26) einfallende Anregungslicht (13) dergestalt relativ zu dem Gitter (26) orientiert ist, dass Licht der nullten Beugungsordnung (0.BO) und Licht der ersten Beugungsordnung (1.BO) und/oder einer höheren Beugungsordnung in die hintere Brennebene (34) des Beleuchtungsobjektivs (36) gestrahlt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das verschwenkbare Gitter (26) unter einem Winkel φ_g gegen die optische Achse (18) geneigt ist, der gegeben ist durch: $cos (φ_{g}) = \frac{m λ}{2 sin (φ_{T}) Λ}$
worin λ die Wellenlänge des Anregungslichts (13), φ_T der Winkel des verwendeten gebeugten Lichts gegen die optische Achse (18), Λ die Gitterkonstante des Gitters (26) und m die Beugungsordnung des verwendeten Lichts ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das verschwenkbare Gitter (26) relativ zur optischen Achse (18) des Beleuchtungsstrahlengangs (10) dergestalt positioniert ist und das auf das Gitter (26) einfallende Anregungslicht (13) dergestalt relativ zu dem Gitter (26) orientiert ist, dass Licht der ersten Beugungsordnung (1.BO) und Licht der minus ersten Beugungsordnung (-1.BO) in die hintere Brennebene (34) des Beleuchtungsobjektivs (36) gestrahlt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (13) unter einem Einfallswinkel φ auf das verschwenkbare Gitter (26) einfällt, der gegeben ist durch: $| {sin}^{- 1} (\frac{λ}{Λ} - sin (φ)) - {sin}^{- 1} (- \frac{λ}{Λ} - sin (φ)) | = 2 φ_{T}$
worin λ die Wellenlänge des Anregungslichts (13), φ_T der Winkel des verwendeten gebeugten Anregungslichts (13) gegen die optische Achse und Λ die Gitterkonstante des Gitters (26) ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das verschwenkbare Gitter (26) relativ zur optischen Achse (18) des Beleuchtungsstrahlengangs (10) dergestalt positioniert ist und das auf das Gitter (26) einfallende Anregungslicht (13) dergestalt relativ zu dem Gitter (26) orientiert ist, dass mindestens für Teile des in die hintere Brennebene (34) des Mikroskopobjektivs (36) gestrahlten Lichts gilt: |m| > 1, worin m die Beugungsordnung an dem Gitter (26) ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Auftrenneinrichtung mindestens einen Strahlteiler, insbesondere einen Neutralteiler, aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Auftrenneinrichtung, insbesondere in einer Richtung parallel zur optischen Achse (18), linear verschiebbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Auftrenneinrichtung eine linear verschiebbare beschichtete keilförmige Komponente (70) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebeeinrichtung mindestens einen verschwenkbaren Spiegel, insbesondere einen zweiachsigen Scannerspiegel, aufweist oder durch mindestens einen verschwenkbaren Spiegel gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebeeinrichtung mindestens ein, insbesondere ansteuerbares und/oder programmierbares, Mikrospiegelarray aufweist oder durch mindestens ein, insbesondere ansteuerbares und/oder programmierbares, Mikrospiegelarray gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebeeinrichtung durch eine, insbesondere galvanometrisch zweiachsig verschwenkbare, Glasplatte (28) gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs (10) oder in der Nähe einer Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs (10) ein, insbesondere einstellbarer und/oder ortsauflösender, Abschwächer vorhanden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsobjektiv (36) und das Mikroskopobjektiv (36) ein und dasselbe Objektiv ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abtrennen von Anteilen des Anregungslichts im Emissionslicht (38) ein Hauptfarbteiler (32) vorhanden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (100) zum Ansteuern von einer oder mehreren der folgenden Komponenten, insbesondere abgestimmt aufeinander eingerichtet ist: • einstellbares Strahlumlenkelement (14), insbesondere Spiegel; • zweite Auftrenneinrichtung, insbesondere verschwenkbares Gitter (26); • Verschiebeeinrichtung (28), insbesondere verschwenkbare Glasplatte (28); • ortsauflösender Abschwächer; • Verschiebeeinrichtung zum Variieren eines Abstands zwischen der Probe (S) und dem Beleuchtungsobjektiv (36) und/oder dem Mikroskopobjektiv (36); • Kamera (90).
Verfahren zum Beleuchten einer Probe für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung, bei dem eine Probe (S) mit einem Beleuchtungsstrahlengang (10) unter Winkeln, die größer sind als der Winkel für Totalreflexion, über ein Beleuchtungsobjektiv (36) mit Anregungslicht (13) mit einem zweidimensionalen Beleuchtungsmuster bestrahlt wird, wobei das Anregungslicht (13) zum Bereitstellen des Beleuchtungsmusters in separate Beleuchtungspunkte in eine Pupillenebene (34) des Beleuchtungsstrahlengangs (10) gestrahlt wird und wobei das Anregungslicht (13) in der Pupillenebene (34) des Beleuchtungsstrahlengangs (10) in einer ersten linearen Koordinatenrichtung (y) aufgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (13) zum Bilden der Beleuchtungspunkte mit einem Beleuchtungswinkel für Totalreflexion unabhängig von dem Auftrennen in der ersten linearen Koordinatenrichtung (y) in einer zweiten linearen Koordinatenrichtung (x), die von der ersten linearen Koordinatenrichtung (y) unabhängig ist, variabel aufgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass für die Bestrahlung der Probe (S) Anregungslicht (13) der nullten Beugungsordnung (0.BO) und Licht der ersten Beugungsordnung (1.BO) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass für die Bestrahlung der Probe (S) Anregungslicht (13) der ersten Beugungsordnung (1.BO) und Licht der minus ersten Beugungsordnung (-1.BO) verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, das Anregungslicht (13) linear polarisiert auf die Probe (S) gestrahlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (13) zirkular polarisiert auf die Probe (S) gestrahlt wird.
Verfahren zur Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung, bei dem eine Probe (S) nach einem der Verfahren 26 bis 30 mit Anregungslicht (13) strukturiert beleuchtet wird, bei dem von der Probe (S) infolge der Bestrahlung mit dem Anregungslicht (13) abgestrahltes Emissionslicht (38) in einem Detektionsstrahlengang (40), der mindestens ein Mikroskopobjektiv (36) aufweist, auf eine Kamera (90) geleitet wird, bei dem das Beleuchtungsmuster in einer Probenebene lateral verschoben wird, bei dem für verschiedene Positionen des Beleuchtungsmusters in der Probenebene jeweils ein Teilbild der Probe (S) aufgenommen wird und bei dem aus den Teilbildern der Probe (S) ein mikroskopisches Bild der Probe (S) berechnet wird.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Emissionslicht (38) Fluoreszenzlicht ist.