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Diese Erfindung bezieht sich auf
ein Verfahren und ein System zum Erzielen einer Korrelation, wenigstens
im Raum, von zwei oder mehr elektromagnetischen Feldern am Fokus
eines optischen Fokussierelements.
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Es ist für Hersteller und Benutzer optischer Fokussierelemente,
wie Linsen und Linsensystemen, extrem wichtig, die Eigenschaften
einer Linse quantitativ bestimmen zu können. Für Hersteller gilt dieses sowohl
für das
Prüfen
neu entwickelter Produkte als auch für die Routinekontrolle der
Produktqualität.
Für die
Benutzer von Linsen und Linsensystemen für zahlreiche Anwendungen sind
quantitative Daten für die
Interpretation von Meßdaten
von Bedeutung. Gegenwärtig
gibt es zahlreiche Techniken, die für die Bestimmung der Qualität von Linsen
verwendet werden können.
Diese Techniken können
praktisch zwei Hauptkategorien zugeordnet werden: (i) Die Bestimmung
der optischen Übertragungsfunktion
(OTF) (K.R. Barnes: The optical transfer function (Adam Hilger,
London 1971)); oder (ii) Die Bestimmung der Punktverwiaschungsfunktion
(PSF) (G.j. Brakenhoff, P.Blom und P. Barends: Confocal scanning
light microscopy with high aperture immersion lenses, J. Microsc.
117, 1979, Seiten 219-232).
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Das Prinzip aller OTF-Meßverfahren
basiert auf der Annahme, daß ein
Linsensystem als ein lineares Filter bezüglich zweidimensionaler räumlicher Frequenzen
in einem Objekt angesehen werden kann, wenn zwei Bedingungen erfüllt sind
(M. Born und E. Wolf: Principles of optics (Pergamon Press, Oxford,
1980)): (i) Isoplanatismus, d.h. die Wellenfrontaberrationen als
Folge der Abbildungslinse sind von der Position des Objekts unabhängig; und
(ii) Lineare Überlagerung,
d.h. der Gesamteinfluß auf
den Bildpunkt, der durch ein oder mehrere Objekte) erzeugt wird,
ist durch eine lineare Summierung der Einzelwerte am Abbildungspunkt
eines jeden der Objekte gegeben. Unter diesen Annahmen ist PSF mit OTF
durch eine Fouriertransformation verwandt.
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Es gibt gegenwärtig zwei Grundprinzipien, von
denen alle OTF-Meßverfahren
abgeleitet sind: (i) Abtastverfahren; und (ii) Scherinterferometrie.
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Die Abtastverfahren basieren auf
der Verwendung eines sinusförmigen
Gitters für
die Auswahl einer Fourierkomponente des zu testenden Objekts. Das
Gitter kann entweder im Objekt oder im Bild verwendet werden. Die
Grenzen der Techniken, die auf diesem Prinzip basieren, sind im
allgemeinen die Folge der geringen Photoneneffizienz, die einen
nachteiligen Einfluß auf
die Genauigkeit der Messung hat. Außerdem ist es häufig nicht
auf einfache Weise möglich,
die Übertragungsfunktion
bei der räumlichen
Frequenz null (notwendig für
die Normierung von OTF) und bei hohen räumlichen Frequenzen zu bestimmen.
Die notwendige Annahme von Isoplanatismus bildet ebenfalls einen
einschränkenden
Faktor in der Anwendbarkeit dieser Techniken.
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Die Techniken, die auf der Scherinterferometrie
basieren, bestimmen die Autokorrealtionsfunktion der AustrittsApertursebene
des Abbildungssystems. Es ist möglich
abzuleiten (J.J. Stamnes: Waves in focal regions (IOP Publishin
Ltd., Bristol, 1986)), daß im
Falle inkoherenter Beleuchtung die OTF gleich dieser Autokorrelationsfunktion
ist. Dies gilt auch, mit kleinen Modifikationen, im Falle kohärenter Beleuchtung.
Grenzen dieser Techniken, die auf Scherinterferometrie basieren,
sind, daß nur
die monochromatische OTF bestimmt werden kann und daß im allgemeinen
hochkomplexe optische Systeme benötigt werden.
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Eine Grenze aller OTF-Meßverfahren
besteht darin, daß sie
nicht in der Lage sind, das Verhalten des Systems in drei Dimensionen
zu bestimmen. Solche Information ist besonders wichtig beispielsweise
für (konfokaler)
Mikroskopie, die in der Lage ist, dreidimensionale Bilder mit einer
Auflösung
unter 1 μm
zu erstellen.
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Die Punktverwaschungsfunktion (PSF)
kann ebenfalls auf verschiedene Weise bestimmt werden. In den meisten
Fällen
basieren die Methoden auf der – dreidimensionalen – Abbildung
eines punktförmigen
Objekts mit einer typischen Größe, die
sehr viel kleiner als die charakteristische Breite der PSF ist. Die
PSF wird dann entweder im vollständigen
Feld mittels mathematischer Rekonstruktion bestimmt oder wird direkt
mittels Abtastung durch Bewegung des Punktobjekts oder des Detektors
gemessen. Obgleich diese Verfahren in der Lage sind, die PSF mit hoher
Genauigkeit zu bestimmen, haben sie doch den wesentlichen Nachteil,
daß sie
relativ langsam sind – häufig ist
mehr als eine Stunde für
eine einzige Bestimmung erforderlich – und sie verlangen daher eine
Langzeit-(Nanometer-)Stabilität
der optischen Meßeinrichtung.
Die Langsamkeit dieser Verfahrensart macht sie auch für die Routineausrichtungs-
oder -testverfahren unpraktisch. Da die optischen und elektronischen
Meßeinrichtungen
für diese
Verfahren im allgemeinen hoch komplex sind, ist es schwierig, die
Messungen reproduzierbar zu machen. Diese Verfahren verlangen häufig auch
eine spezielle Vorbereitung der Probe, wozu beispielsweise fluoreszente – oder streuende – Latexkügelchen
in ein spezielles Medium eingebettet werden müssen. Die Wahl der Probe ist
dann auf die Verfügbarkeit
von fluoreszenten Kügelchen
und den typischen Brechungsindex des einbettenden Mediums begrenzt. Es
ist daher häufig
nicht möglich,
bei der Bestimmung der PSF die speziellen Experimentierbedingungen
sowohl hinsichtlich der Eigenschaften der fluoreszierenden Substanz
auch hinsichtlich des Brechungsindex des Lösungsmittels zu simulieren.
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Das Ziel der Erfindung ist es, die
oben erwähnten
Probleme zu lösen
und das Prinzip der Erfindung im Gebiet der (mikroskopischen) Abbildung und
Mustererkennung anzuwenden, um die Quer- und Längsauflösung zu verbessern. Das Ausmaß der Verbesserung
der Auflösung
kann graduell eingestellt werden und wird unabhängig von den Quer- und Längsabmessungen
verwendet.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist
es, ein Verfahren zum Messen der charakteristischen Eigenschaften
optischer Fokussierelemente oder Linsen anzugeben, das die Testung
und Ausrichtung von Systemen, die aus einem oder mehreren optischen Fokussierelementen
bestehen, "in Echtzeit" ermöglicht.
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Zur Bestimmung von Wellenfrontaberrationen,
die durch ein optisches Fokussierelement und/oder durch äußere Faktoren
hervorgerufen werden, und zur Erzielung einer (inter)aktiven Kontrolle von
Wellenfronten auf der Grundlage dieser Daten wird ein Verfahren
zur Realisierung einer Korrelation, wenigstens im Raum, der Fokusfelder
von wenigstens zwei elektromagnetischen Strahlen im Fokus eines
optischen Fokussierelements angegeben. Dieses Verfahren bildet keinen
Teil der vorliegenden Erfindung und wird nur als Hintergrundinformation
angegeben. Das Verfahren umfaßt
die Schritte der Erzeugung einer speziellen räumlichen Verteilung in Amplitude,
Phase und Polarisation eines Fokusfeldes, kombiniert aus den Fokusfeldern,
am Fokus, und die Messung eines physikalischen Verhaltens auf das
erzeugte Feld in einer Probe, die im Fokus angeordnet ist. Bei einer
weiteren Ausführungsform enthält das Verfahren
auch den Schritt der Erzeugung einer zeitlichen Verteilung der Amplitude,
Phase und Polarisation des kombinierten Fokusfeldes.
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Bei dem oben erwähnten Verfahren wird eine räumliche
Autokorrelationstechnik verwendet, ggf. in Kombination mit einer
Zeitkorrelation, um ein funktionales Verhalten eines optischen Fokuselements
zu bestimmen, Punktverwaschungs-Autokorrelationsfunktion (PSAF)
genannt. Unter optisch fokussierendem Element wird eine beliebige
Linse, ein Linsensystem aus einer Kombination von Linsenelementen oder
ein (mikroskopisches) Abbildungssystem verstanden.
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Gemäß der Erfindung wird dieses
mit Hilfe eines Systems zur Durchführung des oben erwähnten Verfahrens
erreicht, das aus wenigstens einer elektromagnetischen Quelle zur
Erzeugung wenigstens eines elektromagnetischen Strahls, einem Mechanismus
zum Aufteilen des wenigstens eines elektromagnetischen Strahls in
wenigstens zwei Strahlen und zum Rekombinieren derselben, einem
optischen Fokussierelement zum Fokussieren der Teilstrahlen, einem
Mechanismus zum Einführen
wenigstens einer relativen ein- oder mehrdimensionalen räumlichen
Verschiebung des Fokus von wenigstens einem der Teilstrahlen gegenüber den
Foki der ande ren Teilstrahlen und wenigstens einem Detektor besteht,
wobei das System dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Probe jenseits des optischen
Fokussierelements derart angeordnet wird, daß der Fokus der Teilstrahlen darin
gebildet wird und das kombinierte Fokusfeld darin eine physikalische
Reaktion erzeugt, die sich auf wenigstens eine aus der Gruppe bezieht,
die Amplitude, Phase und Polarisation des Fokusfeldes umfaßt, und
daß der
wenigstens eine Detektor zur Messung der physikalischen Reaktion
außerhalb
des Fokus angeordnet ist.
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Zur Bestimmung der PSAF eines optischen Fokussierelements
wird ein ankommender elektromagnetischer Strahl – von beliebiger Wellenlänge und
von einer beliebigen Lichtquelle (irgendeine, von einer Entladungslampe,
einem Dauerstrichlaser oder einem mit Femtosekunden getakteten Lasersystem variierend)
erzeugt – in
zwei kontrollierte Teile aufgespalten. Die zwei Teile des ankommenden
elektromagnetischen Strahls werden mit "Bezugsstrahl" bzw. "Objektstrahl" bezeichnet. Der Objektstrahl durchläuft eine
variable Verzögerungsleitung,
bevor er mit dem Bezugsstrahl kombiniert wird. Die variable Verzögerungsleitung
kann dazu verwendet werden, die relative Zeitkoinzidenz oder Gleichzeitigkeit
der zwei Strahlen nach der Rekombination zu beeinflussen. Die zwei
Strahlen werden in einer geeigneten Weise kombiniert (beispielsweise
kollinear in der bevorzugten Ausführungsform) und in einer Probe durch
das im Test befindliche optische Fokussierelement fokussiert. Orthogonale
(z.B. "Theta"-(E.H.K. Stelzer
und S. Lindek: Fundamental reduction of the obersvation volum in
far-feld light microscopy by detection orthogonal to the illumination
axis: confocal theta microscopy. J. Microsc. 111, 1994, Seiten 536-547))
Beleuchtungsbedingungen können
zur Bestimmung von Asymmetrien in der PSAF in axialer Richtung verwendet
werden. In der hier beschriebenen Anwendungsart besteht die Probe
aus einer Lösung
aus einer oder mehreren fluoreszierenden Substanzen mit einem Absorptionsspektrum,
das zur Wellenlänge
des ankommenden elektromagnetischen Feldes paßt. Proben einer anderen Struktur können ebenfalls
verwendet werden, wie beispielsweise fluoreszente Kugeln, die einen
Radius haben, der wesentlich kleiner als die typischen Abmessungen
des Fokusfeldes des Fokussierelementes ist, dünne fluoreszente Schichten
oder Proben, die eine komplexere Struktur haben.
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Die dreidimensionale Struktur des
elektromagnetischen Feldes im Fokus des optischen Fokussierelements,
bestimmt durch Amplitude, Phase und Polarisation, wird durch Korrelieren
des Fokusfeldes mit sich selbst bestimmt. Diese Autokorrelation
wird durch Hervorbringung einer räumlichen Verschiebung des Fokus
des Objektfeldes (mit "Fokusobjektfeld" bezeichnet) gegenüber dem
Fokus des Bezugsfeldes (mit "Fokusbezugsfeld" bezeichnet) und
durch Messung des kombinierten Feldes im Fokus des optischen Fokussierelementes
(mit "Gesamtfokusfeld " bezeichnet) realisiert.
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Die Messung wird ausgeführt, wenn
die komplexe Menge des Feldes in eine wirkliche Menge umgewandelt
ist. Dieses kann durch einen beliebigen physikalischen Prozeß ausgeführt werden
(Ein-, Zwei- oder Mehrphotonenabsorption gefolgt von Fluoreszenz,
Vier-Wellen-Mischung, usw.), oder durch Detektion des gestreuten
elektromagnetischen Feldes. In beiden Fällen wird das physikalische
Reaktionsverhalten durch eine spezielle Sammelfunktion erfaßt und besteht
aus einem oder mehreren elektromagnetischen Feldern, die von der
Probe ausgehen. Diese Sammelfunktion kann speziell gebildet werden,
indem entweder von einer direkten Abbildung auf einem Detektor oder
auf einer Kombination von Detektoren Gebrauch gemacht wird, so daß eine Sammelfunktion
erzeugt wird, die ein Abbild einer speziellen Raum/Zeit-Verteilung
der physikalischen Menge im Fokus des optischen Fokussierelements ist,
welche Menge zu messen ist. Darüber
hinaus kann bei der Detektion – in
gleicher Weise wie zur Erstellung einer spezifischen Raum/Zeit-Verteilung
in Amplitude, Phase und Polarisation im Fokusfeld – von einer
einzigen oder mehrfachen Spaltung und Kombination Gebrauch gemacht
werden, einschließlich
Mechanismen zum Anwenden (periodischer) Phasenänderungen und mehrdimensionaler
räumlicher
Verschiebungen des physikalischen Reaktionsverhaltens (beispielsweise
eines Fluoreszenzstrahles).
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Die Verwendung einer Probe zur Erzeugung einer
physikalischen Reaktion, wie beispielsweise mittels eines Absorptionsprozesses,
oder im Falle der Streuung durch Verwendung geeignet positionierter
und untersuchter Detektoren, erzeugt in diesem Falle einen örtlichen
Detektor durch Quadrierung des (komplexen) Gesamtfeldes in jeder
räumlichen
Position. Verglichen mit der konventionellen Lösung, bei der die Quadrierung
des komplexen Feldes nur am Detektor stattfindet, bietet diese Anwendung den
großen
Vorteil, daß sich
die Reaktion auf eine örtliche
Menge in jeder räumlichen
Position des Fokusfeldes des Fokussierelements anstelle auf einen integrierten
Wert davon bezieht. Mit anderen Worten: bei dieser Erfindung wird
die Summe der Quadrate gemessen und nicht das Quadrat der Summe.
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Als Folge der zahlreichen Phasensprünge über das
räumliche
Ausmaß des
Fokusfeldes, wie es durch das optische Fokussierelement erzeugt
wird, wird ein spezielles Interferenzmuster erzeugt, wenn das Fokusobjektfeld über das
Fokusbezugsfeld verschoben wird. Das Grundprinzip der Messung der dreidimensionalen
Struktur des Fokusfeldes des optischen Fokussierelements besteht
gemäß dieser
Erfindung aus der räumlichen
Verschiebung einer Kopie des Fokusfeldes oder eines sich darauf
beziehenden Fokusfeldes in einer definierten Weise – entweder
desselben ursprünglichen
elektromagnetischen Strahls, oder eines weiteren elektromagnetischen Strahls,
gegenüber
dem ursprünglichen – sofern
ein gewisses Maß an
Isoplanatismus vorhanden ist (in einer merklich weniger restriktiven
Form als den oben diskutierten Verfahren zur OTF- oder PSF-Bestimmung) – und die
Verwendung eines physikalischen Prozesses als Detektor, der auf
die örtliche
Feldstärke
an jedem Punkt im Fokusfeld anspricht.
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In dem vorliegenden Verfahren sind
mehrere mögliche
Grundmessungen eingeschlossen:
- (i) Die örtliche elektromagnetische
Feldstärke,
integriert über
das räumliche
Ausmaß des
Fokus des optischen Fokussierelements für Zeitkoinzedenz des Bezugs-
und des Objektfeldes für
zahlreiche räumliche
Verschiebungen des Objektfeldes gegenüber dem Bezugsfeld;
- (ii) Der Unterschied zwischen der maximalen und minimalen Stärke der
physikalischen Reaktion des Systems für zahlreiche räumliche
Verschiebungen des Objektfeldes gegenüber dem Bezugsfeld; in diesem Zusammenhang
besteht in dieser Form der Grundmessungen die physikalische Reaktion
aus der wechselnden Amplitude der örtlichen elektromagnetischen
Feldstärke,
integriert über
das räumliche Ausmaß des Fokus
des optischen Fokussierelements als eine Folge positiver und negativer
Interferenz aufgrund der Anwendung einer möglichen, veränderlichen
Phasenänderung,
die beispielsweise durch eine veränderliche optische Weglänge verursacht
ist, des Objektfeldes gegenüber
dem Bezugsfeld;
- (iii) Die relative Phase der physikalischen Reaktion des Systems
gegenüber
der Phase einer anliegenden Phasenänderung für zahlreiche räumliche
Verschiebungen des Objektfeldes gegenüber dem Bezugsfeld. In diesem
Zusammenhang besteht die physikalische Reaktion in dieser Form der
Grundmessungen aus der Wechselamplitude der örtlichen elektromagnetischen
Feldstärke,
integriert über
das räumliche
Ausmaß des
Fokus des optischen Fokussierelements als eine Folge positiver und
negativer Interferenz, die aus der Anwendung einer geeigneten veränderlichen
Phasenänderung,
beispielsweise durch eine veränderliche
optische Weglänge
hervorgerufen, des Objektfeldes gegenüber dem Bezugsfeld. Die Phase
der Änderung
ist durch Differenz in der Weglänge
zwischen dem Objektstrahl und dem Bezugsstrahl bezüglich Zeitkoinzedenz
bestimmt; und
- (iv) Der konstante Teil der physikalischen Reaktion des Systems
für zahlreiche
räumliche
Verschiebungen des Objektfeldes gegenüber dem Bezugsfeld. In diesem
Zusammenhang besteht die physikalische Reaktion in dieser Form der
Grundmessungen aus der wechselnden Amplitude der örtlichen
elektromagnetischen Feldstärke,
integriert über
das räumliche Ausmaß des Fokus
des optischen Fokussierelements als eine Folge positiver und negativer
Interferenz, resultierend aus der Anwendung einer geeigneten veränderlichen
Phasenänderung,
beispielsweise durch eine veränderliche
optische Weglänge,
des Objektfeldes gegenüber
dem Bezugsfeld hervorgerufen.
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Die kombinierte Information aus der
bzw. den Messungen) ergibt – gemäß der Erfindung "in Echtzeit" – eine Anzahl Parameter, die
für die
Charakterisierung des Fokusfeldes des optischen Fokussierelements
hinsichtlich Amplitude, Phase und Polarisation geeignet sind, vergleichbar
zu dem, was mit Hilfe der PSF möglich
ist. Dies gilt für
die Charakterisierung in allen drei Raumkoordinaten. In der Grundausführungsform
des Verfahrens sind nur eine einfache Abtasteinheit zum Hervorrufen
der räumlichen
Fokusverschiebung des Objektfeldes gegenüber dem Bezugsfeld und eine
Lösung
einer geeigneten fluoreszierenden Substanz in einem Medium, das
den richtigen Brechungsindex hat, notwendig. Die Geschwindigkeit
des Verfahrens und die Einfachheit der Probenzubereitung machen
die Technik für
Prüfung
und Messung eines optischen Fokussierelements, für die Ausrichtung und Optimierung
komplexer Abbildungssysteme, für
die Bestimmung von Wellenfrontaberrationen, die durch das optische
Fokussierelement selbst, durch das Medium, in dem die Messung stattfindet
oder durch äußere Faktoren
hervorgerufen werden, und für
die Abbildung und Mustererkennung in hervorragender Weise geeignet.
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Ein alternatives Verfahren zum Bestimmen einer
Reaktion, die Information liefert, die sich auf die Qualität einer
Linse bezieht, ist in dem US-Patent 4 347 000 von F.P.G. Lacoste
beschrieben. In diesem Falle wird ein interferometrisches System
verwendet, bestehend aus einer Lichtquelle und einem Strahlteiler,
der den Lichtstrahl in zwei Teile aufspaltet. Die zu untersuchende
Linse wird in einem der zwei Lichtwege angeordnet. Die zwei Lichtstrahlen
werden reflektiert und im selben Strahlteiler wieder kombiniert,
bevor ihre vereinigte Wirkung mit Hilfe eines Fotodetektors gemessen
wird. Der Reflektor im Lichtweg, der nicht jener ist, in dem sich
die Linse befindet, ist beweglich, sowohl in Form einer Verschiebung
längs der
Achse des Lichtstrahls als auch in Form einer Drehung senkrecht
zu dieser Achse. Die erfaßte
Reaktion stellt die komplexe PSF der Linse dar. Die vorliegende
Erfindung unterscheidet sich von dem genannten Patent dadurch, daß sie Gebrauch
von (i) einer Probe, die im Fokus des zu testenden Fokussierelements
angebracht ist, so daß die
Umwandlung der komplexen Menge des Feldes in eine reelle Menge am örtlichen
Niveau in der Probe und nicht am Detektor selbst stattfindet; (ii)
einer Autokorrelation des Fokusfeldes anstelle einer Kreuzkorrelation;
(iii) von verschiedenen Sammelfunktionen als ein Ergebnis, von dem
die vollständige
dreidimensionale Struktur der Punktverwaschungsfunktion der Linse
verfügbar wird.
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Die Erfindung wird detaillierter
mit Hilfe einiger weniger Ausführungsformen
unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert.
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1 zeigt
eine schematische Darstellung einer Ausführungsform für die Bestimmung
einer PSAF;
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2 zeigt
eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform,
die sich auf die Drehung eines Strahlteilers und die Bewegung einer
Linse gründet,
wodurch eine dreidimensionale Verschiebung des Fokusobjektfeldes
gegenüber
dem Fokusbezugsfeld realisiert werden kann;
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3 zeigt
eine schematische Darstellung einer noch weiteren Ausführungsform
auf der Grundlage der dreidimensionalen Bewegung einer Linse, wodurch
eine dreidimensionale Verschiebung des Fokusobjektfeldes gegenüber dem
Fokusbezugsfeld realisiert werden kann;
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4 zeigt
eine schematische Darstellung einer einfachen Vorrichtung zum Einführen einer
Differenz in die Weglänge
zwischen zwei elektromagnetischen Strahlen;
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5 zeigt
eine schematische Darstellung einer Kombination der Prinzipien,
wie in den Ausführungsformen
der 2 bis 4 gezeigt, wodurch sowohl
eine dreidimensionale Verschiebung des Fokusobjektfeldes gegenüber dem
Fokusbezugsfeldes und eine einstellbare Weglängendifterenz zwischen dem
Objektstrahl und dem Bezugsstrahl realisiert werden kann;
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6 zeigt
eine schematische Darstellung einer Ausführungsform für die Realisierung
einer dreidimensionalen (mikroskopischen) Abbildung; und
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7 bis 9 zeigen Darstellungen verschiedener
experimentell bestimmter PSAFen, verglichen mit theoretisch berechneten
PSAFen und PSFen.
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Um eine detailliertere Beschreibung
des Verfahrens oder der Methode nach der Erfindung zu geben, ist
eine schematische Darstellung einer möglichen Ausführungsform
in 1 angegeben. Ein elektromagnetischer
Strahl, der von einem Dauerstrichlaser 1 geringer Leistung
erzeugt wird, durchläuft
zunächst
ein Teleskop 2, das sicherstellt, daß die Strahlbreite die Apertur
des optischen Fokussierelements 9 vollständig ausfüllt und
ferner sicherstellt, daß ein
praktisch paralleler Strahl abgegeben wird. Der Strahl wird dann
in zwei Teile durch einen 50%-Strahlteiler 4 aufgeteilt. Ein Teil,
der "Bezugsstrahl" 13 läuft über zwei
Spiegel 3a, 3b, während
der andere Teil, der "Objektstrahl" 12 über zwei ähnliche Spiegel
3c, 3d läuft,
die an einer variablen Verzögerungsleitung 5 angebracht
sind. Die zwei Teile werden mit Hilfe eines zweiten Strahlteilers 6 wieder
miteinander kombiniert. Als Ergebnis der Bewegung der variablen
Verzögerungsleitung ändert sich
die Weglänge
des Objektstrahls gegenüber
der des Bezugsstrahls, und die relative Zeitkoinzedenz oder Gleichzeitigkeit
am Punkt der Strahlvereinigung kann daher gesteuert werden. Nach
der Strahlvereinigung wird ein Teil des vereinigten Strahls von
einer Strahlblende 7 aufgefangen, während der andere Teil in die Probe 10 durch
das optische Fokussierelement 9 fokussiert wird. Die Probe
besteht aus einer Lösung aus
einer fluoreszierenden Substanz im einem oder anderen Lösungsmittel.
In Bezug auf die fluoreszierende Substanz oder das Lösungsmittel
gibt es keine speziellen Einschränkungen.
Beide können
derart gewählt
werden, daß sie
für den
Zweck der Messung am besten geeignet sind. Dieses schließt eine
Wahlfreiheit bezüglich
der Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften der fluoreszierenden
Substanz und eine Wahlfreiheit bezüglich eines Lösungsmittels, das
einen speziellen Brechungsindex hat, oder die Verwendung geeigneter
Lösungsmittelmischungen ein.
Die abgegebene Fluoreszenz wird in der Rückstreurichtung von einem "Fotovervielfacherröhren"-Detektor 11 gemessen
und aus dem gestreuten Licht bei der Laserwellenlänge mittels
eines dichroitischen Spiegels 8 abgetrennt.
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Die 2 und 3 zeigen zwei weitere Ausführungsformen
zum Einführen
einer Verschiebung in das Fokusobjektfeld gegenüber dem Fokusbezugsfeld.
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Das Verfahren von 2 macht von einer Drehung des Strahlungsvereinigungs-Strahlteilers 6 zur
Einführung
einer zweidimensionalen Verschiebung des Fokusobjektfeldes gegenüber dem
Fokusbezugsfeld in einer Ebene senkrecht zur Ausbreitungsrichtung
beider Strahlen Gebrauch. Die Drehung kann beispielsweise durch
Verwendung eines motorisierten Schrittmotors, eines piezoelektronischen
Antriebs oder dergleichen ausgeführt
werden. Durch Anordnen des Bündelteilers
relativ zur Apertur des optischen Fokussierelements 9 in
einer Weise, daß telezentrische
Bedingungen erfüllt
werden, wird die richtige Ausfüllung
der Apertur beim Verschieben des Objektstrahls aufrechterhalten.
Die dritte Dimension wird der Verschiebung des Fokusobjektfeldes gegenüber dem
Fokusbezugsfeld durch Hinzufügung zweier
Linsen 14, 15, eine im Bezugsstrahl und eine im
Objektstrahl, hinzugefügt.
Durch Bewegung der Linse 14 in einer Richtung parallel
zur Ausbreitungsrichtung wird auch der Brennpunkt des Objektstrahls in
einer Richtung parallel zur Ausbreitungsrichtung verschoben. Das
Verfahren verwendet eine Linse in beiden Strahlen, um identische
optische Bedingungen für
beide Strahlen sicherzustellen. Die Bewegung der Linse 14 kann
wieder durch Verwendung beispielsweise eines motorisierten Schrittmotors oder
eines piezoelektronischen Antriebs bewerkstelligt werden. Eine der
obigen ähnliche
Wirkung kann mittels einer kombinierten – entgegengesetzten – Bewegung
der Linsen 14 und 15, beide längs der Ausbreitungsachsen
von Objektstrahl bzw. Bezugsstrahl, erreicht werden.
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Die dreidimensionale Verschiebung
des Fokusobjektfeldes gegenüber
dem Fokusbezugsfeld kann in eine Verschiebung der Linse 14,
wie in 3 angegeben,
integriert werden. In diesem Falle wird die Linse 14 in
drei Dimensionen bewegt, was zu einer entsprechenden dreidimen sionalen
Verschiebung des Fokusobjektfeldes gegenüber dem Fokusbezugsfeld führt. Wieder
kann von einem motorisierten Schrittmotor, einem piezoelektronischen
Antrieb oder dergleichen Gebrauch gemacht werden, um die Bewegung
der Linse hervorzurufen. Diese Vorrichtungen sind in der Lage, die
Bewegungen von Linse 14 oder Strahlteiler 16 mit
hoher Geschwindigkeit zu erzeugen, wie in den 2 und 3 gezeigt,
was einen schnellen Datenzugriff und eine Messung "in Echtzeit" möglich macht.
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Komplexere Verfahren zum Anwenden
einer speziellen Phasen- und Amplitudenverteilung sowohl von Bezugsstrahl
als auch von Objektstrahl über
der Apertur des zu testenden optischen Fokussierelements können durch
Anwendung unterschiedlicher Apodisationsbedingungen angewendet werden,
indem beispielsweise von Aperturen unterschiedlicher Gestalten (kreisförmig, quadratisch,
usw.) oder Ringen Gebrauch gemacht wird, und/oder allgemeiner kann
durch Verwendung von Flüssigkristallmatritzen die
Einstellung der örtlichen
Amplituden-, Phasen- und Polarisationsbedingungen über der
Apertur des optischen Fokussierelements erreicht werden.
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Nachdem die vereinigten Strahlen
in die Probe fokussiert worden sind, wird die Fluoreszenz gemessen,
die von dem ausgelösten
Absorptionsprozeß resultiert
und über
das räumliche
Ausmaß des Fokus
integriert wird. Bei diesem Verfahren wirkt der Absorptionsprozeß als ein örtlicher "quadrativer Detektor": die örtliche
Amplitude und Phase des gesamten Fokusfeldes (Bezug und Objekt)
werden in eine örtliche
Intensität
umgewandelt – das
komplexe Quadrat der Amplitude des elektromagnetischen Feldes –, deren
Stärke
nach Integration über
den Raum gemessen wird. Die einfachste Ausführung dieses Prinzips, und
jene, die im Rest dieses Abschnitts beschrieben wird, umfaßt die Verwendung
einer Einzelphotonenabsorption und Detektion der Fluoreszenz. Es
können
jedoch viele andere optische Prozesse für den gleichen Zweck verwendet
werden, wie beispielsweise die Sättigungsabsorption,
die Zweiphotonenabsorption, die Vielphotonenabsorption, die Vier-Wellen-Mischung,
die Streuung, wobei ein geeignet angeordneter und analysierter Detektor
usw. verwendet wird. Es können
auch sogenannte "programmierte" optische Impulse
verwendet werden, in welchem Falle das Frequenz/Zeit-Profil des
Impulses in einer speziellen Weise gebildet wird, und es kann von
nach der Zeit aufgelösten
Messungen Gebrauch gemacht werden.
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In der bevorzugten Ausführungsform
beeinflußt
eine periodische Bewegung der variablen Verzögerungsleitung 5 die
relative Zeitverzögerung
des Objektstrahls gegenüber
dem Bezugsstrahl. Als Folge werden mehrere abwechselnde aufbauende
und abbauende Interferenzen beim Absorptionsniveau während jeder
Bewegung der variablen Verzögerungsleitung
erzeugt. Dieses führt
wiederum zu Veränderungen
(d.h. Schwingungen) im erfaßten
Fluoreszenzsignal. Die Amplitude dieser Schwingungen hängt vom
Grad der Überlappung,
dem betreffenden Pola risationszustand, der relativen Kohärenz und
der Phasenbeziehung zwischen den zwei Fokusfeldern ab. Die Autokonelation
des Fokusfeldes wird durch Messung der Amplitude dieser Schwingungen
als eine Funktion der erzeugten Fokusverschiebung des Fokusobjektfeldes
gegenüber
dem Fokusbezugsfeld gemessen. Die Tatsache, daß die andauernde Bewegung der
variablen Verzögerungsleitung
dieses Verfahren relativ unempfindlich gegenüber äußeren Einflüssen macht, die die Länge des
optischen Weges des Bezugsstrahls oder des Objektstrahls ändern, während der
interferometrische Informationsgehalt bewahrt wird, ist von großem Wert
für die
Anwendung des Verfahrens als ein "benutzerfreundliches" Meßwerkzeug
für die
Eigenschaften optischer Fokussierelemente.
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4 ist
eine schematische Darstellung eines einfachen Verfahrens und einer
Vorrichtung zum Einführen
einer variablen Phasenänderung,
beispielsweise durch eine veränderliche
optische Weglänge,
hervorgerufen zwischen Objektstrahl und Bezugsstrahl. Bei diesem
Verfahren wird von nur zwei Spiegeln 3e, 3f und einem Strahlteiler 16 Gebrauch gemacht,
der sowohl für
das Aufteilen des Strahls als auch für das Vereinigen der Strahlen
verwendet wird. Nach dem Vereinigen wird ein austretender Teil des vereinigten
Strahls von einer Strahlblende 7, wie in den vorangehenden
Figuren, aufgefangen. Als Folge der Bewegung des Strahlteiler 16,
der an einer veränderlichen
Verzögerungsleitung 17 angebracht
ist, ändert
sich die relative Weglänge
für den
einen Teil des Strahls gegenüber
dem anderen Teil. Eine spezielle Bewegung des Strahlteilers führt zu einer Änderung, die
mehr als viermal so groß ist,
wie die relative Weglänge
der zwei Teile des Strahlteilers. Der Vorteil dieser Lösung gegenüber herkömmlichen
Techniken zum Einführen
von Zeitverzögerungen
ist Autokorrelationstechniken besteht darin, daß weniger optische Elemente
und kleinere Bewegung des Antriebs für die variable Verzögerungsleitung
bei der gleichen Zeitverzögerung
notwendig sind. Die kürzeren
optischen Wege machen eine kompaktere – und daher stabilere – Konstruktion
möglich.
Die Konstruktion, wie sie in 4 gezeigt
ist, kann in einem Element verwirklicht werden, das Abmessungen
von weniger als 1 cm hat. Es können
zahlreiche Techniken angewendet werden, die der Fachmann kennt,
um die variable Verzögerungsleitung 17 anzutreiben.
Da hier beschriebene System, wie in 4 gezeigt,
ist nicht nur für
die oben beschriebene Anwendung geeignet, sondern in hervorragender
Weise auch für
die Verwendung in Standardautokorrelationstechniken für die Messung
der Dauer optischer Impulse geeignet.
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5 zeigt
schematisch, wie die zahlreichen Prinzipien, wie sie in den Ausführungsformen
der 2 bis 4 gezeigt sind, zur Bildung
eines einzigen Moduls miteinander kombiniert werden können. Der einfallende
Strahl wird durch einen Strahlteiler 18 aufgeteilt, der
an einer variablen Verzögerungsleitung 19 angebracht
ist. Beide Teile des Strahls laufen über Spiegel, die eine spezielle
Krümmung
3g, 3h haben, die mit (inter)aktiven Elementen für die Einführung von Formänderungen
versehen sein können. Die
unterschiedlichen Krümmungen
ergeben spezielle axiale Positionen der Fokusfelder von Bezugsstrahl 13 und
Objektstrahl 12 jenseits des optischen Fokussierelements.
Die zusätzliche
Querverschiebung des Fokusobjektfeldes gegenüber dem Fokusbezugsfeld wird
durch eine zweidimensionale Neigung eines der beiden Spiegel 3g
erreicht.
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Die Amplitude des fluoreszierenden
Schwingungen wird unter Verwendung eines elektronischen Bandpaßfilters
gemessen, das auf die Schwingungsfrequenz des Signals abgestimmt
ist, oder mit Hilfe eines phasenverriegelten Verstärkers. Neben
der Amplitude der fluoreszierenden Schwingungen können eine
Anzahl anderer Parameter gemessen werden, die für das Verfahren relevant sind.
Diese sind: der konstante (nicht-schwingende) Anteil des fluoreszierenden
Signals, die Fluoreszenzintensität
bei der Zeitverzögerung
null (d.h. wenn die optischen Weglängen für Bezugsstrahl und Objektstrahl
gleich sind) und die Phase des schwingenden Anteils der Fluoreszenz
gegenüber
der Zeitverzögerung
null. All diese Signale können "in Echtzeit" gemessen werden, als
Folge dessen, die Anwendung dieser Technik für schnelle – und Routine- -Testung von
Linsen, die Ausrichtung von Linsen oder Linsensystemen und der schnelle
Datenzugriff im Falle dreidimensionaler Abbildung oder Mustererkennung
möglich
wird.
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Das oben beschriebene Verfahren kann
in vorteilhafter Weise für
die (mikroskopische) Abbildung einer Probe verwendet werden, die
in der einen oder anderen Weise strukturiert ist, bei vergrößerter Quer-
und/oder Längsauflösung in
einer Weise, wie sie in 6 schematisch
angegeben ist. In diesem Falle wird die physikalische Reaktion in Übereinstimmung
mit einer der zuvor beschriebenen Grundmessungen und als Funktion
der dreidimensionalen Position einer Probe 10 für eine spezielle
Position des Fokusfeldes des Bezugsstrahls 13 und jenes
des Objektstrahls 12, erhalten in der u.a. unter Bezugnahme auf
die 2 und 3 beschriebenen Weise, gemessen.
Diese Messung kann entweder durch Bewegung der Probe gegenüber dem
Gesamtfeld oder durch Bewegung des Gesamtfeldes (Ablenkung) gegenüber der
Probe ausgeführt
werden. Die physikalische Reaktion – beispielsweise Fluoreszenz
der Probe – kann
direkt mittels eines Detektors oder mit Hilfe einer speziellen Sammelfunktion
gemessen werden. Diese Prozedur kann für verschiedene Positionen der
Fokusfelder des Objektstrahls und des Bezugsstrahls wiederholt werden,
wobei während
dieses Vorgangs unterschiedliche räumliche Frequenzen in der Probe
verstärkt
werden können.
Die Sammelfunktion kann beispielsweise durch Verwendung konfokaler
Detektion erzeugt werden (G.J. Brakenhoff, P. Blom und O. Barends,
Confocal scanning light microskopy with high apertuere immersion
lenses, cJ. Micros. 117, 1979, Seiten 219-232), wobei die konjugierte
Detektionsverteilung in eine spezielle Position gegenüber den
Fokusfeldern des Bezugsstrahls und des Objektstrahls gebracht wird.
Dieses Abbildungsverfahren, das innerhalb der Koinzidenzgrenze (in Raum
und Zeit) der Fokusfel der von Objektstrahl und Bezugsstrahl äquivalent
einer üblichen
konfokalen Mikroskopie ist, kann für die Bestimmung der dreidimensionalen
Struktur von beispielsweise biologischen Präparaten oder Proben der Materialwissenschaften
verwendet werden. Komplexere Sammelfunktionen können erzeugt werden, indem
von mehreren Detektoren Gebrauch gemacht wird, so daß eine Sammelfunktion
erzielt wird, die ein Abbild einer speziellen Raum/Zeit-Verteilung
der physikalischen Menge im Fokus des zu messenden Fokussierelements
ist.
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Der Informationsgehalt der zahlreichen
Signale kann analysiert werden, indem von theoretischen Modellen
auf der Grundlage skalarer oder vektorieller Diffraktionstheorie
Gebrauch gemacht wird, vermittels der das Fokusfeld des optischen
Fokussierelements (oder abgeleitete Parameter, die für die Charaktertsierung
und Optimierung dieses Elements geeignet sind) unter allgemeinen
Bedingungen berechnet werden können.
Es können
dann Modelle unterschiedlicher Fokussierbedingungen erstellt werden,
indem das Fokusfeld für
Aperturen unter unterschiedlichen Apodisationsbedingungen und für unterschiedliche
Positionen des geometrischen Brennpunkts hinter der Apertur entweder
in oder außerhalb der
optischen Achse berechnet werden. Phasenstörungen sowohl von Bezugsfeld
als auch von Objektfeld oder von beiden Feldern einzeln können unter Verwendung
geeigneter Phasen- und Amplitudenfunktionen in diesen Berechnungen
modelliert werden. Der Polarisationszustand eines jeden der Felder kann
durch Einbeziehung des vektoriellen Charakters des Feldes in die
Beschreibung modelliert werden.
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Ein Beispiel der experimentellen
und theoretischen Ergebnisse, die man unter Verwendung dieses Verfahrens
erhält,
ist in den 7 bis 9 gezeigt. Die experimentellen
Meßpunkte
der PSAF für
drei unterschiedliche numerische Aperturen (Nas) eines gut korrigierten
Mikroskopobjektivs sind durch die Dreiecke in den 7 bis 9 gezeigt.
Die PSAF wird dann theoretisch für
jede numerische Apertur berechnet. Diese Kurven, die durchgehenden
Linien in den genannten Figuren, werden ohne passende Parameter
berechnet, d.h. ohne Einstellung gewisser Parameter in der theoretischen
Rechnung, so daß optimale Übereinstimmung
mit dem Experimenterzielt würde.
Zum Vergleich, die theoretisch berechnet PSF ist in den Zeichnungen
mit gestrichelter Linie ebenfalls gezeigt. Die hervorragende Übereinstimmung
zwischen Experiment und Theorie, insbesondere im Hinblick auf das
Fehlen passender Parameter in der theoretischen Simulation des Experiments zeigt
die Möglichkeiten,
die diese Technik für
die Bestimmung der PSAF und für
die qualitative und quantitative Messung bietet: (i) der Eigenschaften
eines optischen Fokussierelements, wie Auflösungvermögen, Linsenaberrationen erster
und zweiter Ordnung; und – in
Kombination mit theoretischen Modellen – (ii) der Analyse von Phasenaberrationen,
die durch das optische System oder beispielsweise durch den (veränderlichen)
Brechungsindex des Lösungsmittels hervorgerufen
werden. Die PSAF ist somit eine neue Funktion für die Charakterisierung eines
optischen Fokussierelements in einer der PSF vergleichbaren und
verwandten Weise.
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Die oben beschriebene bevorzugte
Ausführungsform
kann auf eine Vielzahl von Arten modifiziert und ausgeweitet werden.
In diesem Kontext ist es beispielsweise möglich, die Verwendung einer Kombination
elektromagnetischer Strahlen beispielsweise unterschiedlicher Wellenlängen in
Betracht zu ziehen, die jeweils durch ihre eigene, oder eine teilweise
kombinierte, Kombination von Strahlteilern und Verzögerungsleitungen
laufen, bevor sie in die Probe fokussiert werden. Eine Ausführungsform
dieses Typs kann für
die Bestimmung der Spektralcharakteristik entweder des optischen
Fokussierelements oder eines in die Probe abzubildenden Objekts
verwendet werden.
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Die Qualität der erhaltenen dreidimensionalen
Abbilder beispielsweise unter Verwendung konfokaler Mikroskopie
kann mit Hilfe von Bildwiederherstellungstechniken merklich verbessert
werden (H.T.M. v.c. Voort und K.C. Strasters, Restoration of confocal
Images for quantitiave image analysis, J. Microsc., 187(2), Seiten
165 bis 181 (1995)). Diese Techniken verlangen die genaue Kenntnis
der PSF des Abbildungssystems. Das in dieser Erfindung beschriebene
Verfahren ist in der Lage, die Daten, aus denen die genannte PSF
abgeleitet werden kann, mit sehr hoher Geschwindigkeit ("Echtzeit") zu erzeugen. Darüber hinaus
können
die Messungen unter Bedingungen ausgeführt werden, die praktisch identisch
mit jenen sind, unter denen die Abbildung erfolgt, soweit die Beleuchtungswellenlänge, die
fluoreszierende Substanz, die Emissionswellenlänge der Brechungsindex des
Mediums und sogar die Tiefe der Probe, an der die Abbildung stattfindet,
betroffen sind.
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Für
die Mustererkennung ist es wichtig, daß mit hoher Genauigkeit kleine
Amplituden- und Phasenänderungen
gegenüber
dem Profil einer oder mehrerer elektromagnetischer Strahlen, die
das Objekt beleuchten, erfaßt
werden können.
Dieses gilt für Betriebsarten,
bei denen die elektromagnetischen Strahlen durch das Objekt laufen,
für Betriebsarten, in
denen die elektromagnetischen Strahlen vom Objekt reflektiert werden,
und für
Betriebsarten, bei denen die elektromagnetischen Strahlen durch
das Objekt beispielsweise in Fluoreszenz umgewandelt werden. Das
in dieser Erfindung beschriebene Verfahren bietet die Möglichkeit,
die Amplitude, Phase und/oder Polarisation an jedem Punkt in einem
elektromagnetischen Strahl oder im Brennpunkt desselben "in Echtzeit" mit hoher Genauigkeit
und in einer einfachen und stabilen Konstruktion zu ermitteln.
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Das in dieser Erfindung beschriebene
Verfahren kann auch als eine Abbildungstechnik verwendet werden,
wie bereits unter Bezugnahme auf 6 festgestellt
wurde. Durch Anwendung geeigneter Verschiebungen des Fokusobjketfeldes
gegenüber
dem Fuousbezugsfeld in Raum und Zeit ist es möglich, ein spezielles und steuerbares
Erregungs- oder Beleuchtungsprofil hinsichtlich Amplitude, Phase
und Polarisation in der Probe anzuwenden. Ein ähnliches Verfahren kann bei
der Detektion verwendet werden, indem die physikalische Reaktion
in einer speziellen Weise in einem oder mehreren Detektoren abgebildet
wird. Die Analyse der Daten aus der Messung der physikalischen Reaktion
des Systems für
zahlreiche solcher Beleuchtungs- und/oder
Detektionsprofile kann dann dazu benutzt werden, ein Abbild eines
Objekts in der Probe zu erzeugen. Die Abbildung kann direkt ausgeführt werden,
oder sie kann nach geeigneter Verarbeitung der Daten mit Hilfe analoger,
digitaler oder anderer Methoden ausgeführt werden. In diesem Zusammenhang
kann von zahlreichen Beleuchtungsmoden, wie beispielsweise Punktmodus,
Zeigermodus, usw. für
die Beleuchtung Gebrauch gemacht werden. Darüber hinaus kann von Einstellungen
der Wellenfronten sowohl bei Beleuchtung als auch bei Detektion
beispielsweise mittels Amplituden- und Phasenfiltern oder holographischer
Systeme Gebrauch gemacht werden. Die physikalische Reaktion des
Systems kann auch dadurch beeinflußt werden, daß Veränderungen
in der Popolation und der Koherenzverteilung über die verschiedenen Energieniveaus
der Moleküle
in der Probe durch Verwendung zusätzlicher elektromagnetischer Strahlen
beeinflußt
werden. Jede dieser drei Ausführungsformen,
nach Wahl in Kombination mit geeigneten Entfaltungstechniken, kann
zu einer höheren
Auflösung
in Quer- und Längsrichtung
führen.
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Mittels geeigneter Abstraktion des
Grundprinzips der Erfindung ist es möglich, komplexe mathematische
Prozesse auf optischem Wege zu realisieren. Eine mathematische Funktion
kann dann in abstrakter Form durch eine spezielle Verteilung von Amplitude,
Phase und Polarisation im Brennpunkt des optischen Fokussierelements
präsentiert
werden. Somit können
verschiedene Funktionen durch Verwendung unterschiedlicher elektromagnetischer (Teil-)Strahlen
repräsentiert
werden. Der physikalische Vorgang in der Probe stellt das mathematische (komplexe)
Produkt dar, während
die Detektion eine spezifische oder nicht-spezifische Integration
in einer oder mehreren Dimensionen darstellt. Durch Implementierung
solcher Abstraktionen ist es mit Hilfe der in der Erfindung beschriebenen
Verfahren möglich, mit
sehr hoher Geschwindigkeit komplexe mehrdimensionale Integrationen
oder mathematische Darstellungen, an denen spezielle Operationen
ausgeführt
worden sind, zu realisieren. Die Wahl der Probe (homogen, zufällig, oder
strukturiert) und der physikalische (Wechselwirkungs-)Prozeß in der
Probe (Streuung, Einzelphotonenabsorption, Muliphotonenabsorption
usw.) bestimmen zusammen die mathematischen Operationen, die an
den Darstellungen vor den Integrationen ausgeführt werden können.
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Obgleich die Erfindung an Hand von
wenigen bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben worden ist, ist dem Fachmann doch klar, daß Variationen und
Modifikationen möglich
sind, ohne den Umfang der Erfindung, wie in den folgenden Ansprüchen angegeben,
zu beeinträchtigen.