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Bereich der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft optische Projektionstomografie.
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Hintergrund
der Erfindung
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Optische
Projektionstomografie ist eine Technik zur Erzeugung von dreidimensionalen
Abbildungen von Proben, wobei ein Beispiel in der Spezifikation
WO 02/095476 des Anmelders offenbart ist. Die Erfindung zielt darauf
ab, einen unterschiedlichen Weg optischer Behandlung des Lichts
zu schaffen, das von der Probe ausstrahlt, mit einer Absicht zur
Vergrößerung des
Inhalts und der Qualität
von von der Probe erhaltenen Informationen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung weist eine Vorrichtung zum Erhalt einer Abbildung
einer Probe durch optische Projektionstomografie Folgendes auf:
Einrichtungen zur Abtastung bzw. zum Scanning von Licht, einen drehbaren
Objekttisch zur Drehung der abzubildenden Probe, ein optisches System
und einen Lichtfühler,
wobei Licht von den Einrichtungen zur Abtastung von Licht die Probe
abtastet und das optische System während der Abtastbewegung des
Lichts wirksam ist, um auf den Fühler nur
Licht auszurichten, welches parallel zu dem auf die Probe einfallenden
Strahl von der Probe ausgeht oder dieselbe umläuft.
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Das
optische System ist vorzugsweise eine Konvexlinse, welche von darauf
einfallendem Licht Konvergenz bewirkt, aber Licht auf den Fühler ausrichtet,
welches parallel zu dem auf die Probe einfallenden Strahl von der
Probe ausgeht. Ein konkaver Spiegel oder ein Beugungsgitter können anstelle
der Konvexlinse verwendet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführung
bilden die Einrichtungen zur Abtastung von Licht einen Abschnitt
eines konfokalen Abtast- bzw. Scanningmikroskops, und der drehbare
Objekttisch (korrespondierend zu dem Objekttisch, welcher in der
vom Anmelder zusammen anhängigen
internationalen Patentanmeldung PCT/GB02/02373 offenbart ist) weist eine
stationäre
Kammer auf, in welcher die Probe aufgehängt ist.
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Der
Lichtfühler
kann aus einem örtlich
festgelegten Fühler
gebildet sein, der so angeordnet ist, dass er nur Licht empfängt, welches
in dem gleichen Winkel, in dem der Strahl auf die Probe einfällt, von der
Probe ausgeht oder dieselbe umläuft.
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Der
Lichtfühler
kann jedoch einen Abschnitt bzw. einen Teil eines eindimensionalen,
das heißt
linearen, Arrays bilden. In diesem Fall bildet ein Fühler des
Arrays den Lichtfühler
und die anderen Fühler des
Arrays bilden Hilfsfühler,
welche gestreutes und/oder gebrochenes Licht erfassen. Die von den Hilfsfühlern empfangenen
Lichtintensitäten
können verwendet
werden, um Informationen über
die räumliche
Aufteilung von Brech-/Streueigenschaften innerhalb der Probe zu
liefern.
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Diese
Vorgehensweise kann erweitert werden, um ein zweidimensionales Array
von Fühlern
zu schaffen, wobei ein Fühler
den Lichtfühler
bildet und wobei die anderen Fühler
Hilfsfühler
bilden, welche gestreutes und/oder gebrochenes Licht in den zusätzlichen
Ebenen erfassen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung ist ein optisches System zur Verwendung
in einer Vorrichtung zum Erhalt einer Abbildung in optischer Projektionstomografie
geschaffen, wobei das optische System Licht von einer von einem
Lichtstrahl abgetasteten Probe empfängt, und wirksam ist, um nur
Licht auf einen Fühler
auszurichten, welches parallel zu dem auf die Probe einfallenden
Lichtstrahl von der Probe ausgeht und dieselbe umläuft.
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Gemäß einem
noch weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalten
einer Abbildung einer Probe in optischer Projektionstomografie geschaffen,
wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte aufweist: Bewegen
eines Lichtstrahls über
die Probe mit einer Abtastbewegung; Weiterleiten des von der Probe
ausstrahlenden Lichts auf einen Fühler, welcher während der
Abtastbewegung des Lichts Licht erfasst, das parallel zu dem auf
die Probe einfallenden Strahl von der Probe ausgeht oder diese umläuft.
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In
dem einfachsten Verfahren gibt es keine optische Wirkung bzw. Brechkraft
zwischen der Probe und dem Fühler,
wobei eine räumliche
Unterscheidung durch das Positionieren des Fühlers erhalten wird.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Durchführen von
irgendeiner der Analysen und Prozeduren oder mehr geschaffen, die hiernach
aufgelistet sind, wobei es die Anwendung eines Verfahrens oder einer
Vorrichtung von einem der oben angegebenen Aspekte aufweist.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können Muster
bzw. Proben zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung präpariert
bzw. vorbereitet werden, wie in den früheren Patentanmeldungen beschrieben,
und/oder indem herkömmliche
pathologische und histologische Techniken und Verfahren benutzt werden,
die den Fachleuten wohlbekannt sind.
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Zum
Beispiel in-situ-Hybridisierung (insbesondere gebräuchlich
zur Erfassung von RNA): Hammond K L, Hanson I M, Brown A G, Lettice
L A, Hill R E „Mammalian
and Drosophila dachsund genes are related to the Ski proto-oncongene
and are expressed in eye and limb". Mech Dev. 1998 Jun; 74(1–2): 121–31.
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Immunohistochemie
(insbesondere gebräuchlich
zur Erfassung von Proteinen und anderen Molekülen): Sharpe J, Ahlgren U,
Perry P, Hill B, Ross A, Hecksher-Sorensen J, Baldock R, Davidson D. „Optical
projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression
studies" Science. 2002
Apr 19; 296(5567): 541–5.
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Es
ist verständlich,
dass eine Modifikation der Erfindung ohne Verlassen des Rahmens
der Erfindung gemacht werden kann.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
Erfindung wird nun in beispielhafter Weise mit Bezugnahme auf die
begleitenden Zeichnungen beschrieben. Hierbei zeigt:
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1 ein
Diagramm der Vorrichtung, welche die bevorzugte Ausführung der
Erfindung bildet;
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2a und 2b wie
die Mikroskopoptik der Vorrichtung angeordnet werden kann, um eine niedrige
numerische Apertur oder hohe numerische Apertur aufzuweisen;
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3 eine
bekannte Abbildung erzeugende Optik;
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4 und 5 die
Abbildung erzeugende Optik eines optischen Systems der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
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6a, 6b, 6c und 6d repräsentative
Lichtpfade für
das optische System der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
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7a, 7b und 7c Darstellungen, wie
unterschiedliche Brechungsgrade einen Betrieb des optischen Systems
beeinflussen;
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8 eine
Darstellung, wie Brechung unter Verwendung eines eindimensionalen
Fühlerarrays gemessen
wird; und
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9 bis 12 Darstellungen
des Betriebs des optischen Systems in drei Dimensionen.
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Detaillierte
Beschreibung der Zeichnungen
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Mit
Bezugnahme auf 1 weist die Vorrichtung eine
Lichtquelle 1 (in der Form eines Laser) auf, welche Licht
auf eine zweidimensionale Einrichtung 2 zur Abtastung bzw.
zum Scanning von Licht liefert, deren Abtastungsmechanismus ein
Dualspiegelsystem besitzt. Licht mit einer Abtastbewegung wird durch
eine Abbildung erzeugende Optik 3 geleitet. Ein dichroitischer
bzw. zweifarbiger Spiegel 4 ist zwischen der Lichtquelle 1 und
der Einrichtung 2 zur Abtastung angeordnet und richtet
zurückgekehrtes
Licht auf einen Hochgeschwindigkeits-Lichtfühler 5. Die Komponenten 1 bis 5 können mit
einem konfokalen Lichtabtastmikroskop versehen sein.
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Licht
von der Optik 3 durchläuft
eine Probe 6, die innerhalb eines drehbaren Objekttisches 7,
auf dem sie aufliegt, rotiert wird, wobei der Objekttisch 7 im
Aufbau zu dem Objekttisch korrespondiert, welcher in der vom Anmelder
zusammen anhängigen
internationalen Patentanmeldung PCT/GB02/02373 offenbart ist. Der
Objekttisch 7 dreht die Probe in aufeinander folgende indexierte
Positionen, wobei in jeder von diesen eine vollständige Abtastung
des Anregungslichts ausgeführt
wird, während
die Probe stillstehend ist. Nach Durchlaufen durch die Probe 6 wird das
Licht von einem optischen System 8 behandelt, welches das
Licht auf ein eindimensionales oder zweidimensionales Array von
Hochgeschwindigkeits-Lichtfühlern 9 ausrichtet.
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In
einem Fluoreszenzmodus wird Licht von der Probe 6 durch
die Optik 3 und die Einrichtung 2 zur Abtastung,
und von dort über
den Spiegel 4 zu dem Hochgeschwindigkeits-Lichtfühler 5 zurückgeführt. In
dem noch zu beschreibenden Übertragungsmodus
wird die neue Anordnung von Optik und Fühlern verwendet.
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Die
Mikroskopoptik 3 kann eine hohe numerische Apertur (2a)
aufweisen, oder sie kann so angepasst sein, dass sie eine niedrige
numerische Apertur (2b) aufweist, was für einige
abzubildende Proben nützlich
ist.
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3 stellt
ein bekanntes Abbildung erzeugendes System dar. Das Licht eines
jeden Punkts in der Brennebene 12 (innerhalb der Probe)
wird gesammelt bzw. gebündelt
und von einer Linse 13 auf einen einzelnen Punkt in der
Bildebene hin gebrochen. Es gibt eine solche Symmetrie, dass irgendein Punkt
auf der Bildebene 14 einen Punkt in der Brennebene 12 abbildet
und umgekehrt.
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Im
Gegensatz dazu ist die Erfordernis für eine Abbildung erzeugende
optische Anordnung bei der erfindungsgemäßen „nicht fokussierenden" Optik von 4 und 5 beseitigt,
welche keine solche Symmetrie zeigen. Das nicht fokussierende optische System 8 wird
durch eine Konvexlinse 15 repräsentiert. Das Licht von einem
einzelnen Punkt auf der Brennebene 12 wird nicht auf einen
einzelnen Lichtfühler
fokussiert. Es wird dergestalt zerstreut bzw. divergiert, dass nur
das Licht, welches die Probe 6 parallel zu dem einfallenden
Strahl verlässt
bzw. ausgeht oder umläuft,
den einzelnen Lichtfühler 9a erreicht,
der auf der optischen Achse angeordnet ist. Der Zweck der Linse 15 in 4 und 5 ist
unterschiedlich zu dem von 3. Die Funktion
findet in einer Lichtabtastsituation statt. Der Lichtstrahl wird über die
Probe durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Positionen (von
denen fünf
als die schwarzen Pfeile in 5 dargestellt
sind) gescannt bzw. abgetastet (zum Beispiel in einem Rastermuster).
Der Zweck des nicht fokussierenden optischen Systems 8 (das
heißt
die Linse 15) besteht darin, Licht auf den einzelnen Lichtfühler 9a zu
richten, welches die Probe parallel zu dem einfallenden Strahl verlässt oder umläuft, unabhängig von
der Abtastposition des Lichtstrahls. Bei Proben, welche eine signifikante Streuung
von Licht bewirken, gestattet das System ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis, das
durch Begrenzung der Abtastung von gestreutem Licht erreichbar ist.
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6a bis 6d,
welche Streuung als ein Beispiel zur Abweichung von der ursprünglichen Strahlposition
darstellen, zeigen einige repräsentative
Lichtpfade für
Strahlen (abgeleitet von einem Laserstrahl), die von der Probe 6 ausgesendet
werden, während sie
durch das nicht fokussierende optische System laufen. Der Strahl,
der sich der Probe von links annähert,
ist der auf die Probe einfallende Strahl.
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In 6a werden
Strahlen, die von einem Punkt in der Mitte der Probe 6 gestreut
werden, von dem Lichtfühler 9a hinweg
divergiert. Der prozentualen Anteil von gestreuten Strahlen, die
erfasst werden, kann durch Veränderung
der effektiven Größe des Fühlers eingestellt
werden. Eine einstellbare Irisblende ermöglicht diese Steuerung (welche
der Lochblende in einem konfokalen Abtastmikroskop sehr ähnlich ist).
Alternativ kann die Position der Linse eingestellt werden, um mehr
oder weniger Divergenz der gestreuten Strahlen zu bewirken. In optischen
Abbildung erzeugenden Systemen ist ein Airysches Beugungsscheibchen
das Interferenzmuster, welches von dem Licht erzeugt wird, das von
einem einzelnen Punkt innerhalb der Probe ausgeht. Optische Systeme,
welche größere Airysche
Beugungsscheibchen erzeugen, besitzen eine geringer Auflösungsleistung,
da Airysche Beugungsscheibchen von benachbarten Punkten innerhalb
der Probe sich überlappen.
Das Konzept des Airyschen Beugungsscheibchens ist nicht streng relevant
zu einem Projektionsmesssystem wie diesem, jedoch existiert ein ähnliches
Konzept. In dem Fall der hier beschriebenen nicht fokussierenden
Optik erzeugt Licht von jeder Projektion eine sehr breite Verteilung
von Intensitäten
(an der Position des Fühlers), ähnlich einem breiten
Airyschen Beugungsscheibchen, was niedrige Auflösungsleistung suggerieren könnte. Da
jedoch nur eine einzelne Projektion zu einem jeweils gegebenen Zeitpunkt
gemessen wird, können
auch sehr breite Verteilungen nicht miteinander interferieren.
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In 6b werden
Strahlen, die von anderen Punkten längs derselben in 6a abgetasteten
Linie gestreut werden, auch von dem Lichtfühler 9a hinweg divergiert.
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In 6c wird
ungestreutes Licht von einer unterschiedlichen abgetasteten Position
(schwarzer Pfeil) von der Probe im Wesentlichen parallel zu der optischen
Achse ausgesandt, und wird daher auf den Lichtfühler 9a hin gebrochen.
Wie in 6a und 6b wird
gestreutes Licht von dem Fühler 9a hinweg
gerichtet.
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In 6d werden
ungestreute Strahlen von jeder abgetasteten Position auf den Lichtfühler 9a hin ausgerichtet.
Die Pfeile stellen aufeinander folgende Positionen des Laserstrahls
dar, wenn er über
die Probe in einer Richtung senkrecht zur optischen Achse gescannt
wird.
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Alle
bisherigen ausgeführten
Untersuchungen mit optischer Projektionstomografie mussten annehmen,
dass der Refraktions- bzw. Brechungsindex der Probe gleichmäßig ist,
obwohl einiges von dem Licht gestreut wurde. Derzeitige Untersuchungen
haben demonstriert, dass eine Anzahl von wichtigen Proben (einschließlich medizinisches
Imaging bzw. Abbilden von Biopsien) ungleichmäßige Refraktionsindizes zeigen.
Dies bedeutet, dass der aktuelle Algorithmus die Proben nicht exakt
abbildet – Verzerrungen
und Artefakten werden hinein gebracht. Die beschriebene Vorrichtung
reduziert dieses Problem durch Messung von Informationen, die nicht
vorher bezüglich
des Winkels verfügbar
waren, in welchem ein Lichtstrahl von der Probe ausgeht. Im Allgemeinen
gestattet es das System bei Proben mit geringer Streuung aber ungleichmäßiger Verteilung
eines Refraktionsindexes, dass diese ungleichmäßige Verteilung durch Messung
des Refraktionsgrades berechenbar ist, der bei jeder Projektion
wahrgenommen wird.
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Bei
der Verwendung der vorliegenden Vorrichtung wird ein Reinigungs-
bzw. Klärmittel
(ein solches wie BABB) so benutzt, dass der Hauptteil des Lichts
nicht gestreut wird. Es ist jedoch Gegenstand einer unterschiedlichen
Form von Spaltung – Refraktion.
In 7 ist gestreutes Licht durch gestrichelte Linien
angegeben, während
der Lichthauptpfad als durchgezogene Linie dargestellt ist. In dem
ersten Beispiel von 7a wird dieser Pfad nicht gebeugt, wenn
er durch die Probe 6 läuft
(er wird nur beim Durchlaufen der Linse gebrochen). Der Hauptpfad durchläuft einen
Bereich der Probe mit einem höheren
Refraktionsindex als der Rest (graue Scheibe), jedoch sind beide Übergänge, auf
die er zwischen Bereichen von unterschiedlichem Refraktionsindex trifft,
senkrecht zu dem Lichtpfad, somit tritt keine Brechung auf.
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In
dem zweiten Fall von 7b ist der Beleuchtungsstrahl
etwas höher,
und deshalb sind die Übergänge, auf
die er zwischen dem grauen Bereich und dem weißen Bereich der Probe (unterschiedliche Refraktionsindizes)
trifft, leicht aus der Senkrechten versetzt. Dieses bewirkt zwei
leichte Brechungen bzw. Beugungen des Hauptpfads dergestalt, dass, wenn
das Licht aus der Probe hervortritt, es nicht länger parallel zu dem einfallenden
Strahl ist und leicht zur Seite des ursprünglich zentralen Lichtfühlers 9a gerichtet
wird. Wenn Hilfslichtfühler 9b auf
jeder Seite des zentralen Lichtfühlers 9a angeordnet
sind, können
diese den Grad der Brechung messen. Jede Projektion wird eine bestimmte
Verteilung von Intensitäten
entlang des Arrays von Lichtfühlern
geben. Die Verteilung von Intensitäten kann verwendet werden,
um den Winkel zu bestimmen, in welchem der Hauptlichtpfad aus der
Probe hervorgetreten ist. In dem letzten Fall von 7c hat
eine unterschiedlich abgetastete Position eine größere Beugung
des Strahls verursacht, welcher sich in einer weiteren Verschiebung
längs des
Fühlerarrays
widerspiegelt.
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In 8 weist
ein länglicher
Bereich der Probe 6 einen höheren Refraktionsindex (graue
Gestalt) als der Rest auf. Strahlen, die um die Probe herum laufen,
werden nicht gebeugt und werden so auf den zentralen Lichtfühler 9a gerichtet.
Strahlen, die durch die Mitte der Probe (mittlere zwei Strahlen 11 in 8)
verlaufen, werden zweimal gebeugt. Die zwei Übergänge, durch welche das Licht
hindurch läuft, (weiß zu grau
und dann grau zu weiß)
liegen parallel zueinander, und die Lichtstrahlen verlassen deshalb die
Probe in dem gleichen Winkel, in dem sie in sie eingefallen sind.
Diese Strahlen werden auch auf den zentralen Fühler 9a gerichtet.
Strahlen, die durch andere Abschnitte des grauen Bereichs verlaufen,
werden auch zweimal gebrochen, aber verlaufen nicht durch parallele Übergänge, so
dass diese Strahlen von den benachbarten Lichtfühlern 9b erfasst werden.
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Die
Tatsache, dass einige Strahlen gebrochen werden und noch die Probe 6 parallel
zu dem einfallenden Strahl verlassen, ist kein Problem. Das Beispiel
aus 8 zeigt nur eine der vielen Projektionsgruppen,
die durch diesen Schnitt hindurch ausgeführt werden. Ein vollständiges Abbilden
schließt ein
Erfassen eines solchen Datensatzes für viele Ausrichtungen durch
den Schnitt hindurch ein, und die Kombination aller dieser Daten
gestattet eine vollständige
Wiederherstellung der Aufteilung.
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9 bis 12 zeigen
dreidimensionale Ansichten der Vorrichtung. In 9 sind
alle ungebeugten (und ungestreuten) Strahlen durch einen zweidimensionalen
Schnitt der Probe auf den zentralen Lichtfühler des Arrays fokussiert.
Die Probe 6 wird um eine vertikale Achse zwischen indexierten
Positionen gedreht, wobei in jeder davon eine komplette Abtastung
ausgeführt
wird.
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10 zeigt
den Pfad von gestreutem oder gebeugtem Licht auf Hilfslichtfühler.
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11 stellt
dar, dass es die Linse (oder das optische System) dem eindimensionalen
Array von Fühlern 9 ermöglicht,
Daten von einer vollständigen zweidimensionalen
Rasterabtastung der Probe zu erfassen. Eine Zeile von abgetasteten
Positionen ist immer nach unten oder nach oben auf die Zeile von Fühlern ausgerichtet,
unabhängig
von der vertikalen Höhe
der Abtastung.
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Ein
zweidimensionales Array von Lichtfühlern 9 kann anstelle
eines eindimensionalen Arrays benutzt werden, wie in 12 dargestellt
ist. Dieses würde
es ermöglichen
Licht zu messen, welches oberhalb oder unterhalb der Ebene gestreut
oder gebeugt wird, welche von den in 12 dargestellten Lichtstrahlen
belegt ist.
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Die
Daten, die von der Fühlerarrayoptik 9 abgeleitet
werden, werden mittels eines Algorithmus interpretiert.
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Viele
verschiedene Algorithmusannäherungen
sind schon zur Durchführung
von Rückprojektionsberechnungen
vorhanden. Eine Annäherung bzw.
Behandlung besteht darin, einen linear gefilterten Standard-Rückprojektionsalgorithmus
(wie im Patent
US 5680484 )
zu verwenden. Weitere Annäherungen
schließen
iterative, maximale Entropie- und algebraische Rekonstruktionstechniken
ein. (R. Gordon et al., „Three-Dimensional Reconstruction
form Projections: A Review of Algorithms".)
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Der
Algorithmus arbeitet wie folgt:
- 1. Die Daten
werden zur Durchführung
einer Rückprojektion
verwendet als wenn es parallele (oder gefächerte Strahl-)Daten wären. Dieses
erzeugt eine „Fuzzy-"Abschätzung der
Verteilung von Absorptionseigenschaften der Probe, oder alternativ
eine Fuzzy-Verteilung der Fluoreszenz der Probe.
- 2. Eine erste Annäherung
der Verteilung eines Refraktionsindex wird abgeschätzt. Dieses
kann in einer Anzahl von Wege erfolgen. Ein verwendbares Verfahren
ist es anzunehmen, dass die Absorption oder fluoreszente Verteilung
die Verteilung eines Refraktionsindex widerspiegelt. Innerhalb eines
jeden Schnitts wird ein 2D-Gradientenvektor
für jedes
Voxel berechnet. Eine Alternative besteht darin, mit einer gleichmäßigen oder
einer zufälligen
Verteilung zu beginnen.
- 3. Die abgeschätzte
Refraktionsverteilung wird benutzt, um eine Vorwärtsprojektion auszuführen, das
heißt,
eine Voraussage darüber,
wie die Projektionsdaten aussehen sollten, wenn die anfängliche
Abschätzung
der Refraktionsverteilung korrekt war.
- 4. Die vorausgesagten Projektionen und die aktuellen Projektionen
werden verglichen.
- 5. Die abgeschätzte
Refraktionsverteilung wird modifiziert. Die Projektionen mit einer
größeren Differenz
zwischen Vorausgesagtem und Aktuellem zeigen an, welche Bereiche
der Verteilung mehr Modifikation benötigen. Zum Beispiel werden
sich in dem Fall der grauen Form, die in 8 dargestellt
ist, Projektionen von den gerundeten Enden der länglichen Gestalt in großem Maß von den
Voraussagen auf Grund des großen
Refraktionsbetrags unterscheiden. Die vor ausgesagten Refraktionsindizes
der Voxels in diesen Bereichen müssen
deshalb mehr als in anderen Bereichen verändert werden.
- 6. Die Schleife von 3 nach 6 wird wiederholt, bis keine weiteren
Verbesserungen mehr an den vorausgesagten Projektionen gemacht werden
können.
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Die
Algorithmusannäherung
kann auch verwendet werden, um andere optische Signale zu interpretieren,
zum Beispiel Fluoreszenz oder Streuung.
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Es
ist selbstverständlich,
dass Modifikationen der Erfindung vorgenommen werden können, ohne
den Rahmen der Erfindung zu verlassen.