DE10004191A1 - Hochleistungs-Grossfeld-Rastermikroskop - Google Patents
Hochleistungs-Grossfeld-RastermikroskopInfo
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Abstract
Ein optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) erzeugt zwei getrennte Punkte (S¶1¶ und S¶2¶) auf einer Probe (12) durch zwei Anregungslaserstrahlen (B¶1¶ und B¶2¶), die durch einen ersten und einen zweiten Laser (L¶1¶ und L¶2¶) erzeugt werden. Die Anregungslaserstrahlen (B¶1¶ und B¶2¶) gelangen in leicht unterschiedlichen Winkeln zuerst durch eine Apertur (15) eines 45 DEG -Umlenkspiegels (13) und dann durch ein Objektivelement (14). Dadurch werden Emissionslichtstrahlen (16, 18) von jedem beleuchteten Punkt (S¶1¶ und S¶2¶) erzeugt, und vom Spiegel (13) reflektiert und durch eine zweite Linse (19) gerichtet, bevor sie einen der beiden Detektoren (PMT 1 und PMT 2) erreichen. Der Emissionsstrahl (16) wird von einem zweiten 45 DEG -Spiegel (22) reflektiert, bevor er den Detektor (PMT 1) erreicht, während der Emissionsstrahl (18) direkt zum Detektor (PMT 2) gelangt. Gegebenfalls können optische Trennelemente (24) wie zum Beispiel dichroitische Filter, Prismen oder Gitter vor dem jeweiligen Detektor (PMT 1 und PMT 2) angebracht werden. Beim optischen Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) kann ein Abtastsytem (17) zum Beleuchten und Abbilden des gesamten Bereichs der Probe (12) verwendet werden.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf optische Fluoreszenz-
Abbildungssysteme und ein entsprechendes Verfahren und ins
besondere auf ein nicht konfokales Fluoreszenz-Abbildungs
system zur großflächigen Abbildung relativ großer Proben.
Die Erfindung bezieht sich auf das simultane Abbilden von
zwei oder mehr fluoreszierend markierte Proben in einem opti
schen Rastermikroskop. Das bei diesem System erhaltene Bild
feld ist wesentlich größer als das herkömmlicher Fluoreszenz
mikroskope, bei denen das Bildfeld typischerweise durch die
optische Konstruktion der Objektivlinse eingeschränkt ist. Die
Erfindung kann auf Proben wie zum Beispiel DNA-Mikrofelder
oder Gewebe-Mikrofelder angewendet werden, ist darauf aber
nicht beschränkt, wobei eine kurze Tiefenschärfe nicht benö
tigt wird, die nämlich die Systemleistung beeinträchtigen
würde (Cheung, V. G., M. Morley, F. Aguilar, A. Massimi, R.
Kucherlapati and G. Childs, "Making and reading microarrays"
("Herstellen und Abtasten von Mikrofeldern") Nature Genetics
Supplement 21: 15-19 (1999)). Sie ist außerdem für Proben
geeignet, die fluoreszente Markierungen mit kleinen Stokes-
Verschiebungen und/oder sich überlagernden Absorptions- und
Emissionsspektren verwenden.
Schwierigkeiten können bei der Fluoreszenzmikroskopie
auftreten, wenn mehrere Fluore mit nahe beieinanderliegenden
Spektraleigenschaften abgebildet werden. Es kann sich aufgrund
der Überlagerung von Absorptionsspektren oder der Spektral
bandbreite der Quelle als unpraktikabel herausstellen, nur
einen Fluor mit einem Quellenstrahl (z. B. einem Laserstrahl)
anzuregen. Die Spektralemissionsbereiche mehrerer Fluore
können sich überlagern, was es schwierig macht, die Emission
vom jeweiligen Fluor effizient und ohne Störungen zu einem
einzigen Detektor zu leiten. Selbst wenn sich die Emissions
bereiche nicht überlagern, können sie so nahe beieinander
liegen, daß es schwierig wird, eine wirksame optische Kom
ponente (z. B. Filter, Gitter oder Prisma) zu deren Trennung
herzustellen. Eine Lösung besteht darin, jede Wellenlänge
unabhängig abzutasten und dann ein Kompositbild aus mehreren
Abtastungen zusammenzusetzen. Hier werden dann jedoch die
Geschwindigkeit und die Bilddeckung ein Thema.
US-Patent Nr. 5,304,810 (Amos) offenbart ein konfokales
Rastermikroskop, bei dem zwei oder mehr Quellenstrahlen mit
unterschiedlichen Winkelausrichtungen zwei getrennte Punkte
beleuchten, die sich auf einer Probe in der Objektebene eines
Mikroskopobjektivs befinden. Das dabei entstehende reflektier
te oder fluoreszierende Licht wird durch eine gleiche Anzahl
beabstandeter Detektoren aufgefangen, wobei jeder Licht von
einem einzigen beleuchteten Punkt empfängt. Bei diesem System
ist der Bereich, aus dem Licht vom jeweiligen Detektor gesam
melt wird (sein "Blickfeld), räumlich auf fast die gleiche
Ausdehnung wie die Anregungspunktgröße beschränkt.
Ein Vorteil des Amos-Systems ist, daß damit eine hohe
räumliche Ausdehnung bei jedem einzelnen auf dem Muster be
leuchteten Punkt erreicht wird, was für viele Anwendungsberei
che höchst erwünscht ist. Bei anderen Anwendungsbereichen
reicht jedoch auch eine geringere Auflösung.
Shalon, D., S. Smith und P. O. Brown beschreiben in "A DNA
micro-array system for analyzing complex DNA samples using
two-color fluorescent probe hybridization" ("DNA-Mikrofeldsy
stem zum Analysieren komplexer DNA-Proben unter Verwendung
einer zweifarbigen Fluoreszenzprobenhybridisierung", Genome
Research 6: 639-645 (1996), einen Scanner zur Zwei-Wellenlän
gen-Fluoreszenzerfassung von DNA-Mikrofeldern, die Punkte
beträchtlicher Größe auf der Probe beleuchten. Dies geschieht
durch ein absichtliches Unterfüllen der Objektiv-Eingangs
pupille (d. h. der Rückapertur), was durch ein Verringern der
numerischen Apertur (NA) des konvergierenden Strahls die durch
Diffraktion eingeschränkte Punktgröße in der Brennebene ver
größert. Hierbei ist zu bemerken, daß ein beträchtliches
Unterfüllen der Objektivapertur mit einem Einzel-Quermoden-
Laserstrahl mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer Gauß'schen
Intensitätsverteilung in der Brennebene führt, während ein
Überfüllen der Objektivapertur, wie das oft in der Laser-
Rastermikroskopie geschieht, eine Verteilung in der Brennebene
erzeugt, die einer Airy-Funktion angenähert ist.
Wie auf diesem Gebiet allgemein bekannt, ist es möglich,
bei einem optischen Mikroskop die axiale Auflösung zu verbes
sern (die Tiefenschärfe zu verringern), indem man es als kon
fokales Mikroskop konstruiert. Der wesentliche Vorteil eines
konfokalen Mikroskops ist, daß Licht aus unscharfen Ebenen
abgestoßen wird, wodurch dicke Proben ohne Verschwimmen abge
bildet werden können (Corle, T. und G. Kino, Confocal Scanning
Optical Microscopy and Related Imaging Systems, Academic
Press, San Diego 1996). Cheung et al. (1999) haben festge
stellt, daß eine konfokale Konfiguration das Signal-Rauschen-
Verhältnis tatsächlich verringerte und daher beim Abtasten von
Mikrofeldern nicht vorteilhaft war. Außerdem ist die in einem
konfokalen System mit hoher numerischer Apertur erzeugte
Tiefenschärfe wesentlich geringer als die typische Dicke eines
Mikroskop-Objektträgers. Dies kann auch bei einem nicht kon
fokalen System mit hoher NA zum Thema werden, kann jedoch
leichter überwunden werden. Zum Beispiel werden bei der vor
liegenden Erfindung Quellenstrahlen mit niedriger NA mit
großflächigen Detektoren kombiniert, um so die Empfindlichkeit
gegenüber Unschärfen zu verringern.
Im US-Patent Nr. 5,459,325 (Heuton und Van Gelder) ist
ein Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzscanner offenbart, bei dem
ein leichtgewichtiger, eine Linse und einen Spiegel enthalten
der Abtastkopf verwendet wird. Diese Konstruktion hat den
Vorteil, daß das Sichtfeld verstellt werden kann. Es muß dabei
jedoch eine Spektraldispersionsvorrichtung verwendet werden,
die die Anregungs- und Emissionsstrahlen trennt. Wie oben
erörtert, gibt es praktische Hindernisse bei der spektralen
Strahltrennung, die in manchen Anwendungsgebieten die Flexi
bilität beschränken.
Es besteht daher ein Bedarf nach einem Mehrwellenlängen-
Abtastsystem zur Messung von Proben ohne strenge Tiefenunter
scheidung. Außerdem sollte es die Einschränkungen spektraler
Strahlteilung überwinden, damit verfügbare Fluore frei einge
setzt werden können. Ferner besteht ein Bedarf nach einem
entsprechenden Verfahren. Die vorliegende Erfindung ist auf
die Lösung dieses Problems gerichtet.
Das erfindungsgemäße optische Fluoreszenz-Abbildungs
system, das ursprünglich zum Zweck der Abbildung hybridis
ierter DNA-Chips konzipiert war, bietet eine reiche Auswahl
potentieller Fähigkeiten. Ein erster Aspekt des erfindungs
gemäßen Abbildungssystems weist eine optische Quelle auf zum
Erzeugen von mindestens zwei Anregungsstrahlen mit räumlicher
Trennung zum Beleuchten von mindestens zwei voneinander ge
trennten Punkten auf einer Probe, die einen vorbestimmten Ab
stand voneinander haben, wobei die beleuchteten Punkte minde
stens zwei Emissionsstrahlen erzeugen, die räumlich oder im
Winkel getrennt sind, einen Detektor zum Empfangen des jewei
ligen Emissionsstrahls und ein Objektivelement zum Richten des
Anregungsstrahls auf die Probe. Jeder Detektor hat ein Blick
feld (empfängt Licht von einem Bereich) auf der Probe, das
größer als der beleuchtete Punkt ist, jedoch nur einen ein
zigen beleuchteten Punkt umfaßt.
Nach einem Aspekt der Erfindung weist das Objektivelement
einen Abtastmechanismus zum Richten der Anregungsstrahlen auf
einen Bereich der Probe auf. Vorzugsweise weist der Abtastme
chanismus eine Einrichtung zum Bewegen des Objektivelements in
eine erste Richtung auf. Bei dieser Ausführungsform weist das
System weiter eine Einrichtung zum Bewegen der Probe in eine
zweite, typischerweise dazu im rechten Winkel verlaufende
Richtung auf. Datenverarbeitungssteuerungen und geeignete
Abbildungsverfahren werden zum Herstellen eines Bilds einer
abgetasteten Probe verwendet.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung erzeugen die
optische Quelle und das Objektivelement die beleuchteten
Punkte in der Weise, daß Punkte erzeugt werden, die relativ
große Punkte sind, wenn man sie mit diffraktionsbegrenzten
Punkten eines Mikroskopobjektivs mit einer mittleren bis hohen
numerischen Apertur (NA) vergleicht, wie sie typischerweise
bei einem konfokalen Mikroskop verwendet werden. Dies ist ein
wichtiges Merkmal eines Aspekts der Erfindung und wird im
einzelnen weiter unten erörtert.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung besteht zwischen
den beiden Anregungsstrahlen eine räumliche Trennung. Vorzugs
weise sind die Anregungsstrahlen zueinander winkelversetzt.
Außerdem weist das System weiter eine Einrichtung zum räumli
chen Trennen der Emissionsstrahlen und zum Umlenken der Emis
sionsstrahlen auf, wobei jeder zu seinem entsprechenden Detek
tor geleitet wird. Die räumliche Trennung der Anregungs- und
Emissionsstrahlen geschieht vorzugsweise über einen Spiegel
mit einem kleinen optischen Loch. Es sind jedoch auch andere
Konstruktionen denkbar, wie zum Beispiel ein kleiner Spiegel,
der kleiner als der Emissionsstrahl ist, oder ein Prisma.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist jeder Detek
tor von einem Brennpunkt seines entsprechenden Emissions
strahls versetzt. Hierdurch wird ein gewisser Grad der Un
schärfe erzeugt, die, wie hier noch erörtert, breitere Ab
bildungsverfahren zuläßt.
Ein zweiter Aspekt des erfindungsgemäßen Abbildungssy
stems weist eine optische Quelle zum Erzeugen eines Anregungs
strahls auf, der auf eine Probe gerichtet wird, die in einer
Weise abgebildet werden soll, bei der ein Emissionsstrahl von
der Probe erzeugt wird, einen Detektor zum Empfangen des
Emissionsstrahls von der Probe, ein Objektivelement zwischen
der optischen Quelle und der Probe zum Richten des Anregungs
strahls auf die Probe und zum Empfangen des Emissionsstrahls
von der Probe in einer Weise, bei der der Anregungsstrahl und
der Emissionsstrahl zumindests teilweise den gleichen Raum
einnehmen, und ein optisches Element zum geometrischen Trennen
des Anregungsstrahls vom Emissionsstrahl und zum Richten des
Emissionsstrahls auf den Detektor. Am Trennungspunkt der
beiden Strahlen nimmt der Anregungsstrahl teilweise den Emis
sionsstrahl ein.
Nach einem Aspekt dieser Ausführungsform des Abbildungs
systems nimmt der Anregungsstrahl einen Teil des Objektiv
elements ein und der Emissionsstrahl nimmt im wesentlichen das
gesamte Objektivelement ein. Vorzugsweise ist das Objektiv
element eine Linse, es kann jedoch auch ein Parabolspiegel
verwendet werden, sowie eine Anzahl dioptrischer, katoptischer
und katadioptrischer Abbildungssysteme.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung weist das opti
sche Element einen Spiegel mit einem kleinen Loch auf. Alter
native Konstruktionen für das optische Element, das hier auch
als Strahlteiler bezeichnet wird, sind ein kleiner Spiegel,
der kleiner ist als der Emissionsstrahl, ein Prisma und mehre
re andere unten beschriebene Konstruktionen.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung nimmt der Anre
gungsstrahl einen kleinen Prozentsatz des vom Emissionsstrahl
eingenommenen Raums ein.
Nach noch einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die
optische Quelle so konstruiert, daß sie einen ersten und einen
zweiten Anregungsstrahl erzeugt, die durch das Objektivelement
in einer Weise auf die Probe gerichtet werden, daß ein erster
und ein zweiter Emissionstrahl entstehen. Vorzugsweise sind
der erste und der zweite Anregungsstrahl zueinander winkelver
setzt. Alternativ dazu können jedoch der erste und der zweite
Anregungsstrahl parallel zueinander verlaufen. Bei dieser
alternativen Konstruktion kann das Objektivelement eine erste
und eine zweite Objektivlinse aufweisen für jeden Anregungs
strahl eine.
Des weiteren wird die oben genannte Aufgabe erfindungs
gemäß durch Verfahren nach den Ansprüchen 26 und 36 gelöst.
Vorteilhafte und bevorzugte Weiterbildungen des erfindungs
gemäßen Verfahrens nach Anspruch 26 sind Gegenstand der An
sprüche 27 bis 35. Vorteilhafte und bevorzugte Weiterbildungen
des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Anspruch 36 sind Gegen
stand der Ansprüche 37 bis 43.
Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung
der Erfindung ersichtlich, die anhand der Zeichnungen erfolgt.
Es zeigt:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen
optischen Abbildungssystems,
Fig. 2 ein Schema, bei dem die Anregungspunktgröße und das
Emissionsbildfeld des optischen Abbildungssystems
von Fig. 1 kontrastiert werden,
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer ersten prakti
schen Ausführungsform des optischen Abbildungssy
stems von Fig. 1,
Fig. 4 eine schematische Darstellung wie Fig. 3 einer zwei
ten praktischen Ausführungsform, bei der der Spiegel
und die Objektivlinse durch einen Parabolspiegel
ersetzt wurden,
Fig. 5 ein Schema einer Ausführungsform einer weiteren
alternativen Ausführungsform eines Parallel-Zwei
strahl-Abbildungssystems,
Fig. 6 eine vergrößerte schematische Darstellung des
Strahlteilers von Fig. 1,
Fig. 7-13 alternative Konstruktionen für Strahlteiler.
Die bevorzugten Ausführungsformern der Erfindung werden
nun im einzelnen beschrieben, von denen Beispiele in den
Zeichnungen dargestellt sind. Die Erfindung wird zwar anhand
bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, doch versteht es
sich, daß die beschriebenen Ausführungsformen nicht als spezi
fische Einschränkung der Erfindung auf diese Ausführungsformen
gedacht sind. Vielmehr soll die Erfindung sich auch auf Alter
nativen, Modifikationen und Äquivalente erstrecken, die im
Geist und im Umfang der Erfindung, wie er durch die nachfol
genden Ansprüche definiert ist, beinhaltet sein können.
Die hier gebotene Offenbarung ist als allgemeine Be
schreibung des Systems gedacht, wobei solche Eigenschaften wie
Bildfeld, Auflösung, Vergrößerung, Ausleuchtungsleistung und
Abbildungsmodi erörtert werden. Mehrere potentielle Variatio
nen des Systems werden auch beschrieben.
Gemäß Fig. 1 ist das erfindungsgemäße optische Fluores
zenz-Abbildungssystem 10 hier zur Verwendung in einem opti
schen Rastermikroskop offenbart, es hat jedoch weitere Anwen
dungsmöglichkeiten, wie noch erörtert wird. Zwei voneinander
getrennte Punkte S1 und S2 werden auf einer Probe 12 durch ein
Paar Anregungslaserstrahlen B1 und B2 beleuchtet, die durch
einen ersten und einen zweiten Laser L1 und L2 erzeugt werden.
Jede der Laserquellen L1 und L2 enthält dabei tatsächlich
mehrere Komponenten (z. B. einen Frequenzverdopplungskristall
zum Erzeugen eines 532-nm-Strahls). Die Anregungs-Laserstrah
len B1 und B2 gelangen in geringfügig verschiedenen Winkeln
zuerst durch eine Apertur 15 eines 45°-Umlenkspiegels 13 und
dann durch ein Objektivelement 14, das in Fig. 1 als Linse
dargestellt ist. Dadurch werden Emissionslichtstrahlen S1 und
S2 relektiert und durch den Spiegel 13 umgelenkt und durch
eine zweite Linse 19 geleitet, bevor sie einen der beiden
Detektoren PMT 1 oder PMT 2 erreichen. Der Emissionsstrahl 16
wird an einem zweiten 45°-Spiegel 22 reflektiert, bevor er den
Detektor PMT 1 erreicht, während der Emissionsstrahl 18 direkt
zum PMT 2 gelangt. Gegebenenfalls können optische Trennelemen
te 24, wie zum Beispiel dichroitische Filter, Prismen oder
Gitter vor jedem Detektor PMT 1 und PMT 2 positioniert werden.
Es versteht sich, daß die optimale relative Position optischer
Trennelemente 24 und ihrer entsprechenden Detektoren, PMT 1
und PMT 2, etwas anders sein kann, als in Fig. 1 gezeigt.
Das optische Fluoreszenz-Abbildungssystem 10 kann ein
Abtastsystem verwenden, das durch die Referenznummer 17 all
gemein in Phantomdarstellung angedeutet ist, das zum Beleuch
ten und Abbilden des gesamten Bereichs der Probe 12 dient.
Vorzugsweise verwendet das Abtastsystem 17 einen Objektivlin
senscanner für eine Achse und einen Proben-(Tisch-)Scanner für
die andere, darauf senkrecht stehende Achse. Das Abtastsystem
17 ist anhand von Fig. 3 eingehender beschrieben.
Es können unterschiedliche Verfahren zum Erzeugen einer
Winkelversetzung, wie sie durch den Winkel θ angegeben ist,
für die Anregungsstrahlen B1 und B2 verwendet werden. Einer der
Strahlen B1 und B2 kann durch einen 45°-Umlenkspiegel 20
gerichtet werden, so daß die Strahlen B1 und B2 mit einer
leichten Winkelversetzung ihrer Propagationsrichtungen in das
optische Abtastsystem eintreten. Bei dieser Konstruktion sind
die Anregungsstrahlen selbst kollimiert oder annähernd kolli
miert.
Die Größe des beleuchteten Bereichs der Punkte S1 und S2
auf der Probe 12 wird durch die Anregungsstrahldurchmesser,
die Brennweite F1 der Objektivlinse 14 und den Grad der Defo
kussierung der Probe bestimmt. Vorzugsweise sind die Anre
gungsstrahldurchmesser viel kleiner als die Eingangspupille
der Objektivlinse. Die Eingangspupille ist die Abbildung der
Aperturblende der Linse aus der Sicht der Quelle und der
Detektoren (und nicht der Probe).
Das Objektivelement 14 ist eine asphärische Einzellinse.
Der nominelle Probenbrennpunkt liegt auf halbem Weg zwischen
den Brennpunkten der beiden Anregungsstrahlen (wobei die
Brennpunkte aufgrund axialer chromatischer Aberration axial
voneinander getrennt sind). Bei der aktuellen Anwendungsweise
haben die Beleuchtungspunkte S1 und S2 einen Durchmesser in der
Größenordnung von 5-10 µm. Die erwünschte Punktgröße und
axiale Trennung kann dadurch eingestellt werden, daß einer
oder alle beide Anregungsstrahlen B1 und B2 leicht konver
gierend oder divergierend und nicht kollimiert sind. Die
seitliche Versetzung zwischen den beiden Punkten wird durch
den Winkel θ der Anregungsstrahlen und die Brennweite der
Objektivlinse bestimmt. Wie noch erörtert wird, kann das
Objektivelement 14 alternativ auch anders konstruiert sein.
Das optische Fluoreszenz-Abbildungssystem 10 verwendet
zwei Detektoren PMT 1 und PMT 2, von denen jeder Licht von
einem der zwei beleuchteten Punkte S1 und S2 auffängt. Durch
den 45°-Umlenkspiegel 22, der den Emissionsstrahl 16 umlenkt,
wird verhindert, daß die Detektoren PMT 1 und PMT 2 Licht vom
falschen Beleuchtungspunkt empfangen, wodurch die Probe in
zwei Bereiche aufgeteilt wird, von denen jeder von einem
einzigen Detektor "gesehen" wird. Die Detektoren PMT 1 und PMT
2 können PMT (photomultiplier tubes/Photovervielfacherröh
ren), Photodioden, Lawinen-Photodioden, CCD-Elemente und
andere optische Detektoren enthalten.
Gemäß Fig. 2 "sieht" jeder Detektor einen von zwei (oder
mehr, im allgemeinen Fall) sich nicht überlagernde Bereiche R1
und R2 der Probe, wobei eine Grenze 25 zwischen diesen Berei
chen verläuft, die durch die Position des Spiegels 22 im
Verhältnis zur zweiten Linse 19, wie in Fig. 1 gezeigt, be
stimmt wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform haben die
Anregungspunkte S1 und S2 einen Durchmesser in der Größen
ordnung von 5-10 µm. Die Größe dieser Punkte wird durch die
Durchmesser und Wellenlängen der eintreffenden Laserstrahlen
B1 und B2 und dadurch bestimmt, daß diese Strahlen nicht die
ganze Apertur der Objektivlinse 14 ausfüllen. Vorzugsweise ist
die Entfernung zwischen diesen Punkten ungefähr 70 µm. Im
Gegensatz dazu ist bei einem konfokalen Mikroskop eine typi
sche Anregungspunktgröße in der Größenordnung von 1 µm oder
weniger, was daran liegt, daß der Punkt durch die diffrak
tionsbegrenzte Punktgröße einer Mikroskoplinse mit einer
mittleren bis hohen NA bestimmt wird.
Zum Erreichen der erwünschten Größe der beleuchteten
Punkte S1 und S2 der vorliegenden Erfindung wird die Eingangs
pupille der Objektivlinse 14 unterfüllt, indem die Laserstrah
len B1 und B2 direkt in die Linse gerichtet und nicht auf den
Durchmesser der Eingangspupille expandiert werden. Diese
Anordnung vermeidet die Verwendung eines dichroitischen Spie
gels zum Trennen des Anregungslichts und des Emissionslichts,
wie das sonst bei konfokalen Mikroskopen und anderen optischen
Abtastsystemen normalerweise getan wird. Stattdessen ist ein
(idealerweise) 100%-reflektierender Spiegel 13 mit einem 1 mm
großen Loch 15 in dessen Mitte vorgesehen. Das Loch kann
kreisförmig, elliptisch oder schlitzförmig sein. Die Anre
gungslichtstrahlen (typischerweise mit einem Durchmesser von
0,8 mm) gelangen durch das Loch, während das Fluoreszenz-
Emissionslicht vom Spiegel reflektiert wird und, falls nötig,
durch ein Sperrfilter, durch das gestreutes Anregungslicht
herausgefiltert wird, und durch die zweite Linse 19 zu den
Lichtdetektoren PMT 1 und PMT 2.
Das Blickfeld der Detektoren PMT 1 und PMT 2 unterschei
det sich auch vom Blickfeld der Detektoren eines typischen
konfokalen Mikroskops. Hier ist zu bemerken, daß das Blickfeld
sich in diesem Zusammenhang auf das Bild des Detektors oder
der Detektorapertur auf der Probe und nicht die Gesamtgröße
des abgetasteten Bereichs bezieht. Wie in Fig. 2 gezeigt, ist
das gesamte Blickfeld der Detektoren bei der vorliegenden
Erfindung der Bereich 26, der beide Anregungspunkte S1 und S2
umfaßt. Es ist in Fig. 2 zwar als Kreis gezeigt, doch versteht
es sich, daß der Bereich 26 auch andere Formen annehmen kann.
Zum Beispiel kann das Blickfeld bei der Probe 12 eine Quer
abmessung von 200 mm haben. Der vor die Detektoren PMT 1 und
PMT 2 geschaltete Spiegel 22 teilt das Blickfeld in zwei
Hälften 28 und 30, so daß jeder Detektor ungefähr die Hälfte
des gesamten Blickfelds "sieht". Dagegen ist das Blickfeld
eines konfokalen Mikroskops räumlich auf 1 µm oder weniger
beschränkt, was fast die gleiche Größe wie der Anregungspunkt
ist, was zum Maximieren der höhen seitlichen Auflösung nötig
ist. Das Blickfeld wird bei einem konfokalen Mikroskop typi
scherweise durch eine vor den Detektor geschaltete Apertur
beschränkt.
Ein zusätzlicher Unterschied zwischen dem vorliegenden
System und einem konfokalen System hängt mit der Tiefenschärfe
(axialen Auflösung) zusammen. Bei, einem typischen hoch ver
größernden konfokalen Mikroskop beschränkt die Verwendung
einer Detektorapertur zum Abweisen von unscharfem Licht die
Tiefenschärfe auf 1 mm oder weniger. Da das erfindungsgemäße
optische System nicht aktiv unscharfes Licht mit Detektoraper
turen oder kleinen Detektoren abweist, ist die Tiefenschärfe
wesentlich größer als bei einem konfokalen Mikroskop.
Wie bei allen optischen Rastermikroskopen erzeugt das
Abbildungssystem 10 ein Bild durch ein sequentielles Erfassen
von Pixeldaten (z. B. Fluoreszenz) und Konstruieren eines Bilds
durch bekannte Computergraphikverfahren. Bei zwei Anregungs
strahlen mit einer kleinen seitlichen Versetzung zwischen
ihren Testorten auf der Probe bildet das vorliegende System
zwei komplette Bilder mit einer bekannten seitlichen Verset
zung dazwischen. Die Abtastung erfolgt in den beiden lateralen
Richtungen.
Bei einer ersten praktischen Ausführungsform des Systems,
wie es in Fig. 3 gezeigt ist, werden zwei Abtastmechanismen
verwendet, jeder in der Form eines Translationstisches 40, 42.
Der Translationstisch 40 ist mit einer linearen Kodierein
richtung 43 kombiniert. In einer ersten Abtastrichtung, die
durch den Pfeil 44 angezeigt ist, gelangen die Anregungsstrah
len B1 und B2 in den Abtasttischbereich in einer ungefähr
horizontalen Richtung, werden durch einen Umlenkspiegel 46
nach oben zur Probe 12 reflektiert, und dann durch eine Objek
tivlinse 14 auf die Probe 12 fokussiert. Die Bewegung des
Translationstischs 40 in der Richtung des Pfeils 44 ergibt die
Bewegung in einer ersten Richtung, bei der der Meßort auf der
Probe durch die optische Achse des Objektivelements 14 be
stimmt wird. Die Langsam-Achsen-Abtastung wird durch ein
Bewegen der Probe 12 über den Translationstisch 42 in einer
zweiten Richtung im rechten Winkel zur ersten Abtastrichtung
bewerkstelligt, wobei die zweite Richtung, wie gezeigt, senk
recht auf der Seite steht.
Fig. 3 zeigt auch eine alternative Zwei-Wellenlängen-
Version des erfindungsgemäßen Abbildungssystems. Zusätzliche
dichroitische Strahlteiler 44, 50 und Bandpaßfilter 54, 56
werden zum Zusammenmischen von Licht aus mehreren Lasern (zwei
Laser sind gezeigt) und zum Trennen fluoreszierenden Emis
sionslichts auf mehrere Bänder verwendet. Diese Anordnung kann
zum simultanen Abtasten mit mehreren Quellen- und Erfassungs
wellenlängen verwendet werden. Wie unten bezüglich des in Fig.
10 gezeigten Strahlteilers erörtert, kann die Leistung dieser
Konstruktion durch die Eigenschaften der dichroitischen
Strahlteiler eingeschränkt sein.
Kleinere Abänderungen der Konstruktion des vorliegenden
Systems können daraus ein Allzweckmikroskop machen oder es auf
spezifische Verwendungsweisen zuschneiden. Diese Abänderungen
beziehen sich auf die Strahlquelle oder -quellen und die
Strahlteilungs-, Erfassungs- und Abtastungseigenschaften, wie
hier erörtert.
Eine Anzahl alternativer Anregungslichtquellenkonfigura
tionen kann bei dem vorliegenden System verwendet werden. Der
einfachste Fall ist die Verwendung eines einfachen axialen
Laserstrahls. Der Probenort liegt dann am Brennpunkt der
Objektivlinse (wenn man einen kollimierten Laserstrahl an
nimmt). Der Teil der Linse, durch den der Strahl gelangt
ändert sich nicht mit der Abtastposition. Dies ist etwas
einfacher als die in Fig. 1 gezeigte allgemeine Anwendung, bei
der die finiten Winkel, die die beiden Anregungsstrahlen mit
der optischen Achse bilden, die Auswirkung haben, daß sie sich
während der Abtastbewegung der Linse zur Mitte der Objektiv
linse und von ihr weg bewegen. Hierdurch entstehen sich leicht
verändernde Beleuchtungsbedingungen während des Abtastung, was
nicht passiert, wenn die Strahlen mit der Linsenachse koaxial
verlaufen. Es ist auch möglich, zwei oder mehr koaxiale Quel
lenstrahlen zu verwenden. In diesem Fall beleuchten sie den
gleichen Punkt auf der Probe (wenn die chromatische Aberration
vernachlässigt wird).
Außerdem ist es möglich, getrennte Beleuchtungspunkte zu
erhalten, indem parallele Strahlen verwendet werden, von denen
jeder einen Teil der Objektivlinsenapertur ausleuchtet. Die
einzelnen Strahlen konvergieren als getrennte Lichtkegel und
sind in der Brennebene der Linse koinzident (wenn man annimmt,
daß kollimierte Quellenstrahlen auf die Objektivlinse auf
treffen). Ein Nachteil bei diesem Verfahren im Vergleich zu
den in einem Winkel verlaufenden Strahlen ist, daß sich der
Abstand zwischen den zwei konvergierenden Strahlen mit einer
Unschärfe der Probe verändert, und es wirkt sich ein vertika
ler Lauffehler (Unschärfe) während der Abtastung auf sie aus.
Wenn die Probe dem Brennpunkt der Linse näherkommt, nähern
sich die beiden Beleuchtungspunkte einander. In dem Fall der
Winkelversetzung der vorliegenden Konstruktion ist dieser
Effekt wesentlich weniger stark ausgeprägt (die beiden Punkte
liegen nie übereinander, wenn man annimmt, daß sich die beiden
Strahlen vor der Objektlinse und nicht zwischen der Linse und
der Probe überkreuzen). Die Auswirkungen eines Lauffehlers auf
den Abstand zwischen den Beleuchtungspunkten können bei der
vorliegenden Erfindung minimiert werden, indem man die beiden
Beleuchtungsstrahlen sich am oder nahe dem vorderen Brennpunkt
der Objektivlinse kreuzen läßt.
Mehrere Strahlen können von einer oder mehr Quellen
kommen und können unterschiedliche Spektraleigenschaften haben
oder nicht. Außerdem ist es möglich, einen oder beide Quellen
strahlen über der Probe (also von gegenüber der Objektivlinse)
einstrahlen zu lassen. Dies ist unten im Abschnitt über Durch
leuchtungsmöglichkeiten bei den alternativen Abbidungsmodi
beschrieben.
Kleinere Beleuchtungspunkte können dadurch erreicht wer
den, daß der Durchmesser der Quellenstrahlen erhöht wird (z. B.
indem die Strahlen durch ein Raumfilter/einen Strahlaufweiter
geleitet werden) und die Eingangspupille der Objektivlinse
überfüllt wird. Das Raumfilter besteht aus einer positiven
Linse zum Fokussieren des Strahls und einer Lochblende, das
zum Durchlassen von lediglich der mittleren Keule des Bre
chungsmusters (Airy-Musters) gedacht ist. Der Strahl expan
diert jenseits der Lochblende und wird durch eine weitere
Linse kollimiert. Dieser Strahl wird dann durch die Objektiv
linse auf die Probe fokussiert, wodurch ein diffraktionsbe
schränkter Beleuchtungspunkt erzeugt wird. Bei dieser Anwen
dungsform sind die durch zwei im Winkel zueinander stehende
Quellenstrahlen nur im Zwischenbereich des Brennpunkts vonein
ander getrennt, und es kann eine gut korrigierte Objektivlinse
nötig sein, um eine angemessene Leistung zu erzielen.
Fig. 4 zeigt eine Abänderung der Konstruktion von Fig. 3.
Bei dieser Ausführungsform wird ein einziger außeraxialer
Parabolspiegel 60 anstelle der Kombination der Objektivlinse
und des 45°-Spiegels verwendet. Der Parabolspiegel 60 hat
viele Funktionen. Er lenkt die Achse der eintreffenden Laser
strahlen B1 und B2 um 90° ab; er fokussiert die Strahlen zu
Einschnürungen, die auf die Probenoberfläche 12 fallen; er
sammelt und rekollimiert Fluoreszenzemissionen und lenkt die
Emissionstrahlen um 90° um.
Fig. 5 veranschaulicht ein gespaltenes paralleles Zwei
strahlsystem. Die Anregungslichtstrahlen B1 und B2 werden durch
getrennte Laser L1 und L2 in paralleler Ausrichtung erzeugt.
Ein Spiegel 64 mit zwei Löchern 66, 68 ist im Pfad der Anre
gungsstrahlen B1 und B2 zum Richten der Strahlen auf zwei
nebeneinanderliegende Objektivlinsen 70, 72 vorgesehen. Ein
Paar beleuchteter Punkte S1 und S2 wird erzeugt, von denen
Fluoreszenzemissionen durch die Objektivlinsen 70, 72 als
Emissionsstrahlen 76, 78 kollimiert werden. Der Spiegel 64
lenkt die Emissionsstrahlen 76, 78 in räumlich getrennter
Weise zu den Detektoren PMT 1 und PMT 2 um, wobei ein 45°-
Spiegel 80 für den Emissionsstrahl 78 vorgesehen ist. Diese
optische Anordnung braucht keine zweite Linse, die aber, wenn
das von Vorteil ist, natürlich auch mit eingebaut werden kann.
Das erfindungsgemäße optische System verwendet eine neue
Konstruktion für einen Strahlteiler, die in Fig. 1 in der Form
eines Spiegels mit einem kleinen Loch dargestellt ist. Eine
vergrößerte Darstellung dieser Konstruktion ist in Fig. 6
gezeigt. Die Anregungsstrahlen B1 und B2 (zwei beim gezeigten
System, in allgemeinen Fällen jedoch auch einer oder mehr)
gelangen durch das Loch 15 in der Mitte des Spiegels 13. Die
Objektivseite des Spiegels 13 weist eine reflektierende Be
schichtung 84 zum Umlenken der Emissionslichtstrahlen 16, 18
auf.
Das von der Probe ausgestrahlte fluoreszente Emissions
licht 16, 18 kehrt entlang der gleichen Richtung zurück,
jedoch mit einem viel größeren Durchmesser als die Anregungs
strahlen B1 und B2. Insbesondere haben die Anregungsstrahlen B1
und B2 einen kleineren Durchmesser als die Eingangspupille der
Objektivlinse, während das gesammelte Emissionslicht 16, 18
den Durchmesser der Objektivpupille hat (wenn kollimierte
Emissionsstrahlen angenommen werden). Aufgrund des großen
Mißverhältnisses zwischen den Durchmessern der Anregungs- und
der Emissionsstrahlen wird durch das Loch 15 in der Mitte des
Spiegels 13 nur eine geringe Menge Emissionslicht verloren,
wodurch ein wirksamer Strahlteiler entsteht.
Die Strahlen B1 und B2 von Fig. 6 sowie in Fig. 7-13
sind aus Gründen der Veranschaulichung koaxial. In der Praxis
können sie koaxial sein oder auch nicht.
Wie in Fig. 7 gezeigt, kann das Loch in der Mitte des
Spiegels dadurch erzeugt werden, daß eine reflektierende
Beschichtung 86 auf der einen Oberfläche eines optischen
Fensters 88 angebracht wird, wobei ein kleiner Bereich 90 in
der Mitte unbeschichtet bleibt (oder antireflektierend be
schichtet wird).
Die reflektierende Beschichtung kann durch eine total
reflektierende Innenoberfläche ersetzt werden, wie in Fig. 8
gezeigt. In diesem Fall werden ein kleines Prisma 85 und ein
großes Prisma 87 so kombiniert, daß die Beleuchtungsstrahlen
B1, B2 in das kleine Prisma eintreten, durch die Schnittstelle
zwischen den Prismen hindurchtreten und aus dem großen Prisma
heraustreten. Die Emissionsstrahlen 16, 18, die einen viel
größeren Durchmesser als die Beleuchtungsstrahlen haben,
treten in das große Prisma 87 ein, gelangen jedoch nicht zum
kleinen Prisma 85 hindurch, außer an der Stelle, an der die
beiden Prismen in Kontakt sind. Stattdessen wird der Großteil
des Strahls innen total reflektiert und tritt auf der anderen
Fläche des großen rechtwinkligen Prismas wieder aus.
Ein weiteres Beispiel ist in Fig. 9 gezeigt, bei dem ein
transparentes Spiegelsubstrat 90 (optisches Fenster) eine
teilreflektierende Beschichtung 92 auf einer Oberfläche hat.
Bei dieser Ausführungsform gelangt ein Teil der Emissions
strahlen 16' und 18' zurück durch das optische Fenster 90.
Bei dieser Konstruktion bewirkt die teilweise reflektie
rende Beschichtung, daß ein Teil (z. B. 50%) eines auf sie
auftreffenden Strahls reflektiert wird und der verbleibende
Teil hindurchgelassen wird (wenn man die Absorption vernach
lässigt). Dies ist eine gebräuchliche Konstruktion für ver
gleichbare Beleuchtungs-Anregungs-) und Erfassungs-(Emis
sions-)Strahldurchmesser. Es gehen dabei jedoch mindestens 75%
verloren (der Beleuchtungsstrahl wird durch den Strahlteiler
hindurchgelassen und der Erfassungsstrahl von ihm reflektiert
oder umgekehrt). Beim vorliegenden System, bei dem der Durch
messer des Anregungsstrahls wesentlich kleiner ist als der des
Emissionsstrahls, ist dieser Verlust unnötig hoch, und aus
diesem Grund handelt es sich hierbei nicht um eine bevorzugte
Ausführungsform. Ein Platten-Strahlteiler ist in Fig. 9 ge
zeigt, doch kann diese Art von Strahlteiler auch in anderen
Formen, wie zum Beispiel als Kubus oder als Membran, verwirk
licht werden.
Eine Abänderung der in Fig. 9 gezeigten Konstruktion
verwendet einen Polarisierungs-Strahlteiler und ein Viertel
wellenplättchen zum Verbessern des Wirkungsgrads des Systems.
In diesem Fall reflektiert der Strahlteiler linear polarisier
tes Licht, das dann durch das Viertelwellenplättchen in zirku
lär polarisiertes Licht umgewandelt wird. Nach der Reflexion
von der Probe wird der Rückstrahl durch das Viertelwellen
plättchen wieder in linear polarisiertes Licht zurückverwan
delt, nun jedoch mit der richtigen Polarisierung, die vom
Polarisierungsstrahlteiler hindurchgelassen wird. Die Reihen
folge von Reflexion und Transmission durch den polarisierenden
Strahlteiler kann auch umgekehrt sein. Dieses Polarisierungs
verfahren wird aufgrund der Beibehaltung der Polarisierung
typischerweise bei der Reflexion, nicht bei der Fluoreszenz
verwendet.
Ein weiteres Beispiel für einen Strahlteiler ist in Fig.
10 gezeigt, wo ein dichroitischer Strahlteiler 94 verwendet
wird, der eine dichroitische Beschichtung 96 aufweist. Bei der
dichroitischen Strahlteilerkonstruktion wird eine Strahlteil
erbeschichtung verwendet, die einen oder mehrere Wellenlängen
bereiche reflektiert (oder hindurchläßt), während sie andere
Wellenlängenbereiche hindurchläßt (bzw. reflektiert). Dies ist
eine effiziente Lösung im fluoreszierenden Betrieb, wo zwi
schen den Beleuchtungswellenlängen und den Emissionswellenlän
gen eine spektrale Verschiebung besteht. Die praktischen
Einschränkungen von dünnen Beschichtungen und die Überlagerung
zwischen dem Absorptions- und dem Emissionsspektrum fluores
zierender Farbstoffe verhindern, daß dies eine ideale Lösung
in der Fluoreszenzmikroskopie ist.
Noch ein weiteres Beispiel für einen Strahlteiler ist in
Fig. 11 gezeigt. Ein kleiner Spiegel 95 reflektiert die Anre
gungsstrahlen B1 und B2, während die Emissionsstrahlen 16, 18
hauptsächlich am Spiegel vorbeigehen. Fig. 11 zeigt im wesent
lichen den umgekehrten Fall von Fig. 6. Hier werden nicht die
Anregungsstrahlen durch ein kleines Loch im Spiegel hindurch
gelassen, der den Erfassungsstrahl reflektiert, wie das beim
Strahlteiler von Fig. 6 geschieht, vielmehr werden die Strah
len von einem kleinen Spiegel 95 reflektiert, während die
Emissionsstrahlen 16, 18 um den Spiegel herum durchgelassen
werden. Der kleine Spiegel kann auch dadurch hergestellt
werden, daß eine reflektierende Beschichtung auf lediglich
einen kleinen Teil eines optischen Fensters aufgebracht wird,
wobei der Rest des Fensters unbeschichtet bleibt (oder mit
einer Antireflexionsbeschichtung beschichtet wird). Alternativ
dazu könnte der Spiegel die Anregungsstrahlen zusätzlich zum
Reflektieren auch noch kollimieren (oder sonst abbilden). Dies
könnte für eine von der Seite des Strahls eingebrachte Faser
quelle geeignet sein.
Fig. 12 zeigt ein weiteres Beispiel, bei dem eine Faser
quelle 99 mit einer Linse 98 einen kollimierten Anregungs
strahl B1 auf das Objektivelement richtet. Der Emissionsstrahl
16 geht an der Linse 98 und der Faserquelle 99 vorbei zum
Detektor.
Außerdem ist es möglich, den Strahlteiler mit einer
Fokussierfähigkeit zu versehen. In Fig. 13 lenkt ein außer
axiales Parabolspiegelsegment 100 mit einem Loch 102 in der
Mitte Emissionsstrahlen 16, 18 um und fokussiert sie auf die
Detektoren. Der in Fig. 13 gezeigte Parabolspiegel ermöglicht
es, den Anregungs- und den Emisssionstrahl zu kombinieren, wie
das auch beim Strahlteiler von Fig. 6 geschieht, gleichzeitig
wird jedoch der Emissionsstrahl fokussiert. Auf die zum Fokus
sieren des Lichts auf die Detektoren verwendete Abbildungs
linse kann nun verzichtet werden, weil ihre Funktion vom
Parabolspiegel übernommen wird. Ein Parabolspiegel leistet
eine perfekte (aberrationsfreie) Abbildung eines kollimierten,
axialen Eingangsstrahls. Die Abbildungsleistung des Parabol
spiegels läßt jedoch bei der außeraxialen Abbildung schnell
nach, und unterschiedlich geformte Linsen sind in bestimmten
Fällen wohl zu bevorzugen.
Ein einziger Detektor wird derzeit zum Sammeln von Licht
vom jeweiligen Beleuchtungsbereich auf der Probe verwendet.
Zwei oder mehr Detektoren können zum Sammeln von Licht vom
jeweiligen Punkt verwendet werden, wobei zum Beispiel spek
trale oder räumliche Unterschiede zwischen dem von den Detek
toren empfangenen Licht bestehen. Die Emission von der Probe
kann zum Beispiel von einem dichroitischen Strahlteiler, einem
dispersiven Element, wie zum Beispiel einem Prisma, oder einem
anderen Brechungselement, wie zum Beispiel einem Gitter in
zwei oder mehr spektrale Bereiche aufgeteilt werden.
Bei dem bevorzugten Erfassungsverfahren wird ein Spiegel
zum Ablenken von Licht von einem der beiden beleuchteten
Punkte zu einem der Detektoren verwendet, während Licht von
dem anderen beleuchteten Punkt ungestört zum anderen Detektor
hindurchgelassen wird. In gewissem Sinn wird die Kante dieses
Spiegels auf die Probe projiziert, wodurch diese in zwei sich
nicht überlagernde "Erfassungs"-Bereiche aufgeteilt wird.
Es ist möglich, die Größe dieser Erfassungsbereiche zu
verringern, indem Aperturen vor einem oder vor mehr Detektoren
angebracht werden. Das Anbringen von solchen Aperturen macht
aus dem vorliegenden System kein konfokales Mikroskop. Bei
einem konfokalen Mikroskop ist eine dreidimensionale Abbildung
möglich, weil Licht von unscharfen Bereichen der Probe abge
wiesen wird. Dies geschieht durch gleichzeitiges diffraktions
begrenztes Abbilden einer Punktquelle und eines Punktdetektors
auf den gleichen Punkt auf der Probe; diese Bedingungen sind
beim vorliegenden System nicht erfüllt.
Das vorliegende System ist zwar nominell für eine Epi-
Beleuchtungs-Fluoreszenz-Abbildung konstruiert, doch sind auch
eine Anzahl anderer Betriebsarten möglich. Diese Modi sind zum
Beispiel Transillumination (Durchleuchtung), Dunkelfeld-,
Hellfeld-, konfokale, interferometrische, Polarisations und
Differenz-Interferenz-Kontrast-Beleuchtung (DIC-Beleuchtung),
sind auf diese jedoch nicht beschränkt.
Bei einem Epi-Beleuchtungssystem beleuchten die Quellen
strahlen die Probe durch die gleiche Linse, die auch zum
Sammeln des Lichts zur Erfassung verwendet wird. Das vorlie
gende System kann in ein Durchleuchtungssystem verändert
werden, indem die Probe von oben beleuchtet wird, während die
Objektivlinse das resultierende Fluoreszenzlicht unterhalb der
Probe sammelt. In gleicher Weise kann die Probe auch von unten
beleuchtet werden, während die Sammellinse über der Probe
angebracht ist. Beim Durchleuchtungs-Fluoreszenzbetrieb kann
der Teil des Beleuchtungsstrahls, der von der Probe durch
gelassen wird, zu den Detektoren weitergelangen. Eine Trennung
der Quellen- und Fluoreszenzsingale wird allgemein durch
Spektralfilter erreicht, und Fehler in diesen Filtern (d. h.
finite Sperrbereichs-Durchleuchtung) verringern dann das
Signal-Rauschen-Verhältnis des Systems. Das vorliegende System
verwendet einen neuartigen Strahlteiler mit einem kleinen Loch
zum Hindurchlassen der Beleuchtungsstrahlen, während die einen
größeren Durchmesser aufweisenden Erfassungsstrahlen haupt
sächlich reflektiert werden. Bei einem Durchleuchtungssystem
kann ein ähnliches Loch in einen Umlenkspiegel im Erfassungs
pfad angebracht werden, wodurch verhindert wird, daß hindurch
gelassene Quellenstrahlen zu den Detektoren gelangen.
Das vorliegende System ist zum Untersuchen fluoreszenter
Eigenschaften von DNA-Chips geeignet, wie zum Beispiel Bildern
mit geringer Tiefenauflösung, womit bestimmt werden kann,
welche Sequenz von Nukleotiden in der DNA-Probe vorhanden ist
oder welche Gene über- oder unterexprimiert sind, was einfach
dadurch geschieht, daß bestimmt wird, welcher Bereich des
komplementäre DNA-Sequenzen enthaltenden DNA-Chips fluoreszent
ist. Das vorliegende System kann aber auch einfach zum Unter
suchen der Streueigenschaften dieser oder anderer Proben
eingesetzt werden. Im Epi-Beleuchtungsmodus erlaubt eine
Entfernung der Spektralfilter im Erfassungspfad (in den Erfas
sungspfaden) das Sammeln von Licht, das von der Probe reflek
tiert wurde (wenn auch Sorgfalt darauf verwendet werden muß,
daß die reflektierten Quellenstrahlen auch wirklich zu den
Detektoren gelangen und nicht durch das Loch im Strahlteiler
entweichen). Dies ist auch bei der Durchleuchtung möglich,
wobei die Hindurchlassung und das Vorwärtsstreuen des Lichts
gemessen wird.
Mehrere andere Abbildungsmodi sind bei Modifikationen des
vorliegenden Systems möglich. Wie oben erörtert, führt das
Anbringen von kleinen Aperturen vor den Detektoren zusammen
mit verkleinerten Beleuchtungspunkten zu einem konfokalen
System. Hierdurch wird eine Abbildung dicker Objekte und eine
dreidimensionale Abbildung möglich. Eine weitere Möglichkeit
besteht in der Verwendung als Interferenzmikroskop (eine nicht
fluoreszierende Verwendung), wobei die Objektivlinse dann
einen Strahlteiler und eine Referenzoberfläche aufweisen muß.
Hierdurch wird eine dreidimensionale Abbildung reflektierender
Gegenstände möglich mit einer axialen Auflösung, die unter der
Wellenlänge liegt. Es sind auch Polarisations- und DIC-Ab
bildungsmodi denkbar, wenn diese auch zusätzliche Komponenten
des Systems benötigen würden.
Claims (44)
1. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10), gekennzeich
net durch
- - eine optische Quelle (L1, L2) zum Erzeugen von mindestens zwei Anregungsstrahlen (B1, B2) mit räumlicher Trennung zum Beleuchten auf einer Probe (12) von mindestens zwei vonein ander getrennten Punkten (S1, S2), die einen vorbestimmten Abstand voneinander haben, wobei die beleuchteten Punkte mindestens zwei Emissionsstrahlen (16, 18) erzeugen, die räum lich getrennt sind,
- - einen Detektor zum Empfangen des jeweiligen Emissions strahls und
- - ein Objektivelement zum Richten des Anregungsstrahls auf die Probe, und dadurch, daß
- - jeder Detektor ein Blickfeld (28, 30) der Probe hat, das größer als ein beleuchteter Punkt (S1, S2) ist.
2. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement einen
Abtastmechanismus zum Richten der Anregungsstrahlen (B1, B2)
auf einen Bereich der Probe (12) aufweist.
3. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
2, dadurch gekennzeichnet, daß der Abtastmechanismus eine Ein
richtung (40) zum Bewegen des Objektivelements in eine erste
Richtung und weiter eine Einrichtung (42) zum Bewegen der
Probe (12) in eine zweite, dazu im rechten Winkel verlaufende,
Richtung aufweist.
4. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Quelle (L1, L2) und
das Objektivelement die beleuchteten Punkte (S1, S2) in einer
Weise erzeugen, daß die Punkte im Vergleich zu diffraktions
begrenzten Punkten eines Objektivelements eines konfokalen
Mikroskops relativ groß sind.
5. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungs- (B1, B2) und
Emissionsstrahlen (16, 18) durch das Objektivelement hindurch
gelangen und daß es weiter eine räumliche Trennung der Anre
gungs- und Emissionsstrahlen aufweist.
6. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsstrahlen (B1, B2)
einen Teil des Objektivelements und die Emissionsstrahlen (16,
18) im wesentlichen das gesamte Objektivelement einnehmen.
7. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsstrahlen (B1, B2)
zueinander winkelversetzt sind.
8. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
7, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter eine Einrichtung zum
räumlichen Trennen der Emissionsstrahlen und zum Umlenken der
Emissionsstrahlen jeweils zu ihrem eigenen Detektor (PMT 1,
PMT 2) aufweist.
9. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Detektor von einem Brenn
punkt seines jeweiligen Emissionsstrahls versetzt ist.
10. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
5, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Trennung der
Anregungs- und Emissionsstrahlen mittels eines Spiegels (13)
mit einem kleinen optischen Loch bewerkstelligt wird.
11. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
5, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Trennung der
Anregungs- und Emissionsstrahlen mittels eines kleinen Spie
gels (95), der kleiner als der ein Emissionsstrahl ist, be
werkstelligt wird.
12. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
5, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Trennung der
Anregungs- und Emissionsstrahlen mittels eines Prismas (87)
bewerkstelligt wird.
13. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Detektor ein Blickfeld
(28, 30) der Probe (12) hat, das auch kleiner als der Abstand
zwischen zwei Punkten (S1, S2) ist.
14. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
5, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement eine Linse
(14) ist.
15. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
5, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement entweder
ein Parabolspiegel (60), ein dioptrisches, ein katoptisches
oder ein katadioptrisches Abbildungssystem sein kann.
16. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10), gekennzeich
net durch
- - eine optische Quelle zum Erzeugen eines Anregungsstrahls, der auf eine Probe (12) gerichtet wird, die in der Weise abge bildet werden soll, daß ein Emissionsstrahl von der Probe erzeugt wird,
- - einen Detektor zum Empfangen des Emissionsstrahls von der Probe,
- - ein Objektivelement zwischen der optischen Quelle und der Probe zum Richten des Anregungsstrahls auf die Probe und zum Empfangen des Emissionsstrahls von der Probe in einer Weise, bei der der Anregungsstrahl und der Emissionsstrahl mindestens teilweise den gleichen Raum einnehmen,
- - ein optisches Element zum geometrischen Trennen des Anregungsstrahls vom Emissionsstrahl zum Richten des Emis sionsstrahls auf den Detektor, und dadurch, daß
- - der Anregungsstrahl am Trennungspunkt der beiden Strahlen teilweise den Emissionsstrahl einnimmt.
17. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
16, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl einen Teil
des Objektivelements einnimmt und der Emissionsstrahl im
wesentlichen das gesamte Objektivelement einnimmt.
18. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
16, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement eine Linse
(14) ist.
19. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
16, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektivelement entweder
ein Parabolspiegel (60), ein dioptrisches, ein katoptisches
oder ein katadioptrisches Abbildungssystem (10) sein kann.
20. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
16, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element einen
kleinen Spiegel (95) aufweist, der kleiner als ein Emissions
strahl ist.
21. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
16, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element ein
Prisma (87) aufweist.
22. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
16, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl einen
kleinen Prozentsatz des Raums einnimmt, der vom Emissions
strahl eingenommen wird.
23. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
16, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Quelle (L1, L2) so
ausgebildet ist, daß sie einen ersten und einen zweiten Anre
gungsstrahl (B1, B2) erzeugt, die vom Objektivelement derart
auf die Probe (12) gerichtet werden, daß dabei ein erster und
ein zweiter Emissionsstrahl (16, 18) entsteht.
24. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
23, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite
Anregungsstrahl (B1, B2) zueinander winkelversetzt sind.
25. Optisches Fluoreszenz-Abbildungssystem (10) nach Anspruch
23, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite
Anregungsstrahl (B1, B2) zueinander parallel sind und das
Objektivelement eine erste und eine zweite Ojektivlinse (70,
72) aufweist, von denen jeweils eine für einen Anregungsstrahl
(B1, B2) gedacht ist.
26. Verfahren zu optischen Fluoreszenzabbildung, gekennzeich
net durch die folgenden Schritte:
- - Erzeugen von mindestens zwei Anregungsstrahlen (B1, B2) mit räumlicher Trennung zum Beleuchten auf einer Probe (12) von mindestens zwei voneinander getrennten Punkten (S1, S2), die einen vorbestimmten Abstand voneinander haben, wobei die beleuchteten Punkte (S1, S2) mindestens zwei räumlich getrennte Emissionsstrahlen (16, 18) erzeugen,
- - Richten der Anregungsstrahlen auf die Probe (12),
- - Erfassen jedes Emissionsstrahls (16, 18) mit einem Detek tor (PMT 1, PMT 2), der ein Blickfeld der Probe (12) hat, das größer als ein beleuchteter Punkt (S1, S2) ist.
27. Verfahren nach Anspruch 26, gekennzeichnet durch den
folgenden Schritt: Scannen der Anregungsstrahlen über die
Probe zum Erzeugen eines Abbilds eines Bereichs der Probe.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß
der Schritt des Scannens den folgenden Schritt aufweist: Bewe
gen des Objektivelements in einer ersten Richtung und Bewegen
der Probe in einer zweiten, dazu rechtwinkligen Richtung.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß
die beleuchteten Punkte in einer Weise erzeugt werden, daß die
Punkte im Vergleich zu diffraktionsbegrenzten Punkten eines
Objektivelements eines konfokalen Mikroskops relativ groß
sind.
30. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß
die Anregungs- und die Emissionsstrahlen durch ein Objektiv
element gelangen und es weiter den folgenden Schritt aufweist:
räumliches Trennen der Anregungs- und der Emissionsstrahlen.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß
die Anregungsstrahlen einen Teil des Objektivelements ein
nehmen und die Emissionsstrahlen im wesentlichen das gesamte
Objektivelement einnehmen.
32. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß
die Anregungsstrahlen zueinander winkelversetzt sind.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß
es weiter den folgenden Schritt aufweist: räumliches Trennen
der Emissionsstrahlen und umlenken der Emissionsstrahlen
jeweils zu ihren eigenen Detektoren.
34. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß
der Schritt des räumlichen Trennens der Anregungs- und der
Emissionsstrahlen dadurch bewerkstelligt wird, daß die Anre
gungsstrahlen durch einen Spiegel (13) mit einem kleinen
optischen Loch gerichtet werden und die Emissionsstrahlen vom
Spiegel reflektiert werden.
35. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß
der Schritt des räumlichen Trennens der Anregungs- und der
Emissionsstrahlen dadurch bewerkstelligt wird, daß die Anre
gungsstrahlen von einem kleinen Spiegel (95), der kleiner als
ein Emissionsstrahl ist, reflektiert werden und die Emissions
strahlen am Spiegel vorbeigelassen werden.
36. Verfahren zum optischen Fluoreszenzabbilden mit den
folgenden Schritten:
- Erzeugen eines Anregungsstrahls, der auf eine Probe
gerichtet wird, die so abgebildet werden soll, daß ein Emis
sionsstrahl von der Probe erzeugt wird,
- - Erfassen des Emissionsstrahls von der Probe,
- - Richten des Anregungsstrahls durch ein Objektivelement und auf die Probe und Richten des Emissionsstrahls durch das Objektivelement in einer Weise, bei der der Anregungsstrahl und der Emissionsstrahl mindestens teilweise den gleichen Räum einnehmen, und
- - geometrisches Trennen des Anregungsstrahls vom Emissions strahl und Richten des Emissionsstrahls auf den Detektor, dadurch gekennzeichnet, daß
- - der Anregungsstrahl am Trennungspunkt der beiden Strahlen teilweise den Emissionsstrahl einnimmt.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß
der Anregungs- und der Emissionsstrahl durch das Objektiv
element in der Weise gerichtet werden, daß der Anregungsstrahl
einen Teil des Objektivelements einnimmt und der Emissions
strahl im wesentlichen das gesamte Objektivelement einnimmt.
38. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß
der Schritt des geometrischen Trennens des Anregungs- und des
Emissionsstrahls die Verwendung eines Spiegels (13) mit einem
kleinen Loch einschließt.
39. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß
der Schritt des geometrischen Trennens des Anregungs- und des
Emissionsstrahls die Verwendung eines kleinen Spiegels (95),
der kleiner als ein Emissionsstrahl ist, einschließt.
40. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß
der Anregungsstrahl einen kleinen Prozentsatz des vom Emis
sionsstrahl eingenommenen Raums einnimmt.
41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß
der erste und der zweite Anregungsstrahl (B1, B2) durch ein
Objektivelement in einer Weise auf die Probe gerichtet wird,
daß ein erster und eine zweiter Emissionsstrahl gebildet
werden.
42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß
der erste und der zweite Anregungsstrahl (B1, B2) zueinander
winkelversetzt sind.
43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß
der erste und der zweite Anregungsstrahl (B1, B2) parallel
zueinander sind und das Objektivelement eine erste und ein
zweite Objektivlinse (70, 72) aufweist, für jeden Anregungs
strahl (B1, B2) eine.
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