DE102009057985A1

DE102009057985A1 - Elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler

Info

Publication number: DE102009057985A1
Application number: DE102009057985A
Authority: DE
Inventors: Dan Davidovici
Original assignee: Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2011-06-16

Abstract

Die Erfindung betrifft einen elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler, ein Mikroskopsystem mit einem solchen Strahlteiler und Mikroskopierverfahren mit entsprechenden Mikroskopsystemen. Der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler (9, 14) enthält eine Flüssigkristallanordnung, deren Kristalle mit einer dichroitisch reflektierenden Beschichtung versehen sind und deren Kristalle durch Anlegen von elektrischen Signalen zwischen Lichtreflexion und Lichttransmission an den dichroitisch reflektierenden Beschichtungen umschaltbar sind. Dabei weist die Flüssigkristallanordnung an unterschiedlichen Stellen unterschiedliche dichroitische Beschichtungen auf, deren Reflexionswellenlängenbänder von einander verschieden sind.

Description

Die Erfindung betrifft einen elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler, ein Mikroskopsystem zur optischen Bildaufnahme und Bildauswertung für die Fluoreszenzmikroskopie mit einem solchen elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler, sowie Mikroskopierverfahren mit solchen Mikroskopsystemen.
In der Fluoreszenzmikroskopie und zur Fluoreszenzanalyse werden zur Zeit Laser-Scan-Mikroskope eingesetzt, wobei laserinduzierte Fluoreszenzsignale zur Charakterisierung eines Untersuchungsgegenstandes beispielsweise von Lösungen oder festen Körpern ausgewertet werden, wie in der DE 101 44 435 B4 beschrieben. Dabei werden Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens zur Charakterisierung der Eigenschaften von fluoreszierenden Proben, beispielsweise lebenden Zellen und Geweben in multi-well, in in-vitro Fluoreszenz-Assays und in DNA-Chips durchgeführt. Die Laser-Scan-Mikroskope benötigen aber allgemein für schnelle Diffusionsvorgänge zu lange Aufnahmezeiten, um detektierte Unterschiede genau zu definieren, und anderseits für die Aufnahmen großer Bildfelder relativ große Aufnahmezeiten.
Aus der DE 102 10 831 A1 ist ein optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem bekannt, bei dem auch bei bisher nur der Laser-Scan-Mikroskopie vorbehaltenen Fluoreszenzanwendungen mit konventioneller Mikroskopie ganze Bildfelder simultan übertragen werden können. Dazu ist in einem Emissionsstrahlengang ein dichroitisch ausgebildeter Strahlteiler angeordnet, der das Licht des Emissions- oder Abbildungsstrahlenganges aufteilt und jeweils einen Teil davon wellenlängenabhängig mindestens zwei Digitalkameras zuführt. Die Aufnahmeparameter der Digitalkameras sind unabhängig voneinander wählbar und die Startzeitpunkte der Bildaufnahmen der Digitalkameras sind zueinander synchronisiert.
Aus der DE 199 21 127 A1 sind weiterhin Mikroskopsysteme zur optischen Abtastung von mikroskopischen Objekten sowie Verfahren zur optischen Abtastung insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen bekannt, wobei u. a. die erste und zweite Bilddetektionseinrichtung je eine Digitalkamera und je einen dichroitischen Strahlteiler umfasst und der Strahlteiler derart ausgelegt ist, dass Detektionsstrahlen des Detektionsbereichs in dem ersten Wellenlängenbereich per Transmission durch den Strahlteiler auf die erste Digitalkamera und Detektionsstrahlen des Detektionsbereichs in dem zweiten Wellenlängenbereich per Reflexion an dem Strahlteiler auf die zweite Digitalkamera fallen.
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler zu schaffen, dessen spektrale Transmissions- und Reflexionseigenschaften durch elektrische Ansteuerung variiert werden können.
Eine weiter Aufgabe ist es, ein Mikroskopsystem zur optischen Bildaufnahme und Bildauswertung, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie, zu schaffen, bei dem mittels eines elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers in einfacher Weise die Beleuchtung eines Präparats und/oder die optische Bildaufnahme und Bildauswertung in der Fluoreszenzanalyse mit einfachen Mitteln schnell variiert werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, mit einem solchen Mikroskopsystem durchführbare Mikroskopierverfahren anzugeben.
Diese Aufgaben werden durch einen elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler mit den Merkmalen des Anspruchs 1, ein Mikroskopsystem mit den Merkmalen des Anspruchs 5 und Mikroskopierverfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 9, 10 und 12 gelöst. Vorteilhafte Ausführungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der abhängigen Patentansprüche.
Bei einer Ausführungsform weist der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler eine Flüssigkristallanordnung auf, deren Kristalle mit einer dichroitisch reflektierenden Beschichtung versehen sind und deren Kristalle durch Anlegen von elektrischen Signalen zwischen Lichtreflexion und Lichttransmission an den dichroitisch reflektierenden Beschichtungen umschaltbar sind. Die Flüssigkristallanordnung weist dabei zusätzlich an unterschiedlichen Stellen unterschiedliche dichroitische Beschichtungen auf, deren Reflexionswellenlängenbänder von einander unterschiedlich sind.
Flüssigkristalldisplays mit einer reflektierenden Beschichtung, deren Kristalle durch anlegen von elektrischen Signalen zwischen Lichtreflexion und Lichttransmission umschaltbar sind, sind im Prinzip aus der modernen TFT-Technologie bekannt. Beschrieben sind derartige Displays beispielsweise in der WO94/20879 . Dort wird als reflektierende Beschichtung aber üblicher Weise eine Silberbeschichtung verwendet, die über das gesamte visuelle Lichtspektrum bei entsprechender Spannungsbeaufschlagung des Flüssigkristalls mehr oder minder gleich gut reflektiert. Im Gegensatz dazu werden bei einer Ausführungsform der Erfindung unterschiedliche Beschichtungen gewählt, die bei entsprechender Spannungsbeaufschlagung des Flüssigkristalls von einander verschiedene Teilspektren des sichtbaren Lichtspektrums, oder des nahen infraroten oder nahen ultravioletten Spektralbereichs reflektieren.
Es sind jedoch auch Ausführungsformen der Erfindung mit sogenannten Multi-Mirror Arrays möglich, bei denen die einzelnen Spiegelelemente jeweils eine dichroitische Beschichtung aufweisen. Bei dieser Ausführungsform weisen zumindest einige unterschiedliche Spiegelelemente auch eine unterschiedliche dichroitische Beschichtung auf, deren Reflexionswellenlängenbänder von einander verschieden sind. Die Spiegelelemente werden dann elektronisch oder elektrisch geschaltet.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung können die dichroitisch reflektierenden Beschichtungen dadurch realisiert werden, dass einem bekannten TFT-Display mit einer breitbandig reflektierenden Beschichtung eine Transmissionsfilteranordnung vorgeschaltet wird, die in unterschiedlichen Bereichen unterschiedliche Spektralanteile transmittiert. Wesentlich eleganter ist es jedoch, entsprechende verschiedene spektrale Filterschichten direkt auf den Flüssigkristall oder auf die einzelnen Pixel der Flüssigkristallanordnung aufzubringen.
Bei einer alternativen Ausführungsform des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers weist dieser mindestens drei unterschiedliche dichroitische Beschichtungen mit unterschiedlichen Reflexionswellenlängenbändern auf. Man kann dann mit diesem Strahlteiler mindestens drei verschiedene Wellenlängenbänder separat und unabhängig von einander schalten.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler eine Flüssigkristallanordnung auf, die aus einer Vielzahl an Pixel aufgebaut ist. Jedes der Pixel kann selbst wieder jeweils separat schaltbare Subpixel mit jeweils unterschiedlichen dichroitischen Beschichtungen aufweisen, deren Reflexionswellenlängenbänder von einander abweichen. Mit einer solchen Anordnung können die transmittierten oder reflektierten Wellenlängenbänder pixelweise geschaltet werden.
Ein Mikroskopsystem nach der Erfindung weist mindestens einen oben beschriebenen elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler auf. Es ist jedoch auch möglich, dass das Mikroskopsystem zwei oder mehr elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler aufweist.
Bei einer Ausführungsform weist das Mikroskopsystem einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung eines Objekts auf und der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler ist im Beleuchtungs- oder Extinktionsstrahlengang angeordnet ist. Mit einem solchen System kann das Präparat an unterschiedlichen Stellen mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge oder unterschiedlicher Spektralbereiche beleuchtet werden. Alternativ dazu kann bei einer anderen Ansteuerung des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers das Präparat an allen Orten mit Licht derselben Wellenlänge oder desselben Wellenlängenbereichs beleuchtet werden und diese Wellenlänge oder dieser Wellenlängenbereich kann zeitlich sequenziell variiert werden. Dadurch sind dann sogenannte Extinktions-Ratio-Messungen möglich, indem die bei unterschiedlichen Beleuchtungswellenlängen erzeugten Fluoreszenzen separat und synchron zur Veränderung der Beleuchtungswellenlänge erfasst und zueinander ins Verhältnis gesetzt werden.
Bei einer alternativen Ausführungsform weist das Mikroskopsystem in einem Beobachtungs- oder Extinktionsstrahlengang zwei Kameras auf und der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler ist im Beobachtungs- oder Emissionsstrahlengang derart angeordnet, dass er das Licht des Beobachtungs- oder Emissionsstrahlengang wellenlängenabhängig zwischen den beiden Kameras aufteilt. Mit einem solchen System können auch mit nur zwei Kameras Fluoreszenzintensitäten bei mehr als zwei Fluoreszenzwellenlängen ohne Umbauten separat erfasst und verarbeitet werden. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, das mit einer Kamera detektierte Fluoreszenzsignal mithilfe des mit der zweiten Kamera aufgenommenen Fluoreszenzsignals zu korrigieren. Darüber hinaus besteht allerdings auch die Möglichkeit mehr als nur zwei Kameras einzusetzen.
Bei einer Ausführungsform eines Mikroskopsystems ist eine Steuereinrichtung zur selektiven Ansteuerung und Schaltung der einzelnen mit unterschiedlichen dichroitischen Beschichtungen versehenen Bereiche der Flüssigkristallanordnung vorgesehen.
Bei einem ersten Mikroskopierverfahren mit einem oben beschriebenen Mikroskopsystem wird ein zu untersuchendes Präparat in einem ersten Präparatbereichen mit Licht einer ersten Lichtwellenlänge oder eines ersten Lichtwellenlängenspektrums beleuchtet wird und gleichzeitig in einem zweiten Präparatbereich, das verschieden vom ersten Präparatbereich ist, mit Licht einer zweiten Lichtwellenlänge oder einem zweiten Lichtwellenlängenspektrum beleuchtet, wobei die zweite Lichtwellenlänge oder das zweite Lichtwellenlängenspektrum unterschiedlich zur ersten Lichtwellenlänge oder dem ersten Lichtwellenlängenspektrum ist.
Bei einem weiteren Mikroskopierverfahren mit einem oben beschriebenen Mikroskopsystem wird ein zu untersuchendes Präparat während einer ersten Zeitperiode in einem ausgedehnten Präparatbereich mit Licht einer ersten Lichtwellenlänge oder eines ersten Lichtwellenlängenspektrums beleuchtet und während einer zweiten Zeitperiode mit Licht einer zweiten Lichtwellenlänge oder einem zweiten Lichtwellenlängenspektrum beleuchtet, wobei die zweite Lichtwellenlänge oder das zweite Lichtwellenlängenspektrum unterschiedlich zur ersten Lichtwellenlänge oder dem ersten Lichtwellenlängenspektrum ist, und wobei in der ersten und der zweiten Zeitperiode in der Probe erzeugtes Fluoreszenzlicht räumlich über den Präparatbereich aufgelöst separat detektiert und ausgewertet wird. Mit diesem Verfahren sind sogenannte Extinktions-Ratio-Messungen über ausgedehnte Bildfelder in kurzer Zeit und ortsaufgelöst möglich. Der ausgedehnte Präparatbereich sollte dabei einen Durchmesser aufweisen, der ein Vielfaches, vorzugsweise mehr als ein Hundertfaches, der ersten und oder zweiten Lichtwellenlänge oder einer Lichtwellenlänge des ersten oder zweiten Lichtwellenlängenspektrums beträgt.
Bei einem weiteren Mikroskopierverfahren mit einem oben beschriebenen Mikroskopsystem, bei dem der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler das Licht des Emissionsstrahlengangs wellenlängenabhängig zwischen zwei Kameras aufteilt, werden die Transmissions- und Reflexionseigenschaften des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler in unterschiedlichen räumlichen Bereichen variiert und dadurch die Existenz verschiedener Farbstoffe in unterschiedlichen Bereichen eines Präparats nachgewiesen.
Eine Ausbildung des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers als transparenter LCD-Screen hat den Vorteil, dass der dichroitische Strahlteiler im Mikroskopsystem elektronisch punktweise steuerbar ist, und dass durch Änderung der Schaltzustände der LCD-Pixel des LCD-Screens unterschiedliche Reflexionseigenschaften eingestellt werden können. Dabei sollten die LCD-Pixel durch eine Steuereinheit digital ansteuerbar sein und sich je nach erhaltenem Steuersignal in einem Licht reflektierenden oder einem Licht transmittierenden Zustand befinden.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass von jeder Dreier-Pixelkombination jedes Subpixel einzeln in zwei verschiedenen Schaltstellungen digital ansteuerbar vorgesehen ist.
Ein Einsatz des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers im Extinktionsstrahlengang hat weiterhin den Vorteil, dass beispielsweise nur eine digitale Farbkamera statt wie üblicherweise zwei Schwarz-Weiß-Kameras notwendig sind.
Der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler kann nicht nur in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden, sondern er ist auch in der konventionellen Mikroskopie zur Untersuchung unterschiedlichster Präparate einsetzbar.
Durch eine Teilbeleuchtung eines Präparates durch eine punktweise Ansteuerung einer LCD-Pixelkombination sind die Präparatbereiche, die mit Licht einer gewünschten Wellenlänge oder eines gewünschten Wellenlängenbereichs beleuchtet werden, frei wählbar. Außerdem können durch Zusammenfassung von mehr als drei LCD-Pixeln zu einer Pixelkombination Zwischenfarben eines zu untersuchenden Präparates erkennbar gemacht werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
1: eine schematische Darstellung eines Mikroskopsystems am Beispiel eines aufrechten Mikroskops,
2: eine Prinzipdarstellung eines als Strahlteiler ausgebildeten LCD-Screens,
3: eine Anordnung des Strahlteilers im Emissionsstrahlengang,
4: eine Anordnung des Strahlteilers im Extinktionsstrahlengang und
5: einen Graphen der Reflexionen der reflektiven Beschichtungen des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers in 2 als Funktion der Wellenlänge.
Ein in 1 dargestelltes Mikroskopsystem 1 zur optisches Bildaufnahme und Bildauswertung für die Fluoreszenzmikroskopie weist ein Stativ 2 auf, an dem in bekannter Weise ein höhenverstellbarer Objekttisch 3 für ein aufzunehmendes Präparat 4 für eine Fluoreszenzanalyse angeordnet ist. Oberhalb des Objekttisches 3 ist an dem Stativ 2 ein Objektivrevolver 5 zur Aufnahme mehrerer Objektive 6 vorgesehen. Die Rückseite des Stativs 1 weist eine Beleuchtungseinrichtung 7 zur Erzeugung eines Auflichtbeleuchtungsstrahlenganges 8 zur Anregung von Fluoreszenzen auf.
Oberhalb des Objektivrevolvers ist ein Auflichtreflektor angeordnet, der als elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler 9 ausgebildet ist. Der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler 9 ist dabei so geneigt zur optischen Achse des Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs 8 angeordnet, dass er bei entsprechender Schaltung der Pixel auf Reflexion einen Teil des Lichtspektrums des Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs 8 zu den Objektiven 6 und damit zum Präparat 4 umlenkt.
Weiterhin oberhalb des Auflichtreflektors ist ein Teilerprisma 11 angeordnet, dass durch den Auflichtreflektor transmittiertes Licht zwischen einem Okulartubus 12 und einem Kamerastrahlengang aufteilt.
Weiterhin weist das dargestellte Mikroskop ein an den Kamerastrahlengang angesetztes Kamerasystem 13 auf, das zwei Kameras 15, 16 aufweist. Das Kamerasystem 13 weist einen weiteren dichroitischen Strahlteiler 14 auf, der das Licht des Kamerastrahlengangs zwischen beiden Kameras 15, 16 aufteilt. Auch dieser dichroitische Strahlteiler 14 ist als elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler ausgebildet.
Jede der beiden Digitalkameras 15, 16 ist mit einem nicht näher dargestellten Computer zur Auswertung der mit den Kameras 15, 16 aufgenommenen Bilder verbunden: Weiterhin kann eine nicht dargestellte Synchronisationseinheit zur Synchronisation der Bildaufnahmen entsprechend der eingangs genannten DE 102 10 831 A1 vorgesehen sein, durch die die Startzeitpunkte der Bildaufnahmen so synchronisiert werden, dass die mit den beiden Kameras 15, 16 aufgenommenen Bilder als gleichzeitig aufgenommene Bilder anzusehen sind. Weiterhin kann eine Steuereinrichtung zur Aufnahme sowie Abspeicherung von Bilddaten und eine Auswerteeinrichtung zur Auswertung der mit den Kameras 15, 16 aufgenommenen Bilder vorgesehen sein.
Bei Anordnung eines elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers 9 im Extinkionsstrahlengang wird das Licht der Beleuchtungseinrichtung 7 über den Auflichtbeleuchtungsstrahlengang 8 und über den dichroitischen Strahlteiler 9 auf das in den Strahlengang eingeschaltete Objektiv 6 umgelenkt, wobei der dichroitische Strahlteiler 9 das von der Beleuchtungseinrichtung 7 kommende Licht und das von dem Präparat 4 emittierte Fluoreszenzlicht voneinander trennt.
Die beiden elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler 9 und 14 sind in dem Emissions- und/oder Extinktionsstrahlengang des Mikroskopsystems 1 angeordnet.
Wie in der 2 dargestellt, bestehen die elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler 9 und 14 aus einem transparenten, möglichst dünn ausgebildeten LCD-Screen 17, dessen LCD-Pixel 18 jeweils eine reflektierende Beschichtung aufweisen, die in einem Schaltzustand der Flüssigkristalle Licht eines durch die Beschichtung vorgegebenen Wellenlängenbereichs reflektieren und in einem anderen Schaltzustand Licht des durch die Beschichtung vorgegebenen Wellenlängenbereichs transmittieren. Jedes Pixel des LCT Screens 17 ist dabei aus drei Subpixel R, G, B aufgebaut, die jeweils eine unterschiedliche Beschichtung aufweisen, so dass die von den verschiedenen Subpixeln R, G, B bei Schaltung im Reflexionszustand jeweils reflektierten Spektralbereiche von einander abweichen. Alle anderen Spektralanteile, die von dem jeweiligen Subpixel nicht reflektiert werden, werden von der Beschichtung absorbiert. Im anderen Schaltzustand „Transmission” der Flüssigkristalle wird derjenige Spektralbereich, der in der Schaltstellung „Reflexion” reflektiert wird, transmittiert; alle anderen Spektralbereiche werden im Schaltzustand „Transmission” von der Beschichtung absorbiert. Beispielweise ist die Beschichtung des Subpixels R so gewählt, dass dieses Subpixel bei Schaltung in den Reflexionszustand nur rotes Licht, das Subpixel G bei Schaltung in den Reflexionszustand nur grünes Licht und das Subpixel B bei Schaltung in den Reflexionszustand nur blaues Licht reflektiert. Die jeweils nicht reflektieren Spektralbereiche werden von der Beschichtung absorbiert. In dem anderen Schaltzustand der Flüssigkristalle wird von dem Subpixel R nur rotes Licht, von dem Subpixel G nur grünes Licht und von dem Subpixel B nur blaues Licht transmittiert.
Die zu verschiedenen Pixeln gehörigen, einander zugeordneten Subpixel, also z. B. die Subpixel R aller Pixel, haben die gleiche Beschichtung und reflektieren im Schaltzustand „Reflexion” Licht desselben Spektralbereichs. Entsprechend haben auch alle Subpixel G dieselbe Beschichtung und alle Subpixel B haben dieselbe Beschichtung. Nur die Beschichtungen zu verschiedenen Subpixeln sind unterschiedlich und reflektieren im Schaltzustand „Reflexion” Licht verschiedener Spektralbereiche.
Auf dem LCD-Screen 17 sind jeweils drei Subpixel R, G, B zu einer Pixelkombination zusammengefasst, so dass mit den drei reflektierten Grundfarben des Lichtes rot R, grün G und blau B ein Präparat 4 in mehreren Farbkombinationen beleuchtet werden kann.
Da jedes Subpixel R, G, B einzeln ansteuerbar ist, lassen sich 5 verschiedene sinnvolle „globale” Schaltungen der dichroitisch ausgebildeten Strahlteiler 9 und 14 ausführen. Drei Schaltungen ergeben sich bereits, wenn jeweils nur ein Subpixel-Typ auf „Reflexion” geschaltet ist, die beiden anderen Subpixeltypen dagegen auf „Transmission”. In einem weiteren Schaltzustand sind alle Subpixel R, G, B auf „Reflexion” geschaltet und in einem weiteren Schaltzustand sind zwei Subpixel-Typen auf „Reflexion” und ein Subpixel-Typ auf „Transmission” geschaltet. Weitere sinnvolle Schaltzustände ergeben sich dadurch, dass die Schaltung auf „Reflexion” und „Transmission” für denselben Subpixel-Typ örtlich variiert wird, also beispielsweise der Subpixel-Typ B in einem Teilbereich des Strahlteilers auf „Reflexion” und in einem anderen Teilbereich auf „Transmission” geschaltet ist.
3 zeigt eine Anordnung eines elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers 14 im Emissionsstrahlengang zwischen den beiden Kameras 15 und 16, um die Emission zwischen zwei Spektralbereichen aufzuteilen. Durch die unterschiedlichen Schaltungen der LCD-Pixel 18 können unterschiedliche Einstellungen realisiert werden. Im Ausführungsbeispiel in 3 sind die LCD-Pixel 18 so geschaltet, dass der dichroitisch ausgebildete Strahlteiler 14 die Farbe rot R durchlässt und die Farbe grün G reflektiert. Es sind auch andere nicht dargestellte Schaltungen möglich, beispielweise wird die Farbe blau B durchgelassen und die Farben rot R und grün G reflektiert.
Die Beleuchtung des Präparats erfolgt dabei mittels Laser oder Laserdioden. Alternativ kann die Beleuchtung auch anderweitige erfolgen, beispielsweise mittels einer Quecksilberdampflampe.
Da bei entsprechender Synchronisation der beiden Kameras 15, 16 entsprechend der eingangs genannten DE 102 10 831 A1 beide Bilder gleichzeitig aufgenommen werden, ist gewährleistet, dass aus dem Quotienten der Fluoreszenzintensitäten tatsächlich im Sinne einer Emissions-Ratio-Messung die interessierenden Konzentrationsverhältnisse bestimmt werden können. Anwendungen für diesen Einsatz des dichroitischen Strahlteilers 14 im Emissionsstrahlengang sind beispielsweise die Emission-Ratio-Messung oder die Colokalisation von Teilchen, bei der zwei Proteine unterschiedlich markiert sind und an derselben Stelle lokalisiert sind oder nicht. Bei der gleichzeitigen Bildaufnahme bei verschiedenen Wellenlängen können außerdem manche Diffusionsprozesse besser erkannt werden, weil sich mit zwei Kameras 15, 16 die Fluoreszenzen bei drei Fluoreszenzwellenlängen ermitteln lassen.
4 zeigt die Anordnung eines elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers 9 im Extinktionsstrahlengang zur Trennung des Auflichtbeleuchtungsstrahlenganges 8 und des Beobachtungsstrahlengangs 10 im Mikroskopsystem 1. Hierbei sind ebenfalls unterschiedliche Schaltstellungen der LCD-Pixel 18 vorgesehen. In der in 4 dargestellten Schaltstellung wird die Farbe blau B am dichroitisch ausgebildeten Strahlteiler 9 reflektiert und damit das Präparat 4 mit der Farbe blau beleuchtet und die vom Präparat 4 abgestrahlte Farbe grün G wird vom dichroitisch ausgebildeten Strahlteiler 9 durchgelassen und kann damit mit hier nicht dargestellten Kameras oder anderen Detektoren detektiert werden.
Die Schaltzeiten der einzelnen LCD-Pixel 18 sollen möglichst schnell sein, beispielsweise ca. 1–20 ms.
Bei einer Anordnung des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteilers 9 im Extinktionsstrahlengang kann das Präparat 4 alternierend mit Licht unterschiedlicher Spektralbereiche beleuchtet werden und die dabei jeweils emittierte Fluoreszenz synchron zum Wechsel der Anregungswellenlänge detektiert werden. Durch Auswertung der detektierten Fluoreszenzintensitäten sind dann auch sogenannte Extinktions-Ratio-Messungen möglich.
Bei einer Verkleinerung der LCD-Pixel 18 gegenüber den Pixeln der aufzuzeichnenden Kameras 15, 16 kann man beispielsweise fünf Pixel 18 zu einem Pixel zusammenfassen und dadurch auch Zwischenfarben realisieren.
Anhand der 1, 3 und 4 wurde die Erfindung am Beispiel von aufrechten Mikroskopen beschrieben. Sie ist natürlich auch bei sogenannten inversen Mikroskopen, bei denen die Beobachtung und die Auflichtbeleuchtung des Präparats 4 oder einer Probe von unten erfolgt einsetzbar.
In der 5 sind schematisch die jeweiligen spektralen Lagen der unterschiedlichen reflektierenden Beschichtungen der elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler 9 und 14 als Funktion der Wellenlänge dargestellt. Die drei Reflexionsspektren R, G, B sind in so weit zu einander unterschiedlich, dass die jedes der drei Reflexionsspektren eine Mittelwellenlänge 34, 35, 36 aufweist, die unterschiedlich zur Mittelwellenlänge 34, 35, 36 der anderen Reflexionsspektren ist. So ist die Mittelwellenlänge 34 des Reflexionsspektrums der Subpixel B kleiner als die Mittelwellenlänge 35 des Reflexionsspektrums der Subpixel G. Die Mittelwellenlänge 35 des Reflexionsspektrums der Subpixel G ist wiederum kleiner als die Mittelwellenlänge 36 des Reflexionsspektrums der Subpixel R. In den jeweiligen Randbereichen 37, 38, können dagegen jeweils zwei oder drei Reflexionsspektren überlappen.
Bezugszeichenliste

1: Mikroskopsystem
2: Stativ
3: Objekttisch
4: Präparat
5: Objektivrevolver
6: Objektive
7: Beleuchtungseinrichtung
8: Auflichtbeleuchtungsstrahlengang
9, 14: dichroitischer Strahlteiler
10: Beobachtungsstrahlengang
11: Teilerprisma
12: Okulartubus
13: Kamerasystem
14: Strahlteiler
15, 16: Kamera
17: LCD-Screen
18: LCD-Pixel
R: Subpixel Rot
G: Subpixel Grün
B: Subpixel Blau
34: Mittelwellenlänge Subpixel B
35: Mittelwellenlänge Subpixel G
36: Mittelwellenlänge Subpixel R

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 10144435 B4 [0002]
DE 10210831 A1 [0003, 0037, 0046]
DE 19921127 A1 [0004]
WO 94/20879 [0010]

Claims

Elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler mit einer Vielzahl unabhängig von einander schaltbaren Spiegelelementen mit dichroitisch reflektierenden Beschichtungen, deren Reflexionsverhalten durch Anlegen von elektrischen Signalen zwischen Lichtreflexion und Lichttransmission umschaltbar sind, und wobei die Spiegelelemente zumindest teilweise unterschiedliche dichroitische Beschichtungen aufweisen, deren Reflexionswellenlängenbänder von einander verschieden sind.
Elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler, der eine Flüssigkristallanordnung enthält, deren Kristalle mit einer dichroitisch reflektierenden Beschichtung versehen sind und deren Kristalle durch Anlegen von elektrischen Signalen zwischen Lichtreflexion und Lichttransmission an den dichroitisch reflektierenden Beschichtungen umschaltbar sind, und wobei die Flüssigkristallanordnung an unterschiedlichen Stellen unterschiedliche dichroitische Beschichtungen aufweist, deren Reflexionswellenlängenbänder von einander verschieden sind.
Elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler nach Anspruch 1 oder 2, der mindestens drei unterschiedliche dichroitische Beschichtungen mit unterschiedlichen Reflexionswellenlängenbändern aufweist.
Elektronisch schaltbarer dichroitischer Strahlteiler nach Anspruch 2, wobei die Flüssigkristallanordnung aus einer Vielzahl an Pixel aufgebaut ist, die jeweils separat schaltbare Subpixel (R, G, B) mit jeweils unterschiedlichen dichroitischen Beschichtungen aufweisen, deren Reflexionswellenlängenbänder von einander verschieden sind.
Mikroskopsystem mit mindestens einem elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler (9, 14) nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Mikroskopsystem nach Anspruch 5, wobei das Mikroskopsystem einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung eines Präparates (4) aufweist und wobei der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler (9, 14) im Beleuchtungs- oder Extinktionsstrahlengang (10) angeordnet ist.
Mikroskopsystem nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Mikroskopsystem in einem Beobachtungs- oder Extinktionsstrahlengang (10) mindestens zwei Kameras (15, 16) aufweist und der elektronisch schaltbare dichroitische Strahlteiler (9, 14) im Beobachtungs- oder Emissionsstrahlengang (10) derart angeordnet ist, dass er das Licht des Beobachtungs- oder Emissionsstrahlengang (10) wellenlängenabhängig zwischen den Kameras (15, 16) aufteilt.
Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei eine Steuereinrichtung zur selektiven Ansteuerung und Schaltung der einzelnen mit unterschiedlichen dichroitischen Beschichtungen versehenen Bereiche der Flüssigkristallanordnung vorgesehen ist.
Mikroskopierverfahren mit einem Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 8, soweit auf einen der Ansprüche 5 oder 6 zurückbezogen, wobei ein zu untersuchendes Präparat (4) in einem ersten Präparatbereichen mit Licht einer ersten Lichtwellenlänge oder eines ersten Lichtwellenlängenspektrums beleuchtet wird und gleichzeitig in einem zweiten Präparatbereich mit Licht einer zweiten Lichtwellenlänge oder eines zweiten Lichtwellenlängenspektrums beleuchtet wird, wobei die zweite Lichtwellenlänge oder das zweite Lichtwellenlängenspektrum unterschiedlich zur ersten Lichtwellenlänge oder dem ersten Lichtwellenlängenspektrum ist.
Mikroskopierverfahren mit einem Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 8, soweit auf einen der Ansprüche 5 oder 6 zurückbezogen, wobei ein zu untersuchendes Präparat (4) während einer ersten Zeitperiode in einem ausgedehnten Präparatbereich mit Licht einer ersten Lichtwellenlänge oder eines ersten Lichtwellenlängenspektrums beleuchtet wird und während einer zweiten Zeitperiode mit Licht einer zweiten Lichtwellenlänge oder einem zweiten Lichtwellenlängenspektrum beleuchtet wird, wobei die zweite Lichtwellenlänge oder das zweite Lichtwellenlängenspektrum unterschiedlich zur ersten Lichtwellenlänge oder dem ersten Lichtwellenlängenspektrum ist, und wobei in der ersten und der zweiten Zeitperiode in der Präparat (4) erzeugtes Fluoreszenzlicht räumlich über den Präparatbereich aufgelöst separat detektiert und ausgewertet wird.
Mikroskopierverfahren nach Anspruch 10, wobei der ausgedehnte Präparatbereich einen Durchmesser aufweist, der ein Vielfaches, vorzugsweise mehr als ein Hundertfaches, der ersten und oder zweiten Lichtwellenlänge oder einer Lichtwellenlänge des ersten oder zweiten Lichtwellenlängenspektrums beträgt.
Mikroskopierverfahren mit einem Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 7 oder 8, soweit auf Anspruch 7 zurückbezogen, wobei die Transmissions- und Reflexionseigenschaften des elektronisch schaltbaren dichroitischen Strahlteiler (9, 14) in unterschiedlichen räumlichen Bereichen variiert werden und dadurch die Existenz verschiedener Farbstoffe in unterschiedlichen Bereichen des Präparates (4) nachgewiesen wird.