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Die
Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang,
der eine Lichtquelle zur Beleuchtung einer Probe mit Beleuchtungslicht umfasst,
und einem Detektionsstrahlengang, der mindestens einen Detektor
zur Detektion von Probenlicht umfasst. Das Probenlicht kann an der
Probe reflektiertes oder gestreutes Beleuchtungslicht oder von der
Probe emittiertes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, das durch
das Beleuchtungslicht angeregt wurde, sein. Die Erfindung betrifft
insbesondere abtastende (engl. „scanning”) Mikroskope
und Weitfeldmikroskope.
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Im
Stand der Technik ist beispielsweise ein Mikroskop in Form eines
Laser-Scanning-Mikroskops (LSM) in der Veröffentlichung
DE 197 52 753 A1 ,
deren Offenbarungsgehalt hier in vollem Umfang einbezogen wird,
beschrieben. In Laser-Scanning-Mikroskopen werden üblicherweise
Strahlteiler als Hauptstrahlteiler zur Trennung von Beleuchtungs- und
Probenlicht in zwei separate Strahlen eingesetzt.
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Im
Falle der Fluoreszenzmikroskopie, sei es bei Scanning-Mikroskopen
oder bei Weitfeldmikroskopen, wird als Hauptstrahlteiler typischerweise
ein dichroitischer Spiegel als sogenannter Hauptfarbteiler verwendet,
der das anregende Beleuchtungslicht und das emittierte Probenlicht
aufgrund ihrer unterschiedlichen Wellenlängenbereiche mit
hoher Effizienz in zwei Strahlen trennt. Es ist auch bekannt, im Detektionsstrahlengang
einen oder mehrere sogenannte Nebenfarbteiler einzusetzen, die das
Probenlicht räumlich auf jeweils zwei Strahlen mit unterschiedlichen
Wellenlängenbereichen aufspalten. Zur Handhabung von mehr
als zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen ist eine
entsprechende Anzahl von kaskadierten Strahlteilern erforderlich. 1 zeigt
einen Ausschnitt aus einem Detektionsstrahlengang eines Mikroskops,
in dem mittels zweier kaskadierter Farbteiler drei verschiedene
Wellenlängenbereiche separiert und auf drei Detektoren
geleitet werden.
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Eine
Strahlteilerkaskade hat den Nachteil, viel Bauraum zu benötigen.
Diese Problematik wird bei mehreren hintereinandergeschalteten Strahlteilern
noch verschärft durch zusätzliche Optiken zur Zwischenabbildung,
die für einen hohen Lichtleitwert insbesondere in der Multiphotonen-Mikroskopie
erforderlich sind. Darüber hinaus tritt an jeder Kaskadenstufe
zwangsläufig ein Lichtverlust auf, so dass die Übertragungseffizienz
mit zunehmender Anzahl von Teilungen geringer wird.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der eingangs
genannten Art zu so verbessern, dass eine räumlich-spektrale
Aufspaltung von Licht auf mehr als zwei Strahlen bei geringem Bauraumbedarf
ermöglicht wird.
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Die
Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop, welches die in
Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist. Die erfindungsgemäße
Lösung wird ergänzt durch einen Strahlteiler,
welcher die in Anspruch 12 angegebenen Merkmale aufweist, und durch
ein Verfahren, welches die in Anspruch 13 angegebenen Merkmale aufweist.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen
angegeben.
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Erfindungsgemäß ist
ein Mikroskop mit einem Strahlteiler mit mehreren ebenen dichroitischen Schichten,
von denen zumindest zwei mit einem von Null verschiedenen Winkel
zueinander angeordnet sind, zur räumlichen Aufspaltung
von Beleuchtungs- und/oder Probenlicht in mindestens drei Strahlen, insbesondere
mit wechselseitig verschiedenen Wellenlängenbereichen und/oder
wechselseitig unterschiedlichen Polarisationsrichtungen, ausgerüstet. Die
relative Anordnung der dichroitischen Schichten kann auch dadurch
beschrieben werden, dass für zumindest zwei der Schichten
die geometrischen Ebenen, entlang derer die Schichten ausgerichtet
sind, einander wechselseitig schneiden. Durch diese Anordnung mehrerer
nicht-paralleler dichroitischer Schichten wird die räumlich-spektrale
Aufteilung in mehr als zwei Strahlen mit kurzen Strahlengängen und
geringem Bauraumbedarf ermöglicht. Ein derartiger Strahlteiler
wird nachfolgend als Mehrwege-Strahlteiler bezeichnet. Ein solches
Mikroskop ist kompakter und effizienter als bekannte Geräte.
Das Kriterium des wechselseitigen Schneidens der mathematischen
Ebenen kann über zwei Schichten hinaus insbesondere für
alle dichroitischen Schichten erfüllt sein.
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Im
Falle eines Scanning-Mikroskops, bei dem der Detektionsstrahlengang
aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt wird, kann der Detektionsstrahlengang
vor oder nach einem Abtastmodul (engl. „scanning module”)
ausgekoppelt werden. Die erfindungsgemäße Anordnung
eines Mehrwege-Strahlteilers kann daher entsprechend zum Zweck einer
direkten Detektion in nicht-descanntem Probenlicht (engl. „non-descanned
detection”; NDD) oder zur konfokalen Detektion in descanntem
Probenlicht (engl. „descanned detection”) erfolgen.
Alternativ oder zusätzlich kann die erfindungsgemäße
Anordnung eines Mehrwege-Strahlteilers in einem reinen Beobachtungsstrahlengang,
beispielsweise im Durchlicht, erfolgen. Hierbei wird üblicherweise
descanntes Probenlicht mehrfach räumlich-spektral aufgespaltet.
Es ist aber auch denkbar, ein zusätzliches Abtastmodul
im Beobachtungsstrahlengang synchron mit dem Abtastmodul des Beleuchtungsstrahlengangs
zu betreiben.
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Es
ist vorgesehen, den Mehrwege-Strahlteiler vorteilhafterweise im
Detektionsstrahlengang anzuordnen, wenn der Detektionsstrahlengang
mehrere Detektoren zur konfokalen Detektion des in die Strahlen
aufgespalteten Probenlichts aufweist. Dadurch kann auf eine Strahlteilerkaskade,
insbesondere mit Zwischenabbildungen, verzichtet werden, so dass
eine farbspezifische Detektion mit geringem Bauraumbedarf gelingt.
Anstelle der Aufspaltung in unterschiedliche Wellenlängenbereiche
ist es möglich, dass zwei oder mehr der aufgespalteten
Strahlen denselben Wellenlängenbereich aufweisen, um die
auf die einzelnen Detektoren fallende Intensität zu reduzieren.
Dies kann insbesondere bei photonenzählenden Detektoren
vorteilhaft sein. Alternativ oder zusätzlich können
die dichroitischen Schichten als Polarisationsfilter ausgebildet
sein, so dass in den aufgespalteten Strahlen unterschiedliche Polarisationsrichtungen
vorliegen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist dem Mehrwege-Strahlteiler
eine (für alle Anteile des Probenlichts gemeinsame) Optik
vorgeschaltet ist, die das Probenlicht über den Strahlteiler
mit identischer Schärfe auf die betreffenden Detektoren
fokussiert. Dadurch kann die Strahlenganglänge und der benötigte
Bauraum weiter reduziert werden, da auf eine eigene Fokussieroptik
für jeden der Detektoren verzichtet werden kann. Besonders
bevorzugt ist eine Weiterbildung, in der die optischen Weglängen der
aufgespalteten Strahlen durch den Strahlteiler identisch sind, insbesondere
in Verbindung mit einer bezüglich aller austretenden Strahlen
symmetrischen Form des Strahlteilers. Auf diese Weise können
die Detektoren kompakt um den Strahlteiler angeordnet werden, so
dass nur minimaler Bauraum benötigt wird.
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Es
ist vorteilhafterweise möglich, den Mehrwege-Strahlteiler
als Hauptstrahlteiler zur Auskopplung mehrerer Detektionsstrahlengänge
aus dem Beleuchtungsstrahlengang anzuordnen. Dies kann alternativ
oder zusätzlich zu der obengenannten Anordnung eines Strahlteilers
mit mehreren nicht-parallelen dichroitischen Schichten im ausgekoppelten Detektionsstrahlengang
erfolgen. Auf diese Weise können ohne Strahlteilerkaskade
mehrere unabhängige Detektionsstrahlengänge verwendet
werden, beispielsweise für unterschiedliche Wellenlängenbereiche
und/oder unterschiedliche Polarisationsrichtungen.
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Vorzugsweise
sind die dichroitischen Schichten des Mehrwege-Strahlteilers so
angeordnet, dass die aufgespalteten Strahlen beim Austritt aus dem Strahlteiler
jeweils eine über den Querschnitt jedes aufgespalteten
Strahls einheitliche optische Weglänge aufweisen. Dadurch
werden in einem abbildenden (nicht-kollimierten) Strahlengang die
gleichartige Handhabung und/oder die Auswertung der aufgespalteten
Strahlen vereinfacht. Weiter vorzugsweise weist der Strahlteiler
für alle aufgespalteten Strahlen eine identische optische
Weglänge auf, sowohl bei der Anordnung des Strahlteilers
in einem abbildenden Strahlengang als auch in einem kollimierten Strahlengang,
sei es im Beleuchtungs- und/oder im Detektionsstrahlengang. Durch
die Erhaltung des Gangunterschieds werden Auswertungen, die auf Phasenunterschieden
zwischen mehreren unterschiedlich farbigen und/oder unterschiedlich
polarisierten Strahlen beruhen, ermöglicht. Beispielsweise können
durch Überlagerung mehrerer der aufgespalteten Strahlen
Interferenzerscheinungen gemessen werden.
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Vorteilhafterweise
ist der Mehrwege-Strahlteiler derart drehbar ausgebildet, dass die Zuordnung
der Wellenlängenbereiche zu den aufgespalteten Strahlen
bei kongruenter Lage der aufgespalteten Strahlen einstellbar ist.
Dadurch können unterschiedliche Eigenschaften der einzelnen
Detektoren, beispielsweise die Fähigkeit eines Detektors zur
Photonenzählung oder unterschiedliche spektrale Empfindlichkeiten,
ausgenutzt werden.
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Es
kann zweckmäßig sein, dem Mehrwege-Strahlteiler
mindestens einen weiteren Strahlteiler, insbesondere einen Mehrwege-Strahlteiler
mit mehreren nicht-parallelen dichroitischen Schichten vor- oder
nachzuschalten. Durch eine solche Teilerkaskade kann der benötigte
Bauraum zumindest gegenüber einer Kaskade einfacher Strahlteiler
noch signifikant reduziert werden.
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Die
Gestaltung des Mehrwege-Strahlteilers mit mehreren dichroitischen
Schichten gelingt auf unterschiedliche Weise: In einer ersten Ausführungsform
weist der Strahlteiler mindestens einen optisch durchlässigen,
polyedrischen Körper, insbesondere ein Prisma, auf, der
auf einer oder mehreren Außenflächen mit einer
jeweiligen der dichroitischen Schichten verspiegelt ist.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung sind mehrere, insbesondere vier
oder sechs, optisch durchlässige, polyedrische Körper
zumindest näherungsweise zu einem vorzugsweise regelmäßigen Polyeder,
insbesondere zu einem Würfel, zusammengefügt,
wobei mindestens eine der dichroitischen Schichten zwischen zwei
der Körper angeordnet ist. Die Anordnung vier dichroitischer
Prismen zu einem Würfel ist als dichroitisches „Kreuzprisma” oder „X-cube” beispielsweise
aus
US 6,698,893 B2 bekannt.
Ein aus polyedrischen Körpern und dichroitischen Schichten
gefügter Polyeder hat den Vorteil einer hohen Übertragungseffizienz,
da die Anzahl der optischen Grenzflächen gegenüber
einer herkömmlichen Reihenschaltung mehrerer einfacher
Teilerwürfel geringer ist. Ein, mehrere oder alle den Polyeder bildende
Körper können aus mehreren Unterkörpern, insbesondere
aus Prismen, zusammengesetzt sein. Zusätzlich zu einer
oder mehreren inneren dichroitischen Schichten können auch
eine oder mehrere Außenflächen des Polyeders mit
einer oder mehreren jeweiligen dichroitischen Schichten verspiegelt
sein. Die Anordnung mit fünf, sechs oder mehr polyedrischen
Körpern hat den Vorteil, dass das einfallende Licht in
mehr als drei ausgehende Strahlen separiert werden kann. So können
prinzipiell alle drei Raumdimensionen ausgenutzt werden.
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Beispielsweise
kann der Strahlteiler im Falle von sechs Prismen, die einen Würfel
formen, fünf gleichförmige Ausgangsflächen
aufweisen.
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Insbesondere
können um einen zentralen inneren polyedrischen Körper,
insbesondere einen Würfel, die übrigen polyedrischen
Körper angeordnet sein, insbesondere in Prismenform, wobei
sich die dichroitischen Schichten zwischen dem inneren und den übrigen
Körpern befinden. Durch das Zusammenfügen ergibt
sich der Mehrwege-Strahlteiler-Polyeder.
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In
einer zweiten Ausführungsform weist der Strahlteiler mindestens
zwei dichroitische Spiegelplatten auf, die jeweils eine der dichroitischen
Schichten bereitstellen und unter einem von Null verschiedenen Winkel
zueinander angeordnet sind. Beispielsweise können zwei
dichroitische Spiegelplatten ineinandergesteckt werden, indem die
erste Platte halbiert und jeweils eine Hälfte auf Vor-
beziehungsweise Rückseite der zweiten Spiegelplatte angeordnet
wird, so dass eine Kreuzform entsteht.
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Die
Erfindung wird vorzugsweise in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet,
weiter vorzugsweise in der Multiphotonenmikroskopie (MPM). Das erfindungsgemäße
Mikroskop kann vorteilhafterweise zur Detektion von Resonanzübergängen
eines Fluorophors zu einem anderen Fluorophor im Rahmen einer Fluoreszenzresonanzenergieübertragungsmessung
(engl. „fluorescence resonance energy transfer”;
FRET) verwendet werden. Durch die hohe Übertragungseffizienz
kann ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis und damit eine
hohe Genauigkeit der Messung erreicht werden. So ist die effiziente
Trennung unterschiedlicher spektraler Anteile bei Multiplex-CARS
oder verwandten Raman-Techniken möglich. Beispielsweise
kann die effiziente Trennung vorteilhaft beim sogenannten „ratiometric
imaging” verwendet werden.
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Die
Erfindung umfasst vorteilhafterweise ein Laser-Scanning-Mikroskop,
insbesondere in einer Ausführungsform, in der mindestens
ein Detektor zur Detektion von non-descanntem Probenlicht angeordnet
ist.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert.
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In
den Zeichnungen zeigen:
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1 eine
herkömmliche Strahlteilerkaskade mit drei Detektoren,
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2 einen erfindungsgemäßen
Dreifach-Strahlteiler in mehreren Varianten,
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3 einen Ausschnitt aus einem LSM-Detektionsstrahlengang
mit drei Detektoren,
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4 ein
Laser-Scanning-Mikroskop mit Kreuzprisma im nicht-descannten Detektionsstrahlengang,
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5 ein
konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit Kreuzprisma im descannten
Detektionsstrahlengang,
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6 einen Ausschnitt aus einem LSM-Detektionsstrahlengang
mit fünf Detektoren,
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7 einen
Ausschnitt aus einem LSM-Detektionsstrahlengang mit vier Detektoren,
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8 einen
Ausschnitt aus einem ersten LSM-Detektionsstrahlengang mit fünf
Detektoren,
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9 einen
Ausschnitt aus einem zweiten LSM-Detektionsstrahlengang mit fünf
Detektoren,
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10 einen
Ausschnitt aus einem zweiten LSM-Detektionsstrahlengang mit sechs
Detektoren und
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11 einen
Ausschnitt aus einem dritten LSM-Detektionsstrahlengang mit sechs
Detektoren.
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In
allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche
Bezugszeichen.
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1 zeigt
einen Ausschnitt aus einem bekannten Detektionsstrahlengang D eines
LSM (nicht abgebildet), in dem mittels zweier kaskadierter Farbteiler 10.1, 10.2 drei
verschiedene Wellenlängenbereiche W1, W2, W3 separiert
und auf drei Detektoren 11.1, 11.2, 11.3 geleitet
werden. Von der Lichtquelle 12, beispielsweise einer fluoreszierenden
Probe (nicht abgebildet), gelangt mehrfarbiges Licht S über eine
Kollimationsoptik 13 auf den ersten Farbteiler 10.1.
Dieser koppelt einen beispielsweise blauen Wellenlängenbereich
W1 über eine Fokussieroptik 14.1 auf den ersten
Detektor 11.1 aus. Eine Überlagerung eines beispielsweise
grünen und eines beispielsweise roten Wellenlängenbereiches
W2, W3 gelangt durch den ersten Strahlteiler 10.1 in kollimierter
Form zu dem zweiten Strahlteiler 10.2. Dieser koppelt den
grünen Wellenlängenbereich W2 über eine
Fokussieroptik 14.2 auf den zweiten Detektor 11.2 aus.
Der verbleibende rote Wellenlängenbereich W3 fällt
durch eine weitere Fokussieroptik 14.3 auf den dritten
Detektor 11.3.
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2 zeigt zwei mögliche Ausführungsformen
eines Dreiwege-Strahlteilers 15 für ein erfindungsgemäßes
Laser-Scanning-Mikroskop (nicht abgebildet). In Teilfigur 2A weist
der Strahlteiler 15 zwei ineinandergesteckte dünne
Farbteiler 10.1 und 10.2 auf. Jeder Farbteiler 10.1, 10.2 besteht
aus einer einzelnen dichroitischen Spiegelplatte, die jeweils senkrecht
zu ihrer optischen Achse einen Schlitz der halben Plattenkantenlänge
aufweist. Die Spektralbereiche in Transmission beziehungsweise Reflexion
ihrer dichroitischen Schichten (nicht abgebildet) überlappen
einander nicht. Alternativ ist es möglich, für
einen der Farbteiler 10.1 oder 10.2 zwei vollständig
getrennte Spiegelplatten (nicht abgebildet) zu verwenden, die beidseits
des jeweils anderen Farbteilers 10.2 beziehungsweise 10.1 angeordnet werden.
In beiden Fällen ist es zweckmäßig, die Spiegelplatten 10.1 und 10.2 durch
eine Fassung 10.3 zu fixieren. Um Verluste an den Vereinigungskanten
zu verringern, sind die Substrate der Spiegelplatten 10.1 und 10.2 zweckmäßigerweise
dünn, beispielsweise wie sogenannte Display-Gläser.
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Leichter
herzustellen als ineinandergesteckte Spiegelplatten ist die in Teilfigur 2B gezeigte Alternative,
bei der zwischen vier gleichschenkligen Prismen 16.1, 16.2, 16.3 und 16.4 zwei
einander kreuzende dichroitische Schichten 17.1 und 17.2 angeordnet
sind. Die Prismen 16 und die dichroitischen Schichten 17 sind
kompakt aneinandergefügt, so dass die Anzahl der optischen Übergänge
minimal ist.
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Einfallendes,
mehrfarbiges Licht S wird von dem Dreiwege-Strahlteiler 15 räumlichspektral
in drei Strahlen zerlegt, die beispielsweise disjunkte Wellenlängenbereiche
W1, W2 und W3 aufweisen. Die Prismen stoßen mit ihren rechten
Winkeln aufeinander, sind aber stets durch die dichroitischen Schichten voneinander
getrennt. Beide Schichten setzen sich über den mittleren
Kreuzungspunkt hinweg fort und nehmen jeweils zwei Prismenseitenflächen
ein, also im Betrag die Fläche einer Raumdiagonale des
Würfels, ein. Die Prismen können beispielsweise
aus Glas, insbesondere aus Quarzglas bestehen.
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Eine
weitere Alternative stellt ein Dreiwege-Strahlteilerwürfel 15 dar,
der aus einem inneren Würfel 18 und vier äußeren
Prismen 16 zusammengefügt ist, wobei der innere
Würfel 18 zweckmäßigerweise
optisch homogen ist, beispielsweise aus demselben Material wie die
Prismen besteht und auf zumindest vier Außenflächen
Paare 17.1A, 17.1B und 17.2A, 17.2B von
dichroitischen Schichten 17.1 und 17.2 trägt.
Dabei erfolgt die spektrale Teilung des einfallenden Lichts S an
der Oberfläche des inneren Würfels 18.
Die optischen Wege der an einem der Schichtpaare reflektierten Lichtanteile
eines aufgespalteten Strahls W1/2/3 sind
jedoch verschieden, was in einem abbildenden Strahlengang nachteilig
sein kann. Beispielsweise können dadurch die Foki der beiden
Strahlanteile an unterschiedlichen Positionen liegen, was unter
Umständen problematisch für die Detektion sein
kann. In einem kollimierten Strahlengang, beispielsweise als Hauptstrahlteiler
eines LSM 1 oder durch Vorschaltung einer Kollimationsoptik 13, kann
ein derartiger Strahlteiler 15 aber vorteilhafterweise
zur Bauraumreduktion verwendet werden, ohne dass diese Nachteile
auftreten. In einer nichtabbildenden Sammeloptik, beispielsweise
im Falle einer direkten (nicht-descannten) Detektion in der nichtlinearen
Mikroskopie, ist ebenso ein Einsatz des Mehrwege-Strahlteilers 15 möglich.
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In 3 sind Ausschnitte aus Detektionsstrahlengängen
D zweier verschiedener Mikroskope (nicht abgebildet) dargestellt,
in denen erfindungsgemäß ein dichroitisches Kreuzprisma
gemäß 2B als
Dreiwege-Strahlteiler 15 zur räumlich-spektralen Aufspaltung
von einfallendem Probenlicht S einer Lichtquelle 12 in
einer Probe (nicht abgebildet) in wechselseitig verschiedene Wellenlängenbereiche W1...3 auf drei Detektoren 11.1...3
dient. In Teilfigur 3A ist vor dem Strahlteiler 15 eine
Kollimationsoptik 13 angeordnet, so dass das einfallende
Licht als paralleles Strahlenbündel auf den Strahlteiler 15 und seine
dichroitischen Schichten (der Übersicht halber nicht mit
Bezugszeichen 17 versehen, siehe stattdessen 2B).
In jedem aufgespalteten Strahl ist dem betreffenden Detektor 11.1, 11.2, 11.3 eine
jeweilige Optik 14.1, 14.2, 14.3 zur
Fokussierung des aus dem Strahlteiler 15 austretenden,
kollimierten Strahlenbündels auf den betreffenden Detektor 11.1, 11.2, 11.3 vorgeschaltet.
In der in Teilfigur 3B gezeigten, vorteilhaften
Alternative ist dem Strahlteiler 15 anstelle einer Kollimationsoptik
eine Fokussieroptik 29 vorgeschaltet. Dadurch kann auf
detektorindividuelle Fokussieroptiken zwischen dem Strahlteiler 15 und
den Detektoren 11 verzichtet werden, um die Kompaktheit
des Detektionsstrahlengangs D zu erhöhen. Der Verständlichkeit
halber sind die Detektoren 11 in der Zeichnung relativ
weit vom Strahlteiler 15 entfernt dargestellt. Tatsächlich
können die Detektoren 11 unmittelbar an den Strahlteiler 15 angrenzen.
Auch sind die Strahlengänge nicht maßstäblich eingezeichnet,
sondern nur grob angedeutet. Zweckmäßigerweise
sind die optischen Weglängen von der Fokussieroptik 29 bis
zu jedem der Detektoren 11.1, 11.2 und 11.3 identisch,
um eine einheitliche Detektionseffizienz zu erreichen. Auf Optiken
zur Zwischenabbildung kann verzichtet werden.
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4 ist
eine schematische Darstellung eines beispielhaften LSM 1,
das mittels einer Steuereinheit 34 gesteuert wird. Das
LSM 1 ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23,
einem Abtastmodul S (engl. „scanning module”),
einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31 zusammengesetzt.
Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und
Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden,
bevor es über Lichtleitfasern und Koppeloptiken 20 in
die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über
den Hauptstrahlteiler 33 und die X-Y-Abtasteinheit 30,
die zwei Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt
es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22,
wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet. Dort erfolgt
beispielsweise eine Zwei- oder Mehrphotonenanregung.
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Von
der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 über
den Hauptstrahlteiler 33 als nicht-descanntes Probenlicht in
das Detektionsmodul D. Zur Fluoreszenzdetektion kann der Hauptstrahlteiler 30 beispielsweise
als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul
D weist drei Detektionskanäle mit jeweils einem Photovervielfacher 11 auf.
Ein Strahlteiler 15, der gemäß 2B als
dichroitischer Multi-Prismen-Nebenfarbteiler aufgebaut ist und entsprechend 3B mit
einer vorgeschalteten gemeinsamen Fokussieroptik 29 versehen
ist, dient der räumlich-spektralen Aufspaltung des von
der Probe 22 einfallenden Lichts auf die drei Detektoren 11.
Aufgrund der Multiphotonenanregung kann Fluoreszenzlicht nur aus dem
Fokusvolumen stammen. Auf konfokale Blenden kann daher verzichtet
werden. Die Photovervielfacher 11 detektieren dennoch ausschließlich
Licht aus dem Fokusvolumen. Der Strahlteiler 15 zerlegt das
von der Probe 22 einfallende Licht räumlich-spektral
in drei Strahlen mit wechselseitig unterschiedlichen Wellenlängenbereichen.
Die Optik 29 fokussiert aufgrund gleicher optischer Wege
alle spektralen Anteile des Probenlichts unabhängig von der
Aufspaltung durch den Strahlteiler 15 gemeinsam auf die
optische Entfernung der Detektoren 11, so dass jeweils
nur ein Wellenlängenbereich den betreffenden Detektor 11 erreicht.
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Das
konfokal beleuchtete und aufgenommene Fokusvolumen der Probe 22 kann
mittels der Abtasteinheit 30 über die Probe 22 bewegt
werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel
der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die
Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der Beleuchtung
mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden
unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme
von den Photovervielfachern 11 erfolgt ebenfalls über
die Peripherieschnittstelle 4.
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Der
Detektionsstrahlengang mit dem Mehrwege-Strahlteiler 15 kann
alternativ oder zusätzlich zur Anordnung im konfokalen
Detektionsweg auch in einem direkten Detektionsweg in Vorwärts-
oder Rückwärtsrichtung, wie sie bei nichtlinearen
Techniken üblich ist, angeordnet sein.
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5 ist
eine schematische Darstellung eines beispielhaften LSM 1,
das mittels einer Steuereinheit 34 gesteuert wird. Das
LSM 1 ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23,
einem Abtastmodul S (engl. „scanning module”),
einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31 zusammengesetzt.
Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und
Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden, bevor
es über Lichtleitfasern und Koppeloptiken 20 in
die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über
den Hauptstrahlteiler 33 und die X-Y-Abtasteinheit 30,
die zwei Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt
es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22,
wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet.
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Von
der Probe reflektiertes Licht oder emittiertes Fluoreszenzlicht
gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 über die
Abtasteinheit 30 durch den Hauptstrahlteiler 33 in
das Detektionsmodul D. Zur Fluoreszenzdetektion kann der Hauptstrahlteiler 30 beispielsweise
als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul
D weist drei Detektionskanäle mit jeweils einem Filter 28 und
einem Photovervielfacher 11 auf. Ein Mehrwege-Strahlteiler 15, der
gemäß 2B als
dichroitischer Multi-Prismen-Nebenfarbteiler aufgebaut ist und entsprechend 3B mit
einer vorgeschalteten gemeinsamen Fokussieroptik 29 versehen
ist, dient der räumlich-spektralen Aufspaltung des von
der Probe 22 einfallenden Lichts auf die drei Detektoren 11.
Eine der gemeinsamen Optik 29 vorgeschaltete konfokale
Lochblende 31 dient der Diskriminierung von Probenlicht,
das nicht aus dem Fokusvolumen stammt. Die Photovervielfacher 11 detektieren
daher ausschließlich Licht aus dem Fokusvolumen. Anstelle
einer Lochblende 31 kann beispielsweise bei linienförmiger
Beleuchtung auch eine Schlitzblende (nicht abgebildet) verwendet
werden. Der Strahlteiler 15 zerlegt das von der Probe 22 einfallende
Licht räumlichspektral in drei Strahlen mit wechselseitig
unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Die Optik 29 fokussiert
alle spektralen Anteile des Probenlichts unabhängig von der
Aufspaltung durch den Strahlteiler 15 gemeinsam auf die
optische Entfernung der Detektoren 11, so dass jeweils
nur ein Wellenlängenbereich den betreffenden Detektor 11 erreicht.
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Das
konfokal beleuchtete und aufgenommene Fokusvolumen der Probe 22 kann
mittels der Abtasteinheit 30 über die Probe 22 bewegt
werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel
der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die
Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der Beleuchtung
mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden
unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme
von den Photovervielfachern 11 erfolgt ebenfalls über
die Peripherieschnittstelle 4.
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Es
ist möglich, in alternativen Ausführungsformen
(nicht abgebildet) sowohl eine descannte als auch eine nicht-descannte
Detektion zu verwenden. Erfindungsgemäß können
dabei ein oder mehrere Mehrwege-Strahlteiler in einem descannten
und/oder in einem nicht-descannten Detektionsstrahlengang angeordnet
sein.
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In 6 ist ein Detektionsstrahlengang D mit fünf
Detektoren 11.1/2/3/4/5 schematisch im Querschnitt dargestellt.
Teilfigur 5A zeigt die Ansicht von vorn
in Eingangsrichtung des einfallenden Strahls S. Teilfigur 5B zeigt die Ansicht von oben und Teilfigur 5C die Ansicht von rechts, bezogen auf
Teilfigur 5A. Der Strahlteiler 15 ist
ein Würfel, der aus sechs pyramidenförmigen optisch
durchlässigen Körpern (der Übersicht
halber nicht mit Bezugszeichen 16 versehen, siehe stattdessen
entsprechend 2B) und vier dazwischenliegenden
dichroitischen Schichten (der Übersicht halber nicht mit
Bezugszeichen 17 versehen, siehe stattdessen entsprechend 2B) besteht.
Die Körper 16 stoßen an den Pyramidenspitzen
aufeinander, sind aber stets durch die dichrotischen Schichten voneinander
getrennt. Jede der vier Schichten setzt sich über den mittleren
Kreuzungspunkt hinweg fort und nimmt zwei Pyramidenseitenflächen,
also im Betrag die Fläche einer halben Raumdiagonale des
Würfels, ein. Die Detektoren 11 sind längs
der Oberflächennormalen der fünf neben der Eintrittsfläche
verbleibenden Würfelflächen angeordnet und blicken
auf den Strahlteilerwürfel 16. Analog zu 3B ist
der Strahlteiler 15 in einem abbildenden, nicht in einem
kollimierten Strahlengang angeordnet. Es ist lediglich eine einzelne
Abbildungsoptik 13 vor dem Strahlteiler 15 angeordnet,
die jedoch aus mehreren optischen Komponenten bestehen kann. Fünf
wechselseitig verschiedene Wellenlängenbereiche W1/2/3/4/5 werden auf je einen der Detektoren 11.1/2/3/4/5
fokussiert und aufgrund identischer optischer Wege mit identischer
Effizienz detektiert.
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7 zeigt
einen Detektionsstrahlengang D mit vier Detektoren 11.
Einem Mehrwegestrahlteiler 15 ist in Reihe ein einfacher
Zweiwegeteiler 10 vorgeschaltet. Der Mehrwegestrahlteiler 15 liegt
im kollimierten Strahlengang. Das Transmissionsband des Zweiwegeteilers 10 überlappt
mit den Transmissions- und Reflexionsbändern des Mehrwegeteilers 15,
das Reflexionsband des Zweiwegeteilers 10 ist disjunkt. Durch
den Mehrwege-Teiler 15 können ein herkömmlicher
Zweiwege-Teiler eingespart und Zwischenabbildungen vermieden werden.
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In 8 ist
in Erweiterung der 6 dem ersten Zweiwegeteiler 10 ein
weiterer Zweiwegeteiler 10 zur Farbseparation nachgeschaltet.
Dadurch können mit fünf Detektoren 11.1/2/3/4/5
fünf wechselseitig unterschiedliche Wellenlängenbänder
W1...5 detektiert werden. Alternativ ist
es in diesem Ausführungsbeispiel und in allen Ausführungsformen
möglich, in mehreren oder gar allen Detektoren denselben
Wellenlängenbereich zu detektieren, sei es zur Intensitätsreduktion
oder zur simultanen Detektion mit unterschiedlichen Detektorarten
oder -zählweisen.
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9 zeigt
eine Variante mit zwei Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B,
die im kollimierten Strahlengang angeordnet sind, wobei fünf
Detektoren 11.1/2/3/4/5 in einer Ebene angeordnet sind.
Mit dieser Ausführungsform können zwei herkömmliche Zweiwege-Teiler
eingespart und Zwischenabbildungen vermieden werden. Das gilt auch
für die in 10 dargestellte Ausführungsform
mit sechs Detektoren 11.1/2/3/4/5/6.
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In 11 ist
eine kompakte Ausführungsform mit zwei Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B und sechs
Detektoren 11.1/2/3/4/5/6 dargestellt, die in einer Ebene
angeordnet sind. Die Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B befinden
sich im abbildenden Strahlengang einer gemeinsamen, dem Zweiwegeteiler 10 vorgeschalteten
Fokussieroptik 29. Alle Detektoren 11 weisen identische
optische Abstände von der Optik 29 auf und sind
kompakt an den Ausgängen der Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B platziert.
Die Transmissions- und Reflexionsbänder des Zweiwege-Teilers 10 sind
disjunkt. Hingegen überlappt das Reflexionsband Zweiwege-Teilers 10 mit
den Transmissions- und Reflexionsbändern des ersten Mehrwege-Strahlteilers 15A.
Das Transmissionsband des Zweiwege-Teilers 10 überlappt
mit den Transmissions- und Reflexionsbändern des zweiten
Mehrwege-Strahlteilers 15B. Selbstverständlich
kann diese Ausführungsform durch pyramidale Form der zusammengefügten
optisch durchlässigen Körper 16 der Mehrwege-Strahlteiler 15A, 15B in
Entsprechung zu 5 auf zehn Detektoren 11 erweitert
werden. Auch ist es möglich, anstelle des Zweiwege-Teilers 10 einen
weiteren Mehrwege-Teiler (nicht abgebildet) einzusetzen und an dessen
dritten Ausgang einen weiteren Mehrwege-Teiler (nicht abgebildet)
anzuschließen. Weisen in diesem Fall die drei äußeren
Mehrwege-Teiler jeweils drei Ausgänge auf, so kann das
einfallende Licht S in neun Strahlen aufgespaltet werden. Werden
die drei äußeren Mehrwege-Teiler mit jeweils fünf
Ausgängen versehen, so kann das einfallende Licht S in
fünfzehn Strahlen aufgespaltet werden In allen Ausführungsformen
der Erfindung kann der Mehrwege-Strahlteiler 15 drehbar
ausgeführt sein, um die aufgespalteten Strahlen zwischen
den Detektoren 11 umzuschalten. Dadurch können
beispielsweise unterschiedliche Detektoreigenschaften wie Eignung
zur Photonenzählung und spektrale Empfindlichkeit ausgenutzt
werden. Außerdem eignen sich die Strahlteiler 15 dazu,
die Menge des einfallenden Lichts S auf mehrere Detektionskanäle/Detektoren 11 zu
aufzuspalten, um ein Überschreiten der maximalen Zählrate
von photonenzählenden Detektoren 11 zu vermeiden.
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Neben
der nichtlinearen Fluoreszenzmikroskopie können ein oder
mehrere Mehrwege-Strahlteiler 15 auch in anderen nichtlinearen
Mikroskopieverfahren wie der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Mikroskopie
(engl. „coherent anti-Stokes Raman Microscopy”;
CARS) und/oder bei multimodaler Bildaufnahme eingesetzt werden.
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Möglich
ist außerdem ein Einsatz in der abbildenden Mikroskopie,
bei der die Aufnahme mit Kameras erfolgt. Beispielsweise benutzt
man für die normale Weitfeldmikroskopie oder bestimmte
Varianten dieser, wie zum Beispiel die Aufnahme ausgewählter
Schichten (engl. „Selective Plane Illumination Microscopy”;
SPIM), oft verschiedene spektral getrennte Kanäle für
die Bildaufnahme. Die Trennung kann vorteilhafterweise gemäß der
Erfindung mit einem Mehrwege-Strahlteiler erfolgen.
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Neben
der reinen Abbildung kann mit einem oder mehreren Mehrwege-Strahlteilern 15 auch
eine Auswertung der Fluoreszenzlebensdauer oder anderer Parameter,
die die zu detektierende Strahlung charakterisieren, spektral erfolgen.
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- 1
- Mikroskop
- 10
- Farbteiler
- 11
- Detektor
- 12
- Lichtquelle
- 13
- Kollimationsoptik
- 14
- Fokussieroptik
- 15
- Strahlteiler
- 16
- Optisch
durchlässiger Körper
- 17
- Dichroitische
Schicht
- 18
- Innerer
Würfel
- 20
- Kollimationsoptik
- 21
- Mikroskopobjektiv
- 22
- Probe
- 23
- Laser
- 24
- Lichtklappe
- 25
- Abschwächer
- 26
- Faserkoppler
- 27
- Tubuslinse
- 28
- Filter
- 29
- Fokussieroptik
- 30
- Scannerspiegel
- 31
- Lochblende
- 33
- Hauptstrahlteiler
- 34
- Steuereinheit
- D
- Detektionsmodul
- M
- Mikroskop
- L
- Beleuchtungsmodul
- S
- Abtastmodul
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 19752753
A1 [0002]
- - US 6698893 B2 [0017]