WO2019110365A1 - Farbstrahlteileranordnung, mikroskopsystem und verfahren zur mikroskopischen abbildung - Google Patents

Farbstrahlteileranordnung, mikroskopsystem und verfahren zur mikroskopischen abbildung Download PDF

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WO2019110365A1
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plane
light
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Florian DR. FAHRBACH
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to a color beam splitter assembly
  • the color-selective detection is for microscopy, especially the
  • Fluorescence microscopy of great importance, since this often several dyes are used simultaneously in a sample.
  • fluorescence microscopy and microscopy in general several different methods and devices are known from the prior art. In principle, it is possible to distinguish between a sequential and a simultaneous or parallel detection of multiple colors or color channels.
  • Fluorescence microscopy is referred to, however, the corresponding explanations also apply to other microscopic examination methods.
  • Monochrome cameras can be used for sequential detection. In order to ensure that only one fluorescence channel is detected by means of the latter, a selection of the respectively to be detected is made
  • Fluorescent dye for example, by switching a suitable einbumblee Fluoreszenzteilerorulfels in Auflichtachsenebene the Microscope. In this way, the correct combination of
  • Excitation and emission wavelength range can be ensured. However, a change between different excitation and detection modalities is comparatively slow.
  • the switching time between the respective emission wavelength ranges is typically about 300 to 400 ms, which often proves to be not sufficiently fast, in particular for the examination of moving objects, in particular living cells.
  • a multiband fluorescence divider cube can also be used, all of which are suitable
  • Excitation wavelength ranges to the sample and correspondingly all eligible emission wavelength ranges reach the camera.
  • the selection of each detected fluorescent dye can be done via a fast switchable emission filter between the microscope and the camera.
  • the stimulation also matches via an excitation filter wheel which can likewise be switched quickly or a light source which can be modulated quickly (for example LED)
  • a disadvantage of corresponding methods and devices remains their partial, in particular in living cell experiments, still not sufficiently fast switching time between the different excitation and detection modalities.
  • color cameras with Bayer or Foveon sensors can also be used.
  • a multiband fluorescence divider cube can be used which, as in the case of the fast sequential detection just described, makes it possible to bring all possible excitation wavelength ranges to the sample and all possible emission wavelength ranges to the camera.
  • the color capability of the camera allows the detection of the different emission wavelength ranges in different color channels.
  • the disadvantage of corresponding methods and devices, however, is the low
  • Sensitivity of a Foveon sensor often does not provide any advantages in practice.
  • a multiband fluorescence divider cube can be used which allows all the possible excitation wavelength ranges for the sample and all relevant emission wavelength ranges to be transmitted to the camera.
  • an optical intermediate module is arranged, which optionally reduces and spectrally divides the intermediate image of the microscope, so that a plurality of copies of the intermediate image are imaged side by side on the camera sensor in different spectral ranges.
  • dichroic splitter plates are used in such arrangements.
  • a multiband fluorescence divider cube can be used which will deliver all candidate excitation wavelength ranges to the sample and all candidate emission wavelength ranges to the cameras.
  • an optical intermediate module is arranged here, which spectrally divides the intermediate image of the microscope, so that different spectral regions are imaged onto different cameras.
  • Color TV camera is described at a relatively long optical path in glass. Furthermore, the light can be divided by means of a Philips prism only in a total of three channels. Another disadvantage is added
  • the transmission interface from A to B should be permeable, but then have a reflective effect on the light reflected at layer 1.
  • a corresponding coating can lead to considerable light losses due to scattering.
  • Beam splitter cube (a so-called X-Cube) known, comprising a total of four prisms.
  • a corresponding arrangement for a camera is also shown for example in US 8,988,564 B2.
  • the deflection taking place in the beam splitter cube at 45 ° is very polarization dependent and thus disadvantageous.
  • Relay optics or are in particular unsuitable or disadvantageous for structural or optical reasons for use in microscopy.
  • the object of the present invention is to enable a simultaneous, multispectral, largely lossless recording of a plurality of different fluorophores in a microscope.
  • a detector module for a microscope system is to be provided in the context of the present invention, which is equipped with a corresponding color beam splitter arrangement.
  • Another object of the present invention is the
  • the present invention proposes a
  • a color beam splitter array, a microscope system and a microscopic imaging method having the features of the respective independent claims.
  • Preferred embodiments are the subject of the dependent claims and the following description.
  • the present invention initially proposes a color beam splitter arrangement which is particularly suitable for use as part of a multi-camera module or a corresponding detection unit with a plurality of monochrome cameras for parallel detection.
  • a corresponding multi-camera module includes In particular, an optical camera adapter, which can be attached to a camera outlet of a microscope, as well as a plurality of outputs for coupling a plurality of monochrome cameras or the corresponding cameras themselves.
  • the terms “detectors”, “cameras” and “sensors” are used interchangeably hereinafter
  • the spectral distribution of observation light of the microscope takes place via prisms in the color beam splitter arrangement explained in detail below, in each case
  • Prisms hereinafter referred to as beam splitter prisms, are provided with mutually different spectral selectivities having dichroic layers or coatings.
  • the optical camera adapter can in particular be designed such that it enlarges the intermediate image of the microscope so far that it at least largely corresponds to the sensor size of the cameras used. In particular, it has a final cutting width which is large enough to be able to install the prism arrangement between camera adapter and camera. If none
  • the camera adapter can only consist of a purely mechanical element to maintain the correct distance to the cameras.
  • the first beam splitter prism has a first prism surface, a second prism surface, a third prism surface, and a fourth prism surface, wherein a plane in which the first prism surface of the first beam splitter prism is disposed parallel to a plane in which the second prism surface of the first beam splitter prism lies, a plane in which the third prism surface of the first beam splitter prism is located, is arranged parallel to a plane in which the fourth prism surface of the first beam splitter prism lies, the plane in which the first prism face of the first beam splitter prism is located includes an obtuse angle at a first angle, hereinafter designated u, with the plane in which the fourth prism face of the first beam splitter prism lies, the plane in which the second prism face of the first
  • the beam splitter prism is at an obtuse angle with the first angular amount u to the plane in which the third prism face of the first beam splitter prism lies, in or parallel to the plane in which the first prism face of the first beam splitter prism is located, a first dichroic layer is arranged first spectral selectivity, and in or parallel to the plane in which the second prism surface of the first beam splitter prism is located, a second dichroic layer is arranged with a second spectral selectivity.
  • a dichroic layer can be applied in particular in the form of one or more metal oxide layers to a prism or a prism surface.
  • layer and “coating” are used synonymously here. In principle, however, it is also possible to have separate, for example plane-parallel, elements with corresponding dichroic layers
  • the dichroic layers on which in turn the dichroic layers are applied.
  • Corresponding separate elements may be arranged at a defined distance of, for example, 5 micrometers or less from the respective prism faces.
  • Wavelength shares that are split into at least three sub-channels, which can be supplied to the simultaneous or parallel detection of different cameras.
  • the cameras can be designed as monochrome cameras, whereby the term "camera” is also understood below to mean a detector or sensor which is without the usually present ones
  • a camera i. Shutter, lens and the like
  • a detector has a photosensitive and digital sensor.
  • the color beam splitter arrangement proposed according to the invention and the cameras or sensors are designed in particular as part of a detection unit.
  • the color beam splitter assembly is formed with a second beam splitter prism, which is constructed in parts comparable to the first beam splitter prism, and therefore can be made with substantially similar manufacturing steps as the first beam splitter prism. It has a first prism surface, a second prism surface, a third prism surface and a fourth prism surface, wherein a plane in which the first prism surface of the second beam splitter prism lies is arranged parallel to a plane in which the second prism surface of the second beam splitter prism lies.
  • the plane in which the first prism face of the second beam splitter prism lies subtends an obtuse angle with the mentioned first angle u with a plane in which the fourth prism face of the second beam splitter prism lies, the plane in which the second prism face of the second beam splitter prism lies , an obtuse angle having a second, smaller angle amount than the first angle amount, here denoted by v, with a plane in which the third prism surface of the second Beam splitter prism lies, includes, in or parallel to the plane in which the first prism surface of the second beam splitter prism lies, a third dichroic layer is arranged with a third spectral selectivity, and in or parallel to the plane in which the second prism surface of the second
  • Beam splitter prisms is located, a fourth dichroic layer having a fourth spectral selectivity is arranged. unlike the first
  • Beam splitter prism differs from the first beam splitter prism in particular by the deviating formation of the third prism surface.
  • a color beam division can be carried out in five spectral channels.
  • the present invention or just explained embodiment is not limited to the arrangement with only a first and a second beam splitter prism. Rather, other beam splitter prisms can be used. These can be arranged in any desired manner with respect to the two beam splitter prisms explained, for example being rotated about a common axis.
  • the splitting into the spectral channels or their maximum number results according to 1 + 2n, where n represents the number of beam splitter prisms. For example, it is thus possible to split into seven spectral channels using three corresponding beam splitter prisms.
  • the first and the second beam splitter prisms are used which comprise the described first and second beam splitter prisms, according to a particularly preferred embodiment of the invention, the first and the second
  • Beam splitter prism are arranged one behind the other in such a way that the first prism surface of the first beam splitter prism and the third prism surface of the second beam splitter prism are arranged in a common plane or parallel to each other, and that a common optical axis extends obliquely through their first prism surfaces and not through their second prism surfaces.
  • the first prism surface of the first beam splitter prism and the third prism surface of the second beam splitter prism can be in surface contact or cemented together, but it is also possible to arrange them at a defined distance from each other.
  • Beam splitter prisms are formed or arranged parallel thereto. The following is for the sake of simplicity, but without corresponding possibilities
  • the corresponding surfaces are each inclined at an angle relative to a common axis, which in particular represents the main optical axis of the color beam splitter arrangement.
  • the common axis occurs in each case through the first prism faces, but not through the second prism faces, the two beam splitter prisms.
  • Beam splitter prisms trained color beam splitter arrangement explained in more detail.
  • the Beam splitting by means of only one beam splitter prism or by means of more than two beam splitter prisms results accordingly.
  • total light The polychromatic or multichromatic light (hereinafter also referred to as “total light”) is first radiated along the common axis, in particular centered to this and in particular convergent, in the first beam splitter prism, in particular on the already mentioned and further explained below, perpendicular third to the common axis
  • the total light then strikes the first prism surface of the first beam splitter prism, in particular further along the common axis, and is spectrally split there according to the spectral selectivity of the first dichroic layer provided here.
  • a portion of the total light striking the first prism surface of the first beam splitter prism or its dichroic layer is at the first
  • Beam splitter prism again on a corresponding dichroic layer and is spectrally split according to the spectral selectivity of this dichroic layer of the second prism surface of the first beam splitter prism.
  • a portion is reflected on the second prism surface of the first beam splitter prism or its dichroic layer, preferably exits via the mentioned and subsequently further explained fourth prism surface of the first beam splitter prism and can, in particular after passing through one or more further prisms, via a correspondingly arranged Camera to be detected.
  • Light not reflected at the second prism surface of the first beam splitter prism or its dichroic layer passes through the second prism surface of the first beam splitter prism or its dichroic layer and can, in particular after passing through one or more further prisms, also be detected via a correspondingly arranged camera.
  • a portion of the total light that is not already reflected at the first prism area of the first beam splitter prism or its dichroic layer passes through the first prism area of the first beam splitter prism or its dichroic layer and continues to propagate, in particular along the common axis, and beyond those already mentioned and below explained third prism surface of the second beam splitter prism, which is arranged parallel to or in a common plane with the second prism surface of the first beam splitter prism, irradiated in the second beam splitter prism.
  • the light irradiated into the second beam splitter prism then strikes, in particular further along the common axis, the first prism surface of the second beam splitter prism or the dichroic layer provided here.
  • Beam splitter prism or here provided dichroic layer incident light reflects a part and therefore meets the second prism surface of the second beam splitter prism or on the second prism surface of the second
  • Beam splitter prisms provided dichroic layer.
  • a part of the light reflected onto the second prism surface of the second beam splitter prism or the dichroic layer provided here is reflected according to the spectral selectivity of this dichroic layer and in particular emitted from the second beam splitter prism via the fourth prism surface of the second beam splitter prism mentioned above and explained below.
  • a further portion of the light reflected onto the second prism surface of the second beam splitter prism or the dichroic layer provided here penetrates it and is likewise emitted from the second beam splitter prism. Both emitted from the second beam splitter prism light components can, in particular after passing through one or more further prisms, are detected by means of appropriate cameras.
  • the first beam splitting prism according to the present invention can be manufactured in a particularly simple, reliable and cost-effective manner using block-shaped blocks of glass or other transparent material (hereinafter referred to simply as "glass blocks”) available,
  • Beam splitter prism can be made to match.
  • cuboid glass blocks can be diagonal in particular to each other
  • opposite edges are each bevelled or folded to obtain the second prism surfaces.
  • two triangular prisms each can be generated, which, as explained below, can be used elsewhere in the color beam splitter arrangement. In this way, can be in the context of the present invention save material and simplify the manufacturing processes by reducing process steps.
  • FIGS. 3 and 7 in which corresponding beam splitter prisms and their respective prism faces are illustrated in detail.
  • the second beam splitter prism can be placed on the first beam splitter prism by arranging the first prism surface of the first beam splitter prism with the third prism surface of the second beam splitter prism in parallel or in a common plane.
  • the first angular amount u which indicates the obtuse angle subtended by respectively the first and fourth prism surfaces of the first beam splitter prism and the first and fourth prism surfaces of the second beam splitter prism, is 145 ° to, according to a particularly preferred embodiment of the present invention 165 °, in particular 150 ° to 160 °, preferably 157.5 °.
  • the respective angle of incidence of the light on the first prism surface of the first and second beam splitter prism and thus also defines the respective angle of incidence of corresponding light components on the second prism surface of the first and second beam splitter prism can the dependence of the reflection on the polarization given in conventional arrangements, in particular the so-called X-Cube, can be largely avoided because the light impinges steeper on a corresponding dichroic layer.
  • Beam splitter prism, if any) according to a particularly preferred Describe embodiment of the invention based on a cuboid glass block, are beveled from the two diagonally opposite edges to obtain the respective first and second prism surfaces in the case of the second beam splitter prism, if available, another edge is bevelled or folded. Also, a production of appropriate
  • Beam splitter prisms using cuboid glass blocks is possible.
  • the first beam splitter prism advantageously comprises a fifth
  • Beam splitter prisms or planes in which they lie, an obtuse angle with an angular amount w include, and wherein the second and the sixth
  • an obtuse prism inner angle with the angular amount w include.
  • the second beam splitter prism if present, preferably comprises a fifth prism face and a sixth prism face parallel to its fifth prism face, the third and fifth prism faces of the second beam splitter prism lying at an obtuse angle with the already angle angle w, as explained with respect to the first beam splitter prism, wherein the first and fifth prism surfaces of the second beam splitter prism include an obtuse angle with the angle w, the fourth and sixth prism surfaces of the second beam splitter prism in which they lie, form a right angle, and wherein the second and the sixth
  • the third prism surface is deviatingly arranged in the second beam splitter prism, i.e., the prism surface of the second beam splitter prism or planes in which these lie. based on a cuboid glass block, also bevelled.
  • Color beam splitter arrangement arranged such that a smallest angle between the first prism surface of the first beam splitter prism and the common axis and a smallest angle between the first prism surface of the second
  • Beam splitter prisms and the common axis each have an angular amount x.
  • the first prism surface of the first beam splitter prism and the third prism surface of the second beam splitter prism are parallel to each other arranged. Preferably, these prism surfaces are arranged parallel to each other or in a common plane.
  • the color beam splitter assembly advantageously comprises one or more triangular prisms each having a first, a second and a third prism surface, the first and second prism surfaces of the triangle prism (s) each lying in planes enclosing an acute angle with an angular amount y to each other and the first prism face of the one or one of the triangle prisms in a common plane with or parallel to the second prism face of the first beam splitter prism and / or the first prism face of the one or one of the triangle prisms is disposed in a common plane with or parallel to the first prism surface of the second beam splitter prism and / or the first prism surface of the one or one of the triangle prisms in a common plane with or parallel to the second prism surface of the second beam splitter prism.
  • a first, a second and a third triangular prism are provided, each comprising the first, the second and a third prism surface.
  • Triangular prisms or the corresponding planes each have an acute angle remaining with the angle sum of 180 °.
  • such triangular prisms can therefore each be obtained by chamfering or edging diagonally opposite edges of a parallelepiped glass block to obtain the first and second prism surfaces.
  • the first prism surface of the first triangular prism is parallel to the second prism surface of the first beam splitter prism
  • the first prism surface the second triangular prism is arranged parallel to the first prism surface of the second beam splitter prism
  • the first prism surface of the third triangular prism parallel to the second prism surface of the second beam splitter prism, wherein the respective parallel prism surfaces are arranged in a common plane or parallel to each other.
  • Directed partial dichroic layers has the
  • Color beam splitter arrangement advantageously one or more cuboid prisms, wherein the or at least one of the cuboid prisms is or are assigned to the one or each of the triangular prisms.
  • the cuboid prisms can also be designed as cube prisms. Their concrete design depends in particular on the geometry of the cameras or sensors used.
  • the color beam splitter arrangement has a first, a second, a third, a fourth and a fifth cuboid prism.
  • the cuboid cube prisms are formed in a suitable size and each have a first prism surface and a second parallel to the first prism surface
  • the first prism surface of the first cuboid or cubic prism is in the above-described arrangement with a first, a second and a third triangular prism parallel to the second prism surface of the first triangular prism, the first prism surface of the second cuboid prism parallel to the second prism surface of the second triangular prism, the first prism surface of the third cuboid prism parallel to the second prism surface of the third triangular prism; the first prism surface of the fourth cuboid prism parallel to the fourth prism surface of the first beam splitter prism and the first prism surface of the fifth cuboid or
  • Dice prisms arranged parallel to the second prism surface of the first cuboid or dice prism. The respectively mentioned, parallel to each other
  • arranged prism surfaces are arranged in a common plane or parallel to each other.
  • other prisms may also be used which form corresponding beam paths and additional prisms may be present.
  • Cube prisms can also be used in a corresponding arrangement, only three cuboid or cube prisms and two additional semi-cuboid or half-cube prisms. The first, the second and the third cuboid or
  • Dice prisms each have a first prism surface and a second prism surface parallel to the first prism surface.
  • the half-cuboid or half-cube prisms each have a first prism surface and a second prism surface arranged at right angles to the first prism surface.
  • the first prism face of the first cuboid prism is parallel to the second prism face of the second triangular prism, the first prism face of the second cuboid prism parallel to the fourth prism face of the first beam splitter prism, the first prism face of the first half cubic prism parallel to the second prism surface of the first
  • Triangular prisms the first prism surface of the second half-cuboid or
  • Triangular prisms the first and second prism surfaces of the cuboid or
  • Cube prisms and the first and second prism surfaces of the half-cuboid or half-cube prisms, if present, are each arranged perpendicular to a reference plane in which, in particular, the common axis can run.
  • the prisms mentioned have further, in particular parallel to the reference plane arranged prism surfaces. If we speak of "triangular prisms" before and below, these are those prisms which have a triangular cross section in plan view of the reference plane, the inner angles of a corresponding triangle corresponding in each case to the angles explained above they are glass blocks, which have six identically dimensioned surfaces, two of which are arranged parallel to each other.
  • a cube prism thus represents a special form of a "cuboid prism" in which each one another
  • a microscope system for the microscopic imaging of a sample is likewise an object of the present invention.
  • This comprises a detection unit which can be designed in particular modularly, ie as a unit which can be coupled and removed via corresponding coupling means, and which furthermore has a color beam splitter arrangement, in particular a color beam splitter arrangement such as previously discussed in preferred embodiments.
  • Detection unit of the microscope system according to the invention further comprises a plurality of sensors.
  • the microscope system according to the invention is equipped with a lighting unit which irradiates light to the sample in accordance with a control by a control unit.
  • the microscope system is further designed such that it irradiates light emitted by the sample with a plurality of different wavelength components into the color beam splitter arrangement, this light by means of the
  • Color beam splitter assembly decomposed into the different wavelength components, and the different wavelength components each lead to one of the sensors in the detection unit. Furthermore, the microscope system acquires individual image data by means of the sensors, evaluates the individual image data and / or image data generated using the individual image data by means of a computing unit, and controls the lighting unit and / or the detection unit on the basis of the evaluation by means of the control unit.
  • the microscope system proposed according to the invention has the respectively required electronic, optical and / or mechanical means which are each set up to carry out these measures.
  • Frame data of composite image is basically possible.
  • Reduction of the intensity can be carried out in particular depending on the intensity of the background or the signal-to-noise ratio.
  • control comprises, in particular, setting one or more light parameters of the light irradiated to the sample on the basis of the evaluation, for example, as mentioned, an advantageous adaptation of a
  • an intensity or a wavelength of light of at least one light source in the lighting unit is adjusted or influenced by a corresponding control.
  • the intensity of one or more light parameters is adjusted or influenced by a corresponding control.
  • Light sources can be increased or decreased by voltage or current control.
  • the same is basically possible by the control of filters or filter arrangements in the lighting unit, for example a filter wheel with gray filters of different tints or by controlling electronically adjustable gray or attenuation filters.
  • a change of a wavelength can be done for example by means of corresponding color filters or other optical devices.
  • Activation on the basis of the evaluation of the individual image data may in particular also include an activation of the detection unit in the latter
  • an amplification factor of the sensors or detectors or one or more filters or filter arrangements can be set.
  • Spectral segregation can be carried out, for example, using reference spectra, by means of which the contribution of the respective fluorophores can be determined or estimated. Due to the spectral segregation, which is basically known from the prior art, it is in particular possible to carry out an exact separation of a series of different fluorescent dyes with very similar emission spectra. For further details refer to relevant literature.
  • a spectral segregation can also be facilitated by the use of the microscope system proposed according to the invention in that the contribution of one or more fluorophores to an overall spectrum can be increased or reduced by triggering based on the evaluation of the individual images. In this way it is possible, for example, to obtain reference spectra which result from excitation of light with a specific selected property and to compare these with an overall spectrum. In other words, the contributions of other fluorophores to a spectrum can be specifically influenced in order to better assess the contribution of a fluorophore to be examined.
  • the contributions of other fluorophores to a spectrum can be specifically influenced in order to better assess the contribution of a fluorophore to be examined.
  • One or more such reference pixels may in particular be a or multiple pixels, the spectrum of which only by the contribution of a
  • Fluorophors is caused, and therefore used as a reference pixel. This can be determined, for example, from a phasor plot or by a comparison with neighboring pixels, or by the fact that only a defined dye is excited by a targeted control of the lighting unit.
  • a separation by a variation of the excitation can be simplified. This can be done, for example, by a shift of the respective excitation wavelength (s) and / or by a corresponding increase or decrease in the
  • Radiation intensity can be achieved, so measures that are made on the lighting side.
  • the components of the individual pixels are represented as dots in a phasor plot.
  • Individual spectral components represent point clouds in such an evaluation. The diameter of these point clouds depends on the noise and is ideally minimized so far that a sufficiently accurate identification of the contributions of the individual dyes to the color value of a pixel is possible.
  • the inventively proposed Microscope system allows a user a decision between the precision of the spectral segregation and the sample load by a stronger illumination.
  • the microscope system proposed by the present invention allows the use of planes or other areas of the sample to provide additional information about the dyes present in a sample.
  • a response to user input is possible, for example with respect to information displayed on a display device.
  • a linear segregation can in the invention
  • proposed microscopic system can be advantageously carried out, as this typically requires a precise knowledge of the spectra of the individual fluorophores
  • the proposed microscope system according to the invention as mentioned, for example, pixels are identified, the spectrum of which is due to a single fluorophore. corresponding information can then be used for the linear spectral segregation.
  • the method proposed according to the invention for the microscopic imaging of a sample comprises the use of a microscope system, in particular as explained above.
  • the microscope system used comprises a detector unit, which has a color beam splitter arrangement and a plurality of sensors, and a lighting unit which, in accordance with a control by a
  • Control unit irradiates light onto the sample
  • light emitted by the sample with a plurality of different wavelength proportions is irradiated into the color beam splitter arrangement by means of the microscope system, this light being converted into the different colors by means of the color beam splitter arrangement
  • Using the microscope system are further by means of the sensors
  • Light detected by means of a microscope objective is advantageously filtered to suppress the excitation light in fluorescence microscopy in a known manner, for example using a suitable filter, in particular a notch filter, before it can be read using the
  • Color beam splitter array is divided into spectral components.
  • a multi-band notch filter can be used on the object side of the beam splitting.
  • the bands of the multiband notch filter are thereby e.g. For example, with a division of the spectrum from 400 nm to 900 nm into 5 bands or spectral components (400 to 500, 500 to 600, 600 to 700, 700 to 800, 800 to 900
  • Nanometer a notch filter which only transmits the ranges 450 to 500, 550 to 600, 650 to 700 nanometers etc.
  • a filtering in areas of 450 to 550 or 650 to 750 nanometers possible.
  • the filter may be absorbent or reflective.
  • its spectral profile can be varied by tilting. A displacement substantially perpendicular to the optical axis can also take place.
  • the reflected light can be directed onto a structurally identical color beam splitter arrangement. This allows the higher spectral resolution to be achieved faster and with higher light output.
  • a correction of the transmission of the optical elements of the color beam splitter arrangement can advantageously be carried out using a tube lens.
  • This tube lens is advantageously matched to the material properties and optical path lengths in the color beam splitter arrangement.
  • the tube lens can compensate for the chromatic or color-dependent offset of the image plane (which is caused by the dispersion of the color beam splitter arrangement), so that for all spectral components or beam paths Image plane directly behind the
  • Color beam splitter arrangement or in defined planes and the sensors can be attached directly to the color beam splitter assembly or connected to this fixed.
  • color beam splitter arrangements can be advantageously further filtered, in particular using bandpass filters, before they are produced by means of corresponding cameras be recorded. In this way, the respectively measured signal can be better defined or crosstalk suppressed. The reliability of the detection is improved in this way.
  • sensors in detectors or cameras can be used in the context of the present invention, in particular monochrome charge-coupled device, complementary metal oxide semiconductor or scientific complementary metal oxide semiconductor (CCD) sensors, CMOS or sCMOS), as they are generally known from the prior art in the field of microscopic detection.
  • the sensors or cameras can be identical or different in design.
  • the sensors can have different formats or different designs.
  • silicon based sensors may be used for the detection of light in the visible spectral range and one or more sensors
  • Indiumgalliumarsenidbasis for the near infrared range (more than 700 nm, in particular more than lOOOnm) can be used.
  • the inventive method for microscopic imaging is
  • a field programmable gate array FPGA
  • a main processor CPU
  • a graphics processor GPU
  • FPGA field programmable gate array
  • a phase analysis can also be performed and be assigned to individual dyes on this basis. This can be done to any extent automation and consideration of user input.
  • Spectral Unmixing The assignment of emitted by a dye emission light based on the images of the cameras or detectors can be done in particular by the known so-called Spectral Unmixing.
  • Spectral Unmixing the sum of the spectral information for the individual fluorophores separated into separate images.
  • algorithms can be used which measure the spectral content of each pixel of a pixel stack as represented by the
  • Overlay is compared with possible sum combinations of the known spectra of the fluorophore molecules of a sample.
  • the color beam splitter arrangement according to the invention makes it possible in particular to ensure that boundary surfaces (inlet and outlet surfaces in or out of glass) are perpendicular to the optical axis of the respective beam paths or
  • Partial beam paths are available. This is particularly important because the light in a corresponding color beam splitter arrangement in particular is not collimated. Furthermore, by the inventive
  • Color beam splitter arrangement can be ensured that the optical path length in glass between the input of the color beam splitter assembly, such as a corresponding tube lens, and the respective of the cameras for all
  • Part beam path is uniform or coordinated. Deviations may be due to possibly remaining longitudinal chromatic
  • the color beam splitter arrangement according to the invention allows a
  • Figure 1 shows a color beam splitter arrangement according to an embodiment of the invention in a simplified schematic representation.
  • Figure 2 shows a color beam splitter arrangement according to an embodiment of the invention in a simplified schematic representation.
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of beam splitter prisms of color beam splitter arrangements according to embodiments of the invention.
  • FIG. 4 schematically illustrates dimensions on a color beam splitter assembly according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 5 shows a color beam splitter arrangement according to an embodiment of the invention in a simplified perspective exploded view.
  • FIG. 6 shows a color beam splitter arrangement according to an embodiment of the invention in a simplified composite perspective view.
  • FIGS 7A to 7D illustrate ways of making
  • Beam splitter and triangle prisms according to embodiments of the invention.
  • FIG. 8 shows a microscope system according to an embodiment of the invention.
  • each other functionally and / or structurally corresponding elements are given identical reference numerals and are the
  • FIG. 1 a color beam splitter arrangement according to a particularly preferred embodiment of the present invention is illustrated schematically in a simplified manner and denoted overall by 100.
  • the color beam splitter arrangement 100 comprises a first beam splitter prism A1 and a second one
  • Beam splitter prism A2 The first beam splitter prism Al and the second
  • Beam splitter prism A2 each have a first prism surface Al-1, A2-1 and a second prism surface Al-2, A2-2.
  • the first beam splitter prism Al and the second beam splitter prism A2 are arranged in the color beam splitter arrangement 100 such that a common axis A extends in each case through their first prism faces Al-1, A2-1, but not through their second prism faces Al-2, A2-2 are the first
  • Beam splitter prisms Al and A2 runs at an angle to the first
  • Prism faces Al-1, A2-1, which allows a largely polarization-independent reflection.
  • first and second prism surfaces Al-1, A2-1, Al-2, A2-2 of the first and second beam splitter prism Al, A2 are respectively dichroic layers
  • the dichroic layers 1 to 4 may also be formed as part of separate optical elements which are in surface contact with the first and second prism surfaces Al-1, A2-1, Al-2, A2-2 or in a predetermined (small ) Distance to the first and second prism surfaces Al-1, A2-1, Al-2, A2-2 may be arranged.
  • These dichroic layers have divergent spectral selectivities, so that explained in the following Way poly- or multichromatic light of a light beam m, which runs along the common axis A and the first prism surface Al-1 of the first beam splitter prism Al meets, can be split into a total of five different spectral components.
  • all dichroic layers 1 to 4 are advantageously designed as short-pass filters, ie they reflect light from a fixed wavelength, that is to say light having longer wavelengths.
  • FIG. 3 further shows the common axis A passing through the first prism surface Al-1 of the first beam splitter prism Al and the first one
  • Prism surface A2-1 of the second beam splitter prism A2 runs.
  • Prism surface A2-2 of the second beam splitter prism A2 is, a previously mentioned several times obtuse angle with a second angle amount v, which is smaller than the angular amount u.
  • Beam splitter prism A2 is closed with its first prism surface A2-1, or a plane in which its first prism surface A2-1 is, however, deviating from the corresponding arrangement of the prism surfaces Al-4 and Al-1 in the first beam splitter prism Al a dull Angle with the angle u.
  • prism faces here referred to as fifth prism face Al-5, A2-5 and sixth prism face Al-6, A2-6, are arranged as previously explained in detail.
  • the beam splitter prisms Al, A2 are each delimited by the solid lines illustrated. As shown in FIG. 3 by means of dashed lines, they can be characterized by bevelling or folding
  • cuboid glass blocks are formed by respectively providing the first and second prism surfaces Al-1, A2-1, A2-1, A2-2 of the first and second beam splitter prisms Al, A2 and the third prism surface A2-3 of the second beam splitter prism A2.
  • a production is not a mandatory requirement.
  • a light beam of polychromatic or multichromatic light is irradiated via the third prism surface Al-3 of the first beam splitter prism Al into the same along the common axis A.
  • the light beam m now hits the first axis relative to the common axis A according to the orientation of the first prism surface Al-1
  • the spectral Selectivity of the dichroic layer 1 is chosen in particular such that red and orange light components are predominantly reflected at this, whereas green, blue and yellow light components predominantly pass through them.
  • the dichroic layer 2 provided here has a spectral selectivity, which is chosen in particular such that orange light components are predominantly reflected at this, whereas red light components predominantly pass through them.
  • Beam splitter prism Al or the corresponding dichroic layer 2 reflected light beam o with orange light components is on the fourth
  • the light beam o radiates through a cube prism C, which in the beam splitter arrangement 100 in FIG.
  • Passing light with red light components radiates in the form of a light beam r a triangular prism B and two cube prisms C and then also strikes a camera, not shown.
  • the triangular prism B serves to ensure that the light beam r exits the color beam splitter assembly 100 via a vertical interface.
  • the glass paths of the light beams o and r are identical.
  • Passing light with green, blue and yellow light components passes in the form of a light beam gby over the third prism surface A2-3 of the second
  • Beam splitter prisms A2 in particular with the first prism surface
  • Beam splitter prism A2 strikes the first prism surface A2-1 of the second beam splitter prism A2 or there provided dichroic layer 3.
  • This dichroic layer has a spectral selectivity, which is chosen in particular such that green and yellow light components are predominantly reflected at this , however, blue light components predominantly pass through them.
  • the dichroic layer 4 provided here has a spectral selectivity, which is chosen in particular such that yellow light components are predominantly reflected at this, whereas green light components predominantly pass through them.
  • Beam splitter prism A2 or the corresponding dichroic layer 4 reflected light beam y with yellow light components is on the fourth
  • Prism surface A2-4 of the second beam splitter prism A2 emitted and meets a camera, not illustrated here.
  • a dice prism C is not provided here.
  • Beam g a triangular prism B and a cube prism C and hits
  • the triangular prism B essentially serves to ensure that the light beam g emerges from the color beam splitter arrangement 100 via a vertical boundary surface.
  • the triangular prism B and the cube prism C explained in detail above, it can be seen that the glass paths of the light beams g and y are identical to each other and identical to the glass paths of the light beams o and r are.
  • Passing light with blue light components is emitted in the form of a light beam b via a triangular prism B and a cube prism C as well as a cuboid prism Q and in particular likewise strikes a corresponding camera, not shown here.
  • a suitable choice of components such as cube and cuboid prisms.
  • a cuboid prism Q is further provided.
  • Embodiments of cube prisms C is the talk, but in all cases can be replaced by cuboid prisms of appropriate dimensions. As mentioned, corresponding cube and / or cuboid prisms essentially ensure that the respective light components pass through identical glass paths. They will therefore be dependent on the present
  • the respective cross section perpendicular to the paper plane according to FIG. 1 can also be adapted to the dimensions of one or more detectors or cameras.
  • the dichroic layer 1 as a long-pass filter with a
  • Edge wavelength of 490 nm, the dichroic layer 2 as a long-pass filter with an edge wavelength of 450 nm, the dichroic layer 3 as a long-pass filter with an edge wavelength of 590 nm and the dichroic layer 4 as Long pass filter be designed with an edge wavelength of 630 nm.
  • interchangeable multiband pass filters can be placed upstream of the beam splitter array, ie on the irradiation side of the light beam m, to further refine the spectral detection bands, eg four bands of 20 nm width around 440 nm, 480 nm, 530 nm, 580 nm and 620 nm. An arrangement at this point is particularly favorable because common
  • FIG. 2 illustrates a beam splitter arrangement according to a further embodiment of the present invention, which differs from that of FIG
  • Beam splitter arrangement 100 according to Figure 1 differs essentially by the use of two half-cube prisms D instead of two cube prisms C. Through each of these can be an even number of reflections of
  • FIG. 3 has already been partially explained previously. This illustrates, as mentioned, the first beam splitter prism Al and the second beam splitter prism A2 isolated. Further, here are compared to Figure 1 and 2 additional areas
  • the angular amount u is 145 ° to 165 °, in particular 150 ° to 160 °, preferably 157.5 °, and the angle amounts v and w are in particular in accordance with the angle u
  • FIG. 4 dimensions of a color beam splitter assembly 100 as shown in Fig. 1 are illustrated. Compared to the representation of Figure 1 was dispensed with a number of reference numerals. As can be seen, the dimensions of the respective prism surfaces are derived from a basic dimension d. The width the beam splitter prisms Al, A2 is 2d, the width of the cube prisms C is d. The cuboid prism Q provides an additional glass path of the illustrated length. The other dimensions are shown in FIG. 4. From the dimensions illustrated in FIG. 4, an angular value a of 157.5 ° results. In FIG. 5, for further illustration, a color beam splitter arrangement 100, as already illustrated in FIGS. 1 and 4, is again shown in the form of an exploded perspective view. Here are too
  • FIG. 6 corresponds to the representation of FIG. 5 in FIG.
  • FIGS. 7A to 7D again illustrate how the
  • Glass blocks 101 can be made. However, as mentioned several times, the present invention is not limited to a corresponding manufacture. As can be seen in FIG. 7A, four triangular prisms, which can be added to the remainder, as illustrated in FIG. 7B, can basically be removed from a corresponding block-shaped glass block 101. By only partial removal of corresponding triangular prisms or only partial bevelling of edges, as can be seen from FIGS. 7C and 7D, the beam splitter prisms A1 and A2 can be obtained.
  • a microscope system which may be designed in particular for carrying out a method according to an embodiment of the present invention, is illustrated in a highly simplified manner and designated by 200 as a whole.
  • the microscope system 200 includes, as here also greatly simplified
  • FIG. 12 illustrates a color beam splitter assembly 100 as previously discussed in US Pat
  • the detection unit 201 comprises a plurality of sensors or cameras, as already explained above, and, depending on the design of the microscope system 200, any other optical elements, in particular bandpass filters and the like. Depending on the design of the color beam splitter arrangement 100 and the color channels provided therewith, a corresponding number of sensors or cameras is present. These cameras or sensors are, as well
  • Image recording or evaluation which may be associated with the sensors or cameras in the detection unit 201, not illustrated.
  • digital image data is obtained, which in particular can be transmitted via a data connection 202 from the detection unit 201 to a computing unit 203, for example a PC or a dedicated microscope control
  • Arithmetic unit can be installed a suitable software, by means of which correspondingly obtained image data can be evaluated. It is understood that at least a part of the image data can also be evaluated in hardware, for example in a graphics processor (GPU). An appropriate software can interact with the graphics processor, for example.
  • a likewise implemented in software and / or hardware control unit 204 is used.
  • a gain factor of at least one of the sensors or at least one of the cameras or other parameters can be set.
  • a weakening of one of the color channels for example by the activation of a controllable filter, can take place by means of the control unit 204.
  • a monitor to be connected to the arithmetic unit 203.
  • the Display device 206 may alternatively be part of the computing unit 203 or housed in a common housing with this.
  • a user can view the image data obtained by means of the sensors or cameras in the detection unit 201 and processed in the arithmetic unit.
  • the processing of the image data in the arithmetic unit can in particular be a spectral segregation, a superimposition of image data from different spectral channels, in particular with respective ones
  • Intensity adjustment and any measures known in the field of image processing include.
  • a user can change parameters of the image processing and / or parameters of the activation of the detection unit 201 via a user interface 207 which can be coupled to the computing unit 203 with a further data connection 208.
  • a purely automatic control can be provided, for example, based on
  • User interface 207 may be part of computing unit 203 or may be housed in a common housing therewith.
  • the user interface 207 may in particular have known input means such as real or virtual keys.
  • a mouse, a trackball, a tablet or other, in particular for the manipulation of image data suitable input means may be provided.
  • the user interface 207 and the display device 206 may also be at least partially designed as a device, for example in the form of a touchscreen.
  • the control unit 204 may in the illustrated in Figure 8
  • Embodiment of the microscope system via a further data connection 209 and a lighting unit 211 are controlled.
  • the illumination unit 211 is in particular designed to provide illumination light in the form of fluorescence excitation light of one or more defined wavelengths or wavelength ranges. This illumination light can be in
  • the wavelengths or wavelength ranges can be selected in particular by means of suitable, in particular changeable, filter or filter arrangements such as filter wheels, filter slides, filter cubes and the like.
  • the lighting unit 211 may comprise one or more light sources, not separately illustrated in FIG. 8, which may each provide monochromatic or polychromatic light. In the case of multiple light sources, their light may in particular also be coupled into a common illumination beam path, for example by means of beam splitters or other coupling devices. As illustrated in the example illustrated in FIG. 8, the light of one or more light sources can be radiated onto a sample 213, for example by means of a fiber optic 212.
  • an adaptive control of the illumination device 211 can be provided as a function of the detection unit 201 obtained and in the
  • Calculate unit 203 evaluated image data. In this way, a targeted adaptation of lighting parameters, such as
  • Lighting units vorappelbar Such an adaptation can be carried out manually, semi-automatically or fully automatically, in particular when using a plurality of fluorescent dyes, which are different In this way, for example, the different intensities can be matched to one another in order to stimulate excitation wavelengths
  • an illumination adjustment can also achieve intensity compensation between different fluorescence channels. Because only the amount of light that is required for optimal detection is always radiated in this way, the sample can be spared and aging too rapid can be prevented.
  • Orientation of the sample to be adjusted e.g. different positions in the sample are measured by e.g. in terms of their properties (e.g.
  • composition of the fluorophores) to identify protruding areas are an objective 214, a multi-band pass filter 215 and a tube lens 216
  • Data links that may be used in a microscope system 200 of the illustrated or other embodiments, in the form of mono- or bidirectional data links, and wired or wireless,
  • ro gby, gy Light rays red / orange, green / blue / yellow, green / yellow o, r, g, y, b Light rays orange, red, green, yellow, blue

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Abstract

Es wird eine Farbstrahlteileranordnung (100) mit einem ersten Strahlteilerprisma (A1), das eine erste Prismenfläche (A1-1), eine zweite Prismenfläche (A1-2), eine dritte Prismenfläche (A1-3) und eine vierte Prismenfläche (A1-4) aufweist, vorgeschlagen, wobei eine Ebene, in der die erste Prismenfläche (A1-1) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die zweite Prismenfläche (A1-2) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, eine Ebene, in der die dritte Prismenfläche (A1-3) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die vierte Prismenfläche (A1-4) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, die Ebene, in der die erste Prismenfläche (A1-1) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, einen stumpfen Winkel mit einem ersten Winkelbetrag mit der Ebene, in der die vierte Prismenfläche (A1-4) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, einschließt, die Ebene, in der die zweite Prismenfläche (A1-2) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, einen stumpfen Winkel mit dem ersten Winkelbetrag mit der Ebene, in der die dritte Prismenfläche (A1-4) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, einschließt, in oder parallel zu der Ebene, in der die erste Prismenfläche (A1-1) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, eine erste dichroitische Schicht (1) mit einer ersten spektralen Selektivität angeordnet ist, und in oder parallel zu der Ebene, in der die zweite Prismenfläche (A1-2) des ersten Strahlteilerprismas (A1) liegt, eine zweite dichroitische Schicht (1) mit einer zweiten spektralen Selektivität angeordnet ist. Ein entsprechendes Mikroskopsystem (200) und ein entsprechendes Verfahren sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Description

Farbstrahlteileranordnung, Mikroskopsystem und Verfahren zur mikroskopischen Abbildung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Farbstrahlteileranordnung, ein
Mikroskopsystem und ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung gemäß den jeweiligen Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche.
Stand der Technik
Die farbselektive Detektion ist für die Mikroskopie, insbesondere die
Fluoreszenzmikroskopie, von hoher Bedeutung, da hierbei häufig mehrere Farbstoffe gleichzeitig in einer Probe verwendet werden. Zur farbselektiven Detektion in der Fluoreszenzmikroskopie und der Mikroskopie generell sind aus dem Stand der Technik mehrere unterschiedliche Verfahren und Vorrichtungen bekannt. Grundsätzlich lässt sich zwischen einer sequenziellen und einer gleichzeitigen bzw. parallelen Detektion mehrerer Farben bzw. Farbkanäle unterscheiden. Wenngleich nachfolgend überwiegend auf die
Fluoreszenzmikroskopie Bezug genommen wird, gelten die entsprechenden Erläuterungen jedoch auch für andere mikroskopische Untersuchungsverfahren.
Für eine sequenzielle Detektion können Monochromkameras verwendet werden. Um sicherzustellen, dass mittels dieser jeweils lediglich ein Fluoreszenzkanal detektiert wird, erfolgt eine Auswahl des jeweils zu detektierenden
Fluoreszenzfarbstoffs beispielsweise durch das Einschalten eines jeweils passenden einbändigen Fluoreszenzteilerwürfels in die Auflichtachsenebene des Mikroskops. Auf diese Weise kann die jeweils korrekte Kombination aus
Anregungs- und Emissionswellenlängenbereich sichergestellt werden. Ein Wechsel zwischen unterschiedlichen Anregungs- und Detektionsmodalitäten ist jedoch hierbei vergleichsweise langsam. Die Umschaltzeit zwischen den jeweiligen Emissionswellenlängenbereichen beträgt typischerweise ca. 300 bis 400 ms, was sich insbesondere für die Untersuchung beweglicher Objekte wie insbesondere lebender Zellen häufig als nicht ausreichend schnell erweist.
Um eine schnellere Detektion unter Verwendung einer einzelnen
Monochromkamera zu ermöglichen, kann auch ein Mehrband- Fluoreszenzteilerwürfel eingesetzt werden, der alle in Frage kommenden
Anregungswellenlängenbereiche zur Probe und entsprechend alle in Frage kommenden Emissionswellenlängenbereiche zur Kamera gelangen lässt. Die Auswahl des jeweils detektierten Fluoreszenzfarbstoffs kann dabei über ein schnell schaltbares Emissionsfilterrad zwischen Mikroskop und Kamera erfolgen. Gleichzeitig wird über ein ebenfalls schnell schaltbares Anregungsfilterrad oder eine schnell modulierbare Lichtquelle (z.B. LED) die Anregung passend
ausgewählt. Als Nachteil an entsprechender Verfahren und Vorrichtungen bleibt ihre teilweise, insbesondere bei Lebendzellexperimenten, immer noch nicht ausreichend schnelle Schaltzeit zwischen den unterschiedlichen Anregungs- und Detektionsmodalitäten.
Zur gleichzeitigen Detektion können auch Farbkameras mit Bayer- oder Foveon- Sensoren verwendet werden. Dabei kann ein Mehrband-Fluoreszenzteilerwürfel eingesetzt werden, der wie bei der soeben beschriebenen schnellen sequenziellen Detektion alle in Frage kommenden Anregungswellenlängenbereiche zur Probe und alle in Frage kommenden Emissionswellenlängenbereiche zur Kamera gelangen lässt. Die Farbfähigkeit der Kamera lässt die Detektion der verschiedenen Emissionswellenlängenbereiche in verschiedenen Farbkanälen zu. Der Nachteil an entsprechenden Verfahren und Vorrichtungen ist jedoch die geringe
Detektionseffizienz, da jeder Kamerapixel nur einen Teil des in einem entsprechenden Bereich auftreffenden Beobachtungslichts detektieren kann: Bei einem Bayer-Sensor, in dem ein schachbrettartige Farbmaske eingesetzt wird, steht für die Detektion jeder einzelnen Farbe naturgemäß jeweils nur ein gewisser Teil der die Gesamtsensitivität ausschlaggebenden Sensorfläche zur Verfügung. Ungeachtet der aufgrund der fehlenden Farbmaske theoretisch höheren
Sensitivität eines Foveon-Sensors liefert dieser häufig in der Praxis keine Vorteile.
Zur gleichzeitigen Detektion können auch einzelne Monochromkameras eingesetzt werden. Wie zuvor kann dabei ein Mehrband-Fluoreszenzteilerwürfel eingesetzt werden, der alle in Frage kommenden Anregungswellenlängenbereiche zur Probe und alle in Frage kommenden Emissionswellenlängenbereiche zur Kamera gelangen lässt. Zwischen Mikroskop und Kamera wird jedoch ein optisches Zwischenmodul angeordnet, das das Zwischenbild des Mikroskops optional verkleinert und spektral teilt, so dass mehrere Kopien des Zwischenbildes in verschiedenen Spektralbereichen nebeneinander auf den Kamerasensor abgebildet werden. Zur spektralen Teilung werden in derartigen Anordnungen häufig wechselbare, dichroitische Teilerplättchen eingesetzt.
Schließlich können auch mehrere Monochromkameras zur Fluoreszenzdetektion eingesetzt werden. Wiederum kann ein Mehrband-Fluoreszenzteilerwürfel eingesetzt werden, der alle in Frage kommenden Anregungswellenlängenbereiche zur Probe und alle in Frage kommenden Emissionswellenlängenbereiche zu den Kameras gelangen lässt. Zwischen Mikroskop und Kamera wird hier ein optisches Zwischenmodul angeordnet, das das Zwischenbild des Mikroskops spektral teilt, so dass verschiedene Spektralbereiche auf verschiedene Kameras abgebildet werden. Auch hier können wechselbare, dichroitische Teilerplättchen bzw.
entsprechende Teilerschichten eingesetzt werden.
Verfahren und Vorrichtungen der soeben beschriebenen Art sind unter anderem aus der WO 2016/166374 Al und der WO 2016/166375 Al der Anmelderin bekannt. Generell können zur spektralen Aufteilung des Zwischenbilds in entsprechenden Verfahren und Anordnungen Farbstrahlteileranordnungen eingesetzt werden, die insbesondere seit geraumer Zeit aus dem Bereich der Farbfernsehtechnik bekannt sind, die jedoch insbesondere in der Mikroskopie jeweils bestimmte Nachteile aufweisen können.
So führt beispielsweise ein sogenanntes Philips-Prisma, wie es in der
US 3,659,918 A und der US 4,084,180 A für den Einsatz für eine
Farbfernsehkamera beschrieben ist, zu einer verhältnismäßig langen optischen Wegstrecke in Glas. Ferner kann das Licht mittels eines Philips-Prismas nur in insgesamt drei Kanäle aufgeteilt werden. Ein weiterer Nachteil wird bei
Betrachtung der Figur 1 der US 4,084,180 A erkennbar, auf die sich die in diesem Absatz verwendeten Bezugszeichen beziehen, und auf die hier ausdrücklich verwiesen wird. Während hier der Strahl rl nach der Reflexion an der Schicht 2 an der Grundfläche des Prismas A totalreflektiert werden kann und somit im ldealfall keine verspiegelnde Beschichtung notwendig ist, muss für Strahl r2 die
Grenzfläche bei Transmission von A nach B zunächst durchlässig sein, dann aber für das an der Schicht 1 reflektierte Licht reflektierend wirken. Eine entsprechende Beschichtung kann zu beträchtlichen Lichtverlusten durch Streuung führen.
Ein aus der US 2009/0323192 Al bekannter Farbstrahlteiler kann aufgrund seiner Größe zu Bauraumproblemen führen und weist ebenfalls den Nachteil langer Glaswege auf. Aufgrund der Vielzahl verwendeter optischer Elemente ist die Herstellung und Justage aufwendig und teuer. Die Vielzahl an Grenzflächen kann ebenfalls zu Lichtverlusten und Streuung führen.
Aus der DE 10 2008 062 791 Al ist ein Mikroskop mit einem
Strahlteilerwürfel (einem sogenannten X-Cube) bekannt, der insgesamt vier Prismen umfasst. Eine entsprechende Anordnung für eine Kamera ist auch beispielsweise in der US 8,988,564 B2 gezeigt. Die in dem Strahlteilerwürfel unter 45° erfolgende Ablenkung ist allerdings sehr stark polarisationsabhängig und damit nachteilig. Auch kann die Positionierung von Prismenkanten im
Strahlengang zu Streuung und Lichtverlusten führen.
Andere Farbstrahlteilereinrichtungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, erfordern weitere aufwendige Komponenten wie beispielsweise eine
Relayoptik, oder sind insbesondere aus baulichen oder optischen Gründen für den Einsatz in der Mikroskopie untauglich oder nachteilig.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist vor diesem Hintergrund, eine zeitgleiche, multispektrale, weitgehend verlustfreie Aufnahme mehrerer unterschiedlicher Fluorophore in einem Mikroskop zu ermöglichen lnsbesondere soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Detektormodul für ein Mikroskopsystem bereitgestellt werden, das mit einer entsprechenden Farbstrahlteileranordnung ausgestattet ist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung eines Mikroskopsystems, das für eine entsprechende Aufnahme eingerichtet ist, und das eine verbesserte Abbildung eine mikroskopischen Probe, die mit mehreren unterschiedlichen Fluorophoren oder anderen Farbstoffen markiert ist, ermöglicht.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund schlägt die vorliegende Erfindung eine
Farbstrahlteileranordnung, ein Mikroskopsystem und ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung mit den Merkmalen der jeweiligen unabhängigen Patentansprüche vor. Bevorzugte Ausgestaltungen sind jeweils Gegenstand der abhängigen Patentansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Die vorliegende Erfindung schlägt zunächst eine Farbstrahlteileranordnung vor, die sich insbesondere zum Einsatz als Teil eines Mehrkameramoduls bzw. einer entsprechenden Detektionseinheit mit mehreren Monochromkameras zur parallelen Detektion eignet. Ein entsprechendes Mehrkameramodul umfasst dabei insbesondere einen optischen Kameraadapter, der an einem Kameraabgang eines Mikroskops anbringbar ist, sowie mehrere Ausgänge zur Ankopplung mehrerer Monochromkameras bzw. die entsprechenden Kameras selbst. Nachfolgend werden die Begriffe„Detektoren",„Kameras" und„Sensoren" synonym verwendet. Es handelt sich jeweils um Pixelsensoren der unten erläuterten Art. Die spektrale Aufteilung von Beobachtungslicht des Mikroskops erfolgt über nachfolgend im Detail erläuterte Prismen in der Farbstrahlteileranordnung, wobei jeweils
Prismen, nachfolgend als Strahlteilerprismen bezeichnet, mit zueinander unterschiedliche spektrale Selektivitäten aufweisenden dichroitischen Schichten bzw. Beschichtungen vorgesehen sind. Durch ein entsprechendes Mikroskop und eine zugehörige Detektionseinheit mit der nachfolgend im Detail erläuterten Farbstrahlteileranordnung wird ein erfindungsgemäßes Mikroskopsystem geschaffen, das sich für die erwähnten Zwecke eignet.
Der optische Kameraadapter kann insbesondere derart ausgebildet sein, dass er das Zwischenbild des Mikroskops so weit vergrößert, dass es der Sensorgröße der verwendeten Kameras zumindest weitgehend entspricht. Er weist insbesondere eine Schlussschnittweite auf, die groß genug ist, um die Prismenanordnung zwischen Kameraadapter und Kamera einbauen zu können. Falls keine
Vergrößerungsanpassung erforderlich ist, kann der Kameraadapter auch nur aus einem rein mechanischen Element zum Einhalten des korrekten Abstandes zu den Kameras bestehen.
Die vorliegende Erfindung schlägt eine Farbstrahlteileranordnung mit zumindest einem („ersten") Strahlteilerprisma vor. Das erste Strahlteilerprisma weist eine erste Prismenfläche, eine zweite Prismenfläche, eine dritte Prismenfläche und eine vierte Prismenfläche auf, wobei eine Ebene, in der die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die zweite Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, eine Ebene, in der die dritte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die vierte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, die Ebene, in der die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, einen stumpfen Winkel mit einem ersten Winkelbetrag, nachfolgend mit u bezeichnet, mit der Ebene, in der die vierte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, einschließt, die Ebene, in der die zweite Prismenfläche des ersten
Strahlteilerprismas liegt, einen stumpfen Winkel mit dem ersten Winkelbetrag u mit der Ebene, in der die dritte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, einschließt, in oder parallel zu der Ebene, in der die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, eine erste dichroitische Schicht mit einer ersten spektralen Selektivität angeordnet ist, und in oder parallel zu der Ebene, in der die zweite Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas liegt, eine zweite dichroitische Schicht mit einer zweiten spektralen Selektivität angeordnet ist.
Auf die erste und die zweite Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas sind also jeweils dichroitische Schichten mit voneinander abweichenden spektralen
Selektivitäten aufgebracht oder entsprechende Schichten sind separat dazu bereitgestellt. Eine dichroitische Schicht kann insbesondere in Form einer oder mehrerer Metalloxidschichten auf ein Prisma bzw. eine Prismenfläche aufgebracht sein. Die Begriffe„Schicht" und„Beschichtung" werden dabei hier synonym verwendet. Es ist grundsätzlich aber auch möglich, separate, beispielsweise planparallele, Elemente mit entsprechenden dichroitischen Schichten
bereitzustellen, auf die dann ihrerseits die dichroitischen Schichten aufgebracht sind. Entsprechende separate Elemente können in einem definierten Abstand von beispielsweise 5 Mikrometern oder weniger zu den jeweiligen Prismenflächen angeordnet sein. Durch eine entsprechende Anordnung, in der ein Luftspalt zwischen der dichroitischen Schicht und der entsprechenden Prismenfläche ausgebildet wird, und damit ein starker Unterschied in den Brechungsindices besteht, lässt sich ggf. die Strahlteilung vorteilhaft gestalten. lnsgesamt werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung damit zumindest zwei dichroitische Schichten mit voneinander abweichenden spektralen Selektivitäten eingesetzt, die jeweils auf bzw. parallel zu einander gegenüberliegenden parallelen Flächen eines Strahlteilerprismas ausgebildet sind. Wie nachfolgend erläutert, kann auf diese Weise eine Farbstrahlteilung in drei Kanäle erfolgen.
Durch die erfindungsgemäß vorgeschlagene Farbstrahlteileranordnung kann poly- oder multichromatisches Licht, allgemeiner Licht mit mehreren
Wellenlängenanteilen, also in zumindest drei Teilkanäle aufgespalten werden, die zur simultanen bzw. parallelen Detektion unterschiedlichen Kameras zugeführt werden können. Die Kameras können insbesondere als Monochromkameras ausgebildet sein, wobei nachfolgend unter dem Begriff„Kamera" auch ein Detektor oder Sensor verstanden wird, der ohne die üblicherweise vorhandenen
Bestandteile einer Kamera, d.h. Verschluss, Objektiv und dergleichen, ausgebildet sein kann. Als wesentlichen Bestandteil weist ein derartiger Detektor jedoch einen lichtempfindlichen und digitalen Sensor auf. Die erfindungsgemäß vorgeschlagene Farbstrahlteileranordnung und die Kameras bzw. Sensoren sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere als Teil einer Detektionseinheit ausgebildet.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist die Farbstrahlteileranordnung mit einem zweiten Strahlteilerprisma ausgebildet, das in Teilen vergleichbar mit dem ersten Strahlteilerprisma aufgebaut ist, und das daher mit weitgehend ähnlichen Fertigungsschritten hergestellt werden kann wie das erste Strahlteilerprisma. Es weist eine erste Prismenfläche, eine zweite Prismenfläche, eine dritte Prismenfläche und eine vierte Prismenfläche auf, wobei eine Ebene, in der die erste Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die zweite Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas liegt, die Ebene, in der die erste Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas liegt, einen stumpfen Winkel mit dem erwähnten ersten Winkelbetrag u mit einer Ebene, in der die vierte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas liegt, einschließt, die Ebene, in der die zweite Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas liegt, einen stumpfen Winkel mit einem zweiten, kleineren Winkelbetrag als der erste Winkelbetrag, hier mit v bezeichnet, mit einer Ebene, in der die dritte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas liegt, einschließt, in oder parallel zu der Ebene, in der die erste Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas liegt, eine dritte dichroitische Schicht mit einer dritten spektralen Selektivität angeordnet ist, und in oder parallel zu der Ebene, in der die zweite Prismenfläche des zweiten
Strahlteilerprismas liegt, eine vierte dichroitische Schicht mit einer vierten spektralen Selektivität angeordnet ist. lm Gegensatz zu dem ersten
Strahlteilerprisma sind also bei dem zweiten Strahlteilerprisma die dritte und vierte Prismenfläche nicht parallel zueinander angeordnet. Das zweite
Strahlteilerprisma unterscheidet sich von dem ersten Strahlteilerprisma dabei insbesondere durch die abweichende Ausbildung der dritten Prismenfläche. ln dieser Ausgestaltung der Erfindung kann eine Farbstrahlteilung in fünf spektrale Kanäle erfolgen. Die vorliegende Erfindung bzw. die soeben erläuterte Ausführungsform beschränkt sich jedoch nicht auf die Anordnung mit nur einem ersten und einem zweiten Strahlteilerprisma. Vielmehr können auch weitere Strahlteilerprismen eingesetzt werden. Diese können gegenüber den erläuterten zwei Strahlteilerprismen in beliebiger Weise angeordnet, beispielsweise um eine gemeinsame Achse verdreht, sein. Die Aufspaltung in die spektralen Kanäle bzw. deren maximale Anzahl ergibt sich dabei gemäß 1 + 2n, wobei n die Zahl der Strahlteilerprismen darstellt. Beispielsweise lässt sich also unter Verwendung von drei entsprechenden Strahlteilerprismen eine Aufspaltung in sieben spektrale Kanäle vornehmen.
Werden zwei oder mehr Strahlteilerprismen eingesetzt, die die erläuterten ersten und zweiten Strahlteilerprismen umfassen, können gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das erste und das zweite
Strahlteilerprisma derart hintereinander angeordnet werden, dass die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die dritte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas in einer gemeinsamen Ebene oder parallel zueinander angeordnet sind, und dass eine gemeinsame optische Achse schräg durch ihre ersten Prismenflächen und nicht durch ihre zweiten Prismenflächen verläuft. Die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die dritte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas können dabei in Flächenkontakt stehen oder auch miteinander verkittet sein, es ist jedoch auch möglich, diese in einem definierten Abstand zueinander anzuordnen. Die genannten Prismenflächen und sämtliche der nachfolgend erläuterten, in einer gemeinsamen Ebene oder parallel zueinander angeordneten Prismenflächen können also auch mit einem zwischenliegenden Luftspalt angeordnet sein, der idealerweise nur eine geringe Dicke, beispielsweise von 5 bis 100 Mikrometern, aufweist. Dies ist, wie bereits erwähnt, ggf. besonders vorteilhaft, da eine dichroitische Strahlteilerschicht an einer Grenzfläche mit einem großen Sprung im Brechungsindex einfacher mit besseren Eigenschaften zu realisieren ist. Grundsätzlich können auch planparallele transparente Elemente zwischengeschaltet sein. lnsgesamt werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemäß der soeben erläuterten Ausgestaltung damit vier dichroitische Schichten mit voneinander abweichenden spektralen Selektivitäten eingesetzt, die jeweils auf einander gegenüberliegenden parallelen Flächen des ersten und des zweiten
Strahlteilerprismas ausgebildet bzw. parallel dazu angeordnet sind. Nachfolgend wird der Einfachheit halber, jedoch ohne entsprechende Möglichkeiten
einzuschränken, von dichroitischen Schichten„der" Prismenflächen oder„auf den" Prismenflächen gesprochen, auch wenn entsprechende dichroitische Schichten parallel dazu angeordnet sind. Auf diese Weise kann mittels dieser dichroitischen Schichten eine Farbstrahlteilung in fünf Kanäle erfolgen. Die entsprechenden Flächen sind dabei jeweils in einem Winkel gegenüber einer gemeinsamen Achse, die insbesondere die optische Hauptachse der Farbstrahlteileranordnung darstellt, geneigt. Die gemeinsame Achse tritt dabei jeweils durch die ersten Prismenflächen, nicht jedoch durch die zweiten Prismenflächen, der beiden Strahlteilerprismen.
Nachfolgend wird die Strahlteilung in einer entsprechenden, aus zwei
Strahlteilerprismen ausgebildeten Farbstrahlteileranordnung näher erläutert. Die Strahlteilung mittels nur eines Strahlteilerprismas bzw. mittels mehr als zwei Strahlteilerprismen ergibt sich entsprechend.
Das poly- oder multichromatische Licht (nachfolgend auch als„Gesamtlicht" bezeichnet) wird dabei zunächst entlang der gemeinsamen Achse, insbesondere zentriert zu dieser und insbesondere konvergent, in das erste Strahlteilerprisma eingestrahlt, und zwar insbesondere über die bereits erwähnte und nachfolgend weiter erläuterte, senkrecht zu der gemeinsamen Achse stehende dritte
Prismenfläche. Das Gesamtlicht trifft sodann, insbesondere weiterhin entlang der gemeinsamen Achse, auf die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und wird dort entsprechend der spektralen Selektivität der hier vorgesehenen ersten dichroitischen Schicht spektral aufgespalten.
Ein Anteil des auf die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitische Schicht treffenden Gesamtlichts wird an der ersten
Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitischer Schicht auf die zweite Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas reflektiert. Dieser an der ersten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitischer Schicht reflektierte Anteil trifft auf der zweiten Prismenfläche des ersten
Strahlteilerprismas erneut auf eine entsprechende dichroitische Schicht und wird entsprechend der spektralen Selektivität dieser dichroitischen Schicht der zweiten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas spektral aufgespalten.
Ein Anteil wird an der zweiten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitischer Schicht reflektiert, tritt vorzugsweise über die erwähnte und nachfolgend weitere erläuterte vierte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas aus diesem aus und kann, insbesondere nach Durchlaufen eines oder mehrerer weiterer Prismen, über eine entsprechend angeordnete Kamera detektiert werden. Nicht an der zweiten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitischer Schicht reflektiertes Licht tritt durch die zweite Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitische Schicht und kann, insbesondere nach Durchlaufen eines oder mehrerer weiterer Prismen, ebenfalls über eine entsprechend angeordnete Kamera detektiert werden.
Ein nicht bereits an der ersten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitischer Schicht reflektierter Anteil des Gesamtlichts tritt durch die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitische Schicht und wird, insbesondere weiterhin entlang der gemeinsamen Achse, und über die bereits erwähnte und nachfolgend weiter erläuterte dritte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas, die parallel zu oder in einer gemeinsamen Ebene mit der zweiten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas angeordnet ist, in das zweite Strahlteilerprisma eingestrahlt.
Das in das zweite Strahlteilerprisma eingestrahlte Licht trifft sodann, insbesondere weiterhin entlang der gemeinsamen Achse, auf die erste Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. die hier vorgesehene dichroitische Schicht.
Wiederum wird entsprechend der spektralen Selektivität dieser dichroitische Beschichtung ein Teil des auf die erste Prismenfläche des zweiten
Strahlteilerprismas bzw. die hier vorgesehene dichroitische Schicht treffenden Lichts ein Teil reflektiert und trifft daher auf die zweite Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. die auf der zweiten Prismenfläche des zweiten
Strahlteilerprismas vorgesehene dichroitische Schicht.
Ein Teil des auf die zweite Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. die hier vorgesehene dichroitische Schicht reflektierten Lichts wird entsprechend der spektralen Selektivität dieser dichroitischen Schicht reflektiert und insbesondere über die erwähnte und nachfolgend weiter erläuterte vierte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas aus dem zweiten Strahlteilerprisma ausgestrahlt. Ein weiterer Anteil der auf die zweite Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. die hier vorgesehene dichroitische Schicht reflektierten Lichts durchdringt diese und wird ebenfalls aus dem zweiten Strahlteilerprisma ausgestrahlt. Beide aus dem zweiten Strahlteilerprisma ausgestrahlte Lichtanteile können, insbesondere nach dem Durchlaufen eines oder mehrerer weiterer Prismen, mittels entsprechender Kameras detektiert werden.
Das nicht an der ersten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. der hier vorgesehenen dichroitischen Schicht reflektierte Licht durchdringt diese erste Prismenfläche bzw. dichroitische Schicht und kann ebenfalls, insbesondere nach dem Durchlaufen eines oder mehrerer weiterer Prismen, mittels einer
entsprechenden monochromen oder anderen Kamera erfasst werden.
Wie nachfolgend erläutert, kann das erste Strahlteilerprisma gemäß der vorliegenden Erfindung auf besonders einfache, zuverlässige und kostengünstige Weise unter Verwendung quaderförmiger Blöcke aus Glas oder anderem transparenten Material (nachfolgend vereinfacht als„Glasblöcke" bezeichnet) hergestellt werden. Auch das zweite sowie jedes weitere, falls vorhanden,
Strahlteilerprisma kann entsprechen hergestellt sein. Entsprechende
quaderförmige Glasblöcke können insbesondere an einander diagonal
gegenüberliegenden Kanten jeweils unter Erhalt der zweiten Prismenflächen abgeschrägt bzw. abgekantet werden. Hierbei können auch insbesondere jeweils zwei Dreiecksprismen erzeugt werden, die wie nachfolgend erläutert, an anderer Stelle der Farbstrahlteileranordnung zum Einsatz kommen können. Auf diese Weise lassen sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung Material sparen und die Fertigungs Vorgänge durch eine Reduktion von Verfahrensschritten vereinfachen.
Zu weiteren Erläuterungen sei in diesem Zusammenhang ausdrücklich auf die beigefügten Zeichnungen, insbesondere die Figuren 3 und 7, verwiesen, in denen entsprechende Strahlteilerprismen und ihre jeweiligen Prismenflächen im Detail veranschaulicht sind.
Vorzugsweise steht der Winkelbetrag v, der den zweiten stumpfen Winkel angibt, den die zweite und die dritte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. entsprechende Ebenen, in denen diese Prismenflächen liegen, einschließen, mit dem Winkelbetrag u, der den ersten stumpfen Winkel angibt, den jeweils die erste und die vierte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die erste und die vierte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. entsprechende Ebenen, in denen diese Prismenflächen liegen, einschließen, gemäß v = u - (180° - u) in Beziehung. Durch die Verwendung entsprechender Prismeninnenwinkel kann, wie auch nachfolgend noch erläutert, das zweite Strahlteilerprisma auf das erste Strahlteilerprisma aufgesetzt werden, indem die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas mit der dritten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas parallel oder in einer gemeinsamen Ebene angeordnet wird.
Der erste Winkelbetrag u, der den stumpfen Winkel angibt, den jeweils die erste und die vierte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die erste und die vierte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. entsprechende Ebenen einschließen, beträgt gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung 145° bis 165°, insbesondere 150° bis 160°, vorzugsweise 157,5°. Durch die Verwendung eines derartigen Winkels, der, wie nachfolgend erläutert, auch den jeweiligen Auftreffwinkel des Lichts auf die erste Prismenfläche des ersten bzw. zweiten Strahlteilerprismas und damit auch den jeweiligen Auftreffwinkel entsprechender Lichtanteile auf die zweite Prismenfläche des ersten bzw. zweiten Strahlteilerprismas definiert, kann die in herkömmlichen Anordnungen, insbesondere dem sogenannten X-Cube, gegebene Abhängigkeit der Reflexion von der Polarisation weitgehend vermieden werden, weil das Licht steiler auf eine entsprechende dichroitische Schicht trifft.
Für den Auftreffwinkel des Lichts auf die erste Prismenfläche des ersten bzw. zweiten Strahlteilerprismas ergibt sich bei einer entsprechenden Anordnung der Strahlteilerprismen, d.h. wenn das Licht senkrecht zu der dritten Prismenfläche in diese eingestrahlt wird, jeweils ein Winkelbetrag von t = 180° - u.
Wie bereits mehrfach erwähnt, lassen sich das erste (und das zweite
Strahlteilerprisma, falls vorhanden) gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung anhand eines quaderförmigen Glasblocks beschreiben, von dem zwei diagonal gegenüberliegende Kanten unter Erhalt der jeweils ersten und zweiten Prismenflächen abgeschrägt bzw. abgekantet sind lm Falle des zweiten Strahlteilerprismas, falls vorhanden, ist eine weitere Kante abgeschrägt bzw. abgekantet. Auch eine Herstellung entsprechender
Strahlteilerprismen unter Verwendung quaderförmiger Glasblöcke ist möglich.
Dabei umfasst das erste Strahlteilerprisma vorteilhafterweise eine fünfte
Prismenfläche und eine zu seiner fünften Prismenfläche parallele sechste
Prismenfläche, wobei die dritte und die fünfte Prismenfläche des ersten
Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen rechten Winkel einschließen, wobei die vierte und die sechste Prismenfläche des ersten
Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen rechten Winkel einschließen, wobei die erste und die fünfte Prismenfläche des ersten
Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen stumpfen Winkel mit einem Winkelbetrag w einschließen, und wobei die zweite und die sechste
Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen stumpfen Prismeninnenwinkel mit dem Winkelbetrag w einschließen. Der Winkelbetrag w, der den stumpfen Winkel angibt, den jeweils die erste und die fünfte Prismenfläche und die zweite und die sechste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas bzw. entsprechende Ebenen einschließen, steht dabei mit dem ersten Winkelbetrag u, der den stumpfen Winkel angibt, den jeweils die erste und die vierte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die erste und die vierte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. entsprechende Ebenen einschließen, gemäß w = 90° + (180° - u) in Beziehung. ln der zuvor erläuterten Beschreibung über einen bzw. der zuvor erläuterten Herstellung aus einem quaderförmigen Glasblock stellen dabei die dritte, die vierte, die fünfte und die sechste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas erhalten gebliebene Quaderflächen dar, wobei die dritte und fünfte Prismenfläche einerseits und die vierte und sechste Prismenfläche andererseits jeweils mit ihren rechten Winkeln, in denen sie zueinander stehen, einander diagonal gegenüberliegende Quaderkanten definieren. ln entsprechender Weise umfasst das zweite Strahlteilerprisma, falls vorhanden, vorzugsweise eine fünfte Prismenfläche und eine zu seiner fünften Prismenfläche parallele sechste Prismenfläche, wobei die dritte und die fünfte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen stumpfen Winkel mit dem bereits bezüglich des ersten Strahlteilerprismas erläuterten Winkelbetrag w einschließen, wobei die erste und die fünfte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen stumpfen Winkel mit dem Winkelbetrag w einschließen, wobei die vierte und die sechste Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen rechten Winkel einschließen, und wobei die zweite und die sechste
Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. Ebenen, in denen diese liegen, einen Winkel mit dem Winkelbetrag w einschließen lm Unterschied zu dem ersten Strahlteilerprisma ist bei dem zweiten Strahlteilerprisma, wie bereits oben erwähnt, die dritte Prismenfläche also abweichend angeordnet, d.h. bezogen auf einen quaderförmigen Glasblock, ebenfalls abgeschrägt.
Die erläuterten Strahlteilerprismen sind vorteilhafterweise derart in der
Farbstrahlteileranordnung angeordnet, dass ein kleinster Winkel zwischen der ersten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und der gemeinsamen Achse und ein kleinster Winkel zwischen der ersten Prismenfläche des zweiten
Strahlteilerprismas und der gemeinsamen Achse jeweils einen Winkelbetrag x aufweisen. Dieser Winkelbetrag x steht dabei mit dem mehrfach zuvor erwähnten Winkelbetrag a, der den stumpfen Winkel angibt, den jeweils die erste und die vierte Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die erste und die vierte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. entsprechende Ebenen einschließen, gemäß x = u - 90° in Beziehung. Weiter vorteilhafterweise sind, wie ebenfalls bereits erwähnt, die erste Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die dritte Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas zueinander parallel angeordnet. Vorzugsweise stehen sind diese Prismenflächen parallel zueinander oder in einer gemeinsamen Ebene angeordnet.
Die erfindungsgemäße Farbstrahlteileranordnung weist vorteilhafterweise ein oder mehrere Dreiecksprismen mit jeweils einer ersten, einer zweiten und einer dritten Prismenfläche auf, wobei die erste und die zweite Prismenfläche des oder der Dreiecksprismen jeweils in Ebenen liegen, die einen spitzen Winkel mit einem Winkelbetrag y zueinander einschließen, der mit dem Winkelbetrag u gemäß y = 180° - u in Beziehung steht, und wobei die erste Prismenfläche des oder eines der Dreiecksprismen in einer gemeinsamen Ebene mit oder parallel zu der zweiten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und/oder die erste Prismenfläche des oder eines der Dreiecksprismen in einer gemeinsamen Ebene mit oder parallel zu der ersten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas und/oder die erste Prismenfläche des oder eines der Dreiecksprismen in einer gemeinsamen Ebene mit oder parallel zu der zweiten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas angeordnet ist. lnsbesondere sind dabei ein erstes, ein zweites und ein drittes Dreiecksprisma vorgesehen, die jeweils die erste, die zweite und eine dritte Prismenfläche umfassen. Hierbei schließen die zweite und die dritte Prismenfläche der Dreiecksprismen bzw. Ebenen, in denen diese Prismenflächen liegen, jeweils einen rechten Winkel und die dritte und die erste Prismenfläche der
Dreiecksprismen bzw. die entsprechenden Ebenen jeweils einen zur Winkelsumme von 180° verbleibenden spitzen Winkel ein. lnsbesondere lassen sich derartige Dreiecksprismen daher jeweils durch das Abschrägen bzw. Abkanten einander diagonal gegenüberliegender Kanten eines quaderförmigen Glasblocks unter Erhalt der ersten und zweiten Prismenflächen gewinnen. Eine derartige
Herstellung ist jedoch explizit keine Voraussetzung zur Herstellung des ersten und des zweiten Strahlteilerprismas bzw. der entsprechenden Dreiecksprismen.
Vorteilhafterweise ist dabei in einer Anordnung mit dem ersten und dem zweiten Strahlteilerprisma die erste Prismenfläche des ersten Dreiecksprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas, die erste Prismenfläche des zweiten Dreiecksprismas parallel zu der ersten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas und die erste Prismenfläche des dritten Dreiecksprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas angeordnet, wobei die jeweils parallel angeordneten Prismenflächen in einer gemeinsamen Ebene oder parallel zueinander angeordnet sind. Wie auch insbesondere unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert, kann auf diese Weise erreicht werden, dass die jeweils an der zweiten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas, der zweiten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. der ersten Prismenfläche des zweiten Strahlteilerprismas bzw. deren dichroitischen Schichten nicht reflektierten und damit die entsprechenden
Prismenflächen bzw. die entsprechenden dichroitischen Schichten
durchstrahlenden Lichtanteile über eine senkrecht zur Strahlachse verlaufende Glasfläche in jeweils nachgeordnete Prismen bzw. zu einer entsprechenden Kamera gelangen können. lnsbesondere zur Erzielung gleicher bzw. aneinander angepasster Strahlwege in Glas bezüglich der jeweils unter Verwendung der Prismenflächen bzw.
dichroitischen Schichten gebildeten Teilstrahlengänge weist die
Farbstrahlteileranordnung gemäß der soeben erläuterten Ausführungsform vorteilhafterweise ein oder mehrere Quaderprismen auf, wobei das oder zumindest eines der Quaderprismen jeweils dem oder einem der Dreiecksprismen zugeordnet ist oder sind. Die Quaderprismen können insbesondere auch als Würfelprismen ausgebildet sein lhre konkrete Ausgestaltung richtet sich insbesondere nach der Geometrie der verwendeten Kameras bzw. Sensoren. lnsbesondere weist die Farbstrahlteileranordnung ein erstes, ein zweites, ein drittes, ein viertes und ein fünftes Quader- bzw. Würfelprisma auf. Die Quader- Würfelprismen sind in geeigneter Größe ausgebildet und weisen jeweils eine erste Prismenfläche und eine zu der ersten Prismenfläche parallele zweite
Prismenfläche auf. Die erste Prismenfläche des ersten Quader- bzw. Würfelprismas ist dabei in der zuvor erläuterten Anordnung mit einem ersten, einem zweiten und einem dritten Dreiecksprisma parallel zu der zweiten Prismenfläche des ersten Dreiecksprismas, die erste Prismenfläche des zweiten Quader- bzw. Würfelprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des zweiten Dreiecksprismas, die erste Prismenfläche des dritten Quader- bzw. Würfelprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des dritten Dreiecksprismas, die erste Prismenfläche des vierten Quader- bzw. Würfelprismas parallel zu der vierten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas und die erste Prismenfläche des fünften Quader- bzw.
Würfelprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des ersten Quader- bzw. Würfelprismas angeordnet. Die jeweils erwähnten, parallel zueinander
angeordneten Prismenflächen sind in einer gemeinsamen Ebene oder parallel zueinander angeordnet. Anstelle der Quader- bzw. Würfelprismen können auch andere Prismen zum Einsatz kommen, die entsprechende Strahlwege bilden, und zusätzliche Prismen vorhanden sein.
Alternativ zu der soeben erläuterten Verwendung von fünf Quader- bzw.
Würfelprismen können in einer entsprechenden Anordnung auch nur drei Quader- bzw. Würfelprismen und zusätzlich zwei Halbquader- bzw. Halbwürfelprismen zum Einsatz kommen. Das erste, das zweite und das dritte Quader- bzw.
Würfelprisma weisen dabei jeweils eine erste Prismenfläche und eine zu der ersten Prismenfläche parallele zweite Prismenfläche auf. Die Halbquader- bzw. Halbwürfelprismen weisen jeweils eine erste Prismenfläche und eine zu der ersten Prismenfläche im rechten Winkel angeordnete zweite Prismenfläche auf. Die erste Prismenfläche des ersten Quader- bzw. Würfelprismas ist dabei parallel zu der zweiten Prismenfläche des zweiten Dreiecksprismas, die erste Prismenfläche des zweiten Quader- bzw. Würfelprismas parallel zu der vierten Prismenfläche des ersten Strahlteilerprismas, die erste Prismenfläche des ersten Halbquader- bzw. Halbwürfelprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des ersten
Dreiecksprismas, die erste Prismenfläche des zweiten Halbquader- bzw.
Halbwürfelprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des dritten
Dreiecksprismas und die erste Prismenfläche des dritten Quader- bzw.
Würfelprismas parallel zu der zweiten Prismenfläche des ersten Halbquader- bzw. Halbwürfelprismas angeordnet. Auch hier sind jeweils erwähnten, parallel angeordneten Prismenflächen parallel zueinander oder in einer gemeinsamen Ebene angeordnet.
Sämtliche der vorstehend benannten Prismenflächen, d.h. die ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Prismenflächen des ersten und des zweiten Strahlteilerprismas, die ersten, zweiten und dritten Prismenflächen der
Dreiecksprismen, die ersten und zweiten Prismenflächen der Quader- bzw.
Würfelprismen und die ersten und zweiten Prismenflächen der Halbquader- bzw. Halbwürfelprismen, soweit jeweils vorhanden, sind jeweils senkrecht zu einer Bezugsebene angeordnet, in der insbesondere auch die gemeinsame Achse verlaufen kann. Die erwähnten Prismen weisen dabei weitere, insbesondere parallel zu der Bezugsebene angeordnete Prismenflächen auf. lst dabei zuvor und nachfolgend von„Dreiecksprismen" die Rede, handelt es sich hierbei um solche Prismen, die in Draufsicht auf die Bezugsebene einen dreieckigen Querschnitt aufweisen, wobei die lnnenwinkel eines entsprechenden Dreiecks jeweils zuvor den erläuterten Winkeln entsprechen. Bei einem„Würfelprisma" handelt es sich um Glasblöcke, die sechs identisch bemaßte Flächen aufweisen, von denen jeweils zwei zueinander parallel angeordnet sind. Ein Würfelprisma stellt damit eine Sonderform eines„Quaderprismas" dar, bei dem die jeweils einander
gegenüberliegenden Flächen, nicht notwendigerweise jedoch aneinander angrenzende Flächen, identisch bemaßt sind lm hier verwendeten
Sprachgebrauch handelt es sich bei einem„Halbquader-" bzw.„Halbwürfelprisma" um ein Quader-bzw. Würfelprisma, das diagonal halbiert ist. Zu den
Prismenbezeichnungen sei ergänzend auf die einschlägige Fachliteratur verwiesen.
Ein Mikroskopsystem zur mikroskopischen Abbildung einer Probe ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dieses umfasst eine Detektionseinheit, die insbesondere modular, also als über entsprechende Kopplungsmittel koppelbare und entfernbare Einheit, ausgebildet sein kann und die ferner eine Farbstrahlteileranordnung, insbesondere eine Farbstrahlteileranordnung, wie sie zuvor in bevorzugten Ausführungsformen erläutert wurde, aufweist. Die
Detektionseinheit des erfindungsgemäßen Mikroskopsystems weist ferner mehrere Sensoren auf. Das erfindungsgemäße Mikroskopsystem ist mit einer Beleuchtungseinheit ausgestattet, die nach Maßgabe einer Ansteuerung durch eine Steuereinheit Licht auf die Probe einstrahlt.
Das Mikroskopsystem ist ferner derart ausgebildet, dass es von der Probe abgestrahltes Licht mit mehreren unterschiedlichen Wellenlängenanteilen in die Farbstrahlteileranordnung einstrahlt, dieses Licht mittels der
Farbstrahlteileranordnung in die unterschiedlichen Wellenlängenanteile zerlegt, und die unterschiedlichen Wellenlängenanteile jeweils auf einen der Sensoren in der Detektionseinheit führt. Ferner erfasst das Mikroskopsystem mittels der Sensoren Einzelbilddaten, wertet die Einzelbilddaten und/oder unter Verwendung der Einzelbilddaten erzeugte Bilddaten mittels einer Recheneinheit aus, und steuert die Beleuchtungseinheit und/oder die Detektionseinheit auf Grundlage der Auswertung mittels der Steuereinheit an.
Zur Durchführung der angegebenen Maßnahmen weist das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mikroskopsystem die jeweils erforderlichen elektronischen, optischen und/oder mechanischen Mittel auf, die jeweils zur Durchführung dieser Maßnahmen eingerichtet sind.
Durch die Auswertung der Einzelbilddaten in dem erfindungsgemäß
vorgeschlagenen Mikroskopsystem, in der die jeweiligen spektralen Kanäle individuell und insbesondere getrennt voneinander betrachtet werden können, ist es insbesondere möglich, eine gezielte Anpassung von Beleuchtungs- und/oder Detektionsparametern vorzunehmen. Auch eine Auswertung eines aus
Einzelbilddaten zusammengesetzten Bilds ist grundsätzlich möglich.
Beispielsweise kann dann, wenn erkannt wird, dass ein Fluorophor in einer mikroskopischen Probe eine übermäßig starke Emissionsintensität zeigt, das entsprechende Anregungslicht reduziert werden. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass ein durch Überlagerung der Einzelbilddaten erzeugtes Gesamtbild nicht überstrahlt wird. Ferner kann sichergestellt werden, dass die Anregung stets nur mit der absolut notwendigen lntensität vorgenommen wird. Auf diese Weise kann die Probe bzw. das entsprechende Fluorophor geschont und ein Ausbleichen verhindert werden. Eine entsprechende Erhöhung oder
Verringerung der lntensität kann insbesondere in Abhängigkeit von der lntensität des Hintergrunds bzw. des Signal/Rausch-Verhältnisses vorgenommen werden.
Wie erwähnt, kann auf Grundlage der Auswertung der Einzelbilddaten in dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskopsystem insbesondere die
Beleuchtungseinheit angesteuert werden ln dieser bevorzugten Ausführungsform umfasst die Ansteuerung insbesondere, einen oder mehrere Lichtparameter des auf die Probe eingestrahlten Lichts auf Grundlage der Auswertung einzustellen, um, wie erwähnt, beispielsweise eine vorteilhafte Adaption einer
Fluoreszenzanregung auf Grundlage der Fluoreszenzantwort zu ermöglichen. ln einem Mikroskopsystem gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden dabei als der eine oder die mehreren Lichtparameter eine lntensität oder eine Wellenlänge von Licht wenigstens einer Lichtquelle in der Beleuchtungseinheit eingestellt bzw. durch eine entsprechende Ansteuerung beeinflusst. Beispielsweise kann dabei die lntensität einer oder mehrerer
Lichtquellen durch Spannungs- oder Stromansteuerung erhöht oder verringert werden. Ähnliches ist grundsätzlich auch durch die Ansteuerung von Filtern oder Filteranordnungen in der Beleuchtungseinheit möglich, beispielsweise eines Filterrads mit Graufiltern unterschiedlicher Tönung oder durch Ansteuern elektronisch einstellbarer Grau- oder Abschwächungsfilter. Eine Änderung einer Wellenlänge kann beispielsweise mittels entsprechender Farbfilter oder anderer optischer Einrichtungen erfolgen.
Eine Ansteuerung auf Grundlage der Auswertung der Einzelbilddaten kann insbesondere auch eine Ansteuerung der Detektionseinheit umfassen ln dieser können beispielsweise ein Verstärkungsfaktor der Sensoren bzw. Detektoren oder ein oder mehrere Filter oder Filteranordnungen eingestellt werden. ln dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskopsystem umfasst die
Auswertung der Einzelbilddaten insbesondere eine spektrale Entmischung (engl. Spectral Unmixing), im Besonderen eine lineare Entmischung. Eine spektrale Entmischung kann beispielsweise unter Verwendung von Referenzspektren vorgenommen werden, anhand derer der Beitrag der jeweiligen Fluorophore bestimmt bzw. abgeschätzt werden kann. Durch die spektrale Entmischung, die grundsätzlich aus dem Stand der Technik bekannt ist, ist es insbesondere möglich, eine exakte Trennung einer Reihe unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe mit sehr ähnlichen Emissionsspektren vorzunehmen. Zu weiteren Details sei auf einschlägige Fachliteratur verwiesen.
Eine spektrale Entmischung kann durch die Verwendung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskopsystems auch dadurch erleichtert werden, dass durch die Ansteuerung auf Grundlage der Auswertung der Einzelbilder der Beitrag eines oder mehrerer Fluorophore zu einem Gesamtspektrum erhöht oder verringert werden kann. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, Referenzspektren zu erhalten, die aus einer Anregung von Licht mit einer spezifisch ausgewählten Eigenschaft resultieren und diese mit einem Gesamtspektrum zu vergleichen. Mit anderen Worten können die Beiträge anderer Fluorophore zu einem Spektrum gezielt beeinflusst werden, um den Beitrag eines zu untersuchenden Fluorophors besser beurteilen zu können. ln einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäß
vorgeschlagenen Mikroskopsystems ermittelt die Recheneinheit zur spektralen Entmischung einen oder mehrere Referenzpixel bzw. dessen oder deren lnhalt oder lnhalte in den Einzelbilddaten und/oder in den aus diesen erhaltenen Bilddaten und verwendet diesen oder diese zur spektralen Entmischung. Bei einem oder mehreren solchen Referenzpixeln kann es sich insbesondere um einen oder mehrere Pixel handeln, deren Spektrum nur durch den Beitrag eines
Fluorophors hervorgerufen wird, und das daher als Referenzpixel verwendet wird. Dies kann beispielsweise aus einem Phasor-Plot oder durch einen Vergleich mit benachbarten Pixeln ermittelt werden, oder dadurch, dass durch eine gezielte Ansteuerung der Beleuchtungseinheit nur ein definierter Farbstoff angeregt wird.
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroskopsystems kann eine Entmischung durch eine Variation der Anregung vereinfacht werden. Diese kann beispielsweise durch eine Verschiebung der jeweiligen Anregungswellenlänge(n) und/oder durch eine entsprechende Erhöhung oder Verringerung der
Strahlungsintensität erzielt werden, also Maßnahmen, die beleuchtungsseitig vorgenommen werden. Alternativ oder zusätzlich kann, durch Ansteuern der verwendeten Detektoren, auch eine beispielsweise eine elektronische Verstärkung im Sensor (Gain) und/oder die jeweilige Belichtungszeit verändert werden. ln dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskopsystem umfasst die
Auswertung der Einzelbilddaten vorteilhafterweise eine Phasoranalyse, und die Ansteuerung erfolgt auf Grundlage der Phasoranalyse. Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mikroskopsystem erweist sich insbesondere im Zusammenhang mit einer derartigen Phasoranalyse als besonders vorteilhaft, weil hier das
Signal/Rausch-Verhältnis entscheidend für die Trennung bzw. spektrale
Entmischung sein kann. Daher ist es hierbei besonders vorteilhaft, wenn die Möglichkeit besteht, einzelne Farben bzw. spektrale Kanäle hinsichtlich ihrer lntensität zu erhöhen bzw. in Bezug auf das vorliegende Rauschen anzupassen. ln einer Phasoranalyse werden die Komponenten der einzelnen Pixel als Punkte in einem Phasorplot dargestellt. Einzelne spektrale Komponenten stellen in einer derartigen Auswertung Punktewolken dar. Der Durchmesser dieser Punktewolken hängt vom Rauschen ab und wird dabei idealerweise soweit minimiert dass eine hinreichend genaue ldentifikation der Beiträge der einzelnen Farbstoffe zum Farbwert eines Pixels möglich ist. Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mikroskopsystem erlaubt dabei einem Benutzer eine Entscheidungsmöglichkeit zwischen der Präzision der spektralen Entmischung und der Probenbelastung durch eine stärkere Beleuchtung.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mikroskopsystem erlaubt die Nutzung von Ebenen oder anderen Bereichen der Probe, um auf diese Weise zusätzliche lnformationen über die in einer Probe vorhandenen Farbstoffe zu erhalten lnsbesondere ist eine Reaktion auf Benutzereingaben möglich, beispielsweise in Bezug auf lnformationen, die auf einem Anzeigegerät dargestellt werden lnsbesondere eine lineare Entmischung kann in dem erfindungsgemäß
vorgeschlagenen Mikroskopsystem vorteilhaft durchgeführt werden, da dieses typischerweise eine genaue Kenntnis der Spektren der einzelnen Fluorophore erfordert ln dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskopsystem können, wie erwähnt, hierzu beispielsweise Pixel identifiziert werden, deren Spektrum auf ein einziges Fluorophor zurückzuführen ist. entsprechende lnformationen können dann für die lineare spektrale Entmischung genutzt werden.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe umfasst die Verwendung eines Mikroskopsystems, insbesondere wie zuvor erläutert. Das verwendete Mikroskopsystem umfasst eine Detektoreinheit, die eine Farbstrahlteileranordnung und mehrere Sensoren aufweist, und eine Beleuchtungseinheit, die nach Maßgabe einer Ansteuerung durch eine
Steuereinheit Licht auf die Probe einstrahlt ln dem Verfahren wird von der Probe abgestrahltes Licht mit mehreren unterschiedlichen Wellenlängenanteilen mittels des Mikroskopsystems in die Farbstrahlteileranordnung eingestrahlt, dieses Licht wird mittels der Farbstrahlteileranordnung in die unterschiedlichen
Wellenlängenanteile zerlegt, und die unterschiedlichen Wellenlängenanteile werden jeweils auf einen der Sensoren in der Detektoreinheit geführt. Unter Verwendung des Mikroskopsystems werden ferner mittels der Sensoren
Einzelbilddaten erfasst, die Einzelbilddaten werden mittels einer Recheneinheit ausgewertet, und die Beleuchtungseinheit und/oder die Detektoreinheit wird auf Grundlage der Auswertung mittels der Steuereinheit angesteuert wird.
Zu Merkmalen und Vorteilen des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens wird auf die diesbezüglichen Ausführungen zu dem erfindungsgemäß
vorgeschlagenen Mikroskopsystem und seiner bevorzugten Ausführungsformen ausdrücklich verwiesen.
Weitere Merkmale und Vorteile der zuvor erläuterten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und weitere vorteilhafte Ausgestaltungen werden nachfolgend zusammenfassend angegeben. Die entsprechenden Erläuterungen betreffen dabei die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Farbstrahlteileranordnung und dass erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren zur mikroskopischen Abbildung mit den betreffenden Ausgestaltungen jeweils in gleicher Weise.
Mittels eines Mikroskopobjektivs erfasstes Licht wird vorteilhafterweise zur Unterdrückung des Anregungslichts in der Fluoreszenzmikroskopie auf bekannte Weise, beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten Filters, insbesondere eines Notch-Filters, gefiltert, bevor es unter Verwendung der
Farbstrahlteileranordnung in spektrale Anteile aufgeteilt wird. lm Rahmen der vorliegenden Erfindung kann insbesondere ein Multiband- Notchfilter objektseitig der Strahlteilung eingesetzt werden. Auf diese Weise kann die spektrale Auflösung in besonders einfacher Weise verdoppelt werden. Die Bänder des Multiband-Notchfilters werden dabei z.B. halb so breit wie die Breite des„Kanals" gewählt, in dessen spektralem Bereich sie liegen. Beispielsweise kann bei einer Teilung des Spektrum von 400 nm bis 900 nm in 5 Banden bzw. spektrale Anteile (400 bis 500, 500 bis 600, 600 bis 700, 700 bis 800, 800 bis 900
Nanometer) ein Notchfilter verwendet werden, der nur die Bereich 450 bis 500, 550 bis 600, 650 bis 700 Nanometer etc. transmittiert. Alternativ ist auch beispielsweise eine Filterung in Bereiche von 450 bis 550 bzw. 650 bis 750 Nanometer möglich.
Der Filter kann absorbierend oder reflektierend ausgeführt sein. Für den absorbierenden Fall, insbesondere wenn der Filter auf Basis von dielektrischen Schichten als lnterferenzfilter ausgeprägt ist, kann dessen spektrales Profil durch Verkippung variiert werden. Auch eine Verschiebung im Wesentlichen senkrecht zur optischen Achse kann erfolgen. Durch mehrere konsekutive Messungen mit verändertem Absorptions- bzw. Reflexions-Spektrum des Filters kann eine hohe spektrale Auflösung erreicht werden.
Für den reflektierenden Fall kann das reflektierte Licht auf eine baugleiche Farbstrahlteileranordnung gelenkt werden. Hiermit kann die höhere spektrale Auflösung schneller und mit höherer Lichtausbeute erreicht werden.
Vor der spektralen Aufteilung mittels der Farbstrahlteileranordnung kann vorteilhafterweise eine Korrektur der Transmission der optischen Elemente der Farbstrahlteileranordnung unter Verwendung einer Tubuslinse durchgeführt werden. Diese Tubuslinse wird vorteilhafterweise auf die Materialeigenschaften und optischen Weglängen in der Farbstrahlteileranordnung abgestimmt lnsbesondere kann die Tubuslinse eine Kompensation des chromatischen bzw. farbabhängigen Versatzes der Bildebene kompensieren (der durch die Dispersion der Farbstrahlteileranordnung hervorgerufen wird), so dass für alle spektralen Anteile bzw. Strahlengänge die Bildebene direkt hinter der
Farbstrahlteileranordnung bzw. in definierten Ebenen liegt und die Sensoren direkt an die Farbstrahlteileranordnung angebracht oder mit dieser fest verbunden werden können.
Die einzelnen spektralen Anteile, die mittels einer entsprechenden
Farbstrahlteileranordnung bereitgestellt werden, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise weiter gefiltert werden, insbesondere unter Verwendung von Bandpassfiltern, bevor sie mittels entsprechender Kameras erfasst werden. Auf diese Weise kann das jeweils gemessene Signal besser definiert bzw. Crosstalk unterdrückt werden. Die Zuverlässigkeit der Detektion wird auf diese Weise verbessert.
Als Sensoren in Detektoren bzw. Kameras, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen können, können insbesondere monochrome Charge-Coupled Device-, Complementary Metal-Oxide-Semiconductor- oder Scientific Complementary Metal-Oxide-Semiconductor-Sensoren (CCD, CMOS oder sCMOS) verwendet werden, wie sie grundsätzlich aus dem Stand der T echnik im Bereich der mikroskopischen Detektion bekannt sind. Die Sensoren bzw. Kameras können gleich oder unterschiedlich ausgebildet sein lnsbesondere können die Sensoren unterschiedliche Formate oder unterschiedliche Bauweisen aufweisen. Zum Beispiel können Sensoren auf Siliziumbasis für die Detektion von Licht im sichtbaren Spektralbereich und ein oder mehrere Sensoren auf
lndiumgalliumarsenidbasis für den nahen lnfrarotbereich (mehr als 700 nm, insbesondere mehr als lOOOnm) verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur mikroskopischen Abbildung wird
vorteilhafterweise unter Steuerung eines oder mehrerer Prozessoren in der eingesetzten Recheneinheit durchgeführt lnsbesondere kann in einem
entsprechenden Verfahren dabei ein Field Programmable Gate Array (FPGA), ein Hauptprozessor (CPU) oder ein Grafikprozessors (GPU) zum Einsatz kommen, mittels dessen eine Anpassung bzw. Verschiebung von jeweils mittels Kameras erfassten Einzelbildern vorgenommen werden kann lnsbesondere kann dabei auch eine Phasoranalyse durchgeführt werden und auf dieser Grundlage eine Zuordnung zu einzelnen Farbstoffen erfolgen. Hierbei kann eine Automatisierung in beliebigen Umfang sowie eine Berücksichtigung von Benutzereingaben erfolgen.
Die Zuordnung des von einem Farbstoff ausgesandten Emissionslichts basierend auf den Bildern der Kameras bzw. Detektoren kann insbesondere durch das bekannte sogenannte Spectral Unmixing erfolgen. Hierbei wird die Summe der spektralen lnformationen für die einzelnen Fluorophore in separate Bilder aufgetrennt. Für das Spectral Unmixing können Algorithmen zum Einsatz kommen, die den spektralen lnhalt jedes Pixels eines Pixelstapels, wie er durch die
Überlagerung erhalten wird, mit möglichen Summenkombinationen der bekannten Spektren der Fluorophormoleküle einer Probe vergleicht.
Durch die erfindungsgemäße Farbstrahlteileranordnung kann insbesondere sichergestellt werden, dass Grenzflächen (Ein- und Austrittsflächen in bzw. aus Glas) senkrecht auf der optischen Achse der jeweiligen Strahlengänge bzw.
Teilstrahlengänge stehen. Dies ist insbesondere deshalb von Bedeutung, da das Licht in einer entsprechenden Farbstrahlteileranordnung insbesondere nicht kollimiert verläuft. Ferner kann durch die erfindungsgemäße
Farbstrahlteileranordnung sichergestellt werden, dass die optische Weglänge in Glas zwischen dem Eingang der Farbstrahlteileranordnung, beispielsweise einer entsprechenden Tubuslinse, und den jeweiligen der Kameras für sämtliche
Teilstrahlengänge einheitlich bzw. aufeinander abgestimmt ist. Abweichungen können sich durch eventuell noch vorhandene longitudinale chromatische
Aberrationen ergeben. Die erfindungsgemäße Farbstrahlteileranordnung ermöglicht eine
Farbstrahlteilung unter Verwendung einer geringen Zahl von optischen Bauteilen, so dass Fertigungsaufwand, Kosten und Baugröße gering gehalten werden können und die Anzahl der optischen Grenzflächen minimiert ist und die Stabilität hoch ist. Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen näher erläutert, welche bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 zeigt eine Farbstrahlteileranordnung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in vereinfachter schematischer Darstellung.
Figur 2 zeigt eine Farbstrahlteileranordnung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in vereinfachter schematischer Darstellung.
Figur 3 zeigt Strahlteilerprismen von Farbstrahlteileranordnungen gemäß Ausführungsformen der Erfindung in schematischer Darstellung.
Figur 4 veranschaulicht Dimensionen an einer Farbstrahlteileranordnung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in schematischer Darstellung. Figur 5 zeigt eine Farbstrahlteileranordnung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in vereinfachter perspektivischer Explosionsansicht.
Figur 6 zeigt eine Farbstrahlteileranordnung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in vereinfachter zusammengesetzter perspektivischer Ansicht.
Figuren 7A bis 7D veranschaulichen Möglichkeiten zur Herstellung von
Strahlteiler- und Dreiecksprismen gemäß Ausführungsformen der Erfindung.
Figur 8 zeigt ein Mikroskopsystem gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. ln den Figuren sind einander funktionell und/oder baulich entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden der
Übersichtlichkeit halber nicht wiederholt erläutert. ln Figur 1 ist eine Farbstrahlteileranordnung gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vereinfacht schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet.
Die Farbstrahlteileranordnung 100 umfasst in der in Figur 1 veranschaulichten Ausführungsform ein erstes Strahlteilerprisma Al und ein zweites
Strahlteilerprisma A2. Das erste Strahlteilerprisma Al und das zweite
Strahlteilerprisma A2 weisen jeweils eine erste Prismenfläche Al-1, A2-1 und eine zweite Prismenfläche Al-2, A2-2 auf.
Das erste Strahlteilerprisma Al und das zweite Strahlteilerprisma A2 sind derart in der Farbstrahlteileranordnung 100 angeordnet, dass eine gemeinsame Achse A jeweils durch ihre ersten Prismenflächen Al-1, A2-1, nicht jedoch durch ihre zweiten Prismenflächen Al-2, A2-2 verläuft lnsbesondere sind die ersten
Prismenflächen Al-1, A2-1 des ersten und des zweiten Strahlteilerprismas Al, A2, und damit auch die parallel zu den ersten Prismenflächen Al-1, A2-langeordneten zweiten Prismenflächen Al-2, A2-2, derart gegenüber der gemeinsamen Achse A geneigt, dass Licht, das jeweils entlang der gemeinsamen Achse A in den
Strahlteilerprismen Al und A2 verläuft, in einem Winkel auf die ersten
Prismenflächen Al-1, A2-1 trifft, der eine weitgehend polarisationsunabhängige Reflexion erlaubt.
Auf die erste und zweiten Prismenflächen Al-1, A2-1, Al-2, A2-2 des ersten und zweiten Strahlteilerprismas Al, A2 sind jeweils dichroitische Schichten
aufgebracht, die hier mit 1 bis 4 bezeichnet sind. Wie erwähnt können die dichroitischen Schichten 1 bis 4 auch als Teil separater optischer Elemente ausgebildet sein, die mit den ersten und den zweiten Prismenflächen Al-1, A2-1, Al-2, A2-2 in Flächenkontakt stehen oder in einem vorgegebenen (geringen) Abstand zu den ersten und zweiten Prismenflächen Al-1, A2-1, Al-2, A2-2 angeordnet sein können. Diese dichroitischen Schichten weisen voneinander abweichende spektrale Selektivitäten auf, so dass in der nachfolgend erläuterten Weise poly- oder multichromatisches Licht eines Lichtstrahls m, der entlang der gemeinsamen Achse A verläuft und auf die erste Prismenfläche Al-1 des ersten Strahlteilerprismas Al trifft, in insgesamt fünf unterschiedliche spektrale Anteile aufgespalten werden kann.
Alle dichroitischen Schichten 1 bis 4 sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise als Kurzpassfilter ausgelegt, reflektieren also Licht ab einer festgelegten Wellenlänge, also Licht mit höheren Wellenlängen.
Weitere Prismenflächen des ersten Strahlteilerprismas Al und des zweiten Strahlteilerprismas A2 sind insbesondere unter Bezugnahme auf die Figur 3 näher erläutert, auf die nun in Zusammenschau mit Figur 1 Bezug genommen wird. Die in Figur 3 verwendeten Bezugszeichen sind der Übersichtlichkeit halber in Figur 1 nur teilweise angegeben ln Figur 3 sind dabei nur das erste Strahlteilerprisma Al und das zweite Strahlteilerprisma A2 isoliert und getrennt voneinander veranschaulicht. Die Figur 3 zeigt ferner die gemeinsame Achse A, die durch die erste Prismenfläche Al-1 des ersten Strahlteilerprismas Al und die erste
Prismenfläche A2-1 des zweiten Strahlteilerprismas A2 verläuft.
Eine gemäß Figur 3 spezifisch bezeichnete dritte Prismenfläche Al-3 des ersten Strahlteilerprismas Al, bzw. eine Ebene, in der diese dritte Prismenfläche Al-3 des ersten Strahlteilerprismas liegt, schließt mit der zweiten Prismenfläche Al-2 des ersten Strahlteilerprismas Al, bzw. einer Ebene, in der diese zweite Prismenfläche Al-2 des ersten Strahlteilerprismas Al liegt, einen zuvor mehrfach erwähnten ersten stumpfen Winkel mit einem ersten Winkelbetrag u ein. Entsprechendes gilt für eine vierte Prismenfläche Al-4 des ersten Strahlteilerprismas Al und dessen erste Prismenfläche Al-1 bzw. die entsprechenden Ebenen, in denen diese
Prismenflächen Al-4 und Al-1 liegen.
Eine gemäß Figur 3 spezifisch bezeichnete dritte Prismenfläche A2-3 des zweiten Strahlteilerprismas A2, bzw. eine Ebene, in der diese dritte Prismenfläche A2-3 des zweiten Strahlteilerprismas liegt, schließt mit der zweiten Prismenfläche A2-2 des zweiten Strahlteilerprismas A2, bzw. einer Ebene, in der diese zweite
Prismenfläche A2-2 des zweiten Strahlteilerprismas A2 liegt, einen zuvor mehrfach erwähnten stumpfen Winkel mit einem zweiten Winkelbetrag v ein, der kleiner als der Winkelbetrag u ist. lnsbesondere steht dabei der Winkelbetrag v mit dem Winkelbetrag u gemäß v = u - (180° - u) in Beziehung, wie mehrfach zuvor angegeben. Eine vierte Prismenfläche A2-4 des zweiten Strahlteilerprismas A2, bzw. eine Ebene, in der diese vierte Prismenfläche A2-4 des zweiten
Strahlteilerprismas A2 liegt, schließt mit dessen erster Prismenfläche A2-1, bzw. einer Ebene, in der dessen erste Prismenfläche A2-1 liegt, hingegen abweichend zu der entsprechenden Anordnung der Prismenflächen Al-4 und Al-1 in dem ersten Strahlteilerprisma Al einen stumpfen Winkel mit dem Winkelbetrag u ein.
Weitere Prismenflächen, hier als fünfte Prismenfläche Al-5, A2-5 und sechste Prismenfläche Al-6, A2-6 bezeichnet, sind angeordnet wie zuvor ausführlich erläutert. Die Strahlteilerprismen Al, A2 sind jeweils durch die durchgezogen veranschaulichten Linien abgegrenzt. Wie in Figur 3 mittels gestrichelter Linien dargestellt, können diese dabei durch Abschrägen bzw. Abkanten aus
quaderförmigen Glasblöcken unter jeweiliger Schaffung der ersten und zweiten Prismenflächen Al-1, A2-1, A2-1, A2-2 des ersten und zweiten Strahlteilerprismas Al, A2 und der dritten Prismenfläche A2-3 des zweiten Strahlteilerprismas A2 hergestellt werden. Wie erwähnt, ist eine derartige Herstellung jedoch keine zwingende Voraussetzung.
Die Strahlteilung unter Verwendung einer entsprechenden Strahlteileranordnung 100 ist wiederum unter Bezugnahme auf die Figur 1 erläutert. Hierbei wird ein Lichtstrahl m poly- oder multichromatischen Lichts über die dritte Prismenfläche Al-3 des ersten Strahlteilerprismas Al in entlang der gemeinsamen Achse A in dieses eingestrahlt. Der Lichtstrahl m trifft nun gemäß der Ausrichtung der ersten Prismenfläche Al-1 gegenüber der gemeinsamen Achse A auf die erste
Prismenfläche Al-1 bzw. die entsprechende dichroitische Schicht 1. Die spektrale Selektivität der dichroitischen Schicht 1 ist insbesondere derart gewählt, dass rote und orange Lichtanteile an dieser überwiegend reflektiert werden, hingegen grüne, blaue und gelbe Lichtanteile diese überwiegend passieren.
Ein auf diese Weise an der ersten Prismenfläche Al-1 des ersten
Strahlteilerprismas Al bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 1 reflektierter Lichtstrahl ro mit roten und orangen Lichtanteilen trifft auf die zweite Prismenfläche Al-2 des ersten Strahlteilerprismas Al. Die hier vorgesehene dichroitische Schicht 2 weist eine spektrale Selektivität auf, die insbesondere derart gewählt ist, dass orange Lichtanteile an dieser überwiegend reflektiert werden, hingegen rote Lichtanteile diese überwiegend passieren.
Ein auf diese Weise an der zweiten Prismenfläche Al-2 des ersten
Strahlteilerprismas Al bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 2 reflektierter Lichtstrahl o mit orangen Lichtanteilen wird über die vierte
Prismenfläche Al-4 des ersten Strahlteilerprismas Al ausgestrahlt. Der Lichtstrahl o durchstrahlt ein Würfelprisma C, das in der Strahlteileranordnung 100 im
Wesentlichen zur Vereinheitlichung der Licht- bzw. Glaswege vorgesehen ist, und trifft auf eine hier nicht veranschaulichte Kamera.
An der zweiten Prismenfläche Al-2 des ersten Strahlteilerprismas Al bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 2 nicht reflektiertes bzw. diese
passierendes Licht mit roten Lichtanteilen durchstrahlt in Form eines Lichtstrahls r ein Dreiecksprisma B und zwei Würfelprismen C und trifft anschließend ebenfalls auf eine nicht dargestellte Kamera. Das Dreiecksprisma B dient im Wesentlichen dazu, sicherzustellen, dass der Lichtstrahl r über eine senkrechte Grenzfläche aus der Farbstrahlteileranordnung 100 austritt. Durch eine geometrische Betrachtung unter Berücksichtigung der zuvor ausführlich erläuterten Prismeninnenwinkel des ersten Strahlteilerprismas Al, des Dreiecksprismas B und der Würfelprismen C wird ersichtlich, dass die Glaswege der Lichtstrahlen o und r identisch sind. An der ersten Prismenfläche Al-1 des ersten Strahlteilerprismas Al bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 1 nicht reflektiertes bzw. diese
passierendes Licht mit grünen, blauen und gelben Lichtanteilen tritt in Form eines Lichtstrahls gby über die dritte Prismenfläche A2-3 des zweiten
Strahlteilerprismas A2, die insbesondere mit der ersten Prismenfläche
Prismenfläche Al-1 des ersten Strahlteilerprismas Al verkittet oder in einem vorgegebenen (geringen) Abstand dazu angeordnet ist, in das zweite
Strahlteilerprisma A2 ein und trifft auf die erste Prismenfläche A2-1 des zweiten Strahlteilerprismas A2 bzw. die dort vorgesehene dichroitische Schicht 3. Diese dichroitische Schicht weist eine spektrale Selektivität auf, die insbesondere derart gewählt ist, dass grüne und gelbe Lichtanteile an dieser überwiegend reflektiert werden, hingegen blaue Lichtanteile diese überwiegend passieren.
Ein auf diese Weise an der ersten Prismenfläche A2-1 des zweiten
Strahlteilerprismas A2 bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 3 reflektierter Lichtstrahl gy mit grünen und gelben Lichtanteilen trifft auf die zweite Prismenfläche A2-2 des zweiten Strahlteilerprismas A2. Die hier vorgesehene dichroitische Schicht 4 weist eine spektrale Selektivität auf, die insbesondere derart gewählt ist, dass gelbe Lichtanteile an dieser überwiegend reflektiert werden, hingegen grüne Lichtanteile diese überwiegend passieren.
Ein auf diese Weise an der zweiten Prismenfläche A2-2 des zweiten
Strahlteilerprismas A2 bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 4 reflektierter Lichtstrahl y mit gelben Lichtanteilen wird über die vierte
Prismenfläche A2-4 des zweiten Strahlteilerprismas A2 ausgestrahlt und trifft auf eine hier nicht veranschaulichte Kamera. Ein Würfelprisma C ist hier nicht vorgesehen. An der zweiten Prismenfläche A2-2 des zweiten Strahlteilerprismas A2 bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 4 nicht reflektiertes bzw. diese passierendes Licht mit gelben Lichtanteilen durchstrahlt in Form eines
Lichtstrahls g ein Dreiecksprisma B und ein Würfelprisma C und trifft
anschließend ebenfalls auf eine nicht dargestellte Kamera. Das Dreiecksprisma B dient auch hier im Wesentlichen dazu, sicherzustellen, dass der Lichtstrahl g über eine senkrechte Grenzfläche aus der Farbstrahlteileranordnung 100 austritt. Durch eine geometrische Betrachtung unter Berücksichtigung der zuvor ausführlich erläuterten Prismeninnenwinkel des ersten und zweiten Strahlteilerprismas Al, A2, des Dreiecksprismas B und des Würfelprismas C wird ersichtlich, dass die Glaswege der Lichtstrahlen g und y identisch zueinander und zu dem identisch zu den Glaswegen der Lichtstrahlen o und r sind.
An der ersten Prismenfläche A2-1 des zweiten Strahlteilerprismas A2 bzw. der entsprechenden dichroitischen Schicht 3 nicht reflektiertes bzw. diese
passierendes Licht mit blauen Lichtanteilen wird in Form eines Lichtstrahls b über ein Dreiecksprisma B und ein Würfelprisma C sowie ein Quaderprisma Q ausgestrahlt und trifft insbesondere ebenfalls auf eine entsprechende, hier nicht dargestellte Kamera. Auch hier kann durch eine geeignete Wahl von Bauelementen wie Würfel- und Quaderprismen ein identischer Glasweg gewährleistet werden.
Zur Anpassung der Glaswege ist ferner ein Quaderprisma Q bereitgestellt. lm Rahmen der Beschreibung der in der Figuren veranschaulichten
Ausführungsformen ist von Würfelprismen C die Rede, die jedoch in sämtlichen Fällen auch durch Quaderprismen geeigneter Dimensionierung ersetzt werden können. Wie erwähnt, stellen entsprechende Würfel- und/oder Quaderprismen im Wesentlichen sicher, dass die jeweiligen Lichtanteile identische Glaswege durchlaufen. Sie werden daher in Abhängigkeit von den vorliegenden
Erfordernissen dimensioniert lnsbesondere kann der jeweilige Querschnitt senkrecht zur Papierebene gemäß Figur 1 auch an die Dimensionen eines oder mehrerer Detektoren bzw. Kameras angepasst werden. lnsbesondere kann die dichroitische Schicht 1 als Langpassfilter mit einer
Kantenwellenlänge von 490 nm, die dichroitische Schicht 2 als Langpassfilter mit einer Kantenwellenlänge von 450 nm, die dichroitische Schicht 3 als Langpassfilter mit einer Kantenwellenlänge von 590 nm und die dichroitische Schicht 4 als Langpassfilter mit einer Kantenwellenlänge von 630 nm ausgebildet sein. Zur feineren spektralen Aufspaltung können auswechselbare Multibandpassfilter stromauf der Strahlteileranordnung, d.h. auf der Einstrahlseite des Lichtstrahls m, platziert werden, um die spektralen Detektionsbänder weiter zu verfeinern, z.B. vier Bänder mit Breite von 20 nm um 440 nm, 480 nm, 530 nm, 580 nm und 620 nm. Eine Anordnung an dieser Stelle ist besonders günstig, weil gängige
Mikroskope an dieser Stelle typischerweise Aufnahmen für entsprechende Filter, beispielsweise ein Filterrad, aufweisen. ln Figur 2 ist eine Strahlteileranordnung gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, die sich von der
Strahlteileranordnung 100 gemäß Figur 1 im Wesentlichen durch die Verwendung von zwei Halbwürfelprismen D anstelle zweier Würfelprismen C unterscheidet. Durch diese kann jeweils eine geradzahlige Anzahl von Reflexionen der
Lichtstrahlen o, r, g, y bewirkt werden, so dass die entsprechenden Bilder lagegleich sind. Die Länge der Glaswege wird hierdurch nicht verändert.
Figur 3 wurde bereits teilweise zuvor erläutert. Diese veranschaulicht, wie erwähnt, das erste Strahlteilerprisma Al und das zweite Strahlteilerprisma A2 isoliert. Ferner sind hier gegenüber Figur 1 und 2 zusätzliche Flächen
veranschaulicht. Ferner sind hier Winkel mit Winkelbeträgen u, v, w dargestellt. Für die hier jeweils in Frage kommenden Winkelbeträge sei auf die obigen
Erläuterungen verwiesen lnsbesondere beträgt der Winkelbetrag u 145° bis 165°, insbesondere 150° bis 160°, vorzugsweise 157,5°, und die Winkelbeträge v und w stehen insbesondere mit dem Winkelbetrag u gemäß
v = u - (180° - u) und w = 90° + (180° - u) in Beziehung. ln Figur 4 sind Dimensionierungen einer Farbstrahlteileranordnung 100, wie sie in Figur 1 gezeigt ist, veranschaulicht. Gegenüber der Darstellung gemäß Figur 1 wurde dabei auf eine Reihe von Bezugszeichen verzichtet. Wie ersichtlich, leiten sich die Maße der jeweiligen Prismenflächen von einem Grundmaß d ab. Die Breite der Strahlteilerprismen Al, A2 beträgt dabei 2d, die Breite der Würfelprismen C beträgt d. Das Quaderprisma Q stellt einen zusätzlichen Glasweg der dargestellten Länge bereit. Die anderen Dimensionen sind der Figur 4 zu entnehmen. Aus den in Figur 4 veranschaulicht Dimensionen ergibt sich ein Winkelbetrag a von 157,5° ln Figur 5 ist zur weiteren Veranschaulichung eine Farbstrahlteileranordnung 100, wie sie bereits in den Figuren 1 und 4 veranschaulicht wurde, nochmals in Form einer perspektivischen Explosionsansicht dargestellt. Hierbei sind auch
insbesondere die ersten und zweiten Prismenflächen Bl, B2 der Dreiecksprismen B dargestellt. Die Figur 6 entspricht der Darstellung der Figur 5 in
zusammengesetzten Zustand. ln den Figuren 7A bis 7D ist nochmals veranschaulicht, wie sich die
Strahlteilerprismen Al und A2 aus gestrichelt gezeigten, quaderförmigen
Glasblöcken 101 hergestellt werden können. Wie mehrfach erwähnt, ist die vorliegende Erfindung aber nicht auf eine entsprechende Herstellung beschränkt. Wie aus Figur 7A ersichtlich, können von einem entsprechenden quaderförmigen Glasblock 101 grundsätzlich vier Dreiecksprismen abgenommen werden, die an den verbleibenden Rest, wie in Figur 7B veranschaulicht, angefügt werden können. Durch nur teilweise Entfernung entsprechender Dreiecksprismen bzw. nur teilweises Abschrägen von Kanten können, wie aus den Figuren 7C und 7D ersichtlich, die Strahlteilerprismen Al und A2 erhalten werden. ln Figur 8 ist ein Mikroskopsystem, das insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ausgebildet sein kann, stark vereinfacht veranschaulicht und insgesamt mit 200 bezeichnet. Das Mikroskopsystem 200 umfasst, wie hier ebenfalls stark vereinfacht
veranschaulicht, eine Farbstrahlteileranordnung 100, wie sie zuvor in
unterschiedlichen Ausgestaltungen erläutert wurde. Diese ist in Figur 8 als Teil einer Detektionseinheit 201 veranschaulicht. Die Detektionseinheit 201 umfasst mehrere Sensoren bzw. Kameras, wie sie bereits oben erläutert wurden, und je nach Ausgestaltung des Mikroskopsystems 200 beliebige weitere optische Elemente wie insbesondere Bandpassfilter und dergleichen. Je nach Ausbildung der Farbstrahlteileranordnung 100 und der damit bereitgestellten Farbkanäle ist eine entsprechende Anzahl von Sensoren bzw. Kameras vorhanden. Diese Kameras bzw. Sensoren sind, ebenso wie
Bildaufnahme- bzw. Auswerteeinrichtungen, die den Sensoren bzw. Kameras in der Detektionseinheit 201 zugeordnet sein können, nicht veranschaulicht.
Mittels der Sensoren bzw. Kameras in der Detektionseinheit 201 werden digitale Bilddaten erhalten, die insbesondere über eine Datenverbindung 202 von der Detektionseinheit 201 an eine Recheneinheit 203, beispielsweise einen PC oder eine dedizierten Mikroskopsteuerung, übertragen werden können ln der
Recheneinheit kann dabei eine geeignete Software installiert sein, mittels derer entsprechend erhaltene Bilddaten ausgewertet werden können. Es versteht sich, dass zumindest ein Teil der Bilddaten auch in Hardware, beispielsweise in einem Grafikprozessor (GPU) ausgewertet werden können. Eine entsprechende Software kann beispielsweise mit dem Grafikprozessor interagieren.
Über dieselbe Datenverbindung 202 oder eine separate Steuerleitung kann auch eine Ansteuerung der Detektionseinheit 201 bzw. ihrer nicht veranschaulichten Sensoren bzw. Kameras vorgenommen werden. Hierzu wird eine ebenfalls in Soft- und/oder Hardware implementierte Steuereinheit 204 verwendet. Beispielsweise können mittels einer entsprechenden Steuereinheit 204 ein Verstärkungsfaktor zumindest eines der Sensoren bzw. zumindest einer der Kameras oder andere Parameter eingestellt werden. Auch beispielsweise eine Abschwächung eines der Farbkanäle, beispielsweise durch das Ansteuern eines ansteuerbaren Filters, kann mittels der Steuereinheit 204 erfolgen.
Über eine weitere Datenverbindung 205 kann ein Anzeigegerät 206,
beispielsweise ein Monitor, an die Recheneinheit 203 angebunden sein. Das Anzeigegerät 206 kann alternativ auch Teil der Recheneinheit 203 sein bzw. in einem gemeinsamen Gehäuse mit dieser untergebracht sein. Auf dem Anzeigegerät 206 kann ein Benutzer die Bilddaten, die mittels der Sensoren bzw. Kameras in der Detektionseinheit 201 erhalten und in der Recheneinheit verarbeitet wurden, betrachten. Die Verarbeitung der Bilddaten in der Recheneinheit kann dabei insbesondere eine spektrale Entmischung, eine Überlagerung von Bilddaten aus unterschiedlichen spektralen Kanälen, insbesondere mit jeweiliger
lntensitätsanpassung, und beliebige aus dem Bereich der Bildverarbeitung bekannte Maßnahmen umfassen. Beispielsweise die Bilddaten aus bestimmten oder allen Farbkanälen oder ein zusammengesetztes Bild einem Weiß- bzw.
Farbabgleich, einer Nullwertsubtraktion, einer digitalen Filterung, einer
Normalisierung, einem Kontrastausgleich, einer Kontrasterhöhung, einer
Schärfung oder einer Segmentierung unterworfen werden.
Auf Grundlage des auf dem Anzeigegerät 206 angezeigten Bilds kann ein Benutzer über eine Benutzerschnittstelle 207, die mit einer weiteren Datenverbindung 208 mit der Recheneinheit 203 gekoppelt sein kann, Parameter der Bildverarbeitung und/oder Parameter der Ansteuerung der Detektionseinheit 201 verändern.
Alternativ zu einer derartigen manuellen Ansteuerung kann auch eine rein automatische Ansteuerung vorgesehen sein, die beispielsweise anhand
hinterlegter Regeln, insbesondere in Form von Lookup-Tabellen, Kennlinien und dergleichen, entsprechende Parameter ändert. Auch Mischformen der
Ansteuerung sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich. Die
Benutzerschnittstelle 207 kann, wie das Anzeigegerät 203, Teil der Recheneinheit 203 sein oder in einem gemeinsamen Gehäuse mit dieser untergebracht sein. Die Benutzerschnittstelle 207 kann insbesondere über bekannte Eingabemittel wie reale oder virtuelle Tasten verfügen. Auch eine Maus, ein Trackball, ein Tablet oder andere, insbesondere zur Manipulation von Bilddaten geeignete Eingabemittel können vorgesehen sein. Die Benutzerschnittstelle 207 und das Anzeigegerät 206 können auch zumindest teilweise als ein Gerät ausgebildet sein, beispielsweise in Form eines Touchscreens. Mittels der Steuereinheit 204 kann in der in Figur 8 veranschaulichten
Ausführungsform des Mikroskopsystems über eine weitere Datenverbindung 209 auch eine Beleuchtungseinheit 211 angesteuert werden. Die Beleuchtungseinheit 211 ist dabei insbesondere dafür ausgebildet, Beleuchtungslicht in Form von Fluoreszenzanregungslicht einer oder mehrerer definierter Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche bereitzustellen. Dieses Beleuchtungslicht kann in
kohärenter oder nichtkohärenter Form bereitgestellt werden. Die Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche können insbesondere mittels geeigneter, insbesondere wechselbarer, Filter oder Filteranordnungen wie Filterrädern, Filterschiebern, Filterwürfeln und dergleichen ausgewählt werden. Die Beleuchtungseinheit 211 kann eine oder mehrere, in Figur 8 nicht gesondert veranschaulichte Lichtquellen umfassen, die jeweils mono- oder polychromatisches Licht liefern können lm Falle mehrerer Lichtquellen kann deren Licht insbesondere auch, beispielsweise mittels Strahlteilern oder anderen Einkoppeleinrichtungen, in einen gemeinsamen Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt werden. Das Licht einer oder mehrerer Lichtquellen kann, wie in dem in Figur 8 dargestellten Beispiel veranschaulicht, beispielsweise mittels einer Faseroptik 212 auf eine Probe 213 eingestrahlt werden. Anstelle der Verwendung einer Faseroptik 212 ist auch die Verwendung klassischer, mit teildurchlässigen Elementen, Linsen, Spiegeln und dergleichen arbeitenden Auflicht- oder Durchlichteinrichtungen möglich. lnsbesondere kann in dem in Figur 8 veranschaulichten Mikroskopsystem 200 vorgesehen sein, eine adaptive Steuerung der Beleuchtungseinrichtung 211 in Abhängigkeit von mittels der Detektionseinheit 201 erhaltenen und in der
Recheneinheit 203 ausgewerteten Bilddaten vorzunehmen. Auf diese Weise ist eine gezielte Anpassung von Beleuchtungsparametern, beispielsweise der
Lichtintensität oder der ausgewählten Wellenlänge, einer oder mehrerer
Beleuchtungseinheiten vornehmbar. Eine derartige Anpassung kann manuell, teilautomatisch oder vollautomatisch vorgenommen werden lnsbesondere bei der Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe, die sich durch unterschiedliche Anregungswellenlängen anregen lassen, können auf diese Weise beispielsweise die unterschiedlichen lntensitäten aneinander angeglichen werden, um eine
Überstrahlung des erhaltenen Bilds durch einen Fluoreszenzkanal zu verhindern. Mit anderen Worten kann durch eine Beleuchtungsanpassung ebenfalls ein lntensitätsausgleich zwischen unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen erzielt werden. Weil dabei stets nur so viel Licht eingestrahlt wird, wie für eine optimale Detektion erforderlich ist, kann auf diese Weise die Probe geschont und eine zu rasche Alterung verhindert werden. Mittels einer weiteren Datenverbindung 210 kann die Position und/oder
Orientierung der Probe angepasst werden. So können z.B. verschiedene Positionen in der Probe gemessen werden um z.B. hinsichtlich ihrer Eigenschaften (z.B.
Zusammensetzung der Fluorophore) herausstechende Bereiche zu identifizieren. Als weitere Elemente des Mikroskopsystems 200, das im Übrigen über sämtliche bekannten Elemente eines (Fluoreszenz-) Mikroskopsystems verfügen kann, sind ein Objektiv 214, ein Multibandpassfilter 215 und eine Tubuslinse 216
veranschaulicht. Es versteht sich, dass sämtliche erwähnten Datenverbindungen, insbesondere die Datenverbindungen 202, 205, 208, 209 und 210 und alle weiteren
Datenverbindungen, die in einem Mikroskopsystem 200 der gezeigten oder anderer Ausgestaltungen zum Einsatz kommen können, in Form von mono- oder bidirektionalen Datenverbindungen und kabelgestützt oder kabellos,
beispielsweise in Form von Wi-Fi-, Bluetooth-, lnfrarot-, oder anderer bekannter Fernübertragungstechniken realisiert sein können. Bezugszeichenliste
100 Strahlteileranordnung
A gemeinsame Achse
1, 2, 3, 4 dichroitische Schichten
Al, A2 erstes, zweites Strahlteilerprisma
Al-1, A2-1 erste Prismenfläche erstes, zweites Strahlteilerprisma Al-2, A2-2 zweite Prismenfläche erstes, zweites Strahlteilerprisma Al-3, A2-3 dritte Prismenfläche erstes, zweites Strahlteilerprisma Al-4, A2-4 vierte Prismenfläche erstes, zweites Strahlteilerprisma Al-5, A2-5 fünfte Prismenfläche erstes, zweites Strahlteilerprisma Al-6, A2-6 sechste Prismenfläche erstes, zweites Strahlteilerprisma B Dreiecksprisma
Bl, B2 erste, zweite Prismenfläche Dreiecksprisma
C Würfel- oder Quaderprisma
Q Quaderprisma
D Halbwürfelprisma
d Grundmaß
m Lichtstrahl multi- /poly chromatisch
ro, gby, gy Lichtstrahlen rot/orange, grün/blau/gelb, grün/gelb o, r, g, y, b Lichtstrahlen orange, rot, grün, gelb, blau
U, V, w Prismeninnenwinkel
101 Glasblock
200 Mikroskopsystem
201 Detektionseinheit
203 Recheneinheit
204 Steuereinheit
206 Anzeigegerät
207 Benutzerschnittstelle
211 Beleuchtungseinheit
212 Faseroptik
213 Probe
214 Objektiv
215 Bandpassfilter
216 Tubuslinse
202, 205, 208-210 Datenverbindungen

Claims

Patentansprüche
1. Farbstrahlteileranordnung (100) mit einem ersten Strahlteilerprisma (Al), das eine erste Prismenfläche (Al-1), eine zweite Prismenfläche (Al-2), eine dritte Prismenfläche (Al-3) und eine vierte Prismenfläche (Al-4) aufweist, wobei
eine Ebene, in der die erste Prismenfläche (Al-1) des ersten
Strahlteilerprismas (Al) liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die zweite Prismenfläche (Al-2) des ersten Strahlteilerprismas (Al) liegt,
eine Ebene, in der die dritte Prismenfläche (Al-3) des ersten
Strahlteilerprismas (Al) liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die vierte Prismenfläche (Al-4) des ersten Strahlteilerprismas (Al) liegt,
die Ebene, in der die erste Prismenfläche (Al-1) des ersten
Strahlteilerprismas (Al) liegt, einen stumpfen Winkel mit einem ersten
Winkelbetrag mit der Ebene, in der die vierte Prismenfläche (Al-4) des ersten Strahlteilerprismas (Al) liegt, einschließt,
die Ebene, in der die zweite Prismenfläche (Al-2) des ersten
Strahlteilerprismas (Al) liegt, einen stumpfen Winkel mit dem ersten
Winkelbetrag mit der Ebene, in der die dritte Prismenfläche (Al-4) des ersten Strahlteilerprismas (Al) liegt, einschließt,
in oder parallel zu der Ebene, in der die erste Prismenfläche (Al-1) des ersten Strahlteilerprismas (Al) liegt, eine erste dichroitische Schicht (1) mit einer ersten spektralen Selektivität angeordnet ist, und
in oder parallel zu der Ebene, in der die zweite Prismenfläche (Al-2) des ersten Strahlteilerprismas (Al) liegt, eine zweite dichroitische Schicht (1) mit einer zweiten spektralen Selektivität angeordnet ist.
2. Farbstrahlteileranordnung (100) nach Anspruch 1 mit einem zweiten Strahlteilerprisma (A2), das eine erste Prismenfläche (A2-1), eine zweite
Prismenfläche (A2-2), eine dritte Prismenfläche (A2-3) und eine vierte
Prismenfläche (A2-4) aufweist, wobei
eine Ebene, in der die erste Prismenfläche (A2-1) des zweiten
Strahlteilerprismas (A2) liegt, parallel zu einer Ebene angeordnet ist, in der die zweite Prismenfläche (A2-2) des zweiten Strahlteilerprismas (A2) liegt,
die Ebene, in der die erste Prismenfläche (A2-1) des zweiten
Strahlteilerprismas (A2) liegt, einen stumpfen Winkel mit dem ersten
Winkelbetrag mit einer Ebene, in der die vierte Prismenfläche (A2-4) des zweiten Strahlteilerprismas (A2) liegt, einschließt,
die Ebene, in der die zweite Prismenfläche (A2-2) des zweiten
Strahlteilerprismas (A2) liegt, einen stumpfen Winkel mit einem zweiten, kleineren Winkelbetrag mit einer Ebene, in der die dritte Prismenfläche (A2-4) des zweiten Strahlteilerprismas (A2) liegt, einschließt,
in oder parallel zu der Ebene, in der die erste Prismenfläche (A2-1) des zweiten Strahlteilerprismas (A2) liegt, eine dritte dichroitische Schicht (1) mit einer dritten spektralen Selektivität angeordnet ist, und
in oder parallel zu der Ebene, in der die zweite Prismenfläche (A2-2) des zweiten Strahlteilerprismas (A2) liegt, eine vierte dichroitische Schicht (1) mit einer vierten spektralen Selektivität angeordnet ist.
3. Farbstrahlteileranordnung (100) nach Anspruch 2, bei der das erste und das zweite Strahlteilerprisma (Al, A2) derart hintereinander angeordnet sind, dass die erste Prismenfläche (Al-1) des ersten Strahlteilerprismas (Al) und die dritte Prismenfläche (A2-3) des zweiten Strahlteilerprismas in einer gemeinsamen Ebene oder parallel zueinander angeordnet sind, und dass eine gemeinsame optische Achse (A) schräg durch ihre ersten Prismenflächen (Al-1, A2-1) und nicht durch ihre zweiten Prismenflächen (Al-2, A2-2) verläuft.
4. Farbstrahlteileranordnung (100) nach Anspruch 2 oder 3, bei dem der zweite Winkelbetrag v mit dem ersten Winkelbetrag u gemäß v = u - (180° - u) in Beziehung steht, wobei der erste Winkelbetrag u bei 145° bis 165°, insbesondere bei 150° bis 160°, vorzugsweise bei 157,5°, liegt.
5. Farbstrahlteileranordnung (100) nach einem der Ansprüche 2 bis 4, die ein oder mehrere Dreiecksprismen (B) mit jeweils einer ersten, einer zweiten und einer dritten Prismenfläche (B-l, B-2, B-3) aufweist, wobei die erste und die zweite Prismenfläche (B-l, B-2) des oder der Dreiecksprismen (B) jeweils in Ebenen liegen, die einen spitzen Winkel mit einem Winkelbetrag y zueinander
einschließen, der mit dem Winkelbetrag u gemäß y = 180° - u in Beziehung steht, und wobei die erste Prismenfläche (B-l) des oder eines der Dreiecksprismen (B) in einer gemeinsamen Ebene mit oder parallel zu der zweiten Prismenfläche (Al-2) des ersten Strahlteilerprismas (Al) und/oder die erste Prismenfläche (B-l) des oder eines der Dreiecksprismen (B) in einer gemeinsamen Ebene mit oder parallel zu der ersten Prismenfläche (A2-1) des zweiten Strahlteilerprismas (A2) und/oder die erste Prismenfläche (B-l) des oder eines der Dreiecksprismen (B) in einer gemeinsamen Ebene mit oder parallel zu der zweiten Prismenfläche (A2-2) des zweiten Strahlteilerprismas (A2) angeordnet ist.
6. Farbstrahlteileranordnung (100) nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem, wobei die jeweils in einer gemeinsamen Ebene oder parallel zueinander angeordneten Prismenflächen (Al-1, A2-3, B-l, Al-2, A2-1, A2-2) unabhängig voneinander in Flächenkontakt stehen, einen vorbestimmten Abstand zueinander aufweisen und/oder miteinander verkittet sind.
7. Farbstrahlteileranordnung (100) nach Anspruch 5, die ein oder mehrere Quaderprismen (C) aufweist, das oder die jeweils dem oder einem der
Dreiecksprismen (B) zugeordnet ist oder sind.
8. Farbstrahlteileranordnung (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem sämtliche der Prismenflächen (Al-1, Al-2, Al-3, Al-4, Al-5, Al-6, A2-1, A2-2, A2-3, A2-4, A2-5, A2-6, Bl, B2, B3) senkrecht zu einer Bezugsebene stehen.
9. Mikroskopsystem (200) zur mikroskopischen Abbildung einer Probe (213), mit einer Detektoreinheit (201), die eine Farbstrahlteileranordnung (100), insbesondere nach einem der vorstehenden Ansprüche, und mehrere Sensoren aufweist, und mit einer Beleuchtungseinheit (211), die nach Maßgabe einer Ansteuerung durch eine Steuereinheit (204) Licht auf die Probe (213) einstrahlt, wobei das Mikroskopsystem (200) von der Probe (213) abgestrahltes Licht mit mehreren unterschiedlichen Wellenlängenanteilen in die
Farbstrahlteileranordnung (100) einstrahlt, dieses Licht mittels der
Farbstrahlteileranordnung (100) in die unterschiedlichen Wellenlängenanteile zerlegt, und die unterschiedlichen Wellenlängenanteile jeweils auf einen der Sensoren in der Detektoreinheit (201) führt, und wobei das
Mikroskopsystem (200) mittels der Sensoren Einzelbilddaten erfasst, die
Einzelbilddaten und/oder unter Verwendung der Einzelbilddaten erzeugte Bilddaten mittels einer Recheneinheit (203) auswertet, und die
Beleuchtungseinheit (211) und/oder die Detektoreinheit auf Grundlage der Auswertung mittels der Steuereinheit (204) ansteuert.
10. Mikroskopsystem (200) nach Anspruch 9, bei dem die Ansteuerung umfasst, einen oder mehrere Lichtparameter des auf die Probe (213)
eingestrahlten Lichts auf Grundlage der Auswertung einzustellen.
11. Mikroskopsystem (200) nach Anspruch 10, bei dem der eine oder die mehreren Lichtparameter eine lntensität oder eine Wellenlänge von Licht wenigstens einer Lichtquelle in der Beleuchtungseinheit (211) umfassen.
12. Mikroskopsystem (200) nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem die Ansteuerung umfasst, einen oder mehrere Filterparameter eines oder mehrerer in dem Mikroskopsystem (200) verwendeter Filter einzustellen.
13. Mikroskopsystem (200) nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem die Auswertung der Einzelbilddaten eine spektrale Entmischung umfasst.
14. Mikroskopsystem (200) nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei dem die Recheneinheit (203) den lnhalt eines oder mehrerer Referenzpixel in den
Einzelbilddaten und/oder in den aus diesen erhaltenen Bilddaten ermittelt und diesen oder diese in der spektralen Entmischung verwendet.
15. Mikroskopsystem (200) nach einem der Ansprüche 9 bis 14, bei dem
Auswertung der Einzelbilddaten eine Phasoranalyse umfasst.
16. Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe (213), bei dem ein Mikroskopsystem mit einer Detektionseinheit (201), die eine
Farbstrahlteileranordnung (100), insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 8, und mehrere Sensoren aufweist, und mit einer Beleuchtungseinheit (211), die nach Maßgabe einer Ansteuerung durch eine Steuereinheit (204) Licht auf die Probe (213) einstrahlt, verwendet wird, wobei von der Probe (213) abgestrahltes Licht mit mehreren unterschiedlichen Wellenlängenanteilen mittels des
Mikroskopsystems (200) in die Farbstrahlteileranordnung (100) eingestrahlt wird, dieses Licht mittels der Farbstrahlteileranordnung (100) in die unterschiedlichen Wellenlängenanteile zerlegt wird, und die unterschiedlichen Wellenlängenanteile jeweils auf einen der Sensoren in der Detektionseinheit (201) geführt werden, und wobei unter Verwendung des Mikroskopsystems mittels der Sensoren
Einzelbilddaten erfasst, die Einzelbilddaten mittels einer Recheneinheit (203) ausgewertet, und die Beleuchtungseinheit (211) und/oder die Detektionseinheit auf Grundlage der Auswertung mittels der Steuereinheit (204) angesteuert wird.
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