CN114441495A - 多色荧光显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多色荧光显微成像系统，包括物镜、二向色镜、会聚镜、消色差中继镜组、筒镜、分束器和探测器；其中，激发光经会聚镜、二向色镜聚焦于被测物激发出荧光，荧光通过物镜收集，再经消色差中继镜组与筒镜后会聚进入分束器进行分束并分别成像在探测器上。本发明在不增加探测器、物镜等成像系统所需硬件的基础上，以较为简单的方式组成成像系统，从而提高单次采集或单位时间内的信息维度，与此同时这种成像方式还具有极高的时间分辨率。

Description

多色荧光显微成像系统
技术领域
本发明涉及多色显微成像技术领域，特别涉及一种多色荧光显微成像系统。
背景技术
多色荧光显微成像利用荧光探针的特异性生物结合、选择性受激发射光谱两个特点，得到了极高的信噪比和空间分辨率，尤其是在生物微结构成像和高通量生物信息检测领域具有重要的应用。由于现有水平的彩色探测器的量子效率低，空间分辨率低，信噪比差等原因，生物多光谱成像主要是通过光谱分离将光谱信息转换为空间强度分布，应用单色探测器进行多光谱成像。光谱分离的实现方式主要有三种：发射滤光片顺序切换、棱镜或光栅色散、顺序二向色片分束，这三种光谱分离方式分别在采样同步性、光谱分辨率、装置复杂程度三个方面具有明显的缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了克服已有技术的缺陷，提出一种多色荧光显微成像系统，以提高光谱分辨率并简化装置的复杂程度。
为实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：
本发明提供的多色荧光显微成像系统，包括物镜、二向色镜、会聚镜、消色差中继镜组、筒镜、分束器和探测器；其中，激发光经会聚镜、二向色镜聚焦于被测物激发出荧光，荧光通过物镜收集，再经消色差中继镜组与筒镜后会聚进入分束器进行分束并分别成像在探测器上。
优选地，分束器包括分束棱镜，分束棱镜包括三棱镜、平行分束板和平行补偿板，三棱镜的斜面与入射光束垂直，平行分束板与平行补偿板的数量均为N个，N≥1，N个平行分束板胶合与N个平行补偿板分别层叠胶合在三棱镜的两个直角面上，在三棱镜的一个直角面与平行分束板之间的胶合面上、各层叠的平行分束板之间的胶合面上分别镀有第一二向色膜，在三棱镜的另一个直角面与平行补偿板之间的胶合面上、各层叠的平行补偿板之间的胶合面上分别镀有与第一二向色膜功能相反的第二二向色膜，以及在最外侧的平行分束板与最外侧的平行补偿板未胶合的一面分别镀有反射膜。
优选地，分束棱镜的数量为两个，且相互垂直摆放。
优选地，分束器包括分束棱镜，分束棱镜包括三棱镜和平行分束板，三棱镜的一个直角面与入射光束垂直，平行分束板的数量为N个，N≥1，N个平行分束板层叠胶合在三棱镜的斜面上，在三棱镜与平行分束板的胶合面上以及各层叠的平行分束板之间的胶合面上分别镀有二向色膜，在最外侧的平行分束板未胶合的面上镀有反射膜。
优选地，分束器包括分束棱镜，分束棱镜包括三棱镜和平行分束板，三棱镜的斜面与入射光束垂直，平行分束板的数量为N个，N≥1，N个平行分束板层叠胶合在三棱镜的一个直角面上，在三棱镜与平行分束板的胶合面上以及各层叠的平行分束板之间的胶合面上分别镀有二向色膜，在最外侧的平行分束板未胶合的面上以及在三棱镜的另一个直角面上分别镀有反射膜。
优选地，消色差中继镜组包括前置镜组、后置镜组和视场光阑，前置镜组靠近二向色镜，后置镜组靠近筒镜，视场光阑设置在前置镜组与后置镜组之间。
与现有技术相比，本发明能够取得以下技术效果：
1、在不增加探测器、物镜等成像系统所需硬件的基础上，以较为简单的方式组成成像系统，从而提高单次采集或单位时间内的信息维度，与此同时这种成像方式还具有极高的时间分辨率。
2、荧光通过分束器分别进行特定分束和光路折反，最终分别成像在探测器的不同位置，实现单维度探测器的多维度信息检出。
3、相对于离散的光学元件搭建，本发明将三棱镜和平行平板搭配组合成分束器，该分束器具有非常高的集成度和稳定性，在太空深海等一系列特殊工作环境具有重要应用价值。
附图说明
图1为根据本发明实施例提供的多色荧光显微成像系统的结构示意图；
图2为根据本发明实施例提供的分束器的第一种结构示意图；
图3为根据本发明实施例提供的分束器的第二种结构示意图；
图4为根据本发明实施例提供的分束器的第三种结构示意图；
图5为根据本发明实施例提供的分束器的第四种结构示意图；
图6为根据本发明实施例提供的分束器的第五种结构示意图；
图7为根据本发明实施例提供的分束器的第六种结构示意图；
图8为根据本发明实施例提供的分束器的第七种结构示意图；
图9为根据本发明实施例提供的探测器的N×M的靶面分割图。
其中的附图标记包括：物镜1、二向色镜2、会聚镜3、消色差中继镜组4、前置镜组401、后置镜组402、视场光阑403、筒镜5、分束器6、三棱镜601、平行分束板602～603、平行补偿板604～605、二向色面606～609、反射面610～611、探测器7、靶面701、被测物8。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
图1示出了根据本发明实施例提供的多色荧光显微成像系统的结构。
如图1所示，本发明实施例提供的多色荧光显微成像系统，包括物镜1、二向色镜2、会聚镜3、消色差中继镜组4、筒镜5、分束器6和探测器7；其中，激发光经会聚镜3的会聚、二向色镜2的反射聚焦于被测物8上，被测物8受激发出荧光，荧光通过物镜1进行收集，物镜1收集的荧光透过二向色镜2入射到消色差中继镜组4消除色差后进入筒镜5，经筒镜5会聚进入分束器6进行分束，分束后的各光束分别成像在探测器7上。
本发明提供的多色荧光显微成像系统以落射方式激发被测物8。
消色差中继镜组4包括前置镜组401、后置镜组402和视场光阑403，前置镜组401靠近二向色镜2，后置镜组402靠近筒镜5，视场光阑403设置在前置镜组401与后置镜组402之间。
物镜1、二向色镜2、会聚镜3、消色差中继镜组4、筒镜5、前置镜组401、后置镜组402、视场光阑403和探测器7均为现有技术，故在此不再赘述。
本发明的改进之处在于对分束器6的设计，下面分别对分束器6的几种结构进行详细说明。
图2示出了根据本发明实施例提供的分束器的第一种结构。
如图2所示，发明实施例提供的第一种分束器，包括分束棱镜，分束棱镜包括三棱镜601和平行分束板602，三棱镜优选为等腰直角棱镜，下面均以等腰直角棱镜为例进行说明，将三棱镜601的两个直角面分别作为入射面和出射面，三棱镜601的入射面与入射光束垂直，实现最大程度的通用性、透过率、消色差；将三棱镜601的斜面作为分束面，平行分束板602胶合在三棱镜601的分束面上，在平行分束板602与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜变为二向色面606，在平行分束板602的另一个面上镀有反射膜变为反射面610。
入射光束从三棱镜601的入射面垂直入射，到达平行分束板602的二向色面606，一部分光束被二向色面606反射后从三棱镜601的出射面垂直射出，另一部分光束透过二向色面606入射到反射面610，经反射面610反射后从三棱镜601的出射面垂直射出，通过二向色面的筛选实现二色分束。又由于一个三棱镜601只能使光束在一个维度上进行空间分离，所以一个三棱镜601配合一个二色向面能够实现光束的一维二色分束，分束后的光以不同光程入射到探测器的靶面701各探测区域上。
图3示出了根据本发明实施例提供的分束器的第二种结构。
如图3所示，发明实施例提供的第二种分束器是对第一种分束器的改进，在平行分束板602上层叠胶合有平行分束板603，此时，在平行分束板602与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜成为二向色面606，在平行分束板603与平行分束板602胶合的面上镀有二向色膜成为二向色面607，在平行分束板603的另一个面上镀有反射膜成为反射面610。相比第一种结构，叠加一层平行分束板603，多镀一层二向色膜，能够多进行一次分束，即通过一个三棱镜601配合两个二向色面实现一维三色分束。
基于此原理，如果想要更多次的分束，则不断的层叠胶合平行分束板，每增加一个平行分束板，在该平行分束板未胶合的一面镀反射膜，在其余的平行分束板上镀二向色膜，实现一维多色分束。
从分束器的第一种结构和第二种结构中可以看出，入射光束与出射光束垂直。
本发明实施例提供的第三种分束器能够实现入射光束与出射光束平行。
图4示出了根据本发明实施例提供的分束器的第三种结构。
如图4所示，本发明实施例提供的第三种分束器，包括分束棱镜，分束棱镜包括三棱镜601和平行分束板602，将三棱镜601的斜面作为入射面和出射面，入射面与入射光束垂直，将三棱镜601的一个直角面作为分束面，在三棱镜601的分束面上胶合有平行分束板602，在平行分束板602与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜变为二向色面606，在平行分束板602的另一个面上镀有反射膜变为反射面610，及在三棱镜601的另一个直角面上分别镀有反射膜变为反射面611。
入射光束从三棱镜601的斜面垂直入射，到达平行分束板602的二向色面606，一部分光束被二向色面606反射到三棱镜601的反射面611，经反射面611反射后从三棱镜601的斜面垂直射出，另一部分光束透过二向色面606入射到平行分束板602的反射面610，经反射面610反射到三棱镜601的反射面611，经反射面611反射后从三棱镜601的斜面垂直射出。通过改变平行分束板的胶合位置与二向色膜的镀膜位置，实现入射光束与出射光束的平行。
本发明实施例提供的第三种分束器同样能够实现光束的一维二色分束，分束后的光以不同光程入射到探测器的靶面701各探测区域上。
图5示出了根据本发明实施例提供的分束器的第四种结构。
如图5所示，本发明实施例提供的第四种分束器，包括分束棱镜，分束棱镜包括三棱镜601、平行分束板602和平行分束板603，将三棱镜601的斜面作为入射面和出射面，入射面与入射光束垂直，将三棱镜601的一个直角面作为分束面，平行分束板602与平行分束板603依次层叠胶合在三棱镜601的分束面上，在平行分束板602与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜变为二向色面606，在平行分束板603与平行分束板602胶合的面上镀有二向色膜变为二向色面607，在平行分束板603的另一个面镀有反射膜变为反射面610，在三棱镜601的另一个直角面上镀有反射膜变为反射面611。
本发明实施例提供的第四种分束器相比第三种分束器，多增加一个平行分束板，多进行一次分束，实现一维三色分束效果。若想要实现一维N色分束，则层叠胶合更多的平行分束板即可。
第一种分束器至第四种分束器的共同点是分束后的光之间存在光程差，以不同光程到达探测器的靶面71上。
如将二色向膜替换为半透半反膜，可实现物空间的多层成像。对于镀有半透半反膜的第一种分束器至第四种分束器，本发明还可以通过增加一个分束棱镜，两个分束棱镜垂直摆放，实现基于二维光束分离的立体成像。
如采用一个镀有半透半反膜的分束棱镜和一个镀有二色向膜的的分束棱镜，两个分束棱镜垂直摆放，则可实现二维多色立体成像。
本发明还可以增加平行补偿板的方式来补偿分束后的光之间的光程差，使分束后的光同时到达探测器的靶面71上。
图6示出了根据本发明实施例提供的分束器的第五种结构。
如图6所示，本发明实施例提供的第五种分束器，包括三棱镜601、平行分束板602和平行补偿板604，将三棱镜601的斜面作为入射面和出射面，入射光束与三棱镜601的斜面垂直，将三棱镜601的一个直角面作为分束面，平行分束板602胶合在三棱镜601的分束面，在平行分束板602与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜变为二色向面606，在平行分束板602的另一个面上镀有反射膜变为反射面610。将三棱镜601的另一个直角面作为补偿面，平行补偿板604胶合在三棱镜601的补偿面上，在平行补偿板604与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜变为二向色面607，二向色面607与二色向面606的功能相反，即在平行分束板602上与平行补偿板604上镀制功能相反的二色向膜，在平行补偿板604的另一个面上镀有反射膜变为反射面611。
入射光束从三棱镜601的斜面垂直入射，到达平行分束板602的二向色面606，一部分光束被二向色面606反射到平行补偿板604的二向色面607，透过二向色面607后到达平行补偿板604的反射面611，经反射面611反射后从三棱镜601的斜面垂直射出，另一部分光束透过二向色面606入射到平行分束板602的反射面610，经反射面610反射到平行补偿板604的二向色面607，经二向色面607反射后从三棱镜601的斜面垂直射出。
在平行补偿板604的两面镀制的二向色膜和反射膜起到补偿光程差的作用，能够使分束后的各路光到达探测器的靶面71的光程相同。
如图6所示，θ1为二向色面606与入射面的夹角；θ2为二向色面607与入射面的夹角；d1为平行分束板602的厚度；d2为平行补偿板604的厚度；△d2为光束的空间分离距离。
本发明采用一种最为普遍的情况：d1＝d2和θ1＝θ2＝45°，即三棱镜601为等腰直角棱镜，平行分束板602与平行补偿板604等厚。
当然，本发明也可以通过设计d1、d2的厚度和θ1、θ2的角度实现光程差的补偿，保证分束后的各路光能够同时到达在探测器面的探测面71上。
△d2与d1之间的关系式：
Figure BDA0003502677640000081
使用者可以根据不同的光束分离距离的需求来定制对应平行分束平板的厚度d1。
图7示出了根据本发明实施例提供的分束器的第六种结构。
如图7所示，本发明实施例提供的第六种分束器，包括三棱镜601、平行分束板602、平行分束板603、平行补偿板604和平行补偿板605，将三棱镜601的斜面作为入射面和出射面，入射光束与三棱镜601的斜面垂直，将三棱镜601的一个直角面作为分束面，平行分束板602与平行分束板603依次层叠胶合在三棱镜601的分束面，在平行分束板602与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜变为二色向面606，在平行分束板603与平行分束板602胶合的面上镀有二色向膜变为二色向面607，在平行分束板603的另一个面上镀有反射膜变为反射面610。将三棱镜601的另一个直角面作为补偿面，平行补偿板604和平行补偿板605依次层叠胶合在三棱镜601的补偿面上，在平行补偿板604与三棱镜601胶合的面上镀有二向色膜变为二向色面608，二向色面608与二色向面606的功能相反，即在平行分束板602上与平行补偿板604上镀制功能相反的二色向膜，在平行补偿板605与平行补偿板604胶合的面上镀制有二向色膜变为二向色面609，二向色面609与二色向面607的功能相反，即在平行补偿板605与平行分束板603上镀制功能相反的二向色膜，在平行补偿板605的另一个面上镀有反射膜变为反射面611。
入射光束从三棱镜601的斜面垂直入射，到达平行分束板602的二向色面606，一部分光束被二向色面606反射到平行补偿板604的二向色面607，透过二向色面608与二向色面609后到达平行补偿板605的反射面611，经反射面611反射后从三棱镜601的斜面垂直射出，另一部分光束透过二向色面606入射到平行分束板603的二色向面607再次分束，再次分束的一部分光束依次经二色向面607的反射、二向色面608的透射、二向色面609的反射后从三棱镜601的斜面垂直射出，再次分束的另一部分光束透过二色向面607到达反射面610，经反射面610反射到二向色面608，再经二向色面608反射后从三棱镜601的斜面垂直射出。
本发明实施例提供的第六种分束器相比第五种分束器能多进行多一次分束，实现一维三色分束。若想实现一维N色分束，则层叠胶合更多的平行分束板与平行补偿板即可。
图8示出了根据本发明实施例提供的分束器的第七种结构。
如图8所示，本发明实施例提供的第七种分束器，包括两个分束棱镜，分束棱镜的结构与第五种分束器中分束棱镜的结构相同，第七种分束器的两个分束棱镜垂直摆放，两个分束棱镜分别实现两个维度上的光束空间分离，分束棱镜的二维垂直复用，实现了二维四色分束成像的效果，由此可以继续拓展到多个分束棱镜的任意相互夹角的复用，可以根据需要遵循此复用思路，设计所需分束棱镜的组合体，实现多色多维度的光束空间分离。
如果第七种分束器的一个分束棱镜能够分出N路光束，另一个分束棱镜能够分出M路光束，最终可实现N×M的靶面分割效果。如图9所示，经过两个分光棱镜分束后的探测器的靶面71将被分为N×M个区域，每个区域对应视场相同，但有着不同的光谱、离焦、偏振、强度等信息。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种多色荧光显微成像系统，其特征在于，包括：物镜、二向色镜、会聚镜、消色差中继镜组、筒镜、分束器和探测器；其中，激发光经所述会聚镜、所述二向色镜聚焦于被测物激发出荧光，所述荧光通过所述物镜收集，再经所述消色差中继镜组与所述筒镜后会聚进入所述分束器进行分束并分别成像在所述探测器上。
2.如权利要求1所述的多色荧光显微成像系统，其特征在于，所述分束器包括分束棱镜，所述分束棱镜包括三棱镜、平行分束板和平行补偿板，所述三棱镜的斜面与入射光束垂直，所述平行分束板与所述平行补偿板的数量均为N个，N≥1，N个平行分束板胶合与N个平行补偿板分别层叠胶合在所述三棱镜的两个直角面上，在所述三棱镜的一个直角面与平行分束板之间的胶合面上、各层叠的平行分束板之间的胶合面上分别镀有第一二向色膜，在所述三棱镜的另一个直角面与平行补偿板之间的胶合面上、各层叠的平行补偿板之间的胶合面上分别镀有与所述第一二向色膜功能相反的第二二向色膜，以及在最外侧的平行分束板与最外侧的平行补偿板未胶合的一面分别镀有反射膜。
3.如权利要求2所述的多色荧光显微成像系统，其特征在于，所述分束棱镜的数量为两个，且相互垂直摆放。
4.如权利要求1所述的多色荧光显微成像系统，其特征在于，所述分束器包括分束棱镜，所述分束棱镜包括三棱镜和平行分束板，所述三棱镜的一个直角面与入射光束垂直，所述平行分束板的数量为N个，N≥1，N个平行分束板层叠胶合在所述三棱镜的斜面上，在所述三棱镜与所述平行分束板的胶合面上以及各层叠的平行分束板之间的胶合面上分别镀有二向色膜，在最外侧的平行分束板未胶合的面上镀有反射膜。
5.如权利要求1所述的多色荧光显微成像系统，其特征在于，所述分束器包括分束棱镜，所述分束棱镜包括三棱镜和平行分束板，所述三棱镜的斜面与入射光束垂直，所述平行分束板的数量为N个，N≥1，N个平行分束板层叠胶合在所述三棱镜的一个直角面上，在所述三棱镜与所述平行分束板的胶合面上以及各层叠的平行分束板之间的胶合面上分别镀有二向色膜，在最外侧的平行分束板未胶合的面上以及在所述三棱镜的另一个直角面上分别镀有反射膜。
6.如权利要求1～5中任一项所述的多色荧光显微成像系统，其特征在于，所述消色差中继镜组包括前置镜组、后置镜组和视场光阑，所述前置镜组靠近所述二向色镜，所述后置镜组靠近所述筒镜，所述视场光阑设置在所述前置镜组与所述后置镜组之间。
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