WO2018096003A1 - Mikroskop zur abbildung eines objekts - Google Patents

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WO2018096003A1
WO2018096003A1 PCT/EP2017/080131 EP2017080131W WO2018096003A1 WO 2018096003 A1 WO2018096003 A1 WO 2018096003A1 EP 2017080131 W EP2017080131 W EP 2017080131W WO 2018096003 A1 WO2018096003 A1 WO 2018096003A1
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WO
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radiation
illumination
illumination radiation
beam path
monitoring device
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PCT/EP2017/080131
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michael GÖGLER
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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    • G—PHYSICS
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    • G02B21/00—Microscopes
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    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/245—Devices for focusing using auxiliary sources, detectors

Definitions

  • the invention relates to a microscope for imaging an object, comprising an objective for imaging the object by an imaging beam, a light source for generating
  • Energy parameter of the illumination radiation comprises, wherein the monitoring device determines an energy parameter of a radiation incident on it.
  • the intensity of the illumination radiation emitted by the light source can also be determined during the measurement of the sample.
  • the object of the invention is to provide a microscope that provides improved monitoring of the energy parameter of the illumination radiation.
  • the invention is defined in claim 1. Preferred embodiments are subject of the dependent claims.
  • the invention provides a reflected-light microscope for imaging an object, which comprises a lens for imaging an object through an imaging beam path, a light source for generating illumination radiation, a monitoring device for monitoring a
  • Energy parameter of the illumination radiation and a beam splitter device comprises.
  • the monitoring device determines an energy parameter of a radiation incident on it.
  • the beam splitter device is arranged upstream of the objective in the illumination direction and couples one of the illumination radiation to the monitoring device.
  • the microscope further comprises at least one optical element for coupling the illumination radiation in the imaging beam path.
  • the imaging beam path is free of optical imaging elements between the beam splitting device which decouples the measuring radiation and the object. Since the microscope is a reflected-light microscope, the illumination radiation is coupled in countercurrent to the imaging beam path and then guided via the objective into the object (usually a sample). Between this location of the coupling and the object, the imaging beam path thus contains the
  • Illumination beam path There, the illumination radiation is directed towards the object and the imaging radiation away from the object.
  • This section is commonly referred to as
  • the beam splitter device for decoupling the measuring radiation on the
  • Monitoring device is arranged in the common beam path close to the lens, so that the decoupled by the beam splitter measuring radiation is very precisely proportional to the energy parameter of the illumination radiation, which is focused by the lens on the object.
  • all the changes in the energy parameter of the illumination radiation which are caused by previously passed filters, optical elements or other effects are thus detected by the monitoring device by the monitoring device.
  • the monitoring device detects a signal that is particularly precise with the
  • Energy parameter of the illumination radiation in the object itself matches. In particular, it is not necessary to take account of the effects of inserted filters, lenses or beam splitters by calculations or other considerations, since the measurement radiation is only decoupled from the illumination radiation when the illumination radiation passed through these elements, etc. At the same time it is possible to change the energy parameter of the
  • Illumination radiation also during the examination of the object to determine. This allows, in particular, a regulation of the light source to a constant energy parameter of the illumination radiation in the object. This reduces the user interaction, thereby
  • the measured data obtained with regard to the illumination of the object can be linked to the recorded images, so that a particularly precise documentation with regard to the lighting conditions is obtainable.
  • the energy parameter can be the intensity or the power or fluence.
  • the microscope can be used both for fluorescence microscopy and for laser-based techniques, in particular in the wide field. Furthermore, it is possible to use the microscope Illuminating radiation that causes optical manipulation techniques such as FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) or FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching).
  • the microscope with different wavelengths can illuminate and / or image and / or edit the object, for. B. by laser ablation.
  • the microscope may be a confocal microscope or a microscope for imaging the object in the far field.
  • the microscope is designed to stimulate emission of fluorescent light in the object and to detect the fluorescent light emitted by the object.
  • the object can be provided, for example, with fluorescent dyes.
  • the object can be understood as any sample, body or structure that is to be imaged with the aid of the microscope.
  • the object may comprise a biological sample.
  • the lens focuses the illumination radiation into the object and simultaneously serves to image the object, i. for detecting the radiation generated or reflected by the object.
  • An image of the object is generated by means of the imaging beam path, at the end of which an image detector for converting the radiation guided by the imaging beam path into electrical signals is produced.
  • a controller may convert the electrical signals into an electronic image of the object, e.g. B. displayed on a display device and / or stored.
  • the light source may comprise a laser, a white light source such as a halogen or mercury lamp, or a light emitting diode (LED) or a combination thereof.
  • the light source illumination light in a wide
  • the light source comprises several
  • the light source is connected to the control device which controls the intensity or the power of the illumination radiation.
  • the light source can provide parallelized illumination radiation, or the light source is preceded by a lens or lens system, for example a microlens array, by means of which the radiation provided by the light source can be parallelized.
  • the control device which controls the intensity or the power of the illumination radiation.
  • the light source can provide parallelized illumination radiation, or the light source is preceded by a lens or lens system, for example a microlens array, by means of which the radiation provided by the light source can be parallelized.
  • the light source is connected to the control device which controls the intensity or the power of the illumination radiation.
  • the light source can provide parallelized illumination radiation, or the light source is preceded by a lens or lens system, for example a microlens array, by means of which the radiation provided by the light source can be parallelized.
  • the lens or lens system for example a microlens array
  • Illumination radiation in the illumination beam path are not parallelized out. Whether the illumination radiation is parallelized depends not least on the imaging process carried out with the microscope. In laser scanning microscopes and in optical manipulation techniques, the illumination radiation is usually parallelized; In far-field imaging or TIRF experiments (Total Internal Reflection Fluorescence), however, the illumination radiation is usually convergent through the illumination beam path.
  • the optical element is used for coupling the illumination radiation in the
  • the optical element may be, for example, a dichroic mirror which reflects radiation in the wavelength range of the illumination radiation and radiation in the wavelength range of the image, for. B. generated by the object fluorescence radiation transmitted. It is also possible to exchange the reflection and transmission behavior of the optical element.
  • the illumination beam path for guiding the optical element may be, for example, a dichroic mirror which reflects radiation in the wavelength range of the illumination radiation and radiation in the wavelength range of the image, for. B. generated by the object fluorescence radiation transmitted. It is also possible to exchange the reflection and transmission behavior of the optical element.
  • Illumination radiation from the light source to the object and the imaging beam path in this case run identically from the optical element to the objective / object.
  • the monitoring device determines the energy parameter of the incident radiation on them, z. As the intensity or the power of the measuring radiation.
  • Monitoring device can be configured as a photodetector, CCD sensor or the like and is in particular designed to detect radiation in a wavelength range from 355 nm to 700 nm; it also has, for example, a dynamic range of 10 5 . If the microscope is also used for optical manipulation techniques, such as optical tweezers, the monitoring device is able to detect the wavelength (s) used, eg 1064 nm or 800 nm. Preferably, the monitoring device with the
  • the beam splitter device can be designed as a beam splitter with a predetermined transmission and reflection behavior. Furthermore, it is possible that the beam splitter device is a glass plate arranged in the imaging beam path. In particular, the
  • Beam splitter device configured such that the measuring radiation, on the
  • Monitoring device is decoupled, small compared to the proportion of
  • Illuminating radiation is, which continues to the lens / object. For example, only 15%, 10%, 5% or 1% of the illumination radiation will be measured radiation on the
  • the beam splitter device is optionally arranged in an infinity space, which is located in the imaging beam path between the
  • the infinity space is the space between the objective and the tube lens.
  • Energy parameter of the illumination radiation, as it arrives in the object can change.
  • Imaging beam path between the beam splitter device and the lens provided. Namely, optical imaging elements have the effect that the energy parameter of the illumination radiation in the object would be changed and this change would not be detected by the monitoring device. Thus, the monitoring device could not directly detect the present in the object energy parameters of the illumination radiation.
  • the beam splitter device is arranged in the common beam path immediately adjacent to the lens.
  • An exception is a shutter, which blocks the illumination radiation in the closed state and is open during microscopy. He does not look at the microscope.
  • the control device optionally has a memory in which a relationship between the energy parameter of the measuring radiation and the energy parameter of
  • Illumination radiation is deposited on the object.
  • the relationship serves the associated actual value of the energy parameter of the measuring radiation associated
  • the control device can control the light source in such a way that the energy parameter of the illumination radiation generated by the light source has a predetermined desired energy parameter within a tolerance range.
  • the portion of the illumination radiation absorbed or reflected by the objective and / or the portion of the illumination radiation transmitted by the objective can be used as parameters, eg. B. in the form of a transmissivity, received.
  • This value can be known for the respective lens or determined before the actual measurement of the object. In particular, this value is dependent on the wavelength stored in the memory; the relationship can be wavelength dependent. Furthermore, it is stored in the memory of the control device as to what ratio the measuring radiation is to the remaining illumination radiation.
  • the control device can preferably calculate the power of the illumination radiation existing in the object from the energy parameter of the measuring radiation detected by the monitoring device. For example, the power LO present in the object, the power L determined with the monitoring device, the proportion of the radiation A coupled out by the beam splitter device and the
  • Transmittance of the objective T via the following equation: If the intensity is to be used as the energy parameter instead of the power, the power is divided by the area of the radiation on the monitoring device.
  • the surface may be known, or the monitoring device is spatially resolving and thus at the same time allows an area measurement of the steel cross section of the measuring radiation.
  • the control device optionally controls the light source such that the energy parameter of the illumination radiation generated by the light source takes into account the light source
  • the desired energy parameter may be the desired value with which the object is to be illuminated.
  • the control device can therefore keep the value of the energy parameter in the object constant.
  • Imaging elements are provided, other parameters such as filters, pinholes or
  • control device may comprise a detection device, by means of which the type or the type of the objective, which is arranged in the imaging beam path, are determined, and knows information about the transmission behavior of the respective lenses arranged in the imaging beam path.
  • the microscope preferably also has an interface for an autofocus device for determining the focus of the objective in the object, wherein the interface has a
  • Beam splitter then has a dual function, on the one hand objectively
  • the reflected-light microscope therefore has an autofocus device for
  • the autofocus device has an autofocus beam path for guiding autofocus radiation to the objective.
  • Beam splitter has a dual function, on the one hand on the object side
  • the light source the optical element and / or the
  • the common beam path between the beam splitting device which decouples the measuring radiation and the objective is free of optical imaging elements.
  • the interface is designed such that the
  • Autofocus device can be connected and at the same time for the
  • Autofocus device relevant radiation through the interface can be performed.
  • the autofocus device may have an optional interface for the monitoring device. It is also possible that the autofocus device is a module
  • Autofocus device and monitoring device is.
  • the interface is, for example, a thread, and the autofocus beam path may comprise a cross section through which the autofocus radiation is directed.
  • the autofocus device can be a separate element from the microscope and be designed as described in WO 2007/144197 A1, DE 102008018952 A1 or DE 102008018864 A1.
  • the autofocus device has a
  • Autofocus light source which is used to generate the auto focus radiation.
  • Autofocus radiation is guided by means of the autofocus beam path via the beam splitter device to the objective and thus onto the object. From the object, the autofocus radiation is reflected or scattered, through the lens TOTAL Melt and fed via the beam splitter means of the autofocus beam path to an autofocus detector.
  • a beam splitter can be provided in the autofocus device, with which the coupling in of the autofocus radiation generated by the autofocusing light source and / or decoupling of the autofocus radiation originating from the object to the autofocus detector takes place.
  • Autofocus measuring radiation which is guided to the autofocus detector, is here combined under the term "autofocus radiation.” They are coupled in and out jointly via the beam splitter device, but it is also possible that a further beam splitter is provided in the imaging beam path, by means of which autofocus radiation In this embodiment, it is thus possible that the autofocusing light source and the autofocus detector on
  • an obliquely arranged grating may be placed, which is imaged into the object, so that the backscattering on the object with the aid of the
  • Autofocus detector is monitored and thus the position of the focus is determined.
  • the autofocus light source in the object may generate a point-shaped spot of light whose sharpness or extent may be generated by means of the autofocus detector is measured and thus conclusions about the position of the focus are closed.
  • the autofocus device is connected to the control device, wherein the control device can adjust or correct the position of the focus on the basis of the values determined by the autofocus device.
  • the autofocus radiation is preferably in a wavelength range that is not for imaging the object
  • the autofocus radiation is in the infrared
  • Wavelength range and the illumination radiation in the visible wavelength range are in particular formed in one piece or in one piece, so that the lens side surface of the beam splitter device and the light source side surface of the
  • the already mentioned shutter is provided in the imaging beam path between the beam splitter device and the object, which blocks the common beam path in an operating state so that no illumination radiation reaches the object.
  • the shutter is usually with the shutter
  • Illumination radiation pass unhindered.
  • the shutter is also optionally used in optical manipulation experiments such as FRAP and / or laser ablation and / or FLIP.
  • the illumination device is used to manipulate the object.
  • the illumination radiation has a much higher power. This means that z. B. bleached or ablated with the illumination device, and the object is imaged to document the fluorescence.
  • these experiments take place at two different wavelengths, which are then used simultaneously; one wavelength range for bleaching or ablating and the other wavelength range for imaging.
  • the shutter may optionally be dichroic, ie for blocking (only) the illuminating radiation, and other wavelengths may transmit it.
  • the extent of the illumination radiation in the object can be set with the aid of a field diaphragm, which is arranged in an intermediate image plane conjugate to the object plane.
  • the field diaphragm is arranged downstream of the light source and arranged in particular in the illumination direction in front of the beam splitter device, for. B. outside the common beam path in the illumination beam path, z. B. between the optical element and the light source.
  • the field stop has a drive which is connected to the control device.
  • the control device can also be designed to detect a degree of opening of the field diaphragm, for example to detect a manual adjustment of the field diaphragm.
  • the decoupling of the measuring radiation from the illumination radiation or the coupling or decoupling of the autofocus radiation is particularly easy when the
  • the beam splitting device is disposed in a portion in which the common beam path is parallelized, between the optical element and the lens.
  • the beam splitter device can thus be arranged in the infinity space.
  • the mentioned shutter is usually provided in the portion of the common optical path which is in infinity space.
  • the microscope has a monitoring diaphragm, which is arranged between the beam splitter device and the monitoring device and whose opening is adjustable, and a control device which controls the opening of the monitoring diaphragm depending on the effective aperture of the objective established.
  • the effective aperture corresponds in particular to the extent of the illumination radiation as it enters the objective in the direction of illumination. If the extent of the illumination radiation is greater than the aperture of the objective, the effective aperture corresponds to the aperture of the objective. If the extent of the illumination radiation at the objective is smaller than the aperture of the objective, for example by being limited by the field diaphragm, the effective aperture corresponds to the diameter of the field diaphragm.
  • the monitoring panel can be replaced with a different opening, z. B. by the desired monitoring aperture is pushed by a slider in the measuring radiation.
  • the diameter of the measuring radiation can be adapted to the effective aperture with the aid of the monitoring diaphragm.
  • the monitoring diaphragm can be connected to the control device which adjusts the aperture of the monitor aperture to the effective aperture.
  • the effective aperture can be determined, for example, on the aperture of the objective, in particular if the diameter of the illumination radiation is greater than that of the objective, or by detecting the opening of the field diaphragm. In this way, the
  • Extension of the lens transmissive illumination radiation and the measuring radiation are equal.
  • the cross section of the measuring radiation is adjusted in such a way that the same proportion of the illumination radiation can pass through the objective and the monitoring diaphragm. In this way, deviations between the measured and the energy parameters present in the object due to a non-uniform intensity profile or power profile of the illumination radiation, such as a Gaussian profile, can be minimized.
  • a monitoring optics is arranged downstream of the beam splitter, which focuses the measuring radiation on the monitoring device, wherein preferably the
  • Monitoring device comprises a non-spatially resolving detector, such as a photodiode having. Together with the monitoring aperture, it is then possible to use a non-spatially resolving detector and still the diameter of the
  • non-spatially resolving detectors are usually smaller than spatially resolving detectors and, moreover, have a simpler design, space and effort can thus be saved.
  • the detection of the effective aperture can also be done by the
  • Monitoring device has a spatially resolving detector, z. B. a CCD (charge-coupled device) sensor. With the help of the spatially resolving detector you can use the CCD (charge-coupled device) sensor.
  • the microscope has at least one filter for attenuating and / or absorbing at least one wavelength range of the illumination radiation which is arranged between the beam splitter device and monitoring device.
  • the filter can be used to attenuate the entire wavelength range of the
  • the filter allows a larger one
  • the filter can also be designed as a bandpass filter, which only allows radiation of a specific wavelength range to pass through.
  • the monitoring device is designed to detect radiation in a predetermined wavelength range, such a filter can avoid measurement errors due to radiation from other wavelength ranges.
  • the filter may be provided as a long-pass or short-pass to block unwanted radiation from the monitoring device, for. B. autofocus radiation or radiation of the fluorescent light.
  • one or more filters are provided in the manner described above between the beam splitting device and the monitoring device.
  • the filter can be fed in and out in the part of the illumination radiation coupled out as measuring radiation.
  • the detection of the measurement radiation can be optimized depending on the wavelength range of the illumination radiation.
  • the microscope is a filter drive for
  • the filter drive may comprise, for example, an electric motor or a linear drive.
  • the filter drive is in particular connected to the control device, so that the position of the at least one filter can be controlled with the aid of the control device.
  • the control device can, for example, automatically move the corresponding filter between the beam splitter device and the monitoring device, depending on the wavelength range of the illumination radiation and the energy parameter of the illumination radiation. Alternatively, this can also be done manually.
  • the beam splitter device may have a drive, which is preferably connected to the control device.
  • the illumination radiation is coupled into the object with the maximum possible energy parameter, since no measuring radiation is then separated off.
  • the beam splitter device can only be placed in the common beam path if the monitoring of the light source is actually desired.
  • the energy parameter of the illumination radiation is computationally corrected, namely with respect to the measurement radiation when the beam splitter device is in / not in the common beam path.
  • the monitoring device can have detectors for detecting the illumination radiation in a broadband wavelength range.
  • the monitoring device it is possible for the monitoring device to have one or more detectors which detect radiation of only a specific wavelength range. Nevertheless, to several wavelength ranges can capture, a device for splitting the illumination beams after
  • Wavelength regions may be provided, such as a prism and / or a grid. These are then upstream of the detectors of the monitoring device in the illumination direction. In addition, it is possible that the monitoring device a
  • Spectrometer includes. Due to the possibility of detecting a plurality of wavelength ranges, it is possible with the aid of the monitoring device to detect which of several
  • Light sources is being used just to illuminate the object. This is particularly helpful if the object with illumination radiation in different
  • Wavelength ranges successively or sim ultan illuminated.
  • the control device determines a wavelength of the illumination radiation and / or arranged in the illumination radiation excitation filter.
  • the wavelength or the wavelength range of the illumination radiation can be detected by detecting the currently activated light source, the spectral range of the light source being stored in the control device.
  • the wavelength range of the illumination radiation can be modified via an excitation filter.
  • an excitation filter is used as a bandpass with a transmission range of 510 nm to 550 nm. To determine the excitation filter can its
  • control device can detect the position of a revolver on which a plurality of excitation filters are arranged. In order to determine the properties of the excitation filter, it can be provided that the control device uses a database in which the transmission spectra of the excitation filters used are stored.
  • the energy parameter by means of which the object is illuminated can be adapted with regard to the wavelength range of the illumination radiation.
  • Parameters of the objective may be the numerical aperture, the instantaneous field of view, the magnification, the aperture and / or the object field.
  • one parameter may be the transmission characteristic and / or the reflection characteristic - as well
  • the parameters of the objective can be input manually, stored in the control device or determined by the control device.
  • the Control device can detect the position of the revolver and thus determine which lens is arranged in the illumination beam path.
  • the control device can be connected to a sensor which can detect the position of the revolver.
  • the lenses are provided with a marking, for example an RFID chip, and a sensor connected to the control device determines the respective objective on the basis of the marking.
  • Illumination radiation a profile of the illumination radiation, a convergence of the illumination radiation and / or an existing between the object and the objective immersion medium depends.
  • the diameter of the illumination radiation can be adjusted, for example, by means of a field diaphragm.
  • the control device can be connected to a sensor which can detect the size of the opening of the field diaphragm. Furthermore, it is possible to manually enter the diameter of the illumination radiation,
  • the diameter of the illumination radiation can also be adjusted by the fact that the diameter of the illumination radiation for the respective light source is known.
  • the profile of the illumination radiation can be determined, for example, by knowing the profile of the illumination radiation for each of the light sources used.
  • the convergence of the illumination radiation may depend on the particular type of microscope or the measurement to be made. For example, the radiation is convergent for wide field imaging or Total Internal Reflection Microscopy (TIRF). In laser scanning microscopes, optical tweezers or optical manipulations, the illumination beams can be parallel. This can be communicated to the control device, for example, via an input interface.
  • All mentioned parameters as well as the immersion medium present between the objective and the object have an influence on the energy parameter of the illumination radiation in the object.
  • the relationship can be modified to provide a more accurate association between the energy parameter of the measurement radiation and the energy parameter of the illumination radiation in the object.
  • the mentioned parameters can therefore be considered as variables in the context.
  • the light source is formed
  • Illuminating radiation with at least two different wavelengths simultaneously generate and / or that the monitoring device is designed to determine the energy parameter of the illumination radiation for at least two different wavelengths.
  • the energy parameter of the illumination radiation it is also possible to use the energy parameter of
  • Control illumination radiation in the object simultaneously for two different wave ranges Preferably, this can also be carried out for three or more different wavelength ranges.
  • a corresponding relationship is stored in the control device for each wavelength range.
  • an element can be provided between the beam splitter for decoupling the measuring radiation from the illuminating radiation and the objective.
  • an element can be provided between the beam splitter for decoupling the measuring radiation from the illuminating radiation and the objective.
  • Laser scanning microscopy often uses differential interference contrast, wherein a prism, eg a Wollaston prism, is introduced into the objective pupil directly in the imaging direction behind the objective, which may also be wavelength-dependent, which is then taken into account in this embodiment can.
  • a prism eg a Wollaston prism
  • Fig. 1 is a schematic representation of a first embodiment of the microscope
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a second embodiment of the microscope
  • FIG. 3 is a schematic representation of a third embodiment of the microscope.
  • a reflected-light microscope 10 according to the embodiment shown in FIG. 1 serves to image an object 12, in particular in the wide field.
  • the microscope 10 can also be designed as a confocal microscope; In this case, there is usually a pinhole in the beam path.
  • the object 12 may contain fluorescent dyes or substances that emit fluorescence radiation after stimulation.
  • the microscope 10 comprises an objective 14, a light source 16, an optical element 18, a monitoring device 20, a beam splitting device 22, an interface 23 for an autofocus device 24, an imaging detector 26 and a control device 28.
  • the objective 14, the beam splitting device 22, the optical element 18 and a lens element 30 and the imaging detector 26 form an imaging beam path 32.
  • the light source 16, the optical element 18, the beam splitter device 22, and the objective 14 form an illumination beam path 34.
  • Illumination beam path 34 extend between the objective 14 and the optical element 18 in a common beam path.
  • the objective 14 therefore serves both to focus the illumination radiation of the illumination beam path 34 on the object 12 and to image the object 12 through the imaging beam path 32.
  • the object 12 is connected to the objective 14 and the lens
  • Lens element 30 is imaged onto the imaging detector 26;
  • the lens element 30 can be considered as a tube lens.
  • the imaging detector 26 converts the radiation incident thereon into electrical signals, e.g. B. transmitted by a line to the controller 28.
  • the control device 28 generates from the electrical signals an image of the object 12, which can be displayed on a display device, not shown.
  • the image of the object 12 may be, for example, a fluorescence image.
  • the light source 16 may be formed as a laser, light emitting diode (LED) or as a white light source.
  • the light source 16 preferably generates parallelized
  • the light source 16 may have a lens or lens system, not shown in the figure, which / which parallelises the illumination radiation.
  • the optical element 18, which is formed, for example, as a dichroic mirror the illumination radiation is coupled into the imaging beam path 32.
  • Illumination radiation includes z. B. a wavelength range which serves to stimulate fluorescence radiation in the object 12.
  • the radiation emitted by the object 12 preferably has a different wavelength range than the wavelength range of the illumination radiation, so that the optical element 18 is generally dichroic and acts only on the illumination radiation.
  • the beam splitter device 22 which z. B. may be formed as a beam splitter, a proportion of the illumination radiation as measuring radiation from the common beam path, in particular wavelength-independent, separated and fed to the monitoring device 20.
  • the decoupled portion of the illumination radiation can be, for example, 10%, 5% or 1% of the intensity or the power of the illumination radiation before the separation.
  • the monitoring device 20 is in the guided in Figure 1 embodiment of the microscope 10 as a spatially resolving detector such. B. as a CCD sensor (charge-coupled device), formed which spatially converts the incoming radiation to it into electrical signals.
  • the electrical signals generated by the monitoring device 20 are passed via a line to the controller 28.
  • the electrical signals generated by the monitoring device 20 are in particular proportional to the intensity or power of the radiation incident on the monitoring device 20, so that the
  • Control device 28 from the signals can determine the incident on the monitoring device 20 intensity of the measuring radiation.
  • control device 28 has a memory 36 in which an optionally wavelength-dependent relationship is stored, which describes which
  • the memory 36 may be, for example, a recordable or non-writable storage medium such as a RAM or ROM. Based on the detected by the monitoring device 20
  • the control device 28 determines the energy parameter of the illumination radiation, which is provided by the light source 16 is available. Far more important, however, is that the control device 28 determines the energy parameter of the illumination radiation in the object 12 via the relationship. The relationship links the energy parameter of the measuring radiation with the energy parameter of the
  • the control device 28 now optionally controls the light source 16 such that the energy parameter of the generated by the light source 1 6
  • Illumination radiation within a tolerance range with a predetermined target energy parameter matches.
  • the relationship may depend on parameters of the lens 14.
  • Parameters of the objective 14 may be the numerical aperture, the instantaneous field of view, the magnification, the aperture or the object field.
  • One parameter of the lens 14 is optional
  • Control device 28 may be connected to the lens 14, for example, to determine which type or type of lens is currently provided in the common beam path 32.
  • a plurality of objectives 14 may be arranged on a revolver and the control device 28 may detect which of the lenses 14 is currently located in the common beam path.
  • a relationship is stored in the memory 36, which indicates the wavelength-dependent transmission and / or reflection behavior of the lens 14.
  • the aperture of the lenses 14 to be used in the microscope 10 can also be deposited.
  • the control device 28 can in particular precisely present the energy parameter of the object 12
  • Illuminating radiation For example, the power LO present in the object 12, the power L determined with the monitoring device 20, the proportion of the power of the Beam splitter 22 coupled out radiation A and the transmittance of the lens 14 T via the following equation:
  • the control device 28 also determines a beam cross section of the measuring radiation. If the extent of the illumination radiation is greater than the aperture of the objective 14, not all of the illumination passes through the objective 14, and not all the available ones
  • Illumination radiation is focused on the object 12.
  • the proportion of the unexposed illumination radiation can thus be taken into account when determining the energy parameter of the illumination radiation in the object if the relationship has the aperture of the objective 14 as a parameter.
  • Illumination radiation can also be determined by being known for the respective light source 16.
  • the profile of the illumination radiation can be determined, for example, by knowing the profile of the illumination radiation for each light source 16 used.
  • the convergence of the illumination radiation may depend on the particular type of microscope or the measurement to be made. For example, the radiation is for
  • the illumination radiations may be parallel. This information can be, for example, the
  • Control device 28 are provided via an input interface.
  • the context can be modified so that it provides a more accurate indication of the energy parameter of the illumination radiation in the object of the
  • Energy parameter of the measuring radiation provides.
  • the relationship can therefore have the mentioned parameters as variables.
  • the light source 16 may be configured to simultaneously generate illumination radiation with at least two different wavelengths. Furthermore, the light source 16 may be configured to simultaneously generate illumination radiation with at least two different wavelengths. Furthermore, the light source 16 may be configured to simultaneously generate illumination radiation with at least two different wavelengths. Furthermore, the light source 16 may be configured to simultaneously generate illumination radiation with at least two different wavelengths. Furthermore, the light source 16 may be configured to simultaneously generate illumination radiation with at least two different wavelengths. Furthermore, the light source 16 may be configured to simultaneously generate illumination radiation with at least two different wavelengths. Furthermore, the
  • Monitoring device 20 may be formed, the energy parameters of
  • the autofocus device 24 may be a separate element relative to the microscope 10 and generates autofocus illumination radiation whose wavelength range preferably does not coincide with the wavelength range of the illumination radiation or with the wavelength range of the fluorescence radiation generated by the object 12.
  • the monitoring device 20 detects the position of the focus of the objective 14 from the autofocus measurement radiation obtained from the object and transmits this information to the control device 28.
  • the control device 28 can then keep the focus of the objective 14 constant. But this can also be achieved by a separate control. Thus, by driving the lens 14, for example, drift and other effects can be compensated.
  • the beam splitter 22 is equipped with a dichroic mirror which reflects the autofocus radiation and the illumination radiation and the
  • the properties of the dichroic mirror and the beam splitter may be realized in a single optical beam splitter layer.
  • the beam splitting device 22 is preferably a one-piece element with coatings which influence its reflection or transmission behavior.
  • the common beam path is free of optical imaging elements between the objective 14 and the beam splitter device 22; in the embodiment shown in Figure 1, no elements are provided in this area. There, the radiation is approximately parallelized; this corresponds to the infinity space.
  • Autofocus device 24 is not shown, it may also be provided in Figure 2. In the following, only the other differences between the two embodiments according to FIGS. 1 and 2 are discussed:
  • a shutter 38 is provided between the lens 14 and the beam splitter 22.
  • the shutter 38 is connected to the control device 28 via a line and can be switched by the control device 28 into two operating states. In an operating state, the shutter 38 blocks the common beam path, so that no
  • Illumination radiation can reach the object 12.
  • the shutter 38 is opened, so that the common beam path is free.
  • the light source 16 is arranged downstream of a field diaphragm 41, by means of which the field size of the illumination radiation can be changed.
  • the field diaphragm 41 is connected via a line m with the control device 28, wherein the control device 28 position and / or size of the opening of the
  • Control field diaphragm 41 and / or can ermetteln In this way it is possible to change the cross section of the illumination radiation in front of the common beam path.
  • the monitoring device 20 in the embodiment shown in FIG. 2 is a non-spatially resolving detector, for example a
  • Photodiode formed. This occupies less space compared to the spatially resolving detector according to FIG. 1 and is simpler in design. To the measuring radiation on the
  • Monitoring device 20 to focus, a monitoring optics 42 between the beam splitter 22 and the monitoring device 20 is arranged.
  • Monitoring optics 42 may include one or more lenses. The monitoring optics 42 focuses the measurement radiation, which was coupled out of the parallelized illumination beam path 34, onto the monitoring device 20.
  • an optional iris diaphragm 44 and an optional filter 46 are arranged between the beam splitting device 22 and the monitoring device 20.
  • the iris diaphragm 44 is connected to the control device 28, whereby the control device 28 has an opening of the iris diaphragm can change in size and / or determine.
  • the control device 28 controls the iris diaphragm 44 such that its opening coincides with the effective aperture of the objective 14. In this way, the cross section of the measurement radiation and the cross section of the illumination radiation in the illumination beam path 34, which passes through the objective 14, have the same size.
  • the intensity of the existing in the object 12 can be
  • the effective aperture of the objective 14 is determined as described above from the type or type of the objective 14 and the size of the opening of the field diaphragm 41.
  • the filter 46 may be provided on the one hand to attenuate, in particular wavelength-independent, the measuring radiation, z. B. to avoid damage to the monitoring device 20 or to increase the measuring range of the monitoring device 20 in terms of intensity.
  • the filter 46 may be configured to receive unwanted radiation which is the result of measuring the intensity of the radiation
  • Illuminating radiation could falsify blocks.
  • radiation is in the
  • the filter 46 may be formed as a bandpass, so that on the
  • the microscope 10 may include one or more filters 46 as described above.
  • the microscope 10 has a filter drive 48, by means of which the filter 46 can be exchanged or removed between the beam splitting device 22 and the monitoring device 20.
  • control device 28 controls the filter drive 48 in such a way that the filter 46 desired for the respective measurement is switched on between the beam splitter device 22 and the monitoring device 20.
  • the beam splitter device 22 may be formed from the common jet passage.
  • the drive 49 is data technology connected to the control device 28 via a line not shown in the figures or by radio.
  • the spectral element 50 deflects the measuring radiation depending on the wavelength.
  • the spectral element 50 comprises a diffraction grating or a prism.
  • the monitoring device 20 has a plurality of, in particular non-spatially resolving, detectors which respectively detect incident radiation in a wavelength range. The radiation deflected by the spectral element 50 as a function of the wavelength is detected by means of the monitoring optics 42 on the respective detectors of the
  • Monitoring device 20 focused.
  • the monitoring device 20 is designed to be spectrometrically analyzing in this way. This could be different, z. B. with a
  • the controller 28 is configured to detect the detected intensity of the
  • Illumination radiation radiation continuously or at selected times in the memory 36 store so that the intensity of the illumination radiation is indicated for the images of the object 12 taken with the microscope 10. In this way, measurements can be better documented and possibly reproduced.
  • an excitation filter 33 arranged in the illumination beam path can be provided.
  • the excitation filter 33 is z. B. the field diaphragm 41 downstream.
  • the wavelength range of the illumination radiation is modified via the excitation filter 33, for example by an excitation filter 33 with a transmission range of 510 nm to 550 nm.
  • the excitation filter 33 its transmission spectrum can be input manually, for example, so that the controller 28 has this information available.
  • the control device 28 is designed to detect the position of a revolver, not shown, on which a plurality of excitation filter 33 are arranged.
  • the control device 28 uses a database in which transmission spectra of the available excitation filters 33 are stored. If the control device knows the used excitation filter 33, it knows which wavelength range the illumination radiation covers. If the relationship is wavelength-dependent, the energy parameter by means of which the object 12 is illuminated can be adapted with regard to the wavelength range of the illumination radiation.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop (10) zur Abbildung eines Objekts (12), umfassend ein Objektiv (14) zur Abbildung des Objekts (12) durch einen Abbildungsstrahlengang (32), eine Lichtquelle (16) zur Erzeugung von Beleuchtungsstrahlung, mindestens ein optisches Element (18) zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung in den Abbildungsstrahlengang (32), so dass zwischen optischem Element (18) und Objektiv (14) ein gemeinsamer Strahlengang gebildet ist, durch den der Abbildungsstrahlengang verläuft und die Beleuchtungsstrahlung geführt ist, eine Überwachungseinrichtung (20) zum Messen eines Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung, wobei die Überwachungseinrichtung (20) einen Energieparameter einer auf sie eintreffenden Strahlung bestimmt, und eine Strahlteilereinrichtung (22), welche in Beleuchtungsrichtung im gemeinsamen Strahlengang dem Objektiv (14) vorgeordnet ist und von der Beleuchtungsstrahlung Messstrahlung auf die Überwachungseinrichtung (20) auskoppelt.

Description

Mikroskop zur Abbildung eines Objekts
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Abbildung eines Objekts, das ein Objektiv zur Abbildung des Objekts durch einen Abbildungsstrahlgang, eine Lichtquelle zur Erzeugung von
Beleuchtungsstrahlung und eine Überwachungseinrichtung zur Überwachung eines
Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung umfasst, wobei die Überwachungseinrichtung einen Energieparameter einer auf sie eintreffenden Strahlung bestimmt.
Bei Mikroskopen, Laser-basierten Verfahren, wie Laser-Scanning-Mikroskopie, und optischen Manipulationstechniken, z.B. optischen Pinzetten, ist es oftmals wünschenswert, die Intensität der Beleuchtungsstrahlung zu überwachen. Dies unterstützt die Reproduzierbarkeit von Messungen. Es ist bekannt, die Intensität der Lichtquelle dadurch zu bestimmen, dass ein Strahlungsdetektor anstelle der Probe angeordnet wird und auf diese Weise die in dem Objekt auftreffende Intensität der Beleuchtungsstrahlung bestimmt werden kann. Solche Verfahren sind beispielsweise in der EP 2458420 B1 oder der US 8619252 B2 offenbart. Da die Messung der Intensität ausschließlich vor oder nach der Messung in der Probe erfolgen kann, schlagen die EP 1260848 B1 oder die EP 1353210 B1 vor, einen Intensitätsdetektor im
Beleuchtungsstrahlengang nahe an der Lichtquelle vorzusehen. Auf diese Weise kann die Intensität der von der Lichtquelle ausgesandten Beleuchtungsstrahlung auch während der Messung der Probe bestimmt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mikroskop bereitzustellen, das eine verbesserte Überwachung des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung bereitstellt. Die Erfindung ist im Anspruch 1 definiert. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Die Erfindung schafft ein Auflicht-Mikroskop zur Abbildung eines Objekts, das ein Objektiv zur Abbildung eine Objekts durch einen Abbildungsstrahlengang, eine Lichtquelle zur Erzeugung von Beleuchtungsstrahlung , eine Überwachungseinrichtung zur Überwachung eines
Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung und eine Strahlteilereinrichtung umfasst. Die Überwachungseinrichtung bestimmt einen Energieparameter einer auf sie eintreffenden Strahlung. Die Strahlteilereinrichtung ist in Beleuchtungsrichtung dem Objektiv vorgeordnet und koppelt eine von der Beleuchtungsstrahlung Messstrahlung auf die Überwachungseinrichtung aus. Bevorzugt weist das Mikroskop ferner mindestens ein optisches Element zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung in den Abbildungsstrahlengang auf. Der Abbildungsstrahlengang ist zwischen der die Messstrahlung auskoppelnden Strahlteileinrichtung und dem Objekt frei von optischen Abbildungselementen. Da es sich beim Mikroskop um ein Auflichtmikroskop handelt, wird die Beleuchtungsstrahlung der Abbildungsstrahlung entgegenlaufend in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt und dann über das Objektiv in das Objekt (üblicherweise eine Probe) geführt. Zwischen diesem Ort der Einkopplung und dem Objekt enthält der Abbildungsstrahlengang folglich den
Beleuchtungsstrahlengang. Dort läuft die Beleuchtungsstrahlung zum Objekt hin und die Abbildungsstrahlung vom Objekt weg. Dieser Abschnitt wird üblicherweise auch als
gemeinsamer Strahlengang bezeichnet. Diese Terminologie wird auch in der nachfolgenden Beschreibung verwendet.
Die Strahlteilereinrichtung zur Auskopplung der Messstrahlung auf die
Überwachungseinrichtung ist im gemeinsamen Strahlengang nah an dem Objektiv angeordnet, so dass die durch die Strahlteilereinrichtung ausgekoppelte Messstrahlung sehr exakt proportional zum Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung ist, welche durch das Objektiv auf das Objekt fokussiert wird. Insbesondere werden somit durch die Überwachungseinrichtung all jene Veränderungen des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung, welche durch zuvor durchlaufene Filter, optische Elemente oder sonstige Effekte hervorgerufen werden, von der Überwachungseinrichtung erfasst. Auf diese Weise erfasst aufgrund der Strahlteilereinrichtung am Objektiv die Überwachungseinrichtung ein Signal, das besonders präzise mit dem
Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt selbst übereinstimmt. Insbesondere ist es nicht nötig, durch Rechnungen oder anderweitige Überlegungen die Auswirkungen von eingeschobenen Filtern, Linsen oder Strahlteilern zu berücksichtigen, da die Messstrahlung von der Beleuchtungsstrahlung erst ausgekoppelt wird, wenn die Beleuchtungsstrahlung diese Elemente etc. durchlief. Gleichzeitig ist es möglich, den Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung auch während der Untersuchung des Objekts zu bestimmen. Dies erlaubt insbesondere eine Regelung der Lichtquelle auf einen konstanten Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt hin. Dies reduziert die Nutzer-Interaktion, wodurch
Experimente vereinfacht werden. Die gewonnenen Messdaten hinsichtlich der Beleuchtung des Objekts können mit den aufgenommenen Bildern verknüpft werden, so dass eine besonders präzise Dokumentation hinsichtlich der Beleuchtungsbedingungen erhaltbar ist. Der Energieparameter kann die Intensität oder die Leistung oder Fluence sein.
Das Mikroskop kann sowohl für Fluoreszenz-Mikroskopie als auch für Laser-basierte Techniken verwendet werden, insbesondere im Weitfeld. Ferner ist es möglich, das Mikroskop bei Beleuchtungsstrahlung, die optische Manipulationstechniken, wie FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) oder FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) bewirkt, anzuwenden. Außerdem kann das Mikroskop mit verschiedenen Wellenlängen das Objekt beleuchten und/oder abbilden und/oder bearbeiten, z. B. mittels Laserablation. Das Mikroskop kann ein konfokales Mikroskop oder ein Mikroskop zur Abbildung des Objekts im Weitfeld sein. Bevorzugt ist das Mikroskop ausgebildet, Emission von Fluoreszenzlicht in dem Objekt zu stimulieren und das von dem Objekt emittierte Fluoreszenzlicht zu detektieren. Dazu kann das Objekt beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen sein. Das Objekt kann als jede Probe, Körper oder Struktur aufgefasst werden, welche mit Hilfe des Mikroskops abgebildet werden soll. Insbesondere kann das Objekt eine biologische Probe umfassen.
Das Objektiv fokussiert die Beleuchtungsstrahlung in das Objekt und dient gleichzeitig zur Abbildung des Objekts, d.h. zur Erfassung der vom/am Objekt erzeugten oder reflektierten Strahlung. Ein Bild des Objekts wird mit Hilfe des Abbildungsstrahlengangs erzeugt, an dessen Ende ein Bilddetektor zur Umwandlung der von dem Abbildungsstrahlengang geführten Strahlung in elektrische Signale steht. Eine Steuereinrichtung kann beispielsweise die elektrischen Signale in ein elektronisches Bild des Objektes umwandeln, das z. B. auf einer Anzeigeeinrichtung dargestellt und/oder abgespeichert wird. Die Lichtquelle kann einen Laser, eine Weißlichtquelle, wie beispielsweise eine Halogen- oder Quecksilberlampe, oder eine Light-Emitting-Diode (LED) oder eine Kombination daraus umfassen. Insbesondere kann die Lichtquelle Beleuchtungsstrahlung in einem breiten
Wellenlängenbereich oder Beleuchtungsstrahlung mit einzelnen diskreten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen erzeugen; bevorzugt umfasst die Lichtquelle mehrere
Einzellichtquellen, die jeweils Strahlung in verschiedenen, z. B. diskreten
Wellenlängenbereichen erzeugen. Vorzugsweise ist die Lichtquelle mit der Steuereinrichtung verbunden, welche die Intensität oder die Leistung der Beleuchtungsstrahlung steuert. Die Lichtquelle kann parallelisierte Beleuchtungsstrahlung bereitstellen oder der Lichtquelle ist eine Linse oder Linsensystem, beispielsweise ein Mikrolinsenarray, vorgeordnet, mittels welchem die von der Lichtquelle bereitgestellte Strahlung parallelisiert werden kann. Alternativ kann die
Beleuchtungsstrahlung im Beleuchtungsstrahlengang nicht parallelisiert geführt werden. Ob die Beleuchtungsstrahlung parallelisiert verläuft, hängt nicht zuletzt von dem mit dem Mikroskop durchgeführten Abbildungsverfahren ab. Bei Laser-Scanning-Mikroskopen und bei optischen Manipulationstechniken wird in der Regel die Beleuchtungsstrahlung parallelisiert verlaufen; bei Weitfeldabbildungen oder TIRF-Experimenten (Total Internal Reflection Fluorescence) verläuft die Beleuchtungsstrahlung hingegen meist konvergent durch den Beleuchtungsstrahlengang. Das optische Element dient zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung in den
Abbildungsstrahlengang. Das optische Element kann beispielsweise ein dichroitischer Spiegel sein, der Strahlung im Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung reflektiert und Strahlung im Wellenlängenbereich der Abbildung, z. B. vom Objekt erzeugte Fluoreszenzstrahlung, transmittiert. Es ist auch möglich, das Reflexions- und Transmissionsverhalten des optischen Elements zu vertauschen. Der Beleuchtungsstrahlengang zum Führen der
Beleuchtungsstrahlung von der Lichtquelle zum Objekt und der Abbildungsstrahlengang verlaufen in diesem Fall von dem optischen Element bis zum Objektiv/Objekt identisch. Die Überwachungseinrichtung bestimmt den Energieparameter der auf sie einfallenden Strahlung, z. B. die Intensität oder die Leistung der Messstrahlung. Die
Überwachungseinrichtung kann als Fotodetektor, CCD-Sensor oder ähnliches ausgestaltet sein und ist insbesondere ausgebildet, Strahlung in einem Wellenlängenbereich von 355 nm bis 700 nm zu detektieren ; sie hat ferner beispielsweise einen dynam ischen Bereich von 105. Wird das Mikroskop auch für optische Manipulationstechniken, wie optische Pinzetten, verwendet, ist die Überwachungseinrichtung in der Lage, die dabei verwendete(n) Wellenlänge(n) zu detektieren, z.B. 1064 nm oder 800 nm . Vorzugsweise ist die Überwachungseinrichtung mit der
Steuereinrichtung verbunden, so dass die Überwachungseinrichtung der Steuereinrichtung ein Signal bereitstellt, das dem Energieparameter der Messstrahlung, welche auf die
Überwachungseinrichtung trifft, entspricht.
Die Strahlteilereinrichtung kann als Strahlteiler m it einem vorgegebenen Transmissions- und Reflexionsverhalten ausgebildet sein. Ferner ist es möglich, dass die Strahlteilereinrichtung eine in dem Abbildungsstrahlengang angeordnete Glasplatte ist. Insbesondere ist die
Strahlteilereinrichtung derart ausgestaltet, dass die Messstrahlung, die auf die
Überwachungseinrichtung ausgekoppelt ist, klein im Vergleich zum Anteil der
Beleuchtungsstrahlung ist, welcher weiter zu dem Objektiv/Objekt läuft. Beispielsweise werden nur 15%, 10%, 5% oder 1 % der Beleuchtungsstrahlung als Messstrahlung auf die
Überwachungseinrichtung ausgekoppelt. Die Strahlteilereinrichtung ist optional in einem Unendlichkeitsraum angeordnet, welcher sich im Abbildungsstrahlengang zwischen dem
Objektiv und einer Tubuslinse befindet. Der Unendlichkeitsraum ist der Raum zwischen Objektiv und Tubuslinse.
Im gemeinsamen Strahlengang, also dem Bereich zwischen Strahlteilereinrichtung und Objektiv, sind vorzugsweise keine optischen Abbildungselemente angeordnet, welche den
Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung, wie sie im Objekt eintrifft, verändern können. So sind beispielsweise keine Filter, Linsen, Blenden, Pinholes oder Optiken im
Abbildungsstrahlengang zwischen der Strahlteilereinrichtung und dem Objektiv vorgesehen. Optische Abbildungselemente hätten nämlich den Effekt, dass der Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt verändert wäre und diese Veränderung nicht durch die Überwachungseinrichtung erfasst wäre. Somit könnte die Überwachungseinrichtung nicht den im Objekt vorhandenen Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung direkt erfassen.
Bevorzugt ist die Strahlteilereinrichtung im gemeinsamen Strahlengang unmittelbar benachbart dem Objektiv angeordnet. Ausgenommen davon ist ein Shutter, welcher im geschlossenen Zustand die Beleuchtungsstrahlung blockiert und beim Mikroskopieren offen steht. Er wirkt beim Mikroskopieren ja nicht. Die Steuereinrichtung weist optional einen Speicher auf, in welchem ein Zusammenhang zwischen dem Energieparameter der Messstrahlung und dem Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung auf dem Objekt hinterlegt ist. Der Zusammenhang dient dazu, dem gemessenen Ist-Wert des Energieparameters der Messstrahlung den zugehörigen
momentanen Wert des Energieparameters auf dem Objekt zu bestimmen. Die Verwendung des Zusammenhangs ist also ein Konvertierungsschritt von Messstrahlung auf die Beleuchtung des Objektes. Die umgekehrte Konvertierung ist optional möglich, da der Zusammenhang mathematisch in der Regel invertierbar ist (bei Verwendung einer Gleichung) oder
entsprechende inverse Tabellen leicht erstellt werden können. Die Steuereinrichtung kann die Lichtquelle dazu derart steuern, dass der Energieparameter der von der Lichtquelle erzeugten Beleuchtungsstrahlung innerhalb eines Toleranzbereichs einen vorgegebenen Soll- Energieparameter hat. In dem Zusammenhang kann ferner der von dem Objektiv absorbierte oder reflektierte Anteil der Beleuchtungsstrahlung und/oder der von dem Objektiv transmittierte Anteil der Beleuchtungsstrahlung als Parameter, z. B. in Form eines Transmissionsgrades, eingehen. Dieser Wert kann für das jeweilige Objektiv bekannt sein oder vor der eigentlichen Messung des Objektes bestimmt werden. Insbesondere ist dieser Wert wellenlängenabhängig im Speicher hinterlegt; der Zusammenhang kann wellenlängenabhängig sein. Ferner ist im Speicher der Steuereinrichtung hinterlegt, wie in welchem Verhältnis die Messstrahlung zur verbliebenen Beleuchtungsstrahlung steht. Auch dieses kann vorbekannt oder vor der eigentlichen Messung durch Kalibration bestimmt werden. Aufgrund der Angaben zum Objektiv und zur Strahlteileinrichtung kann die Steuereinrichtung vorzugsweise aus dem von der Überwachungseinrichtung erfassten Energieparameter der Messstrahlung die im Objekt vorhandene Leistung der Beleuchtungsstrahlung berechnen. Beispielsweise hängen die im Objekt vorhandene Leistung LO, die mit der Überwachungseinrichtung bestimmten Leistung L, der Anteil der von der Strahlteilereinrichtung ausgekoppelten Strahlung A und der
Transmissionsgrad des Objektivs T über folgende Gleichung zusammen:
Figure imgf000007_0001
Soll die Intensität anstelle der Leistung als Energieparameter herangezogen werden, wird die Leistung noch durch die Fläche der Strahlung auf Überwachungseinrichtung dividiert. Die Fläche kann bekannt sein, oder die Überwachungseinrichtung ist ortsauflösend und erlaubt somit zugleich eine Flächenmessung des Stahlquerschnitts der Messstrahlung.
Die Steuereinrichtung steuert optional die Lichtquelle derart, dass der Energieparameter der von der Lichtquelle erzeugten Beleuchtungsstrahlung unter Berücksichtigung des
Zusammenhangs mit einem vorgegebenen Soll-Energieparameter innerhalb eines
Toleranzbereichs übereinstimmt. Der Soll-Energieparameter kann der gewünschte Wert sein, mit dem das Objekt beleuchtet werden soll. Die Steuereinrichtung kann demnach den Wert des Energieparameters im Objekt konstant halten.
Da bevorzugt zwischen Strahlteilereinrichtung und Objektiv keine weiteren optischen
Abbildungselemente vorgesehen sind, müssen weitere Parameter wie Filter, Pinholes oder
Linsen und deren Transmissions- bzw. Reflexionseigenschaften nicht betrachtet werden. Ferner kann die Steuereinrichtung eine Erfassungseinrichtung aufweisen, mittels welcher der Typ oder die Art des Objektivs, das im Abbildungsstrahlengang angeordnet ist, ermittelt werden, und kennt Angaben über das Transmissionsverhalten der jeweiligen im Abbildungsstrahlengang angeordneten Objektive.
Vorzugsweise weist das Mikroskop ferner eine Schnittstelle für eine Autofokuseinrichtung zur Bestimmung des Fokus des Objektivs in dem Objekt auf, wobei die Schnittstelle einen
Autofokusstrahlengang zum Führen von Autofokusstrahlung zum Objekt aufweist. Die
Strahlteilereinrichtung hat dann eine Doppelfunktion, indem sie einerseits objektivseitig
Autofokusstrahlung in den gemeinsamen Strahlengang ein- und/oder daraus auskoppelt und andererseits lichtquellenseitig die Messstrahlung zur Überwachungseinrichtung auskoppelt. In einer Ausgestaltung hat das Auflicht-Mikroskop deshalb eine Autofokuseinrichtung zur
Bestimmung des Fokus des Objektivs für das Objekt. Die Autofokuseinrichtung weist einen Autofokusstrahlengang zum Führen von Autofokusstrahlung zum Objektiv auf. Die
Strahlteilereinrichtung hat eine Doppelfunktion, indem sie einerseits objektivseitig
Autofokusstrahlung in den gemeinsamen Strahlengang ein- und/oder daraus auskoppelt und andererseits lichtquellenseitig die Messstrahlung zur Überwachungseinrichtung auskoppelt. Bei bekannten Auflicht-Mikroskopen besteht Platzmangel im gemeinsamen Strahlengang, um sämtliche optische Elemente darin passend anzuordnen. Insbesondere im Abschnitt des Strahlengangs zwischen Objektiv und Tubuslinse, also im Unendlichkeitsraum , ist bei herkömmlichen Mikroskopen wenig Platz. Durch die Doppelfunktion der Strahlteilereinrichtung können dennoch sowohl eine Autofokuseinrichtung und die Überwachungseinrichtung in dem platzbeschränkten Bereich verschoben werden und es ist möglich, trotz Bauraum knappheit sowohl eine Überwachungseinrichtung als auch eine Autofokuseinrichtung vorzusehen.
Hinsichtlich des Objektivs, der Lichtquelle, des optischen Elements und/oder der
Überwachungseinrichtung gelten für diese Weiterbildung die oben angeführten Überlegungen analog. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass der gemeinsame Strahlengang zwischen der die Messstrahlung auskoppelnden Strahlteilereinrichtung und dem Objektiv frei von optischen Abbildungselementen ist. Die Schnittstelle ist derart ausgebildet, dass daran die
Autofokuseinrichtung angeschlossen werden kann und gleichzeitig die für die
Autofokuseinrichtung relevante Strahlung durch die Schnittstelle geführt werden kann. Natürlich kann die Autofokuseinrichtung eine optionale Schnittstelle für die Überwachungseinrichtung aufweisen. Auch ist es möglich, dass die Autofokuseinrichtung ein Modul aus
Autofokuseinrichtung und Überwachungseinrichtung ist. Die Schnittstelle ist beispielsweise ein Gewinde, und der Autofokusstrahlengang kann einen Querschnitt umfassen, durch welchen die Autofokusstrahlung geleitet wird. Die Autofokuseinrichtung kann ein vom Mikroskop separates Element sein und wie in der WO 2007/144197 A1 , der DE 102008018952 A1 oder der DE 102008018864 A1 beschrieben ausgebildet sein. Die Autofokuseinrichtung weist eine
Autofokuslichtquelle auf, die zur Erzeugung der Autofokusstrahlung dient. Die
Autofokusstrahlung wird m ittels des Autofokusstrahlengangs über die Strahlteilereinrichtung zu dem Objektiv und damit auf das Objekt geführt. Von dem Objekt wird die Autofokusstrahlung reflektiert oder gestreut, durch das Objektiv gesam melt und über die Strahlteilereinrichtung mittels des Autofokusstrahlengangs einem Autofokusdetektor zugeführt. Dazu kann in der Autofokuseinrichtung ein Strahlteiler vorgesehen sein, m ittels welchem das Einkoppeln der von der Autofokuslichtquelle erzeugten Autofokusstrahlung und/oder das Auskoppeln der von dem Objekt stammenden Autofokusstrahlung zum Autofokusdetektor erfolgen. Die
Autofokusbeleuchtungsstrahlung, die von der Autofokuslichtquelle erzeugt wird , und die
Autofokusmessstrahlung, die zu dem Autofokusdetektor geführt wird, werden hier unter dem Begriff „Autofokusstrahlung" zusammengefasst. Sie werden über die Strahlteilereinrichtung gemeinsam ein- bzw. ausgekoppelt. Es ist aber auch möglich, dass ein weiterer Strahlteiler im Abbildungsstrahlengang vorgesehen ist, m ittels welchem Autofokusstrahlung in den gemeinsamen Strahlengang ein- oder daraus ausgekoppelt wird. Bei dieser Ausführungsform ist es somit möglich, dass die Autofokuslichtquelle und der Autofokusdetektor an
verschiedenen, weit entfernten Orten im Mikroskop angeordnet sind.
Im Autofokusstrahlengang kann beispielsweise ein schräg gestelltes Gitter platziert sein, das in das Objekt abgebildet wird, so dass die Rückstreuung am Objekt mit Hilfe des
Autofokusdetektors überwacht wird und som it die Lage des Fokus bestimmt wird. In einer anderen Ausführungsform kann die Autofokuslichtquelle im Objekt einen punktförmigen Lichtpunkt erzeugen, dessen Schärfe oder Ausdehnung m it Hilfe des Autofokusdetektors gemessen wird und somit Rückschlüsse auf die Lage des Fokus geschlossen werden.
Insbesondere ist die Autofokuseinrichtung mit der Steuereinrichtung verbunden, wobei die Steuereinrichtung auf Grundlage der von der Autofokuseinrichtung ermittelten Werten der Lage des Fokus einstellen bzw. nachkorrigieren kann. Somit lässt sich mit Hilfe der
Autofokuseinrichtung ein Drift in der Lage des Fokus ausgleichen. Die Autofokusstrahlung liegt vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich, der nicht zur Abbildung des Objekts
herangezogen wird. Beispielsweise ist die Autofokusstrahlung im infraroten
Wellenlängenbereich und die Beleuchtungsstrahlung im sichtbaren Wellenlängenbereich. Die Strahlteilereinrichtung ist insbesondere einstückig oder einteilig ausgebildet, so dass die objektivseitige Fläche der Strahlteilereinrichtung und die lichtquellenseitige Fläche der
Strahlteilereinrichtung nah beieinander liegen. Objektivseitig kann die Strahlteilereinrichtung als dichroitischer Spiegel ausgebildet sein, der beispielsweise Licht im Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung und der Fluoreszenzstrahlung des Objekts transmittiert und Strahlung im Wellenlängenbereich der Autofokusstrahlung reflektiert.
Bei Beleuchtung des Objekts mit hoher Intensität oder Leistung ist es manchmal
wünschenswert, das Ausbleichen von Fluoreszenzquellen im Objekt zu vermeiden, indem das Objekt nur zeitweise beleuchtet wird. Daher ist es bevorzugt, dass im Abbildungsstrahlengang zwischen der Strahlteilereinrichtung und dem Objekt der bereits erwähnte Shutter vorgesehen ist, der in einem Betriebszustand den gemeinsamen Strahlengang blockiert, so dass keine Beleuchtungsstrahlung auf das Objekt gelangt. Der Shutter ist in der Regel mit der
Steuereinrichtung verbunden. Auch bei blockierendem Shutter kann weiterhin der
Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung erfasst werden. Bei einem Shutter vor der Strahlteilereinrichtung wäre das nicht möglich. Bei offenem Shutter kann die
Beleuchtungsstrahlung ungehindert passieren. Der Shutter findet optional auch bei optischen Manipulationsexperimenten wie FRAP und/oder Laser-Ablation und/oder FLIP Anwendung. Hier wird die Beleuchtungseinrichtung zum Manipulieren des Objekts verwendet. Bei optischen Manipulationsexperimenten hat die Beleuchtungsstrahlung eine wesentlich höhere Leistung. Dies bedeutet, dass z. B. mit der Beleuchtungseinrichtung geblichen oder ablatiert wird, und das Objekt abgebildet wird, um die Fluoreszenz zu dokumentieren. In manchen Varianten laufen diese Experimente mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen ab, die dann gleichzeitig genutzt werden; der eine Wellenlängenbereich zum Bleichen oder ablatieren und der andere Wellenlängenbereich zum Abbilden. Um ungewünschtes Bleichen zu vermeiden, ehe der Energieparameter den korrekten Wert hat oder diesen konstant einnimmt, kann der Shutter optional dichroitisch, d. h. zum Blockieren (nur) der Beleuchtungsstrahlung, ausgebildet sein und andere Wellenlängen können ihn transmittieren. Die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung im Objekt kann mit Hilfe einer Leuchtfeldblende eingestellt werden, welche in einer zu der Objektebene konjugierten Zwischenbildebene angeordnet ist. Die Leuchtfeldblende ist der Lichtquelle nachgeordnet und insbesondere in Beleuchtungsrichtung vor der Strahlteilereinrichtung angeordnet, z. B. außerhalb des gemeinsamen Strahlengangs im Beleuchtungsstrahlengang, z. B. zwischen dem optischen Element und der Lichtquelle. Vorzugsweise weist die Leuchtfeldblende einen Antrieb auf, der mit der Steuereinrichtung verbunden ist. Die Steuereinrichtung kann ferner ausgebildet sein, einen Grad der Öffnung der Leuchtfeldblende zu erfassen, beispielsweise um eine manuelle Verstellung der Leuchtfeldblende zu detektieren.
Die Auskopplung der Messstrahlung von der Beleuchtungsstrahlung bzw. die Ein- oder Auskopplung der Autofokusstrahlung gelingt dann besonders einfach, wenn die
Beleuchtungsstrahlung bzw. die Autofokusstrahlung parallelisiert verläuft. Daher ist es bevorzugt, dass die Strahlteilereinrichtung in einem Abschnitt, in welchem der gemeinsame Strahlengang parallelisiert verläuft, zwischen dem optischen Element und dem Objektiv angeordnet ist. Die Strahlteilereinrichtung kann somit im Unendlichkeitsraum angeordnet sein. Der erwähnte Shutter ist in der Regel in dem Abschnitt des gemeinsamen Strahlengangs vorgesehen, der im Unendlichkeitsraum ist. Um den im Objekt vorhandenen Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung besser bestimmen zu können, weist das Mikroskop eine Überwachungsblende, welche zwischen der Strahlteilereinrichtung und der Überwachungseinrichtung angeordnet ist und deren Öffnung verstellbar ist, sowie eine Steuereinrichtung auf, welche die Öffnung der Überwachungsblende je nach wirksamer Apertur des Objektivs einstellt. Die wirksame Apertur entspricht insbesondere der Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung, wie sie in Beleuchtungsrichtung in das Objektiv eintritt. Ist die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung größer als die Apertur des Objektivs, entspricht die wirksame Apertur der Apertur des Objektivs. Ist die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung an dem Objektiv kleiner als die Apertur des Objektivs, beispielsweise indem dieser durch die Leuchtfeldblende begrenzt wird, entspricht die wirksame Apertur dem Durchmesser der Leuchtfeldblende.
Ferner kann die Überwachungsblende mit anderer Öffnung ausgetauscht werden, z. B. indem die gewünschte Überwachungsblende mittels eines Schiebers in die Messstrahlung geschoben wird.
Entspricht die wirksame Apertur nicht dem Durchmesser der Messstrahlung, so kann mit Hilfe der Überwachungsblende der Durchmesser der Messstrahlung an die wirksame Apertur angepasst werden. Dazu kann die Überwachungsblende mit der Steuereinrichtung verbunden sein, welche die Öffnung der Überwachungsblende an die wirksame Apertur anpasst. Die wirksame Apertur kann beispielsweise auf die Apertur des Objektivs, insbesondere wenn der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung größer als der des Objektivs ist, oder durch Erfassen der Öffnung der Leuchtfeldblende, bestimmt werden. Auf diese Weise lässt sich der
Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt genauer überwachen, da die
Ausdehnung der das Objektiv transmittierenden Beleuchtungsstrahlung und der Messstrahlung gleich sind. Insbesondere wird der Querschnitt der Messstrahlung derart angepasst, dass der gleiche Anteil der Beleuchtungsstrahlung das Objektiv und die Überwachungsblende passieren kann. Auf diese Weise lassen sich Abweichungen zwischen dem gemessenen und dem in dem Objekt vorhandenen Energieparameter aufgrund eines nicht gleichförmigen Intensitätsprofils oder Leistungsprofils der Beleuchtungsstrahlung, wie beispielsweise ein Gaußprofil, minimieren.
Um den Aufbau zu verkleinern und den Bauaufwand für das Mikroskop zu reduzieren, ist es bevorzugt, dass dem Strahlteiler eine Überwachungsoptik nachgeordnet ist, welche die Messstrahlung auf die Überwachungseinrichtung fokussiert, wobei vorzugsweise die
Überwachungseinrichtung einen nicht ortsauflösenden Detektor, wie beispielsweise eine Fotodiode, aufweist. Zusammen mit der Überwachungsblende ist es dann möglich, einen nicht ortsauflösenden Detektor zu verwenden und dennoch den Durchmesser der
Beleuchtungsstrahlung oder die wirksame Apertur zu berücksichtigen. Da nicht-ortsauflösende Detektoren meist kleiner als ortsauflösende Detektoren und darüber hinaus einfacher aufgebaut sind, kann somit Bauraum als auch Aufwand eingespart werden.
Die Erfassung der wirksamen Apertur kann jedoch auch dadurch erfolgen, dass die
Überwachungseinrichtung einen ortsauflösenden Detektor hat, z. B. einen CCD-(charge- coupled device)-Sensor. Mit Hilfe des ortsauflösenden Detektors kann man den
Strahlquerschnitt der Messstrahlung bestimmen. Insbesondere kann eine Intensitätsverteilung und/oder die Form und Größe des Spots der Beleuchtungsstrahlung bestimmt werden. Mit Hilfe dieser Ergebnisse lässt sich der im Objekt vorhandene Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung genauer angeben.
Es ist ferner bevorzugt, dass das Mikroskop mindestens einen Filter zur Abschwächung und/oder Absorption wenigstens eines Wellenlängenbereichs der Beleuchtungsstrahlung aufweist, der zwischen der Strahlteilereinrichtung und Überwachungseinrichtung angeordnet ist. Der Filter kann zur Abschwächung des gesamten Wellenlängenbereichs der
Beleuchtungsstrahlung dienen. Durch ihn kann man mit der Überwachungseinrichtung
Beleuchtungsstrahlung mit hohem Energieparameter detektieren, ohne die
Überwachungseinrichtung zu beschädigen. Der Filter erlaubt es, einen größeren
Energieparameterbereich mit Hilfe der Überwachungseinrichtung zu erfassen. Darüber hinaus kann der Filter auch als Bandpassfilter ausgebildet sein, der nur Strahlung eines bestimmten Wellenlängenbereichs passieren lässt. Insbesondere wenn die Überwachungseinrichtung zur Detektion von Strahlung in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich ausgebildet ist, kann ein solcher Filter Messfehler aufgrund von Strahlung aus anderen Wellenlängenbereichen vermeiden. Ferner kann der Filter als Langpass oder Kurzpass vorgesehen sein, um unerwünschte Strahlung vor der Überwachungseinrichtung zu blocken, z. B. Autofokusstrahlung oder Strahlung des Fluoreszenzlichtes. Vorzugsweise sind einer oder mehrere Filter in der oben beschriebenen Art zwischen der Strahlteilereinrichtung und der Überwachungseinrichtung vorgesehen.
Insbesondere ist es von Vorteil, wenn der Filter in den als Messstrahlung ausgekoppelten Teil der Beleuchtungsstrahlung ein- und herausgeführt werden kann. Auf diese Weise lässt sich die Erfassung der Messstrahlung je nach Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung optimieren. Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Mikroskop einen Filterantrieb zum
Bewegen mindestens eines Filters aus oder in die Messstrahlung vorweist. Der Filterantrieb kann beispielsweise ein Elektromotor oder ein Linearantrieb umfassen. Der Filterantrieb ist insbesondere mit der Steuereinrichtung verbunden, so dass mit Hilfe der Steuereinrichtung die Position des mindestens einen Filters gesteuert werden kann. Die Steuereinrichtung kann beispielsweise automatisch den entsprechenden Filter je nach Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung und des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung zwischen die Strahlteilereinrichtung und die Überwachungseinrichtung bewegen. Alternativ kann dies auch manuell erfolgen.
Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass die Strahlteilereinrichtung in den gemeinsamen
Strahlengang hinein oder daraus heraus bewegbar ist. Dazu kann die Strahlteilereinrichtung einen Antrieb aufweisen, der vorzugweise mit der Steuereinrichtung verbunden ist. Ohne Strahlteilereinrichtung im gemeinsamen Strahlengang wird die Beleuchtungsstrahlung mit maximal möglichem Energieparameter ins Objekt eingekoppelt, da dann keine Messstrahlung abgetrennt wird. Außerdem kann die Strahlteilereinrichtung nur dann in den gemeinsamen Strahlengang gestellt werden, wenn die Überwachung der Lichtquelle tatsächlich gewünscht ist. In dieser Ausführungsform wird der Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung rechnerisch korrigiert, nämlich bezüglich der Messstrahlung, wenn die Strahlteilereinrichtung im/nicht im gemeinsamen Strahlengang steht. Die Überwachungseinrichtung kann Detektoren zur Erfassung der Beleuchtungsstrahlung in einem breitbandigen Wellenlängenbereich aufweisen. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Überwachungseinrichtung einen oder mehrere Detektoren aufweist, die Strahlung nur eines bestimmten Wellenlängenbereichs detektieren. Um dennoch mehrere Wellenlängenbereiche zu erfassen, kann eine Einrichtung zur Aufspaltung der Beleuchtungsstrahlen nach
Wellenlängenbereichen vorgesehen sein, wie beispielsweise ein Prisma und/oder ein Gitter. Diese sind dann in Beleuchtungsrichtung den Detektoren der Überwachungseinrichtung vorgeordnet. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Überwachungseinrichtung ein
Spektrometer umfasst. Durch die Möglichkeit, mehrere Wellenlängenbereiche zu erfassen, kann mit Hilfe der Überwachungseinrichtung detektiert werden , welche von mehreren
Lichtquellen gerade zur Beleuchtung des Objekts verwendet wird. Dies ist insbesondere dann hilfreich, wenn das Objekt mit Beleuchtungsstrahlung in unterschiedlichen
Wellenlängenbereichen nacheinander oder sim ultan beleuchtet wird.
Es ist in einer Weiterbildung vorgesehen, dass der eingangs genannte, in der Steuereinrichtung hinterlegte Zusammenhang wellenlängenabhängig ist, und dass die Steuereinrichtung eine Wellenlänge der Beleuchtungsstrahlung und/oder einen in der Beleuchtungsstrahlung angeordneten Anregungsfilter ermittelt. Die Wellenlänge oder der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung kann durch Detektion der momentan aktivierten Lichtquelle erm ittelt werden, wobei in der Steuereinrichtung der Spektralbereich der Lichtquelle hinterlegt ist. Der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung kann über einen Anregungsfilter modifiziert werden. Beispielsweise wird ein Anregungsfilter als Bandpass m it einem Transm issionsbereich von 510 nm bis 550 nm verwendet. Zur Ermittlung des Anregungsfilters kann dessen
Transmissionsspektrum beispielsweise manuell eingegeben werden. Darüber hinaus kann die Steuereinrichtung die Position eines Revolvers erfassen, auf welchem mehrere Anregungsfilter angeordnet sind. Zur Ermittlung der Eigenschaften des Anregungsfilters kann es vorgesehen sein, dass die Steuereinrichtung eine Datenbank, in welcher die Transm issionsspektren der verwendeten Anregungsfilter hinterlegt sind, heranzieht.
Mittels der Kenntnis der Wellenlänge oder der Wellenlängen der Beleuchtungsstrahlung und/oder des verwendeten Anregungsfilters weiß man somit, welcher Wellenlängenbereich die Beleuchtungsstrahlung abdeckt. Wenn zugleich Zusammenhang wellenlängenabhängig vorliegt, kann der Energieparameter, mittels welchem das Objekt beleuchtet wird, hinsichtlich des Wellenlängenbereichs der Beleuchtungsstrahlung angepasst werden.
Es ist optional vorgesehen, dass der Zusammenhang von Parametern des Objektivs abhängt. Parameter des Objektivs können die numerische Apertur, das momentane Sehfeld, die Vergrößerung, die Apertur und/oder das Objektfeld sein. Wie zuvor beschrieben kann ein Parameter die Transmissionseigenschaft und/oder Reflexionseigenschaft - auch
wellenlängenabhängig - sein. Die Parameter des Objektivs können manuell eingegeben werden, in der Steuereinrichtung hinterlegt sein oder von der Steuereinrichtung ermittelt werden. Beispielsweise sind mehrere Objektive auf einem Revolver angeordnet und die Steuereinrichtung kann die Position des Revolvers erfassen und somit ermitteln, welches Objektiv im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist. Dazu kann die Steuereinrichtung mit einem Sensor verbunden sein, der die Position des Revolvers erfassen kann. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass die Objektive mit einer Markierung, beispielsweise einem RFID-Chip, versehen sind, und ein mit der Steuereinrichtung verbundene Sensor aufgrund der Markierung das jeweilige Objektiv ermittelt. Durch das Ermitteln des Objektivs kann der Zusammenhang an die unterschiedlichen Transmissions- bzw. Reflexionseigenschaften des Objektivs angepasst werden. Dadurch ergibt sich eine genauere Bestimmung des Energieparameters der
Beleuchtungsstrahlung.
Es ist optional vorgesehen, dass der Zusammenhang von einem Durchmesser der
Beleuchtungsstrahlung, einem Profil der Beleuchtungsstrahlung, einer Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung und/oder einem zwischen dem Objekt und dem Objektiv vorhandenen Immersionsmedium abhängt. Der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung kann beispielsweise mittels einer Leuchtfeldblende eingestellt werden. Dazu kann die Steuereinrichtung mit einem Sensor verbunden sein, der die Größe der Öffnung der Leuchtfeldblende erfassen kann. Ferner ist es möglich, den Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung manuell einzugeben,
beispielsweise nachdem die Leuchtfeldblende entsprechend eingestellt wird. Darüber hinaus kann der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung auch dadurch eingestellt werden, dass der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung für die jeweilige Lichtquelle bekannt ist. Ähnlich kann das Profil der Beleuchtungsstrahlung ermittelt werden, beispielsweise indem für jede der verwendeten Lichtquellen das Profil der Beleuchtungsstrahlung bekannt ist. Die Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung kann von der jeweiligen Art des Mikroskops oder der vorzunehmenden Messung abhängen. Beispielsweise ist die Strahlung für Weitfeldabbildungen oder bei Total Internal Reflection Microscopy (TIRF) konvergent. Bei Laserscanningmikroskopen, optischen Pinzetten oder bei optischen Manipulationen können die Beleuchtungsstrahlen parallel verlaufen. Dies kann beispielsweise über eine Eingabeschnittstelle der Steuereinrichtung mitgeteilt sein. Alle genannten Parameter sowie das zwischen dem Objektiv und dem Objekt vorhandene Immersionsmedium haben Einfluss auf den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt. Durch Kenntnis einer, mehrerer oder aller dieser Parameter kann der Zusammenhang so modifiziert werden, dass er eine genauere Verknüpfung zwischen dem Energieparameter der Messstrahlung und dem Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt bereitstellt. Die genannten Parameter können daher als Variablen in dem Zusammenhang eingehen.
In einer Weiterbildung ist es vorgesehen, dass die Lichtquelle ausgebildet ist,
Beleuchtungsstrahlung mit mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen gleichzeitig zu erzeugen und/oder dass die Überwachungseinrichtung ausgebildet ist, den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung für mindestens zwei unterschiedliche Wellenlängen zu bestimmen. Bei dieser bevorzugten Weiterbildung ist es auch möglich, den Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung im Objekt gleichzeitig für zwei verschiedene Wellenbereiche zu steuern. Vorzugsweise kann dies auch für drei oder mehrere verschiedene Wellenlängenbereiche durchgeführt werden. Dazu ist vorgesehen, dass für jeden Wellenlängenbereich ein entsprechender Zusammenhang in der Steuereinrichtung hinterlegt ist.
Zwischen dem Strahlteiler zur Auskopplung der Messstrahlung von der Beleuchtungsstrahlung und dem Objektiv kann man optional ein Element vorsehen . Gerade in Verbindung m it der
Laserscanningmikroskopie wird oftmals ein„differential interference contrast" verwendet, wobei in die Objektivpupille direkt in Abbildungsrichtung nach dem Objektiv ein Prisma, z. B. ein Wollaston-Prisma eingeführt wird. Auch dieses kann wellenlängenabhängig sein , was dann bevorzugt in dieser Ausführungsform mit berücksichtigt werden kann.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen , sondern auch in anderen
Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen :
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform des Mikroskops;
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform des Mikroskops; und
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform des Mikroskops. Ein Auflicht-Mikroskop 10 gemäß der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform dient zur Abbildung eines Objekts 12, insbesondere im Weitfeld. Das Mikroskop 10 kann auch als konfokales Mikroskop ausgebildet sein ; in diesem Fall steht in der Regel ein Pinhole im Strahlengang. Das Objekt 12 kann Fluoreszenzfarbstoffe oder Substanzen enthalten, die nach Stimulation Fluoreszenzstrahlung aussenden. Das Mikroskop 10 umfasst ein Objektiv 14, eine Lichtquelle 16, ein optisches Element 18, eine Überwachungseinrichtung 20, eine Strahlteilereinrichtung 22, eine Schnittstelle 23 für eine Autofokuseinrichtung 24, einen Abbildungsdetektor 26 und eine Steuereinrichtung 28. Das Objektiv 14, die Strahlteilereinrichtung 22, das optische Element 18 und ein Linsenelement 30 sowie der Abbildungsdetektor 26 bilden einen Abbildungsstrahlengang 32. Die Lichtquelle 16, das optische Element 18, die Strahlteilereinrichtung 22, und das Objektiv 14 bilden einen Beleuchtungsstrahlengang 34. Der Abbildungsstrahlengang 32 und der
Beleuchtungsstrahlengang 34 verlaufen zwischen dem Objektiv 14 und dem optischen Element 18 in einem gemeinsamen Strahlengang.
Das Objektiv 14 dient deshalb sowohl zur Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung des Beleuchtungsstrahlengangs 34 auf das Objekt 12 als auch zur Abbildung des Objekts 12 durch den Abbildungsstrahlengang 32. Das Objekt 12 wird mit dem Objektiv 14 und dem
Linsenelement 30 auf den Abbildungsdetektor 26 abgebildet; das Linsenelement 30 kann als Tubuslinse aufgefasst werden. Der Abbildungsdetektor 26 wandelt die auf ihn eintreffende Strahlung in elektrische Signale um , die z. B. mittels einer Leitung an die Steuereinrichtung 28 übermittelt werden. Die Steuereinrichtung 28 erzeugt aus den elektrischen Signalen ein Bild des Objekts 12, das auf einer nicht dargestellten Anzeigeeinrichtung dargestellt werden kann. Das Bild des Objekts 12 kann beispielsweise ein Fluoreszenzbild sein.
Die Lichtquelle 16 kann als Laser, Light Emitting Diode (LED) oder als Weißlichtquelle ausgebildet sein. Die Lichtquelle 16 erzeugt vorzugsweise parallelisierte
Beleuchtungsstrahlung; dazu kann die Lichtquelle 16 eine in der Figur nicht dargestellte Linse oder Linsensystem aufweisen, welche/welches die Beleuchtungsstrahlung parallelisiert. Über das optische Element 18, welches beispielsweise als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist, wird die Beleuchtungsstrahlung in den Abbildungsstrahlengang 32 eingekoppelt. Die
Beleuchtungsstrahlung umfasst z. B. einen Wellenlängenbereich, der zur Stimulation von Fluoreszenzstrahlung in dem Objekt 12 dient. Die vom Objekt 12 emittierte Strahlung hat in der Regel vorzugsweise einen anderen Wellenlängenbereich als der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung, so dass das optische Element 18 in der Regel dichroitisch ist und nur auf die Beleuchtungsstrahlung wirkt. Mit Hilfe der Strahlteilereinrichtung 22, welche z. B. als Strahlteiler ausgebildet sein kann, wird ein Anteil der Beleuchtungsstrahlung als Messstrahlung aus dem gemeinsamen Strahlengang, insbesondere wellenlängenunabhängig, abgetrennt und der Überwachungseinrichtung 20 zugeführt. Der ausgekoppelte Anteil der Beleuchtungsstrahlung kann beispielsweise 10%, 5% oder 1 % der Intensität oder der Leistung der Beleuchtungsstrahlung vor der Abtrennung betragen. Die Überwachungseinrichtung 20 ist in der in Figur 1 geführten Ausführungsform des Mikroskops 10 als ortsauflösender Detektor, wie z. B. als CCD-Sensor (charge-coupled device), ausgebildet, welcher ortsauflösend die auf ihn eintreffende Strahlung in elektrische Signale umwandelt. Die von der Überwachungseinrichtung 20 erzeugten elektrischen Signale werden über eine Leitung an die Steuereinrichtung 28 geleitet. Die von der Überwachungseinrichtung 20 erzeugten elektrischen Signale sind insbesondere proportional zu der Intensität oder Leistung der auf die Überwachungseinrichtung 20 eintreffenden Strahlung, so dass die
Steuereinrichtung 28 aus den Signalen die auf die Überwachungseinrichtung 20 eintreffende Intensität der Messstrahlung bestimmen kann.
Vorzugsweise weist die Steuereinrichtung 28 einen Speicher 36 auf, in dem ein, optional wellenlängenabhängiger Zusammenhang hinterlegt ist, welcher beschreibt, welchen
Prozentsatz der Beleuchtungsstrahlung die Strahlteilereinrichtung 22 als Messstrahlung aus dem gemeinsamen Strahlengang zur Überwachungseinrichtung 20 abtrennt. Der Speicher 36 kann beispielsweise ein beschreibbares oder nicht beschreibbares Speichermedium wie ein RAM oder ROM sein. Anhand des von der Überwachungseinrichtung 20 erfassten
Energieparameters der Messstrahlung kann die Steuereinrichtung 28 den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung ermitteln, welcher von der Lichtquelle 16 zur Verfügung gestellt wird. Weit bedeutender ist es jedoch, dass die Steuereinrichtung 28 über den Zusammenhang den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt 12 ermittelt. Der Zusam menhang verknüpft den Energieparameter der Messstrahlung mit dem Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung am Objekt 12. Die Steuereinrichtung 28 steuert nun optional die Lichtquelle 16 derart, dass der Energieparameter der von der Lichtquelle 1 6 erzeugten
Beleuchtungsstrahlung innerhalb eines Toleranzbereichs mit einem vorgegebenen Soll- Energieparameter übereinstimmt.
Der Zusammenhang kann von Parametern des Objektivs 14 abhängen. Parameter des Objektivs 14 können die numerische Apertur, das momentane Sehfeld, die Vergrößerung, die Apertur oder das Objektfeld sein. Ein Parameter des Objektivs 14 ist optional das
Transmissions- und/oder Reflexionsverhalten des Objektivs 14. Hierzu kann die
Steuereinrichtung 28 mit dem Objektiv 14 verbunden sein, um beispielsweise zu ermitteln, welche Art oder Typ von Objektiv momentan im gemeinsamen Strahlengang 32 vorgesehen ist. Beispielsweise können mehrere Objektive 14 auf einem Revolver angeordnet sein und die Steuereinrichtung 28 kann erfassen, welches der Objektive 14 sich momentan im gemeinsamen Strahlengang befindet. Vorzugsweise ist im Speicher 36 ein Zusammenhang hinterlegt, welcher wellenlängenabhängig das Transmissions- und/oder Reflexionsverhalten des Objektivs 14 angibt. Darüber hinaus kann auch die Apertur der im Mikroskop 10 zu verwendenden Objektive 14 hinterlegt sein. Anhand der Transm issions- und/oder Reflexionseigenschaften des Objektivs 14 und der Kenntnis der Intensität der Beleuchtungsstrahlung kann die Steuereinrichtung 28 insbesondere präzise den in dem Objekt 12 vorhandenen Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung erm itteln. Beispielsweise hängen die im Objekt 12 vorhandene Leistung LO, die mit der Überwachungseinrichtung 20 bestimmten Leistung L, der Anteil der von der Strahlteilereinrichtung 22 ausgekoppelten Strahlung A und der Transmissionsgrad des Objektivs 14 T über folgende Gleichung zusammen:
Figure imgf000019_0001
Da die Überwachungseinrichtung 20 einen ortsauflösenden Detektor hat, bestimmt die Steuereinrichtung 28 auch einen Strahlquerschnitt der Messstrahlung. Ist die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung größer als die Apertur des Objektivs 14, passiert nicht sämtliche Beleuchtung das Objektiv 14, und nicht die sämtliche zur Verfügung stehende
Beleuchtungsstrahlung wird auf das Objekt 12 fokussiert. Mit Hilfe der ortsauflösenden Überwachungseinrichtung 20 kann somit bei der Ermittlung des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung im Objekt der Anteil der nicht ausgenutzten Beleuchtungsstrahlung berücksichtigt werden, wenn der Zusammenhang als Parameter die Apertur des Objektivs 14 aufweist.
Ferner kann der hinterlegte Zusammenhang von einem Durchmesser der
Beleuchtungsstrahlung, einem Profil der Beleuchtungsstrahlung, einer Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung und/oder einem zwischen dem Objekt 12 und dem Objektiv 14 vorhandenen Immersionsmedium abhängen. Der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung kann beispielsweise mittels einer Leuchtfeldblende 41 eingestellt werden. Dazu kann die Steuereinrichtung 28 mit einem Sensor verbunden sein, der die Größe der Öffnung der Leuchtfeldblende 41 erfasst. Ferner ist es möglich, den Durchmesser der
Beleuchtungsstrahlung manuell einzugeben, beispielsweise nachdem die Leuchtfeldblende 41 entsprechend eingestellt wurde. Darüber hinaus kann der Durchmesser der
Beleuchtungsstrahlung auch dadurch ermittelt werden, dass er für die jeweilige Lichtquelle 16 bekannt ist. Ähnlich kann das Profil der Beleuchtungsstrahlung ermittelt werden, beispielsweise indem für jede verwendete Lichtquelle 16 deren Profil der Beleuchtungsstrahlung bekannt ist. Die Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung kann von der jeweiligen Art des Mikroskops oder der vorzunehmenden Messung abhängen. Beispielsweise ist die Strahlung für
Weitfeldabbildungen oder bei total internal reflection microscopy (TIRF) konvergent sein. Bei Laserscanningmikroskopen, optischen Pinzetten oder bei optischen Manipulationen können die Beleuchtungsstrahlungen parallel sein. Diese Angabe kann beispielsweise der
Steuereinrichtung 28 über eine Eingabeschnittstelle zur Verfügung gestellt werden.
Alle genannten Parameter sowie das zwischen dem Objektiv 14 und dem Objekt 12 vorhandene Immersionsmedium haben Einfluss auf den Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung in dem Objekt 12. Durch Kenntnis einer oder mehrerer oder aller dieser Energieparameter kann der Zusammenhang so modifiziert werden, dass er eine genauere Angabe des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung im Objekt aus dem
Energieparameter der Messstrahlung bereitstellt. Der Zusammenhang kann daher die genannten Parameter als Variablen haben.
Die Lichtquelle 16 kann ausgebildet sein, Beleuchtungsstrahlung m it m indestens zwei verschiedenen Wellenlängen gleichzeitig zu erzeugen . Ferner kann die
Überwachungseinrichtung 20 ausgebildet sein, die Energieparameter der
Beleuchtungsstrahlung bei mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen zu bestimmen. Bei dieser Weiterbildung ist es möglich, den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt 12 für zwei, drei oder mehrere verschiedene Wellenbereiche zu steuern. Dazu ist vorgesehen, dass für jeden Wellenlängenbereich ein entsprechender Zusammenhang in der Steuereinrichtung 28 hinterlegt ist. Das Mikroskop weist eine für eine Autofokuseinrichtung 24 auf, deren Strahlung durch die Schnittstelle 23 geführt werden kann. Die Schnittstelle 23 ist beispielsweise ein Gewinde und der Autofokusstrahlengang kann eine Öffnung umfassen, durch welchen die Autofokusstrahlung geleitet wird. Die Autofokuseinrichtung 24 dient zur Erfassung der Lage des Fokus des
Objektivs 14. Eine geeignete Autofokuseinrichtung 24 ist beispielsweise in WO 2007/144197 A1 beschrieben. Die Autofokuseinrichtung 24 kann ein gegenüber dem Mikroskop 10 separates Element sein und erzeugt Autofokusbeleuchtungsstrahlung, deren Wellenlängenbereich vorzugsweise nicht m it dem Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung oder mit dem Wellenlängenbereich der von dem Objekt 12 erzeugten Fluoreszenzstrahlung übereinstimmt. Die Überwachungseinrichtung 20 erfasst die Lage des Fokus des Objektivs 14 aus vom Objekt erhaltener Autofokusmessstrahlung und übermittelt diese Angabe an die Steuereinrichtung 28. Die Steuereinrichtung 28 kann dann den Fokus des Objektivs 14 konstant halten. Dies kann aber auch durch eine separate Steuerung erreicht werden. Somit können durch Ansteuerung des Objektivs 14 beispielsweise Drift und andere Effekte ausgeglichen werden. Objektivseitig ist die Strahlteilereinrichtung 22 m it einem dichroitischen Spiegel versehen, der die Autofokusstrahlung reflektiert und die Beleuchtungsstrahlung sowie die
Fluoreszenzstrahlung transmittiert. Lichtquellenseitig weist die Strahlteilereinrichtung 22 den Strahlteiler zur Auskopplung der Messstrahlung aus dem Beleuchtungsstrahlengang aus.
Optional können die Eigenschaften des dichroitischen Spiegels und des Strahlteilers in einer einzigen optischen Strahlteilerschicht realisiert sein. Die Strahlteilereinrichtung 22 ist vorzugsweise ein einstückiges Element mit Beschichtungen, welche dessen Reflexions- oder Transmissionsverhalten beeinflussen. Der gemeinsame Strahlengang ist zwischen dem Objektiv 14 und der Strahlteilereinrichtung 22 frei von optischen Abbildungselementen ; in der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform sind keine Elemente in diesem Bereich vorgesehen. Dort verläuft die Strahlung näherungsweise parallelisiert; dies entspricht dem Unendlichkeitsraum .
Die in Figur 2 gezeigte Ausführungsform des Mikroskops 10 stimmt mit der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform im grundsätzlichen Aufbau überein. Auch wenn in Figur 2 die
Autofokuseinrichtung 24 nicht gezeigt ist, kann sie in Figur 2 ebenfalls vorgesehen sein. Im Folgenden wird nur auf die sonstigen Unterschiede zwischen den beiden Ausführungsformen gemäß Figur 1 und 2 eingegangen :
Im gemeinsamen Strahlengang ist zwischen dem Objektiv 14 und der Strahlteilereinrichtung 22 ein Shutter 38 vorgesehen. Der Shutter 38 ist über eine Leitung m it der Steuereinrichtung 28 verbunden und von der Steuereinrichtung 28 in zwei Betriebszustände schaltbar. In einem Betriebszustand blockiert der Shutter 38 den gemeinsamen Strahlengang, so dass keine
Beleuchtungsstrahlung das Objekt 12 erreichen kann. In einem anderen Betriebszustand ist der Shutter 38 geöffnet, so dass der gemeinsame Strahlengang frei ist.
Als vom Shutter unabhängige Option ist der Lichtquelle 16 eine Leuchtfeldblende 41 nachgeordnet angeordnet, mittels welcher sich die Feldgröße der Beleuchtungsstrahlung verändern lässt. Die Leuchtfeldblende 41 ist über eine Leitung m it der Steuereinrichtung 28 verbunden, wobei die Steuereinrichtung 28 Lage und/oder Größe der Öffnung der
Leuchtfeldblende 41 steuern und/oder erm itteln kann. Auf diese Weise ist es möglich, den Querschnitt der Beleuchtungsstrahlung vor dem gemeinsamen Strahlengang zu verändern.
Als weitere eigenständige Option ist die Überwachungseinrichtung 20 in der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform als ein nicht-ortsauflösender Detektor, beispielsweise eine
Fotodiode, ausgebildet. Diese nimmt im Vergleich zu dem ortsauflösenden Detektor gemäß Figur 1 weniger Raum ein und ist einfacher im Aufbau. Um die Messstrahlung auf die
Überwachungseinrichtung 20 zu fokussieren, ist eine Überwachungsoptik 42 zwischen der Strahlteilereinrichtung 22 und der Überwachungseinrichtung 20 angeordnet. Die
Überwachungsoptik 42 kann eine oder mehrere Linsen umfassen. Die Überwachungsoptik 42 fokussiert die Messstrahlung, die aus dem parallelisierten Beleuchtungsstrahlengang 34 ausgekoppelt wurde, auf die Überwachungseinrichtung 20.
Ferner sind zwischen der Strahlteilereinrichtung 22 und der Überwachungseinrichtung 20 eine optionale Irisblende 44 und ein optionaler Filter 46 angeordnet. Die Irisblende 44 ist m it der Steuereinrichtung 28 verbunden, wodurch die Steuereinrichtung 28 eine Öffnung der Irisblende in der Größe verändern und/oder ermitteln kann. Insbesondere steuert die Steuereinrichtung 28 die Irisblende 44 derart an, dass deren Öffnung mit der wirksamen Apertur des Objektivs 14 übereinstimmt. Auf diese Weise haben der Querschnitt der Messstrahlung und der Querschnitt der Beleuchtungsstrahlung im Beleuchtungsstrahlengang 34, welche das Objektiv 14 passiert, die gleiche Größe. Somit lässt sich die Intensität der in dem Objekt 12 vorhandenen
Beleuchtungsstrahlung besser ermitteln. Die wirksame Apertur des Objektivs 14 wird wie oben beschrieben aus Typ oder Art des Objektivs 14 sowie Größe der Öffnung der Leuchtfeldblende 41 ermittelt. Der Filter 46 kann einerseits zum Abschwächen, insbesondere wellenlängenunabhängig, der Messstrahlung vorgesehen sein, z. B. um Beschädigungen an der Überwachungseinrichtung 20 zu vermeiden oder um den Messbereich der Überwachungseinrichtung 20 hinsichtlich der Intensität zu vergrößern. Zum anderen kann der Filter 46 derart ausgestaltet sein, dass er nicht gewünschte Strahlung, welche das Ergebnis der Messung der Intensität der
Beleuchtungsstrahlung verfälschen könnte, blockt. Beispielsweise wird Strahlung im
Wellenlängenbereich der Autofokusstrahlung oder des Fluoreszenzlichts blockiert. Darüber hinaus kann der Filter 46 als Bandpass ausgebildet sein, so dass auf die
Überwachungseinrichtung 20 nur Strahlung in demjenigen Wellenlängenbereich eintrifft, die vor der Überwachungseinrichtung 20 erfasst werden kann. Das Mikroskop 10 kann einen oder mehrere Filter 46, wie oben beschrieben, umfassen. Insbesondere weist das Mikroskop 10 einen Filterantrieb 48 auf, mittels welchem der Filter 46 zwischen die Strahlteilereinrichtung 22 und die Überwachungseinrichtung 20 gewechselt oder herausgenommen werden kann.
Insbesondere steuert die Steuereinrichtung 28 den Filterantrieb 48 derart, dass der für die jeweilige Messung gewünschte Filter 46 zwischen die Strahlteilereinrichtung 22 und die Überwachungseinrichtung 20 eingeschaltet wird.
Die Strahlteilereinrichtung 22 kann aus dem gemeinsamen Strahlgengang ausgebildet sein. Dazu kann ein Antrieb 49, z. B. ein Elektromotor oder ein Linearantrieb, vorgesehen sein. Der Antrieb 49 ist datentechnisch mit der Steuereinrichtung 28 über eine in den Figuren nicht eingezeichnete Leitung oder per Funk verbunden. Durch Entfernen der Strahlteilereinrichtung 22 aus dem gemeinsamen Strahlengang oder dem Beleuchtungsstrahlengang 34 wird die maximale von der Lichtquelle 16 erzeugte Intensität am Objekt 12 erreicht, da in diesem Fall keine Messstrahlung ausgekoppelt wird. Die in Figur 3 gezeigte Ausführungsform des Mikroskops stimmt mit der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform des Mikroskops 10 überein, bis auf das Vorsehen eines spektralen Elements 50 anstatt des Filters 46. Es ist jedoch auch möglich, dass sowohl der Filter 46 als auch das spektrale Element 50 zwischen der Überwachungseinrichtung 20 und der Strahlteilereinrichtung 22 vorgesehen sind. Das spektrale Element 50 lenkt die Messstrahlung wellenlängenabhängig ab. Beispielsweise umfasst das spektrale Element 50 ein Beugungsgitter oder ein Prisma. Darüber hinaus hat die Überwachungseinrichtung 20 mehrere, insbesondere nicht- ortsauflösende, Detektoren, die jeweils einfallende Strahlung in einem Wellenlängenbereich detektieren. Die von dem spektralen Element 50 wellenlängenabhängig abgelenkte Strahlung wird mit Hilfe der Überwachungsoptik 42 auf die jeweiligen Detektoren der
Überwachungseinrichtung 20 fokussiert. Die Überwachungseinrichtung 20 ist auf diese Weise spektrometrisch analysierend ausgebildet. Dies könnte auch anders, z. B. mit einem
Spektrometer, geschehen.
Die Steuereinrichtung 28 ist ausgebildet, die erfasste Intensität der
Beleuchtungsstrahlungsstrahlung kontinuierlich oder an ausgewählten Zeitpunkten im Speicher 36 so abzulegen, dass für die mit dem Mikroskop 10 aufgenommenen Bilder des Objekts 12 die Intensität der Beleuchtungsstrahlung angegeben ist. Auf diese Weise lassen sich Messungen besser dokumentieren und ggf. reproduzieren.
In der in Figuren 2 und 3 gezeigten Ausführungsform kann ein im Beleuchtungsstrahlengang angeordneter Anregungsfilter 33 vorgesehen sein. Der Anregungsfilter 33 ist z. B. der Leuchtfeldblende 41 nachgeordnet. Der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung wird über den Anregungsfilter 33 modifiziert, beispielsweise durch ein Anregungsfilter 33 mit einem Transmissionsbereich von 510 nm bis 550 nm. Zur Berücksichtigung des Anregungsfilters 33 kann dessen Transmissionsspektrum beispielsweise manuell eingegeben werden, so dass der Steuereinrichtung 28 diese Information zur Verfügung steht. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Steuereinrichtung 28 ausgebildet ist, die Position eines nicht dargestellten Revolvers zu erfassen, auf welchem mehrere Anregungsfilter 33 angeordnet sind. Zur Ermittlung des Anregungsfilters 33 kann es außerdem vorgesehen sein, dass die Steuereinrichtung 28 eine Datenbank, in welcher Transmissionsspektren der verfügbaren Anregungsfilter 33 hinterlegt sind, heranzieht. Kennt die Steuereinrichtung den verwendeten Anregungsfilters 33, weiß sie, welchen Wellenlängenbereich die Beleuchtungsstrahlung abdeckt. Ist der Zusammenhang wellenlängenabhängig, kann der Energieparameter, mittels welchem das Objekt 12 beleuchtet wird, hinsichtlich des Wellenlängenbereichs der Beleuchtungsstrahlung angepasst werden.

Claims

Patentansprüche
1 . Mikroskop zur Abbildung eines Objekts (12) , umfassend
ein Objektiv (14) zur Abbildung des Objekts (12) durch einen Abbildungsstrahlengang
(32) ,
eine Lichtquelle (16) zur Erzeugung von Beleuchtungsstrahlung,
m indestens ein optisches Element (18) zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung in den Abbildungsstrahlengang (32) , so dass zwischen optischem Element (18) und Objektiv (14) ein gemeinsamer Strahlengang gebildet ist, durch den der Abbildungsstrahlengang verläuft und die Beleuchtungsstrahlung geführt ist,
eine Überwachungseinrichtung (20) zum Messen eines Energieparameters der
Beleuchtungsstrahlung, wobei die Überwachungseinrichtung (20) einen Energieparameter einer auf sie eintreffenden Strahlung bestimmt, und
eine Strahlteilereinrichtung (22) , welche in Beleuchtungsrichtung im gemeinsamen Strahlengang dem Objektiv (14) vorgeordnet ist und von der Beleuchtungsstrahlung
Messstrahlung auf die Überwachungseinrichtung (20) auskoppelt,
wobei der gemeinsame Strahlengang zwischen der die Messstrahlung auskoppelnden Strahlteilereinrichtung (22) und dem Objektiv (14) frei von optischen Abbildungselementen ist.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch eine Schnittstelle (23) für eine Autofokuseinrichtung (24) zur Bestimmung einer Lage des Fokus im Objekt (12) , wobei die Strahlteilereinrichtung (22) eine Doppelfunktion aufweist, indem sie einerseits objektivseitig Autofokusstrahlung zur/von der Schnittstelle in den Abbildungsstrahlengang (32) koppelt und andererseits lichtquellenseitig die Messstrahlung zur Überwachungseinrichtung (20) auskoppelt, und wobei optional das Mikroskop (1 ) eine an die Schnittstelle ankoppelbare
Autofokuseinrichtung (24) aufweist. 3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im gemeinsamen Strahlengang zwischen der Strahlteilereinrichtung (22) und dem Objektiv (14) ein Shutter (38) , der in einem Betriebszustand die Beleuchtungsstrahlung blockiert, vorgesehen ist.
4. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilereinrichtung (22) in einem Unendlichkeitsraum zwischen dem optischen Element (18) und dem Objektiv (14) angeordnet ist. 5. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine
Überwachungsblende, welche zwischen der Strahlteilereinrichtung (22) und der
Überwachungseinrichtung (20) angeordnet ist und deren Öffnung in Lage und/oder Größe verstellbar ist, und eine Steuereinrichtung (28) , welche die Öffnung der Überwachungsblende passend zur wirksamen Apertur des Objektivs (14) einstellt.
6. Mikroskop nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine Überwachungsoptik (42) , welche die Messstrahlung der Beleuchtungsstrahlung auf die Überwachungseinrichtung (20) fokussiert, wobei die Überwachungseinrichtung (20) einen nicht-ortsauflösenden Detektor aufweist.
7. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Überwachungseinrichtung (20) einen ortsauflösenden Detektor umfasst.
8. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch mindestens einen Filter (46) zur Abschwächung und/oder Absorption wenigstens eines Wellenlängenbereichs der
Beleuchtungsstrahlung, wobei der Filter (46) zwischen der Strahlteilereinrichtung (22) und der Überwachungseinrichtung (20) angeordnet ist.
9. Mikroskop nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch einen Filterantrieb (48) zum Bewegen des mindestens einen Filters (46) aus oder in die Messstrahlung der Beleuchtungsstrahlung.
10. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilereinrichtung (22) aus dem oder in den Beleuchtungsstrahlengang (34) bewegbar ist. 1 1 . Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der
Steuereinrichtung (28) ein Zusammenhang zwischen dem Energieparameter der Messstrahlung und dem Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung auf dem Objekt (12) hinterlegt ist und die Steuereinrichtung (28) die Lichtquelle (16) derart steuert oder regelt, dass ein Wert des Energieparameters auf dem Objekt innerhalb eines Toleranzbereichs mit einem vorgegebenen Soll-Wert übereinstimmt.
12. Mikroskop nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Zusammenhang wellenlängenabhängig ist, wobei optional die Steuereinrichtung (28) eine Wellenlänge der Beleuchtungsstrahlung erfasst und/oder einen in der Beleuchtungsstrahlung angeordneten Anregungsfilter (33) ermittelt.
13. Mikroskop nach Anspruch 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die
Steuereinrichtung (28) mindestens einen Parameter des Objektivs (14) erfasst und der Zusammenhang von dem mindestens einen Parameter des Objektivs (14) abhängt.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusammenhang von einem Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung, einem Profil der Beleuchtungsstrahlung, einer Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung und/oder einem zwischen dem Objekt (12) und dem Objektiv (14) vorhandenen Immersionsmedium abhängt.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (16) ausgebildet ist, Beleuchtungsstrahlung mit mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen gleichzeitig zu erzeugen und/oder dass die Überwachungseinrichtung (20) ausgebildet ist, die Energieparameter der Messstrahlung mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen zu bestimmen.
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