DE102022102763A1

DE102022102763A1 - Mikroskop und Bildgebungsverfahren für ein Mikroskop

Info

Publication number: DE102022102763A1
Application number: DE102022102763.5A
Authority: DE
Inventors: Ralf DOUBEK; Felicia Walz
Original assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Current assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Priority date: 2022-02-07
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2023-08-10
Also published as: US20240069316A1

Abstract

Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Mikroskop und ein Bildgebungsverfahren für ein Mikroskop. Das erfindungsgemäße Mikroskop (10) umfasst einen Beleuchtungsstrahlengang (20), der ausgebildet ist, Anregungsstrahlung einer Lichtquelle (30) auf ein zu untersuchendes Objekt (40) einzukoppeln; einen optischen Filter (50), der ausgebildet ist, Teile der Anregungsstrahlung zu selektieren; einen Sensor (60) zur Detektion einer optischen Eigenschaft der Anregungsstrahlung; einen Messstrahlengang (90), der ausgebildet ist, einen Teil der Anregungsstrahlung auf den Sensor (60) zu führen; einen Beobachtungstrahlengang (70), der ausgebildet ist, von dem Objekt (40) abgestrahlte Strahlung abzubilden; wobei der optische Filter (50) im Strahlengang zwischen der Lichtquelle (30) und dem Sensor (60) angeordnet ist, und ein Bilderzeugungsmittel (80), das ausgebildet ist, aus der vom Objekt (40) abgestrahlten und im Beobachtungstrahlengang (70) geführten Strahlung ein Bild zu erzeugen; wobei das Bilderzeugungsmittel (80) ausgebildet ist, die mittels des Sensors (60) detektierten Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung zur Bilderzeugung zu verwenden.

Description

Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop und ein Bildgebungsverfahren für ein Mikroskop, insbesondere ein Operationsmikroskop zur Fluoreszenzbildgebung. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Computerprogramm zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in dem erfindungsgemäßen Mikroskop sowie die Verwendung eines optischen Filters zur Kalibrierung des erfindungsgemäßen Mikroskops.
Technologischer Hintergrund
Der Einsatz von technologischen Hilfsmitteln ist fester Bestandteil der modernen Medizin. Sowohl bildgebende Verfahren als auch robotische Systeme zum Führen medizinischer Instrumente werden in der Chirurgie ebenso selbstverständlich eingesetzt wie in der Diagnostik. Das Verwenden bildgebender Verfahren ermöglicht dabei die Diskriminierung vielfältiger Strukturen im Patienten und die dabei gewonnen Bilddaten können vorteilhaft in der Diagnostik als auch in therapeutischen und chirurgischen Verfahren eingesetzt werden.
Mithilfe eines Operationsmikroskops können eine Vielzahl medizinischer Eingriffe unterstützt werden. Insbesondere können während der Operation gewonnene Bildinformationen mit zuvor gewonnenen diagnostischen Bilddaten (überlagert) dargestellt werden, um dem Operateur schlecht sichtbare Gewebegrenzen, Blutflussinformationen oder anderweitige Fluoreszenzinformationen anzuzeigen. Ebenso können anhand der Bilddaten robotische chirurgische Instrumente gesteuert werden beziehungsweise teil- oder vollautonom gewisse Operationen durchgeführt werden. Dabei kommen Operationsmikroskope insbesondere in der minimalinvasiven Chirurgie sowie in der Mikrochirurgie zum Einsatz.
Für die vorgenannten Anwendungen und insbesondere für die Bildgebung von ansonsten schlecht sichtbaren Geweben und Gewebegrenzen mittels Fluoreszenzanregung, ist dabei eine korrekte Kalibrierung des Mikroskops von entscheidender Bedeutung. Beispielsweise ist ein vom Gewebe emittiertes Fluoreszenzlicht von den Anregungsbedingungen abhängig, insbesondere von der Intensität und dem Spektrum der zur Anregung eingesetzten Lichtquelle aber auch von sonstigen Einflüssen und Anregungsbedingungen des bildgebenden optischen Systems beziehungsweise (Operations-)Mikroskops.
Zur Anregung und Beleuchtung des Gewebes werden unter anderem LED-Lichtquellen verwendet. Die Effizienz der üblicherweise verwendeten LEDs ist jedoch temperaturabhängig und sinkt zudem im Laufe der Lebensdauer. Darüber hinaus kann sich auch das Spektrum der Anregungslichtquelle mit der Zeit sowie in Abhängigkeit der Temperatur spektral verschieben. Effizienz und Spektrum der Lichtquelle können zudem von weiteren Faktoren, wie beispielsweise des zum Betrieb der Lichtquelle eingesetzten Stroms, abhängen. Auch weitere im Strahlengang vorhandene optische Komponenten, wie beispielsweise Lichtleiter, können Alterungserscheinungen aufweisen, wodurch sowohl die Intensität als auch die spektrale Verteilung der auf das Gewebe eingestrahlten Lichtenergie signifikant variieren können.
Für eine exakte Fluoreszenzbildgebung ist jedoch die genaue Kenntnis sowohl der Intensität als auch der spektralen Verteilung des zur Fluoreszenzanregung auf das Gewebe eingestrahlten Lichts essenziell. Diese Werte dienen, gemeinsam mit einer Kenngröße zur Quantenausbeute der Fluoreszenzanregung, als Grundlage für die Darstellung des eingesetzten Fluorophors und mithin auch der eigentlichen Bildgebung. Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung bezeichnet der Begriff Fluorophor sowohl Fluoreszenzstoffe als auch Fluoreszenzmarker und sowohl extern eingebrachte (exogene) als auch natürlich im Körper vorkommende (endogene) Fluorophore.
Ein Operationsmikroskop ist beispielsweise aus DE102020102476A1 bekannt. Das Operationsmikroskop wird bei voreingestellten Beleuchtungseinstellungen kalibriert, sodass insbesondere Einflüsse des bildgebenden optischen Systems kompensiert werden können.
Im Stand der Technik kann eine Veränderung der Abstrahlcharakteristiken der Anregungslichtquelle während des Betriebs nachteilig zu einer fehlerhaften Kalibrierung und damit auch zu einer fehlerhaften Fluoreszenzdarstellung, beispielsweise bei der Tumordetektion und -darstellung, führen. Somit ist eine regelmäßige Überprüfung des Beleuchtungsspektrums beziehungsweise Neu-Kalibrierung des Mikroskops erforderlich. Zudem kann eine Variation von Intensität sowie spektraler Verteilung der Anregungslichtquelle während der Benutzung nicht kompensiert werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und ein verbessertes Operationsmikroskop bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch die Gegenstände der unabhängigen Patentansprüche. Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft ein Mikroskop. Dieses weist erfindungsgemäß einen Beleuchtungsstrahlengang auf, der zum Einkoppeln einer Anregungsstrahlung einer Lichtquelle auf ein zu untersuchendes Objekt ausgebildet ist. Bei der Lichtquelle handelt es sich bevorzugt um eine zur Anregung einer Fluoreszenz in einer Probe ausgebildete Lichtquelle. Bevorzugt handelt es sich bei der Lichtquelle um eine LED. Im erfindungsgemäßen Mikroskop können alternativ jedoch auch andere Lichtquellen, beispielsweise Xenonlampen, eingesetzt werden. Vorteilhaft können im erfindungsgemäßen Mikroskop auch stark alternde Lichtquellen zur Beleuchtung eingesetzt werden. Die Lichtquelle wird ausschließlich oder unter anderem zur Anregung von Fluoreszenz verwendet.
Das erfindungsgemäße Mikroskop weist ferner einen optischen Filter auf, der zum Selektieren eines Teils der Anregungsstrahlung ausgebildet ist. Mit anderen Worten weist der optische Filter eine wellenlängenabhängige Transmission beziehungsweise Absorption (Transmissionsfilter) oder Reflektion (Reflektionsfilter) oder eine Mischung hiervon auf. Beispielsweise kann es sich bei dem Filter um einen Bandpassfilter handeln, wobei die Ableitung der Filtereigenschaften nachfolgend noch im Detail erläutert werden wird. Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung handelt es sich bei dem optischen Filter bevorzugt um ein Filterelement oder eine Kombination einer Mehrzahl von Filterelementen. Das zumindest eine Filterelement ist bevorzugt als Transmissionsfilter oder Reflektionsfilter ausgebildet.
Ferner weist das erfindungsgemäße Mikroskop einen zur Detektion optischer Eigenschaften der Anregungsstrahlung ausgebildeten Sensor auf. Dieser Sensor ist bevorzugt von einem zur Bildgebung verwendeten Sensor des Mikroskops verschieden. Erfindungsgemäß ist der optische Filter im Strahlengang zwischen der Lichtquelle und dem Sensor angeordnet. In diesem Zusammenhang wird unter Lichtquelle insbesondere das eigentliche Leuchtmittel verstanden, der besagte Strahlengang zwischen Lichtquelle und Sensor kann somit auch Abschnitte innerhalb eines Gehäuses um das eigentliche Leuchtmittel umfassen. Der Sensor detektiert mithin den vom optischen Filter selektierten, bevorzugt transmittierten oder reflektierten, Anteil der Anregungsstrahlung. Die Anordnung von Sensor und Filter im Mikroskop kann variieren, der Sensor erfasst das Anregungslicht jedoch nach dessen Interaktion mit dem, insbesondere dessen Durchgang durch den, optischen Filter sowie vor der Interaktion des Anregungslichts mit der zu beleuchtenden Probe. Bevorzugt wird eine Mehrzahl von Sensoren zur Detektion der optischen Eigenschaften der Anregungsstrahlung verwendet. Besonders bevorzugt ist eine Mehrzahl alternativ oder kumulativ zu verwendender Sensoren vorgesehen. Eine alternative Verwendung ist beispielsweise zur Detektion von Anregungsstrahlung verschiedener Intensitäten sinnvoll. Eine kumulative Verwendung kann zur Detektion von Anregungsstrahlung in verschiedenen Spektralbereichen sinnvoll sein.
Das erfindungsgemäße Mikroskop weist ferner einen Messstrahlengang auf, der dazu ausgebildet ist, einen Teil der Anregungsstrahlung auf den Sensor zu führen. Der Messtrahlengang führt bevorzugt den von dem optischen Filter selektierten Teil der Anregungsstrahlung zumindest teilweise auf den Sensor. Mit anderen Worten ist der optische Filter bevorzugt in dem Messstrahlengang angeordnet beziehungsweise beginnt der Messstrahlengang bevorzugt am optischen Filter. Der Messstrahlengang dient dem Erfassen von Eigenschaften der Anregungsstrahlung vor deren Interaktion mit der beleuchteten Probe.
Im erfindungsgemäßen Mikroskop ist ferner ein Beobachtungstrahlengang vorgesehen, der zum Abbilden von dem Objekt abgestrahlter Strahlung ausgebildet ist. Bei der Fluoreszenzmikroskopie beziehungsweise Bildgebung wird vorrangig emittiertes Fluoreszenzlicht zur Bilderzeugung verwendet. Das abgestrahlte Licht kann jedoch neben der vom Objekt emittierten Strahlung auch reflektierte oder gestreute Anteile des zur Anregung verwendeten Lichts aufweisen. Ein Bilderzeugungsmittel des erfindungsgemäßen Mikroskops zum Erzeugen eines Bildes aus der vom Objekt abgestrahlten und im Beobachtungstrahlengang geführten Strahlung ist erfindungsgemäß dazu ausgebildet, die mittels des Sensors detektierten Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung zur Bilderzeugung zu verwenden. Mit anderen Worten geht im erfindungsgemäßen Mikroskop ein von dem optischen Sensor erzeugtes Sensorsignal, welches Eigenschaften der Anregungsstrahlung charakterisiert, in die Bilderzeugung ein. In der Bilderzeugung wird somit bevorzugt ein Bild anhand der vom Objekt abgestrahlten (insbesondere emittierten) Strahlung unter Berücksichtigung des von dem optischen Sensor erzeugten Sensorsignals erzeugt.
Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop sind vorteilhaft während des Betriebs eintretende Änderungen von Eigenschaften des Anregungslichts, wie beispielsweise Intensität, und/oder spektrale Verteilung, bei der Bilderzeugung (in-situ) kompensierbar. Diese Änderungen können dabei auf die Lichtquelle als auch auf optische Komponenten des Mikroskops im Beleuchtungsstrahlengang zurückzuführen sein. Die Kompensation etwaiger Schwankungen des Anregungslichts erfolgt dabei vorteilhaft mit hoher Genauigkeit, aber dennoch kostengünstig, insbesondere sofern als Sensor für die optischen Eigenschaften des Anregungslichts ein Detektor mit reduzierbarer oder reduzierter Kanalzahl eingesetzt wird. Sofern das Sensorsignal anzeigt, dass das Anregungslicht weitgehend dem bei einer erfolgten Kalibrierung entspricht, wird dies bei der Bilderzeugung vorteilhaft dadurch berücksichtigt, dass die Bilderzeugung entsprechend gänzlich ohne Kompensation (Korrektur) oder zumindest ohne erneute Kompensation und beispielsweise unter Verwendung eines zuvor bestimmten Korrekturwerts (bevorzugt gewonnen anhand eines Vergleichs von einem Referenzwert und einem zuvor bestimmten effektiven Wert der Anregung) durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Sensor dazu ausgebildet, die Intensität der Anregungsstrahlung im Messstrahlengang zu bestimmen. Besonders bevorzugt ist der Sensor dazu ausgebildet, lediglich die Intensität der Anregungsstrahlung im Messstrahlengang zu bestimmen. Mit anderen Worten wird bevorzugt ein Sensor ohne jegliche spektrale Auflösung als erfindungsgemäßer Sensor für das Anregungslicht verwendet. Solche Sensoren sind vorteilhaft kostengünstig und einfach zu handhaben. Dabei ist es bevorzugt, dass der Sensor die Lichtstärke und/oder die Beleuchtungsstärke der auf den Sensor treffenden Anregungsstrahlung detektiert. Alternativ oder zusätzlich, kommen andere photometrische Größen in Betracht, wie beispielsweise Lichtstrom, Leuchtdichte, Lichtausbeute, Lichtmenge, Bestrahlungsstärke, Flussdichte, Photonenzahl und ähnliche Größen, die ebenfalls eine Aussage über die auf den Sensor eingestrahlte Energie beziehungsweise Intensität zulassen.
Ferner bevorzugt ist der Sensor breitbandig ausgebildet und weist beispielsweise eine spektrale Absorptionskennlinie mit einer Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) von mehr als 10 nm, bevorzugt von mehr als 30 nm und besonders bevorzugt von mehr als 60 nm auf. Ebenfalls bevorzugt weist zumindest 50 %, besonders bevorzugt zumindest 80 % und ferner bevorzugter zumindest 90 % des vom Sensor absorbierten Lichts eine Wellenlänge im Bereich von 380 nm bis 700 nm auf. Mit anderen Worten ist der erfindungsgemäße Sensor vorzugsweise zur Absorption von sichtbarem Licht ausgebildet. Ebenfalls bevorzugt ist der erfindungsgemäße Sensor jedoch zusätzlich oder alternativ auch zur Detektion von Licht in weiteren Spektralbereich ausgebildet, insbesondere von Licht mit Wellenlängen bis 350 nm im Ultraviolettbereich oder mit Wellenlängen bis 2200 nm im (Nah-)Infrarotbereich.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der optische Filter als Bandpassfilter ausgebildet. Dabei ist die spektrale Filterkennlinie, bevorzugt die Transmissions- oder Reflektionskennlinie, vorzugsweise mit einer Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) von weniger als 300 nm, bevorzugter von weniger als 200 nm und besonders bevorzugt von weniger als 100 nm ausgebildet. Besonders bevorzugt korrespondiert die Bandbreite und die Bandlage eines solchen Bandpassfilters zu dem Absorptionsspektrum des für die Bildgebung des Objekts verwendeten Fluorophors. Somit kann sichergestellt werden, dass lediglich der zur Fluoreszenzanregung beitragende Teil des Anregungslichts mit dem Sensor detektiert wird. Mit anderen Worten ersetzt der Filter erfindungsgemäß eine spektrale Auswertung im Sensor. Bei dem Fluorophor handelt es sich bevorzugt um einen medizinisch zugelassenen Fluorophor, wie beispielsweise Protoporphyrin IX (PpIX), Fluoreszin oder Indocyaningrün. Diese Fluorophore weisen in der Regel einen ausgedehnten zur Fluoreszenzanregung beitragenden Spektralbereich auf. Die spektrale Filterkennlinie, bevorzugt Transmissions- oder Reflektionskennlinie, des Sensors weist daher vorzugsweise eine Halbwertsbreite größer 5 nm, bevorzugt größer 15 nm und besonders bevorzugt größer 25 nm auf.
Im erfindungsgemäßen Mikroskop ist der Filter bevorzugt an die jeweilige Applikation, insbesondere an das effektive Anregungsspektrum eines im Objekt vorhandenen Fluorophors angepasst. Das effektive Anregungsspektrum basiert dabei bevorzugt auf dem Absorptionsspektrum als auch auf der spektralen Anregungseffizienz des Fluorophors. Ebenfalls bevorzugt ist der Filter, insbesondere die Filterkennlinie, an das effektive Anregungsspektrum einer Mehrzahl in der Probe enthaltener Fluorophore angepasst. Somit selektiert der Filter erfindungsgemäß das zur Fluoreszenzanregung beitragende Licht aus der Anregungsstrahlung, wodurch eine Kalibration der Fluoreszenzbildgebung allein anhand einer Intensitätsmessung der selektierten Anregungsstrahlung erfolgen kann. Ebenfalls bevorzugt werden eine Mehrzahl von Filtern verwendet beziehungsweise ist der Filter aus einer Mehrzahl von Filterelementen gebildet. In diesem Fall können gegebenenfalls auch mehrere Filter beziehungsweise Filterelemente für ein einzelnes Fluorophor eingesetzt werden.
Beispielsweise kann es vorgesehen sein, dass in einer Probe mehrere Fluorophore enthalten sind deren Anregungsspektren deutlich voneinander abweichen beziehungsweise abgrenzbar sind. Beispielsweise wird ein erster Fluorophor in einer Probe bei Wellenlängen um 400 nm zur Fluoreszenz angeregt und wird ein zweiter Fluorophor in derselben Probe bei Wellenlängen um 800 nm zur Fluoreszenz angeregt, während eine Kreuzanregung (also Fluorophor 1 bei λ - 800 nm und Fluorophor bei λ - 400 nm) vernachlässigbar ist. In diesem Fall ist der Filter, insbesondere die Filterkennlinie, bevorzugt an das effektive Anregungsspektrum beider Fluorophore angepasst, während die Anregung der einzelnen Fluorophore über die Anregungsstrahlung kontrolliert wird. Hierzu können zwei separate Lichtquellen oder eine modulierbare Lichtquelle vorgesehen sein. Gemäß dieser Ausführungsform ist zudem bevorzugt ein breitbandiger Sensor vorgesehen, mit dem die gefilterte Anregungsstrahlung sowohl um 400 nm als auch um 800 nm detektierbar ist. Bevorzugt ist der Sensor zur individuellen Messung der jedes der mehreren Fluorophore ansteuerbar, wobei die Messung entweder einzeln oder gleichzeitig erfolgen kann.
Ferner bevorzugt ist der Filter, insbesondere die Filterkennlinie, an die optischen Eigenschaften der im Anregungsstrahlengang des Mikroskops enthaltenen optischen Elemente angepasst. Auch diese filtern und manipulieren die Anregungsstrahlung im Mikroskop und nehmen somit Einfluss auf die tatsächlich zur Fluoreszenz beitragenden Anregungsstrahlung. Bevorzugt wird auch dieser Einfluss im erfindungsgemäßen Mikroskop durch den Filter nachgebildet. Eine Nachbildung der optischen Eigenschaften der im Anregungsstrahlengang des Mikroskops enthaltenen optischen Elemente durch den Filter ist insbesondere bei einer Anordnung des Sensors nahe der Lichtquelle notwendig. Ist der optische Sensor jedoch nahe dem Objekt, sprich eher am Ende des Anregungsstrahlengangs, angeordnet, so haben die optischen Eigenschaften der im Anregungsstrahlengang des Mikroskops enthaltenen optischen Elemente die Anregungsstrahlung bereits moduliert, die entsprechende Information ist somit in der Anregungsstrahlung bereits intrinsisch enthalten. Dann ist in der Regel eine Nachbildung der Absorption und/oder Anregungseffizienz (effektive Absorption) zumindest eines Fluorophors ausreichend. Besonders bevorzugt werden lediglich nicht-alternde optische Komponenten des Mikroskops durch den Filter nachgebildet, wie beispielsweise charakteristische Peaks verursachende Coatings im Strahlengang. Sofern die optischen Eigenschaften der optischen Komponenten jedoch selbst einer Alterung unterliegen, wäre eine zeitabhängige Komponente des Filters erforderlich und ist eine intrinsische Berücksichtigung am Ende des Anregungsstrahlengangs bevorzugt. Gleiches gilt im Hinblick auf eine etwaige Temperaturabhängigkeit der optischen Eigenschaften der optischen Komponenten.
Ebenso bevorzugt ist der Filter, insbesondere die Filterkennlinie, an eine spektrale Sensitivität des eingesetzten Sensors angepasst. Da dieser bevorzugt lediglich eine Intensität misst, besonders bevorzugt im gesamten spektralen Bandbereich ohne spektral aufzulösen, kann eine spektral variierende Sensorsensitivität das erfasste Signal verfälschen. Weist der Sensor beispielsweise eine Kennlinie auf, gemäß der weißes Rauschen einer bestimmten Intensität bei verschiedenen Wellenlängen mit verschiedener Sensitivität erfasst wird, so stellt die gemessene Intensität im gesamten Bandbereich eine gewichtete Summierung dar. Besonders bevorzugt weist der Sensor eine an diese Sensorkennlinie, bevorzugt an die inverse Sensorkennlinie, angepasste Filterkennlinie auf. Somit kann ein etwaiger Einfluss des Sensors kompensiert werden. Besonders bevorzugt weist der Filter eine auf der inversen Sensorkennlinie und dem Absorptionsspektrum eines Fluorophors basierende Filterkennlinie auf.
Wie bereits ausgeführt, ist die Filterkennlinie (zum Beispiel die spektrale Transmissionskennlinie oder Reflektionskennlinie) des optischen Filters bevorzugt an das (effektive) Absorptionsspektrum des Fluorophors angepasst. Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung bedeutet dies, dass eine Abweichung der Spektren pro Wellenlänge bevorzugt kleiner als 35 %, ferner bevorzugt kleiner 25 %, ebenfalls bevorzugt kleiner 15 %, besonders bevorzugt kleiner als 10 % und ferner bevorzugt kleiner als 5 % ist. Eine solche Betrachtung setzt eine identische Normierung von Filterkennlinie des Filters und (effektivem) Absorptionsspektrums des Fluorophors voraus. Ferner bevorzugt liegt eine Anpassung von Filterkennlinie und Absorptionsspektrum vor, wenn die Fläche unter dem (normierten, effektiven) Absorptionsspektrum des Fluorophors weniger als 35 %, ferner bevorzugt weniger als 25 %, ebenfalls bevorzugt weniger als 15 %, bevorzugter weniger als 10 % und besonders bevorzugt weniger als 5 % von der Fläche unter der (normierten) Filterkennlinie abweicht. Somit kann eine Anpassung der Filterkennlinie beispielsweise an eine Einhüllende des Absorptionsspektrums erfolgen. Gleiches gilt für eine Anpassung der Filterkennlinie an die optischen Eigenschaften weiterer optischer Elemente im Anregungsstrahlengang oder an die Sensorkennlinie des Sensors. In diesen Fällen erfolgt die Anpassung der Filterkennlinie bezüglich einer resultierenden Kennlinie, welche sich beispielsweise durch Faltung der Absorptionskennlinie des Fluorophors, einer inversen Sensorkennlinie des Sensors und Kennlinien der optischen Elemente ergibt.
In einer ferner bevorzugten Ausführungsform sind der Filter und der Sensor in unmittelbarer Nähe zueinander angeordnet. Vorzugsweise befinden sich zwischen Filter und Sensor keine weiteren strahlformenden optischen Komponenten. Vorzugsweise ist der Abstand zwischen Filter und Sensor kleiner als die Brennweite des im Mikroskop verwendeten Objektivs. Ebenfalls bevorzugt sind Filter und/oder Sensor in einem Bereich angeordnet, in dem die Anregungsstrahlung beziehungsweise der im Messstrahlengang geführte Teil der Anregungsstrahlung eine möglichst hohe Kollimation aufweist, also Winkelabweichungen zwischen den Einzelstrahlen der Anregungsstrahlung möglichst gering sind. Somit lassen sich vom Einfallwinkel abhängige Anisotropien der Filterwirkung oder Sensorerfassung vermeiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der optische Filter durch eine Vielzahl von einzelnen, beispielsweise scheibenförmigen, Filterelementen gebildet. Vorzugsweise sind einzelne, beispielsweise scheibenförmige, Filterelemente direkt hintereinander angeordnet. Ebenfalls bevorzugt weist das erfindungsgemäße Mikroskop eine Mehrzahl von Filtern auf. Dabei sind einzelne Filter der Mehrzahl von Filtern bevorzugt jeweils an einen Fluorophor angepasst. Die Mehrzahl der Filter ist beispielsweise in einem Filterrevolver auswählbar angeordnet und mit einem breitbandigen Sensor kombiniert. Ebenso bevorzugt weist das erfindungsgemäße Mikroskop eine Mehrzahl eher schmalbandiger Sensoren auf, beispielsweise jeweils in Kombination mit einem der Mehrzahl von Filtern. Ebenso bevorzugt weist das erfindungsgemäße Mikroskop eine Mehrzahl von Filtern auf, wobei die Mehrzahl der Filter insgesamt an die (effektive) Absorptionscharakteristik eines Fluorophors angepasst ist. Beispielsweise ist ein einzelner Filter beziehungsweise ein einzelnes Filterelement für eine linke Flanke und ein weiterer einzelner Filter beziehungsweise einzelnes Filterelement für eine rechte Flanke des (effektiven) Absorptionsspektrums des Fluorophors vorgesehen.
Die Lichtquelle ist vorzugsweise spektral breitbandig ausgebildet. Beispielsweise weist eine spektrale Emissionskennlinie der Lichtquelle vorzugsweise eine Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) von mehr als 10 nm, bevorzugt von mehr als 30 nm und besonders bevorzugt von mehr als 60 nm auf. Ferner bevorzugt befinden sich mindestens 50 %, besonders bevorzugt mindestens 80 % und besonders bevorzugt mindestens 90 % des von der Lichtquelle emittierten Lichts im Spektralbereich von 380 nm bis 700 nm, sprich die Lichtquelle emittiert sichtbares Licht. Ebenfalls bevorzugt deckt die Lichtquelle jedoch zusätzlich oder alternativ auch andere Spektralbereich ab, insbesondere Wellenlängen bis zu 350 nm im Ultraviolettbereich oder Wellenlängen bis 2200 nm im Nahinfrarotbeziehungsweise Infrarotbereich. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Mikroskop eine Vielzahl von Lichtquellen auf, wobei es möglich ist, jeder der Lichtquellen einzeln einen angepassten Filter und einen Detektor zuzuordnen. Alternativ und sofern die Anregungsstrahlung der Mehrzahl von Lichtquellen in einem gemeinsamen Strahlengang geführt wird, ist es bevorzugt einen gemeinsamen Filter und einen zugehörigen Detektor vorzusehen.
Bei der Lichtquelle kann es sich jedoch vorzugsweise auch um eine schmalbandige Lichtquelle, beispielsweise um einen Laser, handeln. Laserlicht wird häufig zur Anregung von Fluorophoren verwendet, da zumindest für einige Fluorophore Laser mit gut zum Absorptionsspektrum korrespondierender Wellenlänge bereitgestellt werden können. Auch in diesem Fall erlaubt das erfindungsgemäße Mikroskop die Detektion des zur Anregung effektiv beitragenden Teils der Anregungsstrahlung. Bevorzugt wird in diesem Fall das Sensorsignal nicht nur zur Bilderzeugung herangezogen, sondern auch für eine Steuerung und/oder Regelung der Laserquelle und/oder anderer Komponenten im Mikroskop (beispielsweise Blenden etc.).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops weist dieses eine Steuereinheit auf, die dazu ausgebildet ist, in Abhängigkeit des Sensorsignals die Lichtquelle und/oder andere Komponenten anzusteuern beziehungsweise zu regeln. Dies umfasst bevorzugt das Regeln oder Steuern einer Temperatur oder eines Versorgungsstroms der Lichtquelle. Ebenfalls bevorzugt umfasst dies das Steuern oder Regeln von weiteren Komponenten, wie beispielsweise Blenden oder Filtern (beispielsweise mittels Filterkippungen). Die Steuereinheit umfasst gemäß dieser Ausführungsform bevorzugt das Bilderzeugungsmittel, beziehungsweise letzteres ist eine Subkomponente der Steuereinheit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Messstrahlengang ausgebildet, einen Teil der Anregungsstrahlung aus dem Beleuchtungsstrahlengang auszukoppeln. Dabei ist es bevorzugt, dass lediglich ein geringer Teil von weniger als 10 %, besonders bevorzugt weniger als 5 % und ferner bevorzugt von weniger als 1 % des Anregungslichts in den Messstrahlengang ausgekoppelt wird. Somit bleibt vorteilhaft die Anregungsleistung des eigentlichen Messsignals nahezu erhalten und ist eine hohe Bildqualität realisierbar trotz der zur Kompensation etwaiger Schwankungen des Anregungslichts notwendigen Messung zumindest eines Teils des Anregungslichts. Die Auskopplung von Anregungslicht im Messstrahlengang erfolgt bevorzugt durch einen teildurchlässigen Spiegel beziehungsweise einen Strahlteiler. Somit kann vorteilhaft eine kompakte Bauform ermöglicht werden.
Ferner bevorzugt ist im Messstrahlengang ein Mittel zur Lichthomogenisierung vorgesehen. Das Mittel zur Lichthomogenisierung ist vorzugsweise eine Ulbricht-Kugel. Somit können vorteilhaft räumliche Inhomogenitäten der Anregungsstrahlung reduziert werden. Dies ermöglicht vorteilhaft die Verwendung eines einfachen und kostengünstigen Sensors. Alternativ bevorzugt werden jedoch auch räumliche Inhomogenitäten der Anregungsstrahlung erfasst, beispielsweise indem der Sensor zum Erfassen der optischen Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung als ein Sensor-Array beziehungsweise Pixeldetektor zum Erfassen einer zweidimensionalen Verteilung des gefilterten Anregungslichts ausgebildet ist.
Hierfür kann beispielsweise ein CCD Sensor verwendet werden. Im Ergebnis ermöglicht dies das Ermitteln einer Matrix mit effektiven Werten des Anregungslichts beziehungsweise, durch Vergleich mit einem Referenzwert des Anregungslichts, einer Matrix mit Korrekturfaktoren für das Anregungslicht. Diese Ausführungsform ermöglicht vorteilhaft auch die Darstellung beziehungsweise Kompensation räumlicher Inhomogenitäten des Anregungslichts, wodurch eine Kalibrierung, beispielsweise mit einem Weißtarget, gegebenenfalls überflüssig wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Bilderzeugungsmittel eine Kamera auf. Dabei ist der Beobachtungstrahlengang bevorzugt dazu ausgebildet, das Objekt auf eine lichtempfindliche Detektorebene der Kamera abzubilden. Der lichtempfindliche Detektor der Kamera ist vorzugsweise als CMOS-Sensor oder als CCD-Sensor ausgebildet. Es ist weiterhin möglich, eine Vielzahl von Kameras zur Bilddetektion vorzusehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Bilderzeugungsmittel eine Auswerteeinheit aus. Die Auswerteeinheit ist vorzugsweise durch Hardware- und/oder Softwarekomponenten gebildet. Die Auswerteeinheit ist insbesondere ausgebildet, die von der Kamera detektierten Bilddaten zu verarbeiten und ein Bild unter Verwendung der detektierten, abgebildeten Strahlung (Intensität) zu erzeugen. Dabei ist es bevorzugt, dass die Auswerteeinheit die vom Sensor detektierte Strahlungsintensität verwendet, um etwaige Schwankungen des Anregungslichts, die beispielsweise durch die Alterung der Lichtquelle und/oder optischer Komponenten wie Wellenleiter hervorgerufen ist, mit hoher Genauigkeit zu kompensieren. Dies ist insbesondere in der Fluoreszenzbildgebung vorteilhaft, da hierdurch beispielsweise Gewebegrenzen oder andere Fluoreszenzinformationen trotz der zeitlichen Variation des verwendeten optischen Systems mit hoher Genauigkeit ermittelt und angezeigt werden können.
In einer besonders bevorzugten Durchführungsform erfolgt die Erzeugung des Bildes durch die Auswerteeinheit und unter Verwendung der vom Sensor detektierten Strahlungsintensität fortlaufend. Dabei wird das Bild des Objekts während des Betriebs des Mikroskops fortlaufend beziehungsweise fortwährend (kontinuierlich) detektiert und erzeugt. Somit wird die mittels des Sensors detektierte Eigenschaft (Intensität) der gefilterten Anregungsstrahlung fortlaufend (fortwährend) zur Bilderzeugung verwendet werden, womit eine in-situ Kompensation des sich zeitlich ändernden optischen Systems erreicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mikroskop ausgebildet, die optische Eigenschaft der Anregungsstrahlung mittels des Sensors zu detektieren und unter Berücksichtigung der detektierten Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung und vom Objekt abgestrahlter und im Beobachtungstrahlengang geführter und detektierter Strahlung ein Bild zu erzeugen.
Die Eigenschaften eines optischen Systems ändern sich in der Regel nicht schlagartig, sondern im Laufe der Zeit allmählich. Bevorzugt ist die Auswerteeinheit daher dazu ausgebildet, die mittels des Sensors detektierte Eigenschaft (Intensität) der gefilterten Anregungsstrahlung zur Erzeugung des Bildes diskontinuierlich zu verwenden. Ein Zeitintervall, innerhalb dessen die Eigenschaft der Anregungsstrahlung erneut detektiert und/oder erneut zur Bilderzeugung verwendet wird, ist bevorzugt kleiner als 10 Minuten, ferner bevorzugt kleiner als 1 Minute und besonders bevorzugt kleiner als 10 Sekunden.
Um die Variationen innerhalb des optischen Systems, wie beispielsweise Intensität und Spektrum der Lichtquelle, Transmissionsspektrum eines Wellenleiters, Transmissionsspektrum von optischen Oberflächen etc., effektiv bestimmen und kompensieren zu können, ist es bevorzugt vorgesehen, dass die mittels des Sensors detektierte Eigenschaft (Intensität) der gefilterten Anregungsstrahlung mit einem unter bekannten Anregungsbedingungen zuvor ermittelten Referenzwert verglichen wird. Besonders bevorzugt ist die Auswerteeinheit dazu ausgebildet, die Helligkeit des erzeugten Bildes rechnerisch zu erhöhen, wenn sich das Verhältnis zwischen der detektierten optischen Eigenschaft der Anregungsstrahlung und dem Referenzwert erhöht. Ferner bevorzugt ist die Auswerteeinheit dazu ausgebildet, die Helligkeit des Bildes rechnerisch zu verringern, wenn sich das Verhältnis zwischen der detektierten optischen Eigenschaft der Anregungsstrahlung und dem Referenzwert verringert. Besonders bevorzugt erfolgt eine lineare Anpassung im Verhältnis der mittels des Sensors detektierten optischen Eigenschaft (Intensität) der gefilterten Anregungsstrahlung und dem zuvor ermittelten Referenzwert.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes von einem Objekt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst. Zunächst erfolgt ein Erzeugen von Anregungsstrahlung, insbesondere von zum Anregen von Fluoreszenz geeigneter Anregungsstrahlung. In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Einkoppeln mindestens eines Teils der Anregungsstrahlung auf ein zu untersuchendes Objekt. Ferner erfolgt das Auskoppeln eines Teils der Anregungsstrahlung, wobei der ausgekoppelte Teil der Anregungsstrahlung auf einen optischen Filter geführt wird. Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt ferner ein Selektieren eines Teils der ausgekoppelten Anregungsstrahlung mittels des optischen Filters und eine Detektion optischer Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung mittels eines optischen Sensors. Schließlich erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren ein Abbilden mindestens eines Teils der von dem Objekt abgestrahlten Strahlung, eine Detektion der abgebildeten Strahlung und ein Erzeugen eines Bildes unter Verwendung sowohl der detektierten, abgebildeten Strahlung als auch unter Verwendung der detektierten optischen Eigenschaft der gefilterten Anregungsstrahlung. Durch Berücksichtigung der Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung bei der Bilderzeugung ist vorteilhaft der Einfluss des optischen Systems, beispielsweise der Lichtquelle, auf die Bilderzeugung darstellbar und bevorzugt kompensierbar.
In einer bevorzugten Durchführungsform umfasst das Verfahren ferner ein Bestimmen eines effektiven Werts für die Anregung des zu untersuchenden Objekts. Der effektive Wert charakterisiert dabei bevorzugt die Fluoreszenzanregung im zu untersuchenden Objekt. Dieser Wert wird besonders bevorzugt anhand der detektierten optischen Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung, insbesondere deren Intensität in einem vorbestimmten Spektralbereich ermittelt. Der effektive Wert ergibt sich beispielsweise durch Integration der Intensität in dem relevanten vorbestimmten Spektralbereich. Gemäß dieser bevorzugten Durchführungsform erfolgt ferner ein Vergleich des bestimmten Werts mit einem Referenzwert, beispielsweise durch Bilden eines Verhältnisses der beiden Werte. Schließlich erfolgt ein Erzeugen eines Bildes unter Verwendung der detektierten, abgebildeten Strahlung und unter Verwendung des Vergleichs zwischen dem Referenzwert und dem effektiven Wert. Ebenfalls bevorzugt wird eine Abweichung eines aktuell ermittelten effektiven Werts von einem zuvor ermitteltem effektiven Wert bestimmt und wird der aktuell ermittelte effektive Wert nur zur Bilderzeugung verwendet, wenn diese Abweichung einen vorbestimmten Grenzwert übersteigt. Somit wird vorteilhaft ein zu häufiges Anpassen einer Bilderzeugung vermieden.
Auch in einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der die detektierten optischen Eigenschaft der gefilterten Anregungsstrahlung zum Steuern oder Regeln einer Lichtquelle der Anregungsstrahlung und/oder weiterer Komponenten in einem zur Bilderzeugung verwendeten Mikroskops verwendet werden, wird bevorzugt eine Abweichung einer aktuell detektierten optischen Eigenschaft von einer zuvor detektierten optischen Eigenschaft bestimmt und erfolgt ein Nachsteuern (Nachregeln) der Lichtquelle und/oder weiterer Komponenten nur, wenn diese Abweichung einen vorbestimmten Grenzwert überschreitet. Somit wird vorteilhaft ein zu häufiges Nachsteuern (Nachregeln) vermieden.
In einer ebenfalls bevorzugten Durchführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner die Verwendung eines optischen Filters, dessen spektrale Filterkennlinie zu dem (effektiven) Absorptionsspektrum eines im Objekt enthaltenen Fluorophors korrespondiert oder diesem entspricht. In einer ferner bevorzugten Durchführungsform umfasst das Verfahren ferner die Verwendung eines optischen Filters, dessen spektrale Filterkennlinie zu einem Produkt (einer Faltung) des Absorptionsspektrums des im Objekt enthaltenen Fluorophors und einer inversen Sensorkennlinie korrespondiert. In einer ebenfalls bevorzugten Durchführungsform umfasst das Verfahren ferner die Verwendung eines optischen Filters, dessen spektrale Filterkennlinie zu einem Produkt (einer Faltung) des Absorptionsspektrums des im Objekt enthaltenen Fluorophors, einer inversen Kennlinie des zur Detektion der gefilterten Anregungsstrahlung verwendeten Sensors und spektralen Kennlinien optischer Elemente im Anregungsstrahlengang korrespondiert. Bei der Filterkennlinie handelt es sich bevorzugt um eine Transmissionskennlinie oder eine Reflektionskennlinie.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen, in den Unteransprüchen genannten Merkmalen. Die verschiedenen in dieser Anmeldung genannten Ausführungsformen der Erfindung sind, sofern im Einzelfall nicht anders ausgeführt, mit Vorteil miteinander kombinierbar.
Figurenliste
Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der zugehörigen Zeichnungen erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops gemäß einer Ausführungsform;
2 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform;
3 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform;
4 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform;
5 schematische Darstellungen von Kennlinien des im erfindungsgemäßen Mikroskop verwendeten optischen Filters gemäß Ausführungsformen;
6 ein schematisches Ablaufdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer Durchführungsform;
7 ein schematisches Ablaufdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer weiteren Durchführungsform; und
8 ein schematisches Ablaufdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer weiteren Durchführungsform.

1 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 10 gemäß einer ersten Ausführungsform.
Das Operationsmikroskop 10 weist eine Lichtquelle 30 auf, die hier durch eine breitbandige, nicht-monochromatische LED ausgebildet ist. Das Licht der Lichtquelle 30 wird über einen Beleuchtungsstrahlengang 20 auf das Objekt 40, beispielsweise eine zu untersuchende Gewebeprobe 40, eingestrahlt. Der Beleuchtungsstrahlengang 20 umfasst einen Lichtwellenleiter 220, in den die Anregungsstrahlung der Lichtquelle 30 eingekoppelt wird. Dabei wird das Licht der Lichtquelle 30 mittels einer Optik effizient in den Lichtwellenleiter 220 eingekoppelt. Der Beleuchtungsstrahlengang 20 kann weiterhin eine Vielzahl grundsätzlich bekannter optischer und mechanischer Komponenten ausweisen. So weist der Beleuchtungsstrahlengang 20 einen als Linse 160 ausgebildeten optischen Kollektor auf, der die aus dem Lichtwellenleiter 220 austretende Strahlung der Lichtquelle 30 kollimiert. Diese Strahlung wird dann, gegebenenfalls unter Zuhilfenahme weiterer optischer Komponenten wie dem Umlenkspiegel 110, auf das Objekt 40 eingestrahlt.
Das Operationsmikroskop 10 ist für eine Fluoreszenzbildgebung ausgelegt. Dazu umfasst das Operationsmikroskop 10 neben dem Beleuchtungsstrahlengang 20 einen Beobachtungstrahlengang 70 über den vom Objekt 40 abgestrahlte Strahlung auf ein Bilderzeugungsmittel 80 abgebildet und dort detektiert wird. Der Beobachtungstrahlengang 70 kann ebenfalls eine Vielzahl grundsätzlich bekannter optischer und mechanischer Komponenten ausweisen, beispielsweise ein als Linse ausgebildetes Objektiv 150, das die abgestrahlte Strahlung des Objekts 40 auf einen im Bilderzeugungsmittel 80 enthaltenen Detektor führt. Das Bilderzeugungsmittel 80 ist ausgebildet, aus der vom Objekt 40 abgestrahlten und im Beobachtungstrahlengang 70 geführten Strahlung ein Bild zu erzeugen.
Das Mikroskop 10 wird vor seinem Einsatz vorzugsweise mit vorbekannten Beleuchtungseinstellungen kalibriert. Vorzugsweise wird in der Kalibration eine vordefiniert emittierende Referenzprobe verwendet. Anhand der Kalibration können Einflüsse des bildgebenden optischen Systems kompensiert werden. Während des Betriebs des Mikroskops 10 können Veränderungen der Lichtquelle 30 jedoch trotz der vorherigen Kalibration zu einer fehlerhaften Fluoreszenzbildgebung, beispielsweise einer fehlerhaften Intensität von detektierten Bereichen, und damit beispielsweise zu einer fehlerhaften Tumordetektion oder Tumordarstellung führen.
Seitens der Erfinder wurde gefunden, dass eine zeitliche Variation der Anregungsstrahlung einen signifikanten Einfluss auf die Generierung der Fluoreszenzbilder hat. Dies gilt insbesondere für Fluoreszenzbilder bei denen die Grauwerte (Helligkeitswerte) vom durch die Anregung des im Gewebe enthaltenen Fluorophors bestimmt werden. Hier kann schon eine geringe Variation der Anregungsstrahlung im relevanten Wellenlängenbereich zu einer signifikanten Abweichung der Fluoreszenzintensität führen. Dies ist insbesondere für die bei der Fluoreszenzbildgebung häufig verwendeten, medizinisch zugelassenen Fluorophore wie beispielsweise Protoporphyrin IX (PpIX), Fluorescein und Indocyaningrün (ICG) der Fall.
Die Idee der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine zeitliche Variation der Anregungsstrahlung mit einfachen und kostengünstigen Mitteln zu bewerkstelligen.
Dazu ist es vorgesehen, neben dem Beleuchtungsstrahlengang 20 und dem Beobachtungstrahlengang 70 einen Messstrahlengang 90 vorzusehen, der ausgebildet ist, einen Teil der Anregungsstrahlung aus dem Beobachtungstrahlengang 70 heraus auf einen Sensor 60 zu führen. Im ersten Ausführungsbeispiel wird dazu ein Teil der Anregungsstrahlung mittels des teildurchlässigen Spiegels 100 in den Messstrahlengang 90 geführt. Dabei ist es bevorzugt, dass der Strahlteiler 100 (teildurchlässiger Spiegel) mehr als 90 % (besonders bevorzugt mehr als 98 % und ferner bevorzugt mehr als 99 %) der (Leistung der) Anregungsstrahlung weiter im Beleuchtungsstrahlengang 20 führt, während höchstens 10 % (besonders bevorzugt höchstens 2 % und ferner bevorzugt höchstens 1 %) (der Leistung) der Anregungsstrahlung in den Messstrahlengang 90 umgelenkt werden.
Der Sensor 60 ist zur Detektion mindestens einer optischen Eigenschaft der Anregungsstrahlung ausgelegt. Besonders bevorzugt handelt es sich um ein Mittel zur Detektion der Intensität (Lichtstärke oder Beleuchtungsstärke) der im Messstrahlengang 90 geführten Anregungsstrahlung. Beispielsweise kann der Sensor 60 als Photodiode ausgebildet sein. Das Signal des Sensors 60, das beispielsweise der Intensität der im Messstrahlengang 90 geführten Anregungsstrahlung entspricht, wird dann in das Bilderzeugungsmittel 80 eingespeist und bei der Bilderzeugung berücksichtigt. Dadurch wird eine zeitliche Variation der Anregungsstrahlung kompensiert und eine Variation der Intensität der Anregungsstrahlung bei der Fluoreszenzbildgebung rechnerisch eliminiert.
Der über einen bestimmtem Wellenlängenbereich empfindliche Sensor 60 integriert bei der Detektion der Intensität (Lichtstärke) der im Messstrahlengang 90 geführten Anregungsstrahlung die Intensität über den bestimmten Wellenlängenbereich. Somit haben verschiedenste Wellenlängenanteile der breitbandigen Lichtquelle 30 (entsprechend einer Kennlinie des Sensors 60) Einfluss auf das vom Sensor 60 erzeugte Signal. Daher ist es erfindungsgemäß vorgesehen, zur Erhöhung der Genauigkeit der Bilderzeugung einen optischen Filter 50 vor dem Sensor 60 anzuordnen. Dabei ist der optische Filter 50 ausgebildet, vordefinierte Teile der Anregungsstrahlung zu selektieren.
Somit wird mittels der Kombination eines Lichtsensors 60 mit einem auf die Applikation abgestimmten Filter 50 die wirksame Anregungsenergie für das im Objekt 40 enthaltene Fluorophor bestimmt. Die Kennlinie 210 (hier: spektrale Transmission) des Filters 50 entspricht dabei vorzugsweise den Absorptionseigenschaften 190 eines im Gewebe enthaltenen Fluorophors (vgl. 5) beziehungsweise den zur Fluoreszenz beitragenden Anteilen des absorbierten Lichts (effektive Absorption). Vorzugsweise werden medizinisch zugelassene Fluorophore wie beispielsweise Protoporphyrin IX (PpIX), Fluorescein und Indocyaningrün (ICG) verwendet. Der optische Filter 50 ist im Ausführungsbeispiel als Transmissionsfilter ausgebildet, jedoch ist die vorliegende Erfindung darauf nicht beschränkt und der optische Filter 50 kann beispielsweise alternativ als Reflektionsfilter ausgelegt sein.
Mittels einem solchen durch die Kombination von Filter 50 und Sensor 60 erzeugten Signal (des Sensors 60), welches der Anregung des verwendeten Fluorophors entspricht, können die variierenden Einflüsse der Beleuchtung auf die Fluoreszenzdarstellung mathematisch mit hoher Genauigkeit kompensiert werden. Dabei ist es bevorzugt, in der Filterkennlinie 210 weitere Einflussfaktoren zu berücksichtigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsvariante entspricht die Filterkennlinie 210, also das (Transmissions-)Spektrum des Filters 50, einer Einhüllenden des Absorptionsspektrums 190 eines in der Probe 40 enthaltenen Fluorophors. Dies ist beispielsweise in 5(A) dargestellt. Als Einhüllende wird dabei jede Kennlinie des Filters 50 verstanden, deren Abweichung pro (jeder) Wellenlänge kleiner als 15 %, bevorzugt kleiner als 10 % und ferner bevorzugt kleiner als 5 % ist. Dabei sind sowohl das Spektrum des Filters 50 als auch das Absorptionsspektrums des Fluorophors bei seinem Maximum jeweils auf 100 % zu normieren. Weiterhin bevorzugt sind sämtliche normierte Werte der Einhüllenden größer oder gleich der korrespondierenden Werte des Absorptionsspektrums des Fluorophors. Weiterhin bevorzugt, ist die Fläche unter dem (normierten) Absorptionsspektrums des Fluorophors höchstens 15 % kleiner, bevorzugt höchstens 10 % kleiner und ferner bevorzugt höchstens 5 % kleiner als die Fläche unter der (normierten) Einhüllenden.
Ein weiterer wesentlicher Faktor ist die wellenlängenabhängige Detektionskennlinie des verwendeten Sensors 60 (vgl. 5(B)). Es ist daher vorzugsweise vorgesehen, in der Filterkennlinie 210 neben den Absorptionseigenschaften 190 eines im Gewebe enthaltenen Fluorophors weiterhin eine Detektionskennlinie 191 des Sensors 60 (invers) zu berücksichtigen. Dadurch kann die Genauigkeit der Bilderzeugung trotz variierender Lichtquelle 30 weiter erhöht werden. Dies ist in der 5(B) dargestellt, gemäß der die Filterkennlinie 210 auf der mathematischen Faltung des Absorptionsspektrums 190 mit der inversen Detektionskennlinie 191 basiert.
Weiterhin bevorzugt, werden für die Filterkennlinie 210 zusätzlich (oder alternativ) die Anregungseffizienz des verwendeten Fluorophors pro Wellenlänge, Gewebeeigenschaften des Objekts 40 und/oder die optischen Eigenschaften der optischen Elemente im Anregungsstrahlengang berücksichtigt, wie beispielsweise die Transmissionseigenschaften der im Mikroskop 10 verwendeten optischen Oberflächen oder eines Lichtleiters. Dadurch wird gewährleistet, dass der Sensor 60 ein Signal erzeugt, das mit hoher Genauigkeit äquivalent zur zu erwartenden absorbierten und zur Fluoreszenz anregenden Leistung sowie unabhängig vom eingestrahlten Spektrum ist. Ein solcher Filterkennlinie 210 ist in 5(C) gezeigt, gemäß der die Filterkennlinie 210 auf der mathematischen Faltung des Absorptionsspektrums 190 mit der inversen Detektionskennlinie 191, einer Transmissionskennlinie 192 eines Lichtleiters (beispielsweise Lichtleiter 220) und einer Transmissionskennlinie 193 eines Strahlteilers (beispielsweise Strahlteiler 100) basiert. Abweichend von den Darstellungen in den 5(B) und 5(C) könnten die Filterkennlinien auch den Einhüllenden der mathematischen Faltungen der Komponenten entsprechen.
Um eine kostengünstige Kompensation zu erreichen, ist der Sensor 60 vorzugsweise als Einkanaldetektor oder als Detektor mit (bis auf eins) reduzierbarer Kanalzahl ausgebildet. Hierdurch kann vorteilhafterweise der Einsatz kostenintensiver Komponenten wie Spektrometer und ähnliches vermieden werden. Als Detektor (Sensor 60) kommen vorzugweise Photozellen, Photodioden, pin-Photodioden, Avalanche-Photodioden, MSM-Photodioden, Phototransistoren und Photowiderstände in Betracht.
Um unterschiedliche Fluorophore effizient verwenden zu können, ist es gemäß einer bevorzugten Ausführungsvariante vorgesehen, einen Filterrevolver mit mehreren Filtern sowie einen breitbandigen Einkanalsensor zu verwenden. Breitbandig bedeutet, dass der Sensor in einem Wellenlängenbereich größer als 100 nm, bevorzugt größer als 200 nm und ferner bevorzugt größer als 400 nm eine Sensitivität größer als 10 % (seiner maximalen Sensitivität) besitzt. Alternativ ist es bevorzugt, mehrere Sets (Kombinationen) aus unterschiedlichen Sensoren 60 und unterschiedlichen Filtern 50 vorzusehen, die im Mikroskop 10 eingesetzt werden können. Diese Sets sind Teil des Mikroskops 10 und können durch einen Benutzer durch Umschalten ausgewählt werden. Dabei können mit unterschiedlichen Sets sowohl Objekte mit unterschiedlichen Fluorophoren als auch Objekte mit nur einem Fluorophor (beispielsweise mittels verschiedenen Sensoren-Filter-Kombinationen für die linke Flanke und die rechte Flanke des (effektiven) Absorptionsspektrums des Fluorophors) untersucht werden.
Zur Kompensation der genannten Einflüsse, insbesondere der zeitlichen Variation der Intensität der Lichtquelle 30 wird der erzeugte Signalwert des Sensors 60 (beispielsweise der Strom einer Photodiode) vorzugsweise für eine Anregungsleistungskalibrierung der Lichtquelle (Stromanpassung) beziehungsweise eine Darstellungsanpassung bei der Fluorophordetektion, sprich der Bilderzeugung, verwendet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsvariante wird ein Strahl-Homogenisierer vorgesehen, beispielsweise eine Ulbricht-Kugel, der bevorzugt vor dem Sensor 60 und nach dem Strahlteiler 100 angeordnet ist.
2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 10 gemäß einer weiteren Ausführungsform.
Das Licht der Lichtquelle 30 wird zunächst über einen Lichtwellenleiter 200 geführt, mittels einer Linse 160 kollimiert und zu einem Strahlteiler 100 geführt. Ein geringer Teil (zirka 1 %) der Anregungsstrahlung passiert den Strahlteiler 100 und gelangt durch den Filter 50 zum Sensor 60. Vom Filter 50 wird, wie bereits erläutert, nur derjenige Teil der Anregungsstrahlung durchgelassen, der zur Anregung des verwendeten Fluorophors relevant ist. Weiterhin wird durch den Filter 50 die wellenlängenabhängige Detektionskennlinie des Sensors 60 berücksichtigt, wobei die vorliegende Erfindung darauf nicht beschränkt ist. Vielmehr wäre es alternativ möglich, im Filter lediglich die zur Anregung des verwendeten Fluorophors relevante Anregungsstrahlung passieren zu lassen.
Ein großer Teil (zirka 99 %) der Anregungsstrahlung wird durch den Strahlteiler 100 auf das Objektiv 150 umgelenkt, das im vorliegenden Ausführungsbeispiel sowohl Teil des Beleuchtungsstrahlengangs 20 als auch Teil des Beobachtungstrahlengang 70 ist. Die Anregungsstrahlung wird nun auf das zu untersuchende Objekt 40 abgebildet, wodurch das (oder die) im Objekt 40 (zu untersuchendes Gewebe) enthaltene Fluorophor (Fluorophore) zu einer Fluoreszenzemission angeregt wird (werden). Die derart vom Objekt absorbierte und (re-)emittierte Strahlung (nebst gestreuten und/oder reflektierten Anteilen) wird mittels des Objektivs 150 (und gegebenenfalls weiterer optischer Komponenten) auf eine Kamera 120 abgebildet, die ein Bild der vom Objekt abgestrahlten Strahlung erfasst. Das von der Kamera 120 erfasste Bild und der vom Sensor 60 bestimmte Signalwert werden zu einer Auswerteeinheit 130 geleitet und verarbeitet. Wie bereits erläutert, wird der erzeugte Signalwert des Sensors 60 für eine Anpassung des von der Kamera 120 erzeugten Bildes verwendet. Alternativ oder zusätzlich wird der Signalwert für eine Leistungsanpassung der Lichtquelle genutzt. Das angepasste Bild, in dem Variationen der Anregungsstrahlung kompensiert sind, wird auf einem Display 140 angezeigt und kann so von einem Operateur verwendet werden.
3 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 10 gemäß einer weiteren Ausführungsform.
In dieser Ausführungsform ist zusätzlich zur Ausführungsform der 2 im Beobachtungstrahlengang 70 ein weiterer Strahlteiler 100 vorgesehen, der es ermöglicht, neben dem Bild, das durch die Kamera 120 erfasst, durch die Auswerteeinheit 130 erzeugt und durch das Display 140 angezeigt wird, ein weiteres Bild des Objekts - ohne rechnerische Kompensation - anzuzeigen. Dazu wird ein Teil der vom Objekt abgestrahlten Strahlung ausgekoppelt und über ein Okular abgebildet. Dieses Bild kann dann ebenfalls von einem Operateur verwendet werden. Die Möglichkeit der gleichzeitigen Erzeugung zweier Bilder kann dem Operateur eine zusätzliche Entscheidungshilfe sein.
4 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 10 gemäß einer weiteren Ausführungsform.
In dieser Ausführungsform wird der Messstrahlengang 90 nicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang 20 ausgekoppelt, sondern ist dem Beleuchtungsstrahlengang 20 vorgelagert. Nach der Auskopplung eines Teils der Anregungsstrahlung in den Messstrahlengang (in Richtung Filter 50 und Sensor 60) mittels des Strahlteilers 100 wird das Anregungslicht im Beleuchtungsstrahlengang mit Hilfe eines Umlenkspiegels 110 und einer Linse 160 auf das Objekt 40 fokussiert. Im Übrigen entspricht die Ausführungsform der 4 der Ausführungsform der 3. Die Position des Filters 50 und des Sensors 60 ist grundsätzlich variabel (innerhalb des Mikroskops 10), solange sichergestellt ist, dass zumindest ein Teil der Anregungsstrahlung zunächst den Filter 50 passiert und dann auf den Sensor 60 gelangt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsvariante sind Filter 50 / Sensor 60 nah (vom Strahlteiler sind es weniger als drei, bevorzugter weniger als zwei strahlformende Flächen zum Objekt), am zu untersuchenden Gewebe (Objekt 40) angeordnet, da in diesem Fall bereits mehr Einflüsse des Mikroskops 10 im Lichtsignal der Lichtquelle 30 abgebildet sind. Sofern Filter 50 / Sensor 60 direkt oder nah der Lichtquelle 30 angeordnet sind, kann zusätzlich eine Hilfslichtquelle (mit wenig Leistung) vorgesehen werden, um dennoch den Temperatur-Einfluss und Lichtleiter-Einfluss erfassen zu können.
5 zeigt schematische Darstellungen von Kennlinien des im erfindungsgemäßen Mikroskop 10 verwendeten optischen Filters 50 gemäß mehrerer Ausführungsformen. Wie bereits obenstehend erläutert, wird die von der breitbandigen Lichtquelle 30 erzeugte Strahlung 200 mittels der Filterkennlinie 210 gefiltert, bevor diese gefilterte Anregungsstrahlung dann auf den Sensor 60 trifft. In den 5(A) bis 5(C) ist das Spektrum der Lichtquelle, beispielsweise der Lichtquelle 30, zu Veranschaulichungszwecken derart dargestellt, dass die Lichtquelle in vier verschiedenen Spektralbereichen mit gleicher Beleuchtungsstärke emittiert und ansonsten kein oder nur sehr wenig Licht emittiert.
In dem in 5(A) dargestellten Ausführungsbeispiel entspricht die Filterkennlinie 210 einer Einhüllenden des Absorptionsspektrums 190 von Protoporphyrin IX (PpIX), wodurch die Anregungsstrahlung im Bereich etwa zwischen 360 nm und 440 nm (die zwei von der Lichtquelle mit geringeren Wellenlängen emittierten Spektralbereiche) vollständig passieren kann, während die Anregungsstrahlung im Bereich größerer Wellenlängen (die zwei von der Lichtquelle mit größeren Wellenlängen emittierten Spektralbereiche) nahezu vollständig eliminiert wird und daher nicht auf den Sensor 60 trifft.
In dem in 5(B) dargestellten Ausführungsbeispiel basiert die Filterkennlinie 210 auf dem Absorptionsspektrums 190 von Protoporphyrin IX (PpIX) sowie der Kennlinie 191 (der spektralen Sensitivität) des Sensors 60. Bevorzugt basiert die Filterkennlinie 210 auf einer Faltung des Absorptionsspektrums 190 von Protoporphyrin IX (PpIX) mit der inversen Kennlinie des Sensors 60. Die Berücksichtigung der Detektionskennlinie 191 des Sensors 60 zeigt, dass noch weniger spektrale Anteile des Anregungslichts effektiv zur Fluoreszenzanregung beitragen. Insbesondere trägt nur noch der von der Lichtquelle mit den geringsten Wellenlängen emittierte Spektralbereich vollständig zur Fluoreszenz von PpIX bei.
In dem in 5(C) dargestellten Ausführungsbeispiel basiert die Filterkennlinie 210 auf dem Absorptionsspektrums 190 von Protoporphyrin IX (PpIX), der Kennlinie 191 (der spektralen Sensitivität) des Sensors 60, der Transmissionskennlinie 192 eines Lichtleiters (beispielsweise Lichtleiters 220) und den Reflektions- und Transmissionseigenschaften 193 eines Strahlteilers (beispielsweise Strahlteiler 100). Die optischen Eigenschaften des Strahlteilers 100 sind sowohl hinsichtlich des auf den Sensor 60 abgelenkten Lichts als auch hinsichtlich des auf das Objekt 40 transmittierten Lichts zu berücksichtigen. Bevorzugt basiert die Filterkennlinie 210 auf einer Faltung des Absorptionsspektrums 190 von Protoporphyrin IX (PpIX) mit der inversen Kennlinie des Sensors 60, der Transmissionskennlinie eines Lichtleiters 192 und den Reflektions- und Transmissionseigenschaften 193 eines Strahlteilers. Die Berücksichtigung der optischen Eigenschaften des Strahlteilers führt dazu, dass tatsächlich noch weniger spektrale Anteile des Anregungslichts effektiv zur Fluoreszenzanregung beitragen. Insbesondere trägt auch der von der Lichtquelle mit den geringsten Wellenlängen emittierte Spektralbereich nur noch unwesentlich zur Fluoreszenz von PpIX bei. Abweichend von den Darstellungen in den 5(B) und 5(C) könnten die Filterkennlinien alternativ auch den Einhüllenden der mathematischen Faltungen der besagten Komponenten entsprechen.
Zur übersichtlicheren Veranschaulichung, welchen Einfluss die Berücksichtigung weiterer optischer Komponenten im Beleuchtungsstrahlengang 20 auf die Filterkennlinie 210 hat, zeigt die 5(D) die resultierende Filterkennlinie 210 aus der 5(C) im Vergleich mit der Absorptionskennlinie 190 des Fluorophors PpIX. Die Berücksichtigung weiterer optischer Komponenten im Beleuchtungsstrahlengang 20 ermöglicht somit vorteilhaft das Selektieren der effektiv zur Fluoreszenz beitragenden Anregungsstrahlung mit erhöhter Präzision.
6 zeigt ein schematisches Ablaufdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer ersten Durchführungsform.
Im Schritt S100 wird breitbandige Anregungsstrahlung durch die Lichtquelle 30 erzeugt. Diese breitbandige Anregungsstrahlung wird nunmehr im Schritt S200 auf ein zu untersuchendes Objekt 40 eingekoppelt, wobei das Objekt 40 vorzugsweise mindestens eine Substanz enthält, die für eine Fluoreszenzanregung ausgelegt ist. Die Erfindung ist aber nicht auf Operationsmikroskope 10 zur Fluoreszenzbildgebung beschränkt, vielmehr wäre es möglich, das erfindungsgemäße Mikroskop auch zur Bilderzeugung ohne Fluoreszenzbildgebung zu verwenden. Im Schritt S300 wird ein Teil der Anregungsstrahlung in einen Messstrahlengang 90 ausgekoppelt. In diesem Messstrahlengang werden im Schritt S400 mittels Filter 50 bestimmte Wellenlängen der ausgekoppelten Anregungsstrahlung selektiert (gefiltert). Im Schritt S410 wird nachfolgend die Intensität der gefilterten Anregungsstrahlung mittels des Sensors 60 detektiert und ein Signalwert dafür erzeugt. Mit dem durch die Kombination von Filter 50 und Sensor 60 erzeugten Signal (des Sensors 60), welches der Anregung des verwendeten Fluorophors entspricht, können variierende Einflüsse der Beleuchtung auf die Fluoreszenzdarstellung mit hoher Genauigkeit kompensiert werden. Dabei ist es bevorzugt, in der Filterkennlinie 210 weitere Einflussfaktoren zu berücksichtigen.
Im Schritt S500 wird die von dem Objekt 40 abgestrahlte Strahlung beispielsweise auf die Kamera 120 abgebildet und dort im Schritt S510 detektiert, beispielsweise durch einen in der Kamera 120 eingebauten CMOS-Sensor oder einen CCD-Sensor. Nachfolgend wird, beispielsweise mittels der Auswerteeinheit 130, ein Bild des Objekts 40 erzeugt. Dabei wird das Bild unter Verwendung der detektierten, abgebildeten Strahlung und unter Verwendung der detektierten optischen Eigenschaft der gefilterten Anregungsstrahlung erzeugt.
7 zeigt ein schematisches Ablaufdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer zweiten Durchführungsform. Im Gegensatz zur Durchführungsform der 6 wird der Schritt S300 des Auskoppelns eines Teils der Anregungsstrahlung zeitlich vor dem Schritt S200 des Einkoppelns der Anregungsstrahlung auf das zu untersuchende Objekt 40 durchgeführt, wie es beispielsweise in der Ausführungsform der 4 vorgesehen ist.
8 zeigt ein schematisches Ablaufdiagram eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer weiteren Durchführungsform.
Diese Durchführungsform umfasst weiterhin den Schritt S420, bei dem ein effektiver Signalwert für die Anregung des zu untersuchenden Objekts 40 bestimmt und an die Auswerteeinheit 130 geleitet wird. Nachfolgend wird im Schritt S430 ein Vergleich des bestimmten Signalwerts mit einem zuvor (vor der eigentlichen Verwendung des Mikroskops) in einem Kalibrierungsschritt (mit einer Referenzprobe) ermittelten Referenzwerts verglichen. Zum Schluss wird dann das Bild (im Schritt S600) unter Verwendung der detektierten, abgebildeten Strahlung und unter Verwendung des Vergleichs zwischen dem Referenzwert und der detektierten optischen Eigenschaft (Signalwert des Sensors 60) der gefilterten Anregungsstrahlung erzeugt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante wird eine lineare Anpassung der Bildhelligkeit vorgenommen, d.h. die detektierte Helligkeit im Verhältnis von Signalwert des Sensors 60 zum Referenzwert angepasst.
Bezugszeichenliste

10: Mikroskop
20: Beleuchtungsstrahlengang
30: Lichtquelle
40: Objekt
50: optischer Filter
60: optischer Sensor
70: Beobachtungstrahlengang
80: Bilderzeugungsmittel
90: Messstrahlengang
100: Strahlteiler
110: Umlenkspiegel
120: Kamera
130: Auswerteeinheit
140: Display
150: Objektiv
160: Linse
170: Okular
180: Auge eines Betrachters
190: Absorptionsspektrum des Objekts
191: (inverse) Sensorkennlinie
192: Transmissionskennlinie eines Lichtwellenleiters
193: Reflektions- und Transmissionskennlinie eines Strahlteilers
200: Spektrum der Anregungsstrahlung
210: Kennlinie des optischen Filters
220: Lichtwellenleiter
S100: Erzeugung von Anregungsstrahlung
S200: Einkoppeln der Anregungsstrahlung auf ein zu untersuchendes Objekt
S300: Auskoppeln Teils der Anregungsstrahlung
S400: Selektieren bestimmter Wellenlängen der ausgekoppelten Anregungsstrahlung
S410: Detektion der Intensität der gefilterten Anregungsstrahlung
S420: Bestimmen effektiven Werts für die Anregung des zu untersuchenden Objekts
S430: Vergleich des bestimmten Werts mit einem Referenzwert
S500: Abbilden der von dem Objekt abgestrahlten Strahlung
S510: Detektion der abgebildeten Strahlung
S600: Erzeugen eines Bildes

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102020102476 A1 [0007]

Claims

Mikroskop (10), umfassend: einen Beleuchtungsstrahlengang (20), der ausgebildet ist, Anregungsstrahlung einer Lichtquelle (30) auf ein zu untersuchendes Objekt (40) einzukoppeln; einen optischen Filter (50), der ausgebildet ist, Teile der Anregungsstrahlung zu selektieren; einen Sensor (60) zur Detektion einer optischen Eigenschaft der Anregungsstrahlung; einen Messstrahlengang (90), der ausgebildet ist, einen Teil der Anregungsstrahlung auf den Sensor (60) zu führen; einen Beobachtungstrahlengang (70), der ausgebildet ist, von dem Objekt (40) abgestrahlte Strahlung abzubilden; wobei der optische Filter (50) im Strahlengang zwischen der Lichtquelle (30) und dem Sensor (60) angeordnet ist, und ein Bilderzeugungsmittel (80), das ausgebildet ist, aus der vom Objekt (40) abgestrahlten und im Beobachtungstrahlengang (70) geführten Strahlung ein Bild zu erzeugen; wobei das Bilderzeugungsmittel (80) ausgebildet ist, die mittels des Sensors (60) detektierten Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung zur Bilderzeugung zu verwenden.
Mikroskop (10) nach Anspruch 1, wobei der Filter (50) ausgebildet ist, denjenigen spektralen Teil der Anregungsstrahlung zu selektieren, der zu einer Fluoreszenzanregung des Objekts (40) beiträgt.
Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei ein Strahlteiler (100) im Beleuchtungsstrahlengang (20) angeordnet ist, der ausgebildet ist, einen Teil der Anregungsstrahlung weiter im Beleuchtungsstrahlengang (20) und einen Teil der Anregungsstrahlung in den Messstrahlengang (90) zu führen.
Mikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Filter (50) als Bandpassfilter ausgebildet ist und/oder im Messstrahlengang (90) ein Mittel zur Lichthomogenisierung vorgesehen ist.
Mikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Sensor ausgebildet ist, die Intensität der Anregungsstrahlung im Messstrahlengang (90) zu bestimmen.
Mikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bilderzeugungsmittel (80) Teil einer Steuereinheit ist, die ferner dazu ausgebildet ist, anhand der mittels des Sensors (60) detektierten Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung die Lichtquelle (30) und/oder andere Komponenten des Mikroskops (10) zu regeln oder zu steuern.
Mikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bilderzeugungsmittel (80) eine Kamera (120) aufweist, und wobei der Beobachtungstrahlengang (70) ausgebildet ist, das Objekt (40) auf eine lichtempfindliche Detektorebene der Kamera (120) abzubilden.
Mikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bilderzeugungsmittel (80) eine Auswerteeinheit (130) umfasst, die ausgebildet ist, die mittels des Sensors (60) detektierte Eigenschaft der gefilterten Anregungsstrahlung zur Erzeugung des Bildes diskontinuierlich zu verwenden.
Mikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ausgebildet, die optische Eigenschaft der Anregungsstrahlung mittels des Sensors (60) zu detektieren und gleichzeitig sowohl unter Berücksichtigung der detektierten Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung als auch der vom Objekt (40) abgestrahlten und im Beobachtungstrahlengang (70) geführten Strahlung ein Bild zu erzeugen.
Mikroskop (10) nach Anspruch 8, wobei die Auswerteeinheit (130) ausgebildet ist, die detektierte optische Eigenschaft der Anregungsstrahlung mit einem Referenzwert zu vergleichen.
Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 8 und 10, wobei die Auswerteeinheit (130) ausgebildet ist, zur Erzeugung des Bildes ein Verhältnis zwischen der detektierten optischen Eigenschaft der Anregungsstrahlung und dem Referenzwert zu verwenden.
Verfahren zur Erzeugung eines Bildes von einem Objekt (40), umfassend: Erzeugung (S100) von Anregungsstrahlung; Einkoppeln (S200) mindestens eines Teils der Anregungsstrahlung auf ein zu untersuchendes Objekt (40); Auskoppeln (S300) eines Teils der Anregungsstrahlung, wobei der ausgekoppelte Teil der Anregungsstrahlung auf einen optischen Filter (50) geführt wird; Selektieren (S400) eines Teils der ausgekoppelten Anregungsstrahlung mittels des optischen Filters (50); Detektion (S410) optischer Eigenschaften der gefilterten Anregungsstrahlung mittels eines optischen Sensors (60); Abbilden (S500) mindestens eines Teils der von dem Objekt (40) abgestrahlten Strahlung; Detektion (S510) der abgebildeten Strahlung; und Erzeugen (S600) eines Bildes unter Verwendung der detektierten, abgebildeten Strahlung und unter Verwendung der detektierten optischen Eigenschaft der gefilterten Anregungsstrahlung.
Verfahren nach Anspruch 12, ferner umfassend: Bestimmen (S420) eines effektiven Werts für die Anregung des zu untersuchenden Objekts (40); Vergleich (S430) des bestimmten Werts mit einem Referenzwert; und Erzeugen (S600) eines Bildes unter Verwendung der detektierten, abgebildeten Strahlung und unter Verwendung des Vergleichs zwischen dem Referenzwert und dem bestimmten effektiven Wert.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, ferner umfassend: Verwenden der detektierten optischen Eigenschaft der gefilterten Anregungsstrahlung zum Steuern oder Regeln einer Lichtquelle der Anregungsstrahlung und/oder anderer Komponenten in einem zur Bilderzeugung verwendeten Mikroskops.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 und 13, wobei eine Filterkennlinie des optischen Filters (50) zu einem Absorptionsspektrum eines im Objekt (40) enthaltenen Fluorophors und/oder zu einer Detektionskennlinie des Sensors (60) korrespondiert.