DE10033180A1 - Verfahren und Anordnung zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe - Google Patents
Verfahren und Anordnung zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten ProbeInfo
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Abstract
Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe, insbesondere des Emissions- und/oder Absorptionsverhaltens, vorzugsweise der Fluoreszenz und/oder Lumineszenz und/oder Phosphoreszenz und/oder enzymaktivierten Lichtemission und/oder enzymaktivierten Fluoreszenz, DOLLAR A wobei mindestens ein spektraler Schwerpunkt und/oder ein Maximum der Emissionsstrahlung und/oder der absorbierten Strahlung bestimmt wird sowie DOLLAR A die Bestimmung des Schwerpunkts und/oder des Maximums der Emissionsstrahlung von Fluorochromen zur DOLLAR A Unterscheidung von verschiedenen Farbstoffen und/oder DOLLAR A zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder DOLLAR A zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Emissionsspektrums in Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder zur Vermessung von Emissionsratiofarbstoffen zur Bestimmung von Ionenkonzentrationen erfolgt.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Anordnung in der
Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere der Laser Scanning Mikroskopie, der
Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie und der Scanning Nahfeld
mikroskopie, zur Untersuchung von vorwiegend biologischen Proben,
Präparaten und zugehörigen Komponenten. Mit eingeschlossen sind auf
Fluoreszenzdetektion basierenden Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen
(High Throughput Sceening) Durch den Übergang von der Detektion von
wenigen breiten spektralen Farbstoffbändern zur simultanen Aufnahme
kompletter Spektren eröffnen sich neue Möglichkeiten bei der Identifikation,
Separation und Zuordnung der meist analytischen oder funktionalen
Probeneigenschaften zu räumlichen Teilstrukturen oder dynamischen
Prozessen. Simultan-Untersuchungen von Proben mit Mehrfachfluorophoren
werden damit bei überlappenden Fluoreszenzspektren auch in räumlichen
Strukturen von dicken Proben möglich. Zusätzlich ist es möglich, lokale
spektrale Verschiebungen von Emissionsbändern der Farbstoffe zu
detektieren und den räumlichen Strukturen zu zuordnen. Die
Datenaufnahmerate wird durch die Anordnung nicht verringert.
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung
von biologischen Präparaten ist die Fluoreszenzmikroskopie (Lit.: Pawley,
"Handbook of biological confocal Microscopy"; Plenum Press 1995). Hierbei
werden bestimmte Farbstoffe zur spezifischen Markierung von Zellteilen
verwendet.
Die eingestrahlten Photonen einer bestimmten Energie regen die
Farbstoffmoleküle durch die Absoption eines Photons aus dem Grundzustand
in einen angeregten Zustand an. Diese Anregung wird meist als Einphotonen-
Absorption bezeichnet (Abb. 1a). Die so angeregten Farbstoffmoleküle
können auf verschiedene Weise in den Grundzustand zurück gelangen. In der
Fluoreszenzmikroskopie ist der Übergang unter Aussendung eines
Fluoreszenzphotons am wichtigsten. Die Wellenlänge des emittierten Photons
ist aufgrund der Stokesverschiebung im Vergleich zur Anregungsstrahlung
generell rotverschoben, besitzt also eine größere Wellenlänge. Die
Stokesverschiebung ermöglicht die Trennung der Fluoreszenzstrahlung von
der Anregungsstrahlung.
Das Fluoreszenzlicht wird mit geeigneten dichroitischen Strahlteilern in
Kombination mit Blockfiltern von der Anregungsstrahlung abgespalten und
getrennt beobachtet. Dadurch ist die Darstellung einzelner, mit verschiedenen
Farbstoffen eingefärbten Zellteilen, möglich. Grundsätzlich können jedoch
auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen sich
spezifisch anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden (Mehrfachfluoreszenz).
Zur Unterscheidung, der von den einzelnen Farbstoffen ausgesendeten
Fluoreszenzsignale, werden wiederum spezielle dichroitischen Strahlteiler
verwendet.
Neben der Anregung der Farbstoffmoleküle mit einem hochenergetischen
Photon (Einphotonen-Absoption) ist auch eine Anregung mit mehreren
Photonen geringerer Energie möglich (Abb. 1b). Die Summe der Energien der
Einzelphotonen entspricht hierbei ungefähr einem Vielfachen des
hochenergetischen Photons. Diese Art der Anregung der Farbstoffe wird als
Mehrphotonen-Absorption bezeichnet (Lit.: Corle, Kino; "Confocal Scanning
Optical Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996).
Die Farbstoffemission wird durch diese Art der Anregung jedoch nicht
beeinflußt, d. h. das Emissionsspektrum erfährt bei der Mehrphotonen-
Absoption einen negativen Stokesshift, besitzt also eine geringere
Wellenlänge im Vergleich zur Anregungsstrahlung. Die Trennung der
Anregungs- von der Emissionsstrahlung erfolgt in der gleichen Art und Weise
wie bei der Einphotonen-Absorption.
Der Stand der Technik soll im folgenden beispielhaft anhand eines konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskopes (LSM) erläutert werden (Abb. 2 [L 1]).
Ein LSM gliedert sich im wesentlichen in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul,
Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher
beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE 197 02 753 A1 verwiesen.
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat
werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die
Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptions
eigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Die Anregungsstrahlung
wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei
verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im
Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der
Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z. B. durch den Einsatz eines
akusto optischen Kristalls Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine
Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs (2)
beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das
Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung
ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im
Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen Sekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes,
gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber-
und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen
dichroitischen Strahlteiler (MDB). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom
Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende
(konfokale Blende/Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur
Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden
Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variiren der
Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt
werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer Blockfilter
(EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des
Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT)
gemessen.
Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der
Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die
Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich
größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen
Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die
Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonen
absorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte
Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die
Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide
Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen
bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt)
wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die
Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen
Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales
Bild der Probe generiert werden.
Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die
Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen
spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissions
eigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher,
daß nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom
Punktdetektor gemessen wird.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene
Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert
(Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der
Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder
Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu
erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren
Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilern (DBS) und eine getrennte Detektion
der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x).
Eine flexible Anpassung der Detektion und der Anregung an entsprechende
neue Farbstoffeigenschaften durch den Anwender ist mit der oben
beschriebenen Anordnung nicht möglich. Statt dessen müssen für jeden
(neuen) Farbstoff neue dichroitische Strahlteiler und Blockfilter kreiert werden.
In einer Anordnung gemäß DE. . . wird das Fluoreszenzlicht mit Hilfe eines
Prismas spektral aufgespalten. Das Verfahren unterscheidet sich von der
oben beschriebenen Anordnung mit dichroitischen Filtern nur dadurch, dass
der verwendete Filter in seiner Charakteristik einstellbar ist. Es werden jedoch
weiterhin pro Punktdetektor vorzugsweise das Emissionsband eines
Farbstoffs aufgezeichnet.
Überlagern sich die Emissionsspektren zweier Farbstoffe, so stoßen die
bisherigen Detektionseinrichtungen an ihre Grenzen. Um ein Übersprechen
zwischen beiden Farbstoffen zu vermeiden, muß der spektrale
Detektionsbereich eingeschränkt werden. Der Bereich in dem sich die beiden
Farbstoffe überlagern wird hierzu einfach herausgeschnitten und nicht
detektiert. Somit verschlechtert sich die Effizienz der Detektionseinheit. Ein
gleiches Signal- zu Rauschverhältnisses kann nur durch die Erhöhung der
Anregungsleistung erzielt werden, wodurch es zu einer Präparatschädigung
kommen kann. Deshalb werden heutzutage maximal bis zu 6 verschiedene
Farbstoffsonden simultan eingesetzt, da die Farbstoffe sonst aufgrund der
sich stark überlagernden Emissionsbänder nicht getrennt werden können.
Bisher wurden Farbstoffe so modifiziert, daß sie sich entweder in ihren
Absorptionseigenschaften oder in ihren Emissionseigenschaften voneinander
unterscheiden. Fig. 3a) zeigt die Emissionsspektren von verschiedenen
typischen Farbstoffen. Aufgetragen ist das Emissionssignal in Abhängigkeit
von der Wellenlänge. Zu erkennen ist das sich die mit 1 bis 4 bezeichneten
Farbstoffe in der Lage und der Form ihrer Emissionsspektren unterscheiden.
Diese Farbstoffe sind jedoch in den meisten Fällen toxisch für
Lebendpräparate. Somit sind Untersuchungen zur Evolution von
Zellverbänden in Lebendpräparaten unmöglich. Ende der 90 er Jahre wurden
in der Natur vorkommende Farbstoffe, die sogenannten fluoreszierenden
Proteine (GFP, YFP, CFP, TOPAS, GFT, RFP) entdeckt (Firma: Clonetech,
USA).
Diese Farbstoffe zeichnen sich durch eine geringe Probenbeeinflussung aus.
Deshalb sind sie zur Markierung von Zellregionen in Lebendpräparaten
besonders geeignet. Nachteilig ist jedoch, daß sich die Farbstoffe in ihren
Emissionseigenschaften nur geringfügig unterscheiden. Fig. 3b) zeigt die
Emisssionssignale in Abhängigkeit von der Wellenlänge für die Farbstoffe
GFP, Topas, GFT und Cyan-FP.
Mit den herkömmlichen Methoden könnte nur das CFP und RFP aufgrund
seiner geänderten Absoptionseigenschaften effizient, d. h. bei sequentieller
Bildaufnahme von den übrigen getrennt werden. Eine Trennung der
Farbstoffe GFP und GFT wäre mit herkömmlichen Mitteln überhaupt nicht
möglich.
In einer weiteren Methode zur Bestimmung der Lokalisation von zwei
Proteinen werden beide Proteine mit verschiedenen Farbstoffen markiert,
wobei das Emissionsspektrum des ersten Farbstoffes sich mit dem
Absorptionsspektrum des zweiten Farbstoffs überlagert. Anschließend wird
der erste Farbstoff mit einer geeigneten Wellenlänge zur Fluoreszenz
angeregt. Befinden sich beide Moleküle sehr nahe beieinander (<10 nm) so
kann die Emissionsstrahlung des ersten Farbstoffs vom zweiten absorbiert
werden, wodurch der zweite Farbstoff und nicht der erste Farbstoff im
Anschluß emittiert. Fig. 3d) zeigt das Energieterm-Schema für diesen
Vorgang, der in der Literatur Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET)
genannt wird.(Lit.: Fan et al.; Biophysical Journal, V 76, May 1999, P 2412-2420).
Wenn man bei diesem Verfahren die Emissionsstrahlungen beider
Farbstoffe detektiert und das Verhältnis beider Detektorsignale bestimmt, so
kann man den Abstand beider Moleküle voneinander bestimmen.
Weiterhin ist bekannt, dass das Emissionsspektrum eines Farbstoffes der sich
in einem biologischen Präparat befindet von dem Emissionsspektrum
gemessen in einer Farbstoffküvette unterscheiden kann. Fig. 3c) zeigt die
Emissionsspektren eines Farbstoffes in Abhängigkeit von der Umgebung in
der sich der Farbstoff befindet. In der Abbildung aufgetragen ist hierzu das
Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Die Wellenlängenverschiebung kann bis zu mehreren 10 nm betragen.
Genauere Untersuchungen der Abhängigkeit dieser
Wellenlängenverschiebung von der Umgebung sind bisher nicht bekannt, da
eine derartige Untersuchung mit den Methoden nach dem Stand der Technik
nur schwer möglich sind. Zwar werden heutzutage Spektrometer auch in
Verbindung mit einem LSM eingesetzt. Hierbei wird statt eines Punktdetektors
ein herkömmliches meist hochauflösendes Spektrometer eingesetzt (Patent
Dixon, et al. US 5,192,980). Diese können jedoch nur punktuell oder gemittelt
über ein Gebiet ein Emissionsspektrum aufzeichnen. Es handelt sich also um
eine Art der Spektroskopie. In einer weiteren Anordnung wird die
Lebensdauer der Farbstofffluoreszenz gemessen, wodurch wiederum auf die
Art der Umgebung geschlossen werden kann. Würde man jedoch ein
komplettes Bild aufzeichnen so würde dies eine lange Datenaufnahmezeit
erfordern. Deshalb können diese Verfahren nur bedingt bei der Untersuchung
von Lebendpräparaten eingesetzt werden.
In einer weiteren Applikation der Fluoreszenzmikroskopie wird die
Ionenkonzentration (z. B.: Ca+, K+, Mg2+, ZN+, . . .) insbesondere in biologischen
Präparaten bestimmt. Hierzu werden spezielle Farbstoffe oder
Farbstoffkombinationen (z. B. Fura, Indo, Fluo; Molecular Probes, Inc.)
verwendet, die eine spektrale Verschiebung in Abhängigkeit von der
Ionenkonzentration besitzen. Ionenkonzentration besitzen. Abb. 4a) zeigt die
Emissionsspektren von Indo-1 in Abhängigkeit von der Konzentration der
Kalziumionen. Abb. 4b) zeigt ein Beispiel für die Emissionsspektren in
Abhängigkeit von der Kalzium Ionenkonzentration bei Verwendung der
Kombination von FLuo-3 und Fura Red-Farbstoffen. Diese speziellen
Farbstoffe werden als Emissionsratiofarbstoffe bezeichnet. Detektiert man
wiederum die beiden in Abb. 4a dargestellten Fluoreszenzbereiche und bildet
das Verhältnis beider Intensitäten, so kann auf die entsprechende
Ionenkonzentration rückgeschlossen werden. Meist werden bei diesen
Messungen dynamische Änderung der Ionenkonzentration in
Lebendpräparaten untersucht, die eine Zeitauflösung von weniger als einer
Millisekunde erfordern.
Gegenstand der Erfindung sind daher neue Methoden zur flexiblen und frei
programmierbaren Detektion. Diese Methoden sollen in bildgebenden wie in
analytischen Mikroskopiersystemen eingesetzt werden können. Deshalb darf
beim Einsatz dieser Methoden die Datenaufnahmerate nicht verschlechtert
werden. Die Mikroskopsysteme sind bildgebende Systeme wie Laser-
Scanning-Mikroskope zur dreidimensionalen Untersuchung von biologischen
Präparaten mit einer optischen Auflösung bis zu 200 nm, Scanning-Nahfeld-
Mikroskope zur hochaufgelösten Untersuchung von Oberflächen mit einer
Auflösung von bis zu 10 nm. Fluoreszenzkorrelations-Mikroskope zur
quantitativen Bestimmung von Molekülkonzentrationen und zur Vermessung
von Molekül-Diffussionen. Weiterhin sind auf Fluoreszenzdetektion
basierende Verfahren zum Screenen von Farbstoffen eingeschlossen.
In all den o. g. Systemen werden Fluoreszenzfarbstoffe zur spezifischen
Markierung der Präparate eingesetzt. Diese Zielstellungen werden durch
Verfahren und Anordnungen gemäß den Patentansprüchen gelöst.
Durch die Erfindung können sich teilweise oder auch vollständig
überlagernde Farbstoffe noch getrennt und dabei die oben erwähnten
Nachteile bzw. Limitationen der bisher eingesetzten Techniken umgangen
bzw. überwunden werden. Multifluoreszenzaufnahmen unter Verwendung von
den in der Natur vorkommenden fluoreszierenden Proteinen sind hierdurch
möglich. Weiterhin können mit dieser Methode besonders effizient
Wellenlängenverschiebungen aufgrund von verschiedenen Umgebungen in
den zu untersuchenden Präparaten bestimmt werden.
Hintergrund des Verfahrens zur flexiblen Detektion ist eine spektral
aufgespaltete Detektion der Fluoreszenz. Dazu wird das Emissionslicht im
Scanmodul oder im Mikroskop (bei Mehrphotonen-Absorption) mit Hilfe des
Hauptfarbteilers (MDB) vom Anregungslicht abgespalten. Ein Blockschaltbild
der nun folgenden Detektoreinheit ist in Abb. 5 dargestellt. Das Licht der
Probe wird nun mit Hilfe von einer abbildenden Optik PO bei konfokaler
Detektion durch eine Blende (Pinhole) PH fokusiert, wodurch Fluoreszenz,
die außerhalb des Fokus entstand, unterdrückt wird. Bei einer
nichtdescannten Detektion entfällt die Blende. Das Licht wird nun mit Hilfe
eines winkeldispersiven Elements DI in seine Spektralanteile zerlegt. Als
winkeldispersive Elemente kommen Prismen, Gitter und akusto optische
Elemente in Frage. Das vom dispersiven Element in seine spektralen
Komponenten aufgespaltete Licht wird im Anschluß auf einen Zeilendetektor
DE abgebildet. Dieser Zeilendetektor DE mißt also das Emissionssignal in
Abhängigkeit von der Wellenlänge und wandelt dies in elektrische Signale
S() um. Zusätzlich kann der Detektionseinheit noch ein Linienfilter zur
Unterdrückung der Anregungswellenlängen vorgeschaltet werden.
Eine mögliche Ausführungsform des optischen Strahlenganges der in Abb. 5
im Blockschaltbild gezeigten Detektoreinheit ist in Abb. 6 dargestellt. Der
Aufbau beschreibt im wesentlichen einen Cerny Turner Aufbau. Bei einer
konfokalen Detektion wird das Licht L der Probe mit der Pinholeoptik PO
durch die konfokale Blende PH fokusiert. Bei einer nichtdescannten Detektion
im Falle einer Mehrphotonen-Absorption kann diese Blende entfallen. Der
erste abbildende Spiegel S1 kollimiert das Fluoreszenzlicht. Anschließend
trifft das Licht auf ein Liniengitter G, beispielsweise ein Gitter mit einer
Linienzahl von 651 Linien pro mm Das Gitter beugt das Licht entsprechend
seiner Wellenlänge in verschiedene Richtungen. Der zweite abbildende
Spiegel S2 fokusiert die einzelnen spektral aufgespaltenen
Wellenlängenanteile auf die entsprechenden Kanäle des Zeilendetektors DE.
Besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines Zeilen-
Sekundärelektronenverfielfachers der Firma Hamamatsu H7260. Der Detektor
besitzt 32 Kanäle und eine hohe Empfindlichkeit. Der freie Spektralbereich der
oben beschriebenen Ausführungsform beträgt etwa 350 nm. Der freie
Spektralbereich wird in dieser Anordnung gleichmäßig auf die 32 Kanäle des
Zeilendetektors verteilt, wodurch sich eine optische Auflösung von etwa 10 nm
ergibt. Somit ist diese Anordnung nur bedingt zur Spektroskopie geeignet.
Jedoch ist ihr Einsatz in einem bildgebenden System vorteilhaft, da das Signal
pro Detektionskanal aufgrund des relativ breiten detektierten Spektralbandes
noch relativ groß ist. Eine Verschiebung des freien Spektralbereiches kann
zusätzlich durch eine Verdrehung beispielsweise des Gitters erfolgen.
Eine weitere mögliche Ausführungsform könnte die Verwendung eines
Matrixdetektors (z. B. eine CCD, . . .) beinhalten. Hierbei wird in einer
Koordinate durch das dispersive Element eine Aufspaltung in verschiedene
Wellenlängenanteile vorgenommen. In der verbleibenden Richtung auf dem
Matrixdetektor wird eine komplette Zeile (oder Spalte) des gescannten Bildes
abgebildet. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft beim Aufbau
eines Linienscanners (Lit.: Corle, Kino; "Confocal Scanning Optical
Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996). Der
prinzipielle Aufbau entspricht im wesentlichen dem eines LSM nach Abb. 2.
Jedoch wird statt eines Punktfokus eine Linie in den Fokus abgebildet und die
zu untersuchende Probe nur noch in einer Richtung gescannt. Als konfokale
Blende dient in einem solchen Aufbau statt einer Lochblende eine
Schlitzblende. Eine nichtdescannte Detektion bei Verwendung einer
Mehrphotonen-Absorption kann auch mit dieser Anordnung erfolgen. Hierzu
kann wiederum die konfokale Blende entfallen.
Im folgenden wird der Auswertealgorithmus für die in Abb. 6 dargestellte
Anordnung also für eine Punktscanner beschrieben. Der Algorithmus kann
jedoch ohne Einschränkung auf die Anordnung für einen Linienscanner
angewendet werden.
Wie aus Abb. 3 und 4 ersichtlich ist unterscheiden sich die einzelnen
Farbstoffe in der Lage und der Form der Emissionsspektren. Der Algorithmus
(Abb. 7) bestimmt pro Bildpunkt die Lage des Schwerpunkts bzw. Maxima des
in dem Bildpunkt detektierten Emissionssignals. Im folgenden wird eine
vorteilhafte mögliche Art der Bestimmung des Schwerpunktes näher
beschrieben. Andere Arten der Bestimmung des Schwerpunktes bzw.
Maxima, wie Interpolationsfits, etc. sind uneingeschränkt Teil der Erfindung.
Die vom Zeilendetektor detektierten Signale pro Kanal (linkes Diagramm)
werden dazu mit einer Kalibrierfunktion (rechtes Diagramm) multipliziert, d. h.
jeder Kanal erhält eine bestimmte Wichtung. Das linke Diagramm in Abb. 7
stellt beispielhaft ein gemessenes Emissionssignal in Abhängigkeit von der
Kanalnummer in dem das Signal detektiert wurde dar. Im rechten Diagramm
ist ein Beispiel einer Wichtungsfunktion für die entsprechenden Einzelkanäle
in Abhängigkeit von der Kanalnummer aufgeführt.
Die gewichteten Einzelsignale pro Kanal werden nun aufsummiert und durch
die Summe der ungewichteten Einzelsignale pro Kanal (Summensignal)
geteilt. Damit ergibt sich ein Signal, das ein charakteristisches Maß für die
Lage des Schwerpunktes des Emissionsspektrums und damit eines
angeregten Farbstoffe ist (Abb. 8a). Dieses Signal wird im folgenden
Positionssignal genannt. Abb 8a zeigt das Positionssignal in Abhängigkeit
von der Lage des Schwerpunkts bzw. Maximums des detektierten
Emissionsspektrums.
Es können durch die Messung des Positionssignals verschiedene Farbstoffe
aufgrund ihrer Lage und Art der Emissionsspektren unterschieden werden.
Weiterhin kann bei Verwendung beispielsweise eines Farbstoffes die von der
Umgebung abhängige Wellenlängenverschiebung des Emissionsspektrum
gemessen werden.
Befinden sich im Bildpunkt gleichzeitig mehrere Farbstoffe so ergibt sich je
nach Konzentration des einen Farbstoffs im Vergleich zum anderen Farbstoff
eine Linearkombination der Lage des Schwerpunkts nach folgender
Gleichung:
wobei Posk die charakteristische Lage des Schwerpunkts eines Farbstoffs, Ck
die Konzentration eines Farbstoffs und n die Anzahl der simultan in dem
Bildpunkt angeregten Farbstoffe sind. Der Algorithmus kann somit auch
Ionenkonzentrationen bestimmen und zur Detektion eines FRET-Signals
eingesetzt werden. Zusätzlich ist eine Analyse der lokalen Überlagerung von
2 oder mehrenen Farbstoffen möglich (Colokalisationsmessung).
Das von der Ionenkonzentration abhängige Signal bei Verwendung von 2
Farbstoffe (z. B. Fluo-3 und Fura Red, Molecular Probes, Inc.) oder von einem
Farbstoff mit 2 charakteristischen Emissionsbändern (z. B. Indo, Molecular
Probes, Inc.) ist in Abb. 8b dargestellt. Aufgetragen ist das Positionssignal in
Abhängigkeit von der Ionenkonzentration.
Wie bereits erwähnt ist das Positionssignal ein Maß für die Lage des
Schwerpunktes des Emissionsspektrums. Es kann also als Maske für eine
Berechnung eines farbkodierten Intensitätsbildes dienen. Der Algorithmus ist
in Abb. 9 schematisch dargestellt. Dazu wird im ersten Schritt die Maske (also
das Positionssignal) mit einer entsprechenden Lookup Tabelle multipliziert.
Die Lookup Tabelle beinhaltet die entsprechende Farbzuordnung in
Abhängigkeit von der Lage des Schwerpunktes des Emissionsspektrums. Im
Anschluß wird das Ergebnis dieser Multiplikation mit dem Intensitätswert (dem
Summensignal) multipliziert, also die Helligkeit der Farbe der tatsächlichen
Fluoreszenzintensität angepaßt. Je nach Wahl der Lookup Tabelle können
farbmaskierte Intensitätsbilder (diskrete Farbverteilung), d. h. pro Pixel kommt
nur ein Farbstoff vor oder auch Intensitätsbilder mit Mischfarben durch ein
Zusammensetzen der Einzelbildpunkte zu einem Bild erzeugt werden.
Der entscheidende Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass die gesamte
Fluoreszenz eines jeden Farbstoffe (das Summensignal) unabhängig von
dem Grad der Überlagerung der Emissionsspektren detektiert werden kann
und trotzdem die Farbstoffe noch getrennt (durch das Positionssignal)
darstellbar sind. Sich stark überlagernden Farbstoffe (Abb. 3c) können somit
besonders effizient detektiert werden.
Eine Implementation des Algorithmus in den Aufbau nach Abb. 6 kann digital
oder auch analog erfolgen. Beide Anordnungen werden im folgenden näher
beschrieben. Eine Anordnung zur digitalen Berechnung des Summen- und
des Positionssignals ist in Abb. 10 schematisch dargestellt. Hierbei wird der
an den Anoden eines Mehrkanal-PMT fließende Strom, jeweils durch den
ersten Amplifier A (als Strom-Spannungswandler geschaltet) in eine
Spannung gewandelt und verstärkt. Die Spannung wird einem Integrator I
zugeführt der über eine entsprechende Zeit (z. B. Pixelverweilzeit) das Signal
integriert.
Zur schnelleren Auswertung kann dem Integrator I ein Komparator K
nachgeschaltet werden, der als einfacher Komparator eine Schaltschwelle
hat, die bei Überschreitung ein digitales Ausgangssignal erzeugt oder der als
Fensterkomparator ausgebildet ist und dann ein digitales Ausgangssignal
bildet, wenn sich das Eingangssignal zwischen der oberen und unteren
Schaltschwelle befindet oder wenn sich das Eingangssignal außerhalb (unter
oder über) den Schaltschwellen liegt. Die Anordnung des Komparators bzw.
des Fensterkomparators kann sowohl vor dem Integrator als auch danach
erfolgen. Schaltungsanordnungen ohne Integrator (so genannte
Verstärkermode) sind ebenfalls denkbar. Bei der Anordnung im
Verstärkermode wird der Komparator K auch nach entsprechender
Pegelanpassung angeordnet. Der Ausgang des Komparators K dient als
Steuersignal für ein Switch-Register Reg, das direkt die aktiven Kanäle
schaltet (online) oder der Zustand wird dem Computer über eine zusätzliche
Verbindung V mitgeteilt, um eine individuelle Auswahl der aktiven Kanäle zu
treffen (off-line). Das Ausgangssignal des Integrators I wird direkt einem
weiteren Ampl. A1 zur Pegelanpassung, für die nachfolgende A/D-Wandlung
AD zugeführt. Die AD gewandelten Werte werden über geeignete
Datenübertragung an einen Rechner (PC oder Digital-Signal-Prozessor DSP)
übertragen, der die Berechnung des Positionssignales und des
Summensignales nach Abb. 7 und 9 durchführt.
Ein auf analoger Datenverarbeitung basierendes Aquivalent der Anordnung in
Abb. 10 ist Abb. 11 dargestellt. Die Signale der Einzelkanäle werden hierbei
wiederum mit einem Verstärker in Spannungssignale transformiert.
Anschließend werden die einzelnen Spannungssignale in einem Integrator I
während der Pixelverweilzeit aufintegriert.
Dem Integrator nachgeschaltet ist ein Komperator K der einen Vergleich des
aufintegrierten Signals mit einem Referenzsignal durchführt.
Falls das aufintegrierte Signal kleiner als die Komperatorschwelle ist, so
würde in dem entsprechenden Einzelkanal kein oder ein zu kleines
Fluoreszenzsignal gemessen. In einem solchen Falle soll das Signal des
Einzelkanals nicht weiter verarbeitet werden, da dieser Kanal nur einen
Rauschanteil zum Gesamtsignal beiträgt. Der Komperator betätigt in einem
solchen Falle über Reg einen Schalter S und der Einzelkanal wird für den
gerade gemessenen Pixel ausgeschalten. Mit Hilfe der Komperatoren in
Kombination mit den Schaltern wird also automatisch der für den gerade
gemessenen Bildpunkt relevante Spektralbereich ausgewählt.
Im Anschluß wird das integrierte Spannungssignal wieder mit Hilfe eines
Widerstandes R in einen Strom umgewandelt. Jeder Einzelkanal erzeugt
somit einen von der auf den Einzelkanal auftreffenden Fluoreszenzintensität
abhängigen Strom. Alle aneinander grenzenden Einzelkanäle werden
anschließend mit einem weiteren zwischen ihnen liegenden Widerstand R1
verbunden. Der entstehende Gesamtstrom am oberen und unteren Ende der
Detektorzeile wird wiederum mit einem Strom-Spannungswandler A1 in eine
Spannung gewandelt. Die Spannung am oberen und unteren Ende Eo und Eu
entsprechen der Summe der mit gegenläufigen Geraden gewichteten Signale
der Einzelkanäle. Die beiden Signale am oberen und am unteren Ende
werden im folgenden mit einem Summationsverstärker SV summiert. Das so
entstehende Signal entspricht dem Summensignal der gesamten
gemessenen Fluoreszenz. Dieses Summensignal und das Signal vom oberen
Ende oder das Signal vom unteren Ende (gestrichelt dargestellt) werden
einem analogen Dividierer zugeführt, der am Ausgang das Positionssignal
bildet.
Das Summen- und das Positionssignal werden im Anschluß mit jeweils einem
Analog-Digital-Wandler in digitale Signale umgewandelt und vom Computer
oder DSP weiterverarbeitet. Es können jedoch auch uneingeschränkt das
obere und untere Signal gewandelt und vom Computer verarbeitet werden. In
diesem Falle würde der Computer das Summensignal und das Positionssignal
bestimmen. In beiden Fällen wird der Algorithmus nach Abb. 9 im Computer
durchgeführt.
Jedoch kann auch eine Implementierung des Algorithmus nach Abb. 9 in die
Schaltung nach Abb. 11 erfolgen. Hierzu werden im folgenden 3
Möglichkeiten näher erläutert. In einer ersten Anordnung erfolgt die
Multiplikation mit der Lookup Tabelle durch eine Veränderung der
Widerstände (R1), die sich zwischen den benachbarten
Einzeldetektionskanälen befinden. Der Rest der Schaltung bleibt wie
Eingangs beschrieben. In zweiten Anordnung erfolgt die Multiplikation mit der
Lookup Tabelle im Verstärker (A1). Hierzu wird der Verstärker A1 mit einer
veränderlichen nichtlinearen Kennlinie betrieben. In einer dritten Anordnung
(digitale (nach Abb. 10) und analoge Detektion (nach Abb. 11)) erfolgt eine
Manipulation bzw. Verzerrung der Eingangssignale der
Einzeldetektionskanäle durch: eine Veränderung der Verstärkung von (A),
eine Veränderung der Integrationszeiten von (I), durch ein Einspeisen eines
zusätzlichen Offsets vor dem Integrator und/oder durch eine digitale
Beeinflußung der gezählten Photonen bei einer Photonenzählanordnung. Alle
3 Methoden können auch beliebig miteinander kombiniert werden.
Für die Vermeidung von Artefakten ist es bei einer Fluoreszenzmessung
notwendig das von der Probe rückgestreute Anregungslicht zu unterdrücken
oder zumindest so stark abzuschwächen das es kleiner als oder in der
gleichen Größenordnung wie das Emissionsmaximum ist. Hierzu kann der
oben beschriebene zusätzliche Linienfilter oder ein entsprechend optimierter
Hauptfarbteiler (MDB) zur optischen Abschwächung verwendet werden. Da
die spektrale Breite der Anregungslaserstrahlung sehr viel kleiner als die vom
Einzelkanal detektierte Bandbreite ist, kann die rückgestreute bzw. reflektierte
Anregungsstrahlung auch durch ein gezieltes Ausschalten des
entsprechenden Einzelkanals mit dem in Abb. 11 dargestellten Schalter
erfolgen.
Die Anordnung nach Abb. 11 hat gegenüber Anordnung nach Abb. 10
mehrere Vorteile. Der aufälligste Vorteil ist, dass lediglich 2 Kanäle in digitale
Daten gewandelt und an den Computer gesendet werden müssen. Dadurch
werden die vom Computer zu verarbeitenden Datenraten minimiert. Dies ist
besonders wichtig bei der Anwendung des Verfahrens in der
Echtzeitmikroskopie bei der beispielsweise mehr als 50 Bilder mit 512 × 512
Pixeln und 12 bit Pixeltiefe detektiert werden müssen, um die extrem schnell
ablaufenden dynamischen Prozesse registrieren zu können. Beim Einsatz
dieses Verfahrens ist weiterhin keine Grenzen an die Anzahl der Einzelkanäle
des verwendeten Zeilendetektor (Matrixdetektors) und damit an die Größe
des detektierbaren Spektralbereiches und/oder die spektrale Auflösung des
Spektralsensors gesetzt.
Weiterhin sind bei der in Abb. 10 dargestellten Vorrichtung die zu wandelnden
Signalpegel wesentlich kleiner. Dadurch ist das zu erwartende Signal zu
Rauschverhältnis geringer.
In den beide oben beschriebenen Anordnungen zur Umsetzung des
Auswertealgorithmus wurde eine Integratorschaltung zur Detektion der
Einzelkanalsignale verwendet. Uneingeschränkt kann jedoch auch eine
Photonenzählung in den Einzelkanälen erfolgen. Die in Abb. 10 dargestellte
Anordnung hat jedoch den Vorteil, dass sie neben dem Positionssignal auch
noch die komplette Spektralinformation zur nachträglichen Bildverarbeitung
zur Verfügung stellt. Die Erfindung schließt deshalb auch eine Kombination
beider Anordnungen ein.
Abb. 12 zeigt Messungen, die mit den in Abb. 10 und 11 dargestellten
Anordnungen durchgeführt worden. In Abb. 12a sind die mit einem
Spektrometer gemessen Emissonsspektren der verwendeten Farbstoffe GFP,
CFP und DI aufgeführt. Die Anregung der Farbstoffe erfolgte mit einem Argon
Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm. Diese Farbstoffe wurden im
folgenden spezifisch an bestimmte Regionen in einem biologischen Präparat
gebracht. Abb. 12b zeigt ein Histogramm des Positionssignals beim Scannen
über einem Probenausschnitt an dem sich alle 3 Farbstoffe befinden. Deutlich
sind die 3 Maxima im Histogramm zu erkennen an denen die 3 Farbstoffe ihr
charakteristisches Positionssignal besitzen. Die Positionen für die 3 Farbstoffe
sind in der folgenden Tabelle aufgelistet:
Die Farbstoffe sollten sich also ohne weiteres mit den erfindungsgemäßen
Anordnungen trennen lassen. Zusätzlich sind lokale Wellenlängen
verschiebungen aufgrund der verschiedenen lokalen Umgebungen innerhalb
eines Farbstoffes sichtbar. Dies äußert sich in der Breite der Maxima für die
einzelnen Farbstoffe im Histogramm.
Abb. 13a zeigt das aus den Summensignalen gebildete Intensitätsbild. In Abb.
13b ist das entsprechende aus den Positionssignalen gebildete Bild. Dieses
Bild verkörpert die entsprechenden Schwerpunkte der Emissionsspektren.
Deutlich sind die unterschiedlich eingefärbten Zellkerne (teils mit GFP, teils
mit CFP gefärbt) und die mit DI gefärbten Zellgerüste unterscheidbar.
Abb. 13c stellt das entsprechend dem Algorithmus in Abb. 9 berechnete
farbkodierte Intensitätsbild dar. Die einzelnen Regionen, an denen sich
unterschiedliche Farbstoffe anlagerten sind nun durch die Farbkodierung
getrennt. Die Trennung wird verdeutlicht durch die Darstellung eines Bildes in
seinen 3 RGB Kanälen. Zum Vergleich ist auch ein mittels einer Detektion
nach dem Stand der Technik gemessenes Bild in Abb. 13d dargestellt. Hierbei
erfolgte die Detektion nur in extrem engen Spektralbändern, um ein
übersprechen der Fluoreszenzsignale unterschiedlicher Farbstoffe
untereinander zu vermeiden. Durch das starke Einengen der
Detektionsbänder konnte nur ein Bruchteil des von der Probe emittierten
Fluoreszenzsignales gemessen werden. Um ein Bild mit möglichst gleichem
Signal zu Rauschverhältnis zu erhalten, mußte die Anregungsleistung um ein
vielfaches erhöht werden. Dies demonstriert die hohe Effizienz der
erfindungsgemäßen Anordnungen im Vergleich zu Anordnungen nach dem
Stand der Technik. Weiterhin können Regionen in denen sich das CFP bzw.
das GFP anlagerten aufgrund der sich überlagernden Emissionsspektren
beider Farbstoffe nicht getrennt werden. Dies äußert sich in der gelben
Einfärbung dieser Zellregionen bzw. in dem doppelten Erscheinen der
Regionen in 2 Bildkanälen (R und G).
Claims (87)
1. Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des
wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe, insbesondere
des Emissions- und/oder Absorptionsverhaltens, vorzugsweise der
Fluoreszenz und/oder Lumineszenz und/oder Phosphoreszenz und/oder
enzymaktivierten Lichtemission und/oder enzymaktivierten Fluoreszenz,
wobei mindestens ein spektraler Schwerpunkt und/oder ein Maximum der
Emissionsstrahlung und/oder der absorbierten Strahlung bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung des Schwerpunkts
und/oder des Maximums der Emissionsstrahlung von Fluorochromen zur:
Unterscheidung von verschiedenen Farbstoffen und/oder
zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder
zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Emissionsspektrums in Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder
zur Vermessung von Emissionsratiofarbstoffen zur Bestimmung von Ionenkonzentrationen erfolgt.
zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder
zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Emissionsspektrums in Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder
zur Vermessung von Emissionsratiofarbstoffen zur Bestimmung von Ionenkonzentrationen erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung des Schwerpunkts
und/oder des Maximums der reflektierten oder transmittierten
Anregungsstrahlung von Fluorochromen zur:
Unterscheidung von verschiedenen Farbstoffen und/oder
zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder
zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Absorptionsspektrums in Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder
zur Vermessung der Absorptionsratio zur Bestimmung von Ionenkonzentrationen erfolgt.
zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder
zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Absorptionsspektrums in Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder
zur Vermessung der Absorptionsratio zur Bestimmung von Ionenkonzentrationen erfolgt.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Emissionsstrahlung der Probe mit einem dispersiven Element
aufgespalten und in mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Aufspaltung der Fluoreszenzstrahlung erfolgt
5. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei zur Absorptionsmessung die von der Probe reflektierte oder
transmittierte Strahlung mit einem dispersiven Element aufgespalten und in
mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine spektrale Wichtung zwischen mehreren Detektionskanälen, eine
Summation der gewichteten Kanäle der Signale der Detektionskanäle sowie
eine Summation der Detektionskanäle erfolgt
7. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Signale von Detektionskanälen gewichtet werden, indem sie mit
einer Wichtungskurve multipliziert werden, ein Summensignal erzeugt wird,
indem die Summe der berücksichtigten Kanäle bestimmt wird und ein
Positionssignal erzeugt wird indem die Summe der gewichteten Signale durch
das Summensignal geteilt wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Wichtungskurve eine Gerade ist
9. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei Signale von Detektionskanälen gewandelt und digital ausgelesen
werden und die Wichtung und Summation digital in einem Rechner erfolgt.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Wichtung und Summation mit analoger Datenverarbeitung mittels
einer Widerstandskaskade erfolgt
11. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Widerstände einstellbar sind
12. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Wichtungskurve einstellbar ist
13. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Signale der Detektorkanäle durch eine nichtlineare Verzerrung der
Eingangssignale beeinblußt werden
14. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Beeinflussung der Intergrationsparameter erfolgt
15. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Beeinflussung der Kennlinie eines Verstärkers erfolgt
16. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Positonssignal und das Summensignal analog ermittelt, gewandelt
und digital ausgelesen werden
17. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei ein oberes und ein unteres Signal, die der Summe der mit
gegenläufigen Wichtungskurven gewichteten Signale der Einzelkanäle
entsprechen, ausgelesen, digital gewandelt und dem Rechner zugeführt
werden.
18. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Positionssignal und das Summensignal zur Generierung eines
Bildes verwendet werden
19. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei ein farbkodiertes Fluoreszenzbild erzeugt wird
20. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Überlagerung mit weiteren Bildern erfolgt
21. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Positionssignal und das Summensignal mit einer lookup Tabelle
kombiniert werden
22. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei mittels der lookup-Tabelle eine Darstellung verschiedener Farbstoffe
und/oder der Spreizung des generierten Bildes erfolgt
23. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei über Komparatoren in Detektionskanälen ein Vergleich des
gemessenen Signals mit einem Referenzsignal erfolgt und im Falle einer
Unterschreitung und/oder Überschreitung des Referenzsignals eine
Veränderung der Betriebsweiser des Detektionskanales erfolgt
24. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Abschaltung und/oder Nichtberücksichtigung des jeweiligen
Detektionskanals erfolgt.
25. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei hierdurch eine Einengung des interessierenden Spektralbereichs
erfolgt
26. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Signale der Detektionskanäle jeweils mittels mindestens einer
Integratorschaltung generiert werden
27. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Signale der Detektionskanäle mittels Photonenzählung und
anschließender Digital/Analogwandlung generiert werden
28. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Photonenzählung zeitkorreliert erfolgt
29. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
zur Erfassung von Ein- und/oder Mehrphotonenfluoreszenz und/oder durch
entangled photon angeregter Fluoreszenz
30. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit paralleler Beleuchtung und Detektion, vorzugsweise im
Wirkstoffscreening, wobei die Probe vorzugsweise eine Mikrotiterplatte ist
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
in einem Mikroskop
31. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
zur Detektion in einem Scanning-Nahfeldmikroskop.
32. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
zur Detektion einer Ein- und/oder Mehrphotonen-Farbstofffluoreszenz in
einem Fluoreszenzkorrelierten Spektroskop.
33. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mittels konfokaler Detektion
34. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einer scannenden Anordnung
35. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einem X/Y Scanner in der Beleuchtung
36. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einem X/Y Scantisch
37. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mittels nichtkonfokaler Detektion
38. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einer scannenden Anordnung
39. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit descannter Detektion
40. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit Hellfeldabbildung
41. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit Punktabbildung
42. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit nicht descannter Detektion
43. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit Hellfeldabbildung
44. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit nicht scannender, konfokaler oder nichtkonfokaler Detektion und Punkt-
oder Hellfeldabbildung
45. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einem X/Y Scantisch
46. Anordnung zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des
wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe, insbesondere
des Emissions- und/oder Absorptionsverhaltens, vorzugsweise der
Fluoreszenz und/oder Lumineszenz und/oder Phosphoreszenz und/oder
enzymaktivierten Lichtemission und/oder enzymaktivierten Fluoreszenz,
wobei Mittel zur Bestimmung mindestens eines spektralen Schwerpunktes
und/oder eines Maximum der Emissionsstrahlung und/oder der absorbierten
Strahlung vorgesehen sind.
47. Anordnung nach Anspruch 46,
wobei die Emissionsstrahlung der Probe mit einem dispersiven Element
aufgespalten und in mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird.
48. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Aufspaltung der Fluoreszenzstrahlung erfolgt
49. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei zur Absorptionsmessung die von der Probe reflektierte oder
transmittierte Strahlung mit einem dispersiven Element aufgespalten und in
mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird.
50. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine spektrale Wichtung zwischen mehreren Detektionskanälen, eine
Summation der gewichteten Kanäle der Signale der Detektionskanäle sowie
eine Summation der Detektionskanäle erfolgt
51. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Signale von Detektionskanälen gewichtet werden, indem sie mit
einer Wichtungskurve multipliziert werden, ein Summensignal erzeugt wird,
indem die Summe der berücksichtigten Kanäle bestimmt wird und ein
Positionssignal erzeugt wird indem die Summe der gewichteten Signale durch
das Summensignal geteilt wird.
52. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Wichtungskurve eine Gerade ist
53. wobei Signale von Detektionskanälen gewandelt und digital ausgelesen
werden und die Wichtung und Summation digital in einem Rechner erfolgt.
54. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Wichtung und Summation mit analoger Datenverarbeitung mittels
einer Widerstandskaskade erfolgt
55. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Widerstände einstellbar sind
56. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Wichtungskurve einstellbar ist
57. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Positonssignal und das Summensignal analog ermittelt, gewandelt
und digital ausgelesen werden
58. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei ein oberes und ein unteres Signal, die der Summe der mit
gegenläufigen Wichtungskurven gewichteten Signale der Einzelkanäle
entsprechen, ausgelesen, digital gewandelt und dem Rechner zugeführt
werden.
59. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Positionssignal und das Summensignal zur Generierung eines
Bildes verwendet werden
60. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei ein farbkodiertes Fluoreszenzbild erzeugt wird
61. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Überlagerung mit weiteren Bildern erfolgt
62. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Positionssignal und das Summensignal mit einer lookup Tabelle
kombiniert werden
63. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei mittels der lookup-Tabelle eine Darstellung verschiedener Farbstoffe
und/oder der Spreizung des generierten Bildes erfolgt
64. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei über Komparatoren in Detektionskanälen ein Vergleich des
gemessenen Signals mit einem Referenzsignal erfolgt und im Falle einer
Unterschreitung und/oder Überschreitung des Referenzsignals eine
Veränderung der Betriebsweiser des Detektionskanales erfolgt
65. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Abschaltung und/oder Nichtberücksichtigung des jeweiligen
Detektionskanals erfolgt.
66. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei hierdurch eine Einengung des interessierenden Spektralbereichs
erfolgt
67. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Signale der Detektionskanäle jeweils mittes mindestens einer
Integratorschaltung generiert werden
68. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Signale der Detektionskanäle mittels Photonenzählung und
anschließender Digital/Analogwandlung generiert werden
69. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobe9i
die Photonenzählung zeitkorreliert erfolgt
70. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
zur Erfassung von Ein- und/oder Mehrphotonenfluoreszenz und/oder durch
entangled photon angeregter Fluoreszenz.
71. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit paralleler Beleuchtung und Detektion, vorzugsweise im
Wirkstoffscreening,
wobei die Probe vorzugsweise eine Mikrotiterplatte ist
72. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
in einem Mikroskop
73. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
zur Detektion in einem Scanning-Nahfeldmikroskop.
74. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
zur Detektion einer Ein- und/oder Mehrphotonen-Farbstofffluoreszenz in
einem Fluoreszenzkorrelierten Spektroskop.
75. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mittels konfokaler Detektion
76. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einer scannenden Anordnung
77. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einem X/Y Scanner in der Beleuchtung
78. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einem X/Y Scantisch
79. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mittels nichtkonfokaler Detektion
80. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einer scannenden Anordnung
81. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit descannter Detektion
82. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit Hellfeldabbildung
83. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit Punktabbildung
84. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit nicht descannter Detektion
85. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit Hellfeldabbildung
86. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit nicht scannender, konfokaler oder nichtkonfokaler Detektion und Punkt-
oder Hellfeldabbildung
87. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einem X/Y Scantisch
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