DE19915137C2 - Verfahren zur Quantifizierung mehrerer Fluorochrome in einer mehrfach gefärbten Probe bei der Fluoreszenzmikroskopie und Verwendungen des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung mehrerer Fluorochrome in einer mehrfach gefärbten Probe bei der Fluoreszenzmikroskopie gemäß Patentanspruch 1 sowie Verwendungen des Verfahrens gemäß den Patentansprüchen 4, 5 und 6.

Die Quantifizierung einzelner Fluorochrome setzte bislang eine quantitative Trennbarkeit der Fluoreszenzsignale durch Wahl der Anregungs- und Emissionsbedingungen voraus. Bei Fluoreszenzindikatoren, deren Fluoreszenzen nicht durch entsprechende Anregungs- und Emissionskonfigurationen vollständig voneinander getrennt werden können, oder bei Fluorochromen mit stark überlappenden Anregungs- und Emissionscharakteristika können mit den bisherigen Verfahren nur Quantifizierungen zweier Fluorochrome mit überlappenden spektralen Eigenschaften erzielt werden. Zudem müssen zur Quantifizierung anschließend an den Meßvorgang Kalibrationsprozeduren durchgeführt werden oder mit Hilfe von Kalibrierproben Referenzwerte für ein "Ratio-Verfahren" aufgezeichnet werden (stellvertretend für eine Vielzahl von Indikatorsystemen seien hier die Ca²⁺-Indikatoren Fura- 2 und Indo-1 genannt, siehe US 4603209 und Grynkiewicz et al. (1985)). Bei gleichzeitiger Anwesenheit weiterer Fluoreszenzen (z. B. "green fluorescent protein" (GFP) und dessen Varianten), die mit den spektralen Eigenschaften des Indikators überlappen, ist eine Quantifizierung über das in US 4603209 und in Grynkiewicz et al. (1985) beschriebene "Ratio-Verfahren" nicht anwendbar.

Durch spezielle Kombinationen von Fluoreszenzfarbstoffen, Anregungslichtquellen, Anregungsfiltern, di- oder multichroitische Spiegel und Emissionsfilter wurde die Anzahl simultan registrierbarer Fluorochrome ausgeweitet (Carlsson et al. (1994), Lowy (1995), Carlsson et al. (1998); WO 98/17992 A2, WO 94/18547 A1 und WO 97/23648 A1). Diese Methoden leisten trotz optimierter optischer Vorrichtungen lediglich eine qualitative Aussage über die Anwesenheit oder Abwesenheit von Fluorochromen in einem gegebenen Bildelement. Bei Anwendung multipler Fluorochrome beispielsweise in der Chromosomenanalyse (Ried et al. (1992); WO 97/23648 A1) müssen Konfigurationen von Anregungsfiltern, dichroischen Spiegeln und Emissionsfiltern angewendet werden, die weniger als 10% Signalstreuung in Nachbarkanäle garantieren. Eine Quantifizierung ist bei diesem Verfahren nicht vorgesehen, es können lediglich die Anwesenheit oder die Abwesenheit der entsprechenden Fluorochrome bestimmt werden.

Die Unterscheidung verschiedener Fluorochrome mit Hilfe der "fluorescence-lifetime" Methode oder durch Amplitudenmodulation der Anregungslaser (Carlsson et al. (1998); WO 98/09154 A1, US 5784157 A) ist zwar in der Lage, einige Fluorochrome anhand unterschiedlicher kinetischer Eigenschaften zu unterscheiden, doch sind die technischen Erfordernisse und die Kosten durch die Anwendung gepulster Lichtquellen und Detektorsysteme mit hoher Zeitauflösung enorm. Implementierungen des "fluorescence- lifetime" Verfahrens für die Fluoreszenzmikroskopie (Oida et al. (1993), Brismar and Ulfhake (1997); US 4791310), für die Durchflußzytometrie (WO 92/07245 A1, US 5270548 A und US 5504337 A) und für die DNA-Sequenzierung (He et al. (1998)) wurden jedoch beschrieben. Viele Indikatorsysteme, die in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden (beispielsweise Fura-2 vs. Fura-2-Ca²⁺-Komplex, verschiedene Varianten des GFP), unterscheiden sich durch spektrale Veränderungen der Fluoreszenzcharakteristika, jedoch nicht bezüglich ihrer "fluorescence-lifetime"; daher ist die Anwendbarkeit der "fluorescence- lifetime" Verfahrens für solche Fluorochrome nicht gegeben.

Durch die vorhandenen Laserlichtquellen beschränkt sich die Auswahl der Anregungswellenlängen in konfokalen Lasermikroskopen auf wenige, verfügbare Laseremissionslinien. Hierbei kann oft nicht vermieden werden, daß Fluoreszenzen eines Fluorochroms in den Meßkanal eines anderen Fluorochroms mit einfließen. Unter solchen Bedingungen können viele Kombinationen von Fluorochromen und/oder Fluoreszenzindikatoren nicht eingesetzt werden. Bei diesen gemischten Meßsignalen können mit dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren die Beiträge der in der Probe vorhandenen Fluorochrome zurückverfolgt werden. Zudem beeinträchtigt ein unterschiedlich schnelles Ausbleichen verschiedener Fluorochrome die quantitative Erfassung des Beitrags einzelner Fluorezenzfarbstoffe zu einem zusammengesetzten Gesamtsignal bei unvollständiger Trennbarkeit durch Anwendung optimierter optischer Vorrichtungen. Auch diese Störgrößen können durch Anwendung des hier beschriebenen neuen Verfahrens eliminiert werden.

Die Separation von vier verschiedenen Fluorochrome bei der Fluoreszenz-gestützten DNA- Sequenzierung gelang durch Aufzeichnen der Reinfluorochrome und Lösen eines linearen Gleichungssystems (EP 0 294 524 A1). Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens ist jedoch wegen inhomogener Helligkeit und inkompletter Farbebnung in der bildgebenden Mikroskopie nicht in dieser Form anwendbar. Die gleichen Limitationen bezüglich ortsaufgelöster Spektroskopie in der Fluoreszenzmikroskopie gelten für ein Verfahren der Spektrenvergleichung, das nach Aufzeichnung eines isolierten Analytspektrums und seiner ersten Ableitung mittels eines linearen Least-Square-Regressionsverfahrens diesen Analyten in einem komplexen Spektrum z. B. in der Atomemissions- oder Infrarotspektroskopie wiederfinden kann (DE 692 18 536 T2) Ein Verfahren, das durch Beobachtung der Abklingfunktion der Fluoreszenz von Analyten und Anpassung von Wichtungsfaktoren das Vorhandensein eines oder mehrerer Analyten in einer Probe qualitativ nachweist (DE 197 18 016 A1) ist zwar in der Fluoreszenzmikroskopie anwendbar ("fluorescence lifetime microscopy"), benötigt jedoch die Selektion von Analyten mit deutlich unterschiedlicher Fluoreszenzlebensdauer, wie es beispielsweise bei den ineinander überführbaren Formen von Fluoreszenzindikatoren oder bei Farbvarianten des grün fluoreszierenden Proteins nicht der Fall ist.

Aufgabe dieser Erfindung ist die quantitative Bestimmung der Beiträge verschiedener Fluorochrome zu einem komplex zusammengesetzten Gesamtsignal auch bei unvollständiger Trennbarkeit der Fluoreszenzeigenschaften mehrerer Fluorochrome und/oder Fluoreszenzindikatorspezies durch alleinige Anwendung optischer Vorrichtungen.

Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe erfolgt durch die in Patentanspruch 1 angegebenen Schritte. Das erfindungsgemäße Verfahren setzt sich also im wesentlichen aus drei Arbeitsschritten zusammen, die zeitlich voneinander getrennt vorgenommen werden können:

• - Aufzeichnung und Speicherung von spektral aufgetrennten Fluoreszenzsignalen der einzelnen Fluorochrome in Reinform
• - Aufzeichnung und Speicherung von spektral aufgetrennten Fluoreszenzsignalen der Probe, die eine unbekannte Mischung der Reinformen enthält
• - Mathematisches Regressionsverfahren zur Berechnung des Beitrags der einzelnen Reinformen zu dem komplexen Gesamtsignal der Probe

Im ersten Schritt werden spektral aufgetrennte Fluoreszenzsignale der in einer Probe vorkommenden Fluorochrome in Reinform sowie das Hintergrundsignal ohne Fluorochrom im gegebenen optischen System aufgezeichnet. Die genannte spektrale Auftrennung wird entweder durch Änderung der Fluoreszenzanregungswellenlängen oder durch spektrale Selektion des in den Detektor gelangenden Fluoreszenzemissionslichts oder durch eine Kombination von beiden Maßnahmen erzielt. Die spektrale Auftrennung kann hierbei kontinuierlich beispielsweise mit Hilfe von Monochromatoren erfolgen oder diskontinuierlich gestaltet werden, beispielsweise durch diskrete Monochromatoreinstellungen, dichroische Spiegel, Filtersätze oder verschiedene Lichtquellen. Die spektral aufgelösten Datensätze werden nach Subtraktion des Hintergrundsignales in einer Datenbank zur späteren Verwendung gespeichert. Die gespeicherten, spektralen Datensätze der Reinformen können bei guter Reproduzierbarkeit in den Datenbanken verbleiben und für spätere Messungen wiederverwendet werden. Die spektral aufgetrennten Datensätze der Reinformen weiterer Fluorochrome können die Datenbank ergänzen und zu den bereits gespeicherten Datensätzen hinzugefügt werden. Die spektral aufgetrennten Datensätze der Reinformen können auch bei mehr spektralen Konfigurationen aufgezeichnet werden, als es bei der Messung der Probe zunächst nötig ist. Dies bietet den Vorteil, daß bei späterer Verwendung anderer spektraler Konfigurationen bereits Referenzdaten der Reinformen in der Datenbank existieren, und somit die Reinformfluoreszenzen nicht erneut aufgezeichnet werden müssen.

Die Fluoreszenz der Probe setzt sich aus den Fluoreszenzen der genannten Reinformen zusammen. Eine spektrale Auftrennung der Fluoreszenzen der Probe wird in den spektralen und optischen Konfigurationen durchgeführt, in denen auch Daten der Reinformen aufgezeichnet wurden. Vornehmlich kommen solche spektrale Konfigurationen zum Einsatz, bei denen, die Fluoreszenzen der in der Probe vorhandenen Reinformen die größten Differenzen untereinander aufweisen. Eventuell in der Probe vorhandene Autofluoreszenzen werden von den gewonnenen, spektral aufgetrennten Datensätzen subtrahiert.

Die Aufzeichnung der spektral getrennten Datensätze der Probe kann gegebenenfalls wiederholt werden um entweder dynamische Prozesse in der Probe zu verfolgen oder durch Mittelwertbildung die Streuung des Meßsignals zu verringern.

Die gespeicherten Daten werden im folgenden Schritt mit Hilfe einer Regressionsanalyse ausgewertet. Hierbei können multivariate lineare Regressionsanalysen oder nichtlineare Regressionsanalysen zum Einsatz kommen. Im vorliegenden Anwendungsbeispiel wurden Auswertungen mit beiden Verfahren durchgeführt. Vor- und Nachteile der entsprechenden Verfahren werden erläutert. Durch die Regressionsanalyse können die relativen Beiträge dei Reinformen zum Gesamtsignal ermittelt werden und bei Kenntnis der Signalintensität bekannter Mengen des Fluorochroms auf die in der Probe vorhandene Menge des Fluorochroms geschlossen werden. Die hierzu erforderlichen Schritte werden in der Folge beschrieben:
Da CCD-Kameras bis zur Sättigungsschwelle weitgehend linear arbeiten, kann angenommen werden, daß sich unterhalb der Sättigungsschwelle bei jeder spektralen Konfiguration i das Gesamtsignal einer Probe F_ges additiv aus den Signalanteilen der Einzelkomponenten 1, 2 . . . m zusammensetzt. Daher gilt F_ges = F₁ + F₂ + . . . + F_m. Diese Einzelkomponenten können als Produkt der durch Aufzeichnung und Normierung der Reinformfluoreszenzen bekannten, normierten Fluoreszenzintensitäten x₁, x₂, . . . x_m mit den unbekannten Skalierungsfaktoren b₁, b₂, . . . b_m ausgedrückt werden: F_m = b_mx_m. Während die normierten Fluoreszenzintensitäten x jeder der Einzelkomponenten bei unterschiedlichen spektralen Konfigurationen verschieden sind, bleiben die Skalierungsfaktoren b, die die in der Probe vorhandenen Stoffmengen der Fluorochrome anzeigen, konstant. Falls das für die Aufzeichnung eines spektralen Datensatzes benötigte Zeitintervall bei dynamischen Prozessen nicht vernachlässigbar gering ist, können sich Fehlerquellen ergeben; daher ist bei kinetischen Untersuchungen auf einen geschwindigkeitsoptimierten Ablauf der Datenerfassung zu achten.

Das Verfahren der Regressionsanalyse wird nun auf die Datensätze angewendet, um den Betrag der unbekannten Skalierungsfaktoren b₁ . . . b_m der jeweiligen normierten Intensität der Reinformen x₁ . . . x_m zum Gesamtsignal y zu ermitteln. Bei jeder spektralen Konfiguration i setzt sich das Gesamtsignal y_i aus den Signalen der im Bildelement befindlichen Reinformen F_im bzw. b_mx_im additiv zusammen.

Für jede Wellenlänge i gilt somit:

Formel (1): y_i = b₁x_i1 + b₂x_i2 + b₃x_i3 + . . . + b_mx_im

Die Anzahl der Reinformen m bestimmt die Zahl n der spektral unterschiedlichen Datensätze, die mindestens aufgezeichnet werden müssen, um eine Lösung mit Hilfe der Regressionsanalyse zu erzielen. Allgemein gilt also n ≧ m.

Durch Aufzeichnen der n verschiedenen Datensätze ergeben sich aus den gemessenen spektral verschiedenen Datensätzen n verschiedene Lösungen eines linearen Gleichungssystems (LGS).

Dieses LGS kann bei der Aufzeichnung von m verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen, deren spektrales Verhalten bekannt ist (x₁₁ . . . x_nm sind bekannt) bei n = m Wellenlängen direkt durch das Gauss-Jordan'sche Eliminationsverfahren gelöst werden, falls zwischen den n verschiedenen Lösungen keine linearen Abhängigkeiten bestehen. Die multivariate lineare Regressionsanalyse besitzt jedoch den Vorteil, daß mehr Meßwerte in die Berechnung aufgenommen werden können, und daß das Berechnungsverfahren zuverlässiger gestaltet werden kann.

Bei steigender Anzahl n erhöht sich die Zuverlässigkeit der Regressionsanalyse besonders bei nur schwach spektral unterschiedlichen Fluorochromen. Andererseits werden die Datensätze umfangreicher und die Datenanalyse verlangsamt. Bei der im Anwendungsbeispiel verwendeten CCD-Kamera mit 12 bit Auflösung werden beispielsweise bis zu 1,3 × 10⁶ Bildpunkte aufgezeichnet. Dies entspricht bei jeweils 10 verschiedenen spektralen Konfigurationen zu 20 Zeitintervallen einem Datensatz von 520 Megabyte.

Bei vektorieller Beschreibung einer multivariaten linearen Regressionsanalyse können die gesuchten Beträge der Reinformen in einem Lösungsvektor wie folgt ausgedrückt werden:
= A^-1 × , wobei A^-1 die inverse einer Matrix A ist. Der gesamte Term lautet:

Die Summen Σ werden hierbei über alle gemessenen spektralen Konfigurationen i = 1 bis. i = n gebildet. Da die Matrix A quadratisch ist, kann die Inverse der Matrix A^-1 durch das Gauß'sche Eliminationsverfahren mit Rücksubstitution gebildet werden. Bei hoher Komplexität der Matrix und bei schwach divergenten Datensätzen muß besonders auf Rundungsfehler geachtet werden, die sich teilweise dramatisch auswirken können. Die Computergestützte Ermittlung der inversen Matrix wurde daher im Anwendungsbeispiel mit doppelt genauen Fließkommavariablen durchgeführt. Im Zweifelsfall kann ein iteratives Verfahren zur Kontrolle und Verbesserung der Bildung der inversen Matrix dienen. Da die inverse Matrix für ein Meßprotokoll lediglich einmal berechnet werden muß, ist das aufwendige Verfahren der iterativen Kontrolle und Verbesserung empfehlenswert. Entsprechende Algorithmen mit Programmierungsroutinen sind der Fachliteratur zu entnehmen und im Internet publiziert.

Nach Kalkulation der inversen Matrix A^-1 können mit Hilfe einiger Multiplikations- und Additionsschritte die Matrix A^-1 mit dem Vektor zur Ermittlung des Lösungsvektors ausmultipliziert werden. In den Zeilen des Lösungsvektors sind die relativen Beträge des Beitrags der einzelnen Fluorochrome zum jeweiligen Gesamtsignal enthalten. Diese können bei homogener Ausleuchtung des Gesichtsfeldes über das gesamte Bildfeld als Maß für die lokale Menge des jeweiligen Fluorochroms dienen. Bei inhomogener Ausleuchtung können. Korrekturfaktoren angewendet werden, die zuvor durch Messung einer normierten Fluorochromkonzentration in verschiedenen Bereichen des Gesichtsfeldes ermittelt wurden. Bei Fluoreszenzindikatoren, die abhängig von Milieubedingungen ihre Eigenschaften ändern (z. B. Fura-2 und Fura-2-Ca²⁺-Komplex), ist zur Rückrechnung der entsprechenden Milieubedingung (lokale Ca²⁺-Konzentration) keine Korrektur erforderlich, da Unterschiede in der Fluoreszenzintensität beide Indikatorformen gleichermaßen betreffen. So kann im Fall des Fluoreszenzindikators Fura-2 die lokale Ca²⁺-Konzentration durch folgende Formel berechnet werden:

Formel (4) [Ca²⁺] = K_D x [Fura-2-Ca²⁺]/[Fura-2]

Alternativ zum beschriebenen multivariaten linearen Regressionsverfahren wurden nichtlineare Regressionsverfahren geprüft. Die Berechnung der relativen Anteile dei Einzelkomponenten zum Gesamtsignal wird durch ein Minimierungsverfahren dei Abweichungsquadrate zwischen Meßwerten der Probe und einer Summierung der mit den gesuchten Faktoren multiplizierten normierten Meßdaten der Reinformen (Formel (1)) erzielt. Die Summe der Abweichungsquadrate kann mittels verschiedener iterativer Verfahren minimiert werden. Vergleichend wurden die "steepest gradient" Methode und der Levenberg- Marquardt-Algorithmus für die iterative Berechnung angewendet. Beide Verfahren ergeben unter Berücksichtigung äquivalenter Abbruchkriterien der iterativen Optimierung identische Lösungen. Bei geeigneter Wahl von Startwerten für die iterativ zu ermittelnden Faktoren b₁ . . . b_m, ist das nichtlineare Regressionsverfahren zuverlässig und bietet eine einfache Handhabung. Falls die Startwerte und die initialen Schrittweiten des iterativen Verfahrens ungünstig definiert wurden, ergeben sich jedoch falsch konditionierte Iterationsschritte, die eine Fehlbestimmung in Form eines lokalen Minimums der Minimierungsfunktion ergeben können. Diese Gefahr kann zwar durch die Definition von Grenzwerten für b₁ . . . b_m reduziert werden, doch gerade bei Minimierungsfunktionen mit komplexer Topologie ist die Zuverlässigkeit der iterativen Suche des globalen Minimums eingeschränkt.

Das multivariate lineare Regressionsverfahren bietet somit gegenüber dem nichtlinearen Regressionsverfahren für die Mehrzahl der Applikationen folgende Vorzüge:

• - nichtlineare Regressionsverfahren bergen das Risiko, ein lokales Optimum der Datenanpassung zu finden, das multivariate lineare Regressionsverfahren erfaßt immer das globale Optimum der Datenanpassung.
• - Der Berechnungsaufwand durch das multivariate lineare Verfahren ist wesentlich niedriger als bei den iterativen Verfahren und bei einer gegebenen Konfiguration immer identisch. Somit ist die benötigte Rechenzeit abschätzbar und dadurch die Integrierbarkeit in Echtzeit-Programmabläufe gegeben.
• - Die Berechnungsschritte der Matrixoperation (Formel (3)) bestehen lediglich in Additionen und Multiplikationen. Daher kann für die Anwendung des Verfahrens der hohe Grad der Rechenoptimierung in aktuellen Prozessoren ("pipelining" von Additionen und Multiplikationen) ideal genutzt werden. Alternativ können jedoch auch Prozessoren mit reduziertem Befehlssatz ("RISC"-Prozessoren) verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung zeigt

Fig. 1 Flußdiagramm der notwendigen Arbeitsschritte zur Durchführung des Verfahrens

Fig. 2 Anregungsspektren der Fluoreszenzen von Fura-2, Fura-2-Ca²⁺- Komplex und GFP (green fluorescent protein)

Fig. 3 Zeitverlauf der Hintergrundsignal-korrigierten Fluoreszenzintensitäten in mehrfach gefärbten Einzelzellen, die bei 340 nm angeregt wurden.

Fig. 4 Zeitverlauf der Hintergrundsignal-korrigierten Fluoreszenzintensitäten in mehrfach gefärbten Einzelzellen, die bei 358 nm angeregt wurden.

Fig. 5 Zeitverlauf der Hintergrundsignal-korrigierten Fluoreszenzintensitäten in mehrfach gefärbten Einzelzellen, die bei 380 nm angeregt wurden.

Fig. 6 Zeitverlauf der Hintergrundsignal-korrigierten Fluoreszenzintensitäten in mehrfach gefärbten Einzelzellen, die bei 480 nm angeregt wurden.

Fig. 7 Quantifizierung mehrerer Fluorochrome in der mehrfach gefärbten Probe unter Nutzung der in Fig. 3-6 gezeigten spektral aufgelösten Datensätze und der in Fig. 2 gezeigten Anregungsspektren der Fluorochrome in Reinform. Gezeigt sind die Zeitverläufe der durch das beschriebene Verfahren ermittelten intrazellulären Ca²⁺- Konzentrationen (Abbildungsteil (1)), der Summe der Fluoreszenzintensitäten von Fura-2 und Fura-2-Ca²⁺-Komplex (in % der initialen Fluoreszenzintensität, Abbildungsteil (2)) und der Fluoreszenzintensitäten des GFP (green fluorescent protein, Abbildungsteil (3)).

In Fig. 1 ist ein Flußdiagramm der notwendigen Arbeitsschritte dargestellt. Das in einem Monochromator (T. I. L. L.-Photonics) erzeugte Anregungslicht wurde durch eine schnelle Steuervorrichtung auf verschiedene Wellenlängen eingestellt. Durch die Wahl der Ruheposition des Monochromators bei einer von der Optik nicht transmittierten Wellenlänge von 260 nm diente die schnelle Monochromatorsteuerung gleichzeitig zur Steuerung der Belichtungszeit der CCD-Kamera. Andernfalls muß durch eine gepulste Lichtquelle oder durch einen mechanischen oder elektronischen Verschluß im Strahlengang die Belichtungszeit des Sensors reguliert werden. Das Anregungslicht kann bei Verwendung nicht-monochromer Lichtquellen durch geeignete Bandpassfilter gefiltert werden. Hier können zur Aufzeichnung spektraler Datensätze beispielsweise Filterräder zum Einsatz kommen, die synchron zu dem Verschluß der CCD-Kamera gesteuert werden. Die dichroitischen Spiegel, die bei herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskopen verwendet werden, können ebenfalls zur spektralen Auftrennung gewechselt werden. Hierbei ist jedoch auf einen möglichen Pixelversatz des Bildsignales nach Wechsel der Spiegel und Filtersätze zu achten, der durch die Bauweise der Spiegel und Filter bedingt sein kann. Das Objektiv muß über eine hinreichende Bildebnung und eine geringe chromatische Aberration verfügen. Das im Anwendungsbeispiel angewendete Objektiv ist ein UV-optimierter, lichtstarker Achromat (Fluar 10x/0.50, Carl Zeiss AG), dessen Bildebnung im Meßfeld der verwendeten CCD-Kamera eine hohe Bildschärfe in den verwendeten spektralen Bereichen erzeugte. Das emittierte Licht wurde zur Elimination von Streulicht durch einen Langpassfilter (Transmission bei λ < 510 nm) geleitet, bevor es in den Sensor gelangte. Die verwendete CCD-Kamera zeichnet sich durch einen "grade-0"-Chip ohne Pixeldefekte aus, der zur Verringerung des Dunkelstromes durch Peltier-Elemente auf -20°C gekühlt wird. Bei Verwendung anderer Sensoren muß beachtet werden, daß das Regressionsverfahren auf der Grundlage der Formel (1) nur dann angewendet werden kann, wenn der Sensor in einem linearen Arbeitsbereich betrieben wird. Gegebenenfalls können bei einem bekanntem, nichtlinearen Verhalten des Sensors entsprechende Umrechnungsfaktoren bei der Datenerfassung angewendet werden, um die tatsächliche Signalintensität der Probe zu erfassen und nach dem beschriebenen Verfahren fortzusetzen.

In Fig. 2 sind spektral aufgelöste Datensätze der Anregungswellenlängen von 320 nm bis 490 nm in 1 nm-Schritten von Fura-2, Fura-2-Ca²⁺-Komplex und "green fluorescent protein" (GFP) nach Normierung auf die maximale Fluoreszenzintensität des entsprechenden Fluorochroms abgebildet. Als Reinformen wurden in der Fokusebene folgende Materialien gemessen:

• 1. GFP: In HEK 293-Zellen (humane embryonale Nierenzellen), die rekombinantes modifiziertes GFP exprimieren (48 Stunden nach transienter Transfektion des Plasmids pEGFP-C1, Clontech, Palo-Alto, CA, USA)
• 2. Fura-2: In HEK 293-Zellen, die mit Fura-2-Azetoxymethylester (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) geladen wurden, und mit dem Ca²⁺-Chelator Ethylenglykol-bis-(2- aminoethyl)-tetraessigsäure 2 mM (EGTA; Fluka, Deisenhofen, Deutschland) und dem Ca²⁺-Ionophor Ionomycin 5 µM (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) für 2 h inkubiert wurden.
• 3. Fura-2-Ca²⁺-Komplex: In HEK 293-Zellen, die mit Fura-2-Azetoxymethylester (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) geladen wurden und mit Ca²⁺ 10 mM und dem Ca²⁺-Ionophor Ionomycin 5 µM (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) für 20 min inkubiert wurden.
• 4. Zusätzlich zu Punkt 2 und 3 wurde eine 2 µM Lösung von Fura-2-Kaliumsalz in einer Pufferlösung (pH 7,1) in Anwesenheit von Ca²⁺ bzw. EGTA in der Probenkammer gemessen. Die Daten dieser Messungen ergaben gegenüber den Messungen nach Punkt 2 und Punkt 3 weniger als 1 nm spektrale Verschiebungen und bestätigten dadurch die Effizienz der Äquilibrationsprozedur in HEK 293-Zellen. Da diese normierten Anregungsspektren mit den nach Punkt 2 bzw. Punkt 3 ermittelten Spektren nahezu übereinstimmen, wurden sie aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht in Fig. 2 abgebildet.

Als Probe wurden im selben optischen System HEK 293-Zellen gemessen, die gleichzeitig mit pEGFP-C1 und der cDNA eines Kationenkanals (mTRPC4) im Expressionsvektor pcDNA3.1 (Invitrogen, USA) transient transfiziert wurden. Die Kontrolle der Transfektionseffizienz und die Auswahl der positiv transfizierten Zellen für den Meßvorgang konnte durch die Expression des GFP erfolgen. Der Ca²⁺-Indikator Fura-2 wurde verwendet, da er Mangan (Mn²⁺) unter Ausbildung eines nicht-fluoreszierenden Komplex bindet (Grynkiewicz et al. (1985)). Da der Kationenkanal mTRPC4 neben Ca²⁺ auch Manganionen (Mn²⁺) leitet, kann in Mn²⁺-haltigen Medien die Kanalaktivität durch das Absinken der Fura-2- und Fura-2-Ca²⁺-abhängigen Fluoreszenz verfolgt werden. Hierbei wäre zu erwarten, daß die Fluoreszenz beider Fura-2-Indikatorspezies absinkt, nicht jedoch die Fluoreszenz des GFP. Da große Intensitätsunterschiede der Fluoreszenzen der drei in der Probe vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffspezies im Bereich von 340 nm, 358 nm, 380 nm und 480 nm große Differenzen untereinander aufweisen, wurden diese Anregungswellenlängen für den Meßvorgang ausgewählt. Durch die Wahl der Expositionszeit der CCD-Kamera von 30 ms bei jeder Anregungswellenlänge wurde der dynamische Bereich der CCD-Kamera optimal genutzt, wobei insbesondere darauf geachtet wurde, daß keine Bildpixel die Sättigungsschwelle der CCD-Kamera übersteigen. Die Aufzeichnung eines spektralen Datensatzes erforderte weniger als 200 ms und wurde in 1 s Intervallen wiederholt.

Bildregionen, die einzelnen Zellen entsprechen, wurden selektiert und eine Zeitserie der mittleren Bildpixelwerte über jede der selektierten Bildregionen berechnet. Die entsprechenden Mittelwerte der Bildregionen bei den Wellenlängen 340 nm, 358 nm, 380 nm und 480 nm sind als Funktion der Zeit in den Fig. 3-6 dargestellt. Bei 20 s wurde Mn²⁺ 1 mM zugegeben, um die Kanalaktivität zu verfolgen, nach 90 s wurden die Zellen mit Carbachol 100 µM stimuliert. Durch das beschriebene multivariate, lineare Regressionsverfahren wurden nun die relativen Beträge der einzelnen Fluorochrome, die sich zum jeweiligen Gesamtsignal addieren, für jede Zelle zu den verschiedenen Zeitpunkten ermittelt. Zugrundegelegt wurden hierbei die normierten spektral aufgetrennten Fluoreszenzintensitäten der Reinformen aus Fig. 2. Nach Verrechnung der relativen Fura-2 und Fura-2-Ca²⁺-Konzentrationen gemäß der Formel (4) wurde die resultierende freie zytosolische Ca²⁺-Konzentration in den selektierten Bildarealen (entsprechend mehreren verschiedenen Zellen im Gesichtsfeld) im oberen Abbildungsteil der Fig. 7 ((1) in Fig. 7) als Funktion der Zeit aufgetragen. Die durch das mutivariate, lineare Regressionsverfahren ermittelten Zeitverläufe der Summe der relativen Fura-2 und Fura-2-Ca²⁺ Fluoreszenzen wurden summiert und nach Normierung auf die initialen Fluoreszenzintensitäten im mittleren Abbildungsteil der Fig. 7 ((2) in Fig. 7) dargestellt. Die relative GFP-Konzentration ist im unteren Abbildungsteil der Fig. 7 ((3) in Fig. 7) aufgetragen. Aus Abbildungsteil (2) in Fig. 7 kann man ersehen, daß die Stimulation eines Mn²⁺-Einstromes zu einer rapiden Verringerung der Fura-2- und Fura-2-Ca²⁺-Signale führt. Die durch das genannte Verfahren ermittelte GFP- Fluoreszenz ((3) in Fig. 7) hingegen bleibt nahezu konstant. Weiterhin ist eine Bestimmung der zytosolischen Ca²⁺-Konzentration selbst unter mehreren Störeinflüssen möglich ((1) in Fig. 7). So wurden im Anwendungsbeispiel mehrere Störgrößen eingeführt, die jeweils eine Quantifizierung durch das von Grynkiewicz et al. (1985) beschriebene "Ratio-Verfahren" beeinträchtigen würden:

• - Die Anwesenheit eines dritten Fluorochroms (GFP) verursacht in den Anregungswellenlängen 380 nm, 358 nm und 340 nm unterschiedlich starke Signalintensitäten, die die Fluoreszenzsignale von Fura-2 überlagern.
• - Die deutliche Abnahme der Fura-Fluoreszenzen nach Auslösung eines Mn²⁺-Einstromes in die Zellen führt zu inkonsistenten Ergebnissen nach dem "Ratio-Verfahren".
• - Durch Abnahme der Fura-Fluoreszenzen nimmt die Störgröße der GFP-Fluoreszenz zeitabhängig im Verhältnis zu den Fura-Fluoreszenzen zu.

Da mit dem beschriebenen Verfahren die Fluorochromzusammensetzung ohne die Bildung von "Ratio-Verfahren" ermittelt werden kann, nehmen die Störgrößen keinen Einfluß auf die Quantifizierung der örtlich und zeitlich aufgelösten Fluorochromzusammensetzung. Fluorochrome mit deutlich überlappenden spektralen Eigenschaften können somit erstmals ohne die Verwendung von "Ratio-Verfahren" zuverlässig quantifiziert werden.

Die Schnelligkeit des Berechnungsverfahrens erlaubt es, eine hohe zeitliche und/oder räumliche Auflösung der Meßvorrichtung unvermindert zu nutzen. Durch weitere Entwicklungen in Hard- und Software werden durch online-Berechnungen die im Speicher verbleibenden Datensätze weiter reduziert werden können, da nach dem Berechnungsverfahren die spektral aufgelösten Bilddaten nicht mehr benötigt werden. Eine online-Berechnung der Datensätze würde neben der Speicherplatzreduktion den weiteren Vorteil bieten, daß bereits kalibrierte Daten visualisiert werden können. Der Anwender könnte auf dem Bildschirm beispielsweise simultan und nahezu in Echtzeit die bereits kalibrierte Ca²⁺-Konzentration, den pH-Wert in einer Zelle oder die Lokalisation verschiedener fluoreszierender Proteine und Farbstoffe während eines laufenden Experiments beobachten. In einem Fluoreszenzmikroskop können nach Angabe der in der Probe enthaltenen Fluorochrome durch Echtzeit-Berechnungen verschiedene Fluorochrome in getrennten Bildern oder durch Farbkodierungen kenntlich gemacht nebeneinander oder in übereinandergelagerten Bildern dargestellt werden. Dies ist bei Verwendungen von Fluorochromen, die durch optische Vorrichtungen quantitativ unterscheidbar sind, in der konfokalen Lasermikroskopie und in der mehr-Photonen-Mikroskopie bereits verwirklicht worden. Bei Verwendung von Indikatorfarbstoffen können jedoch lediglich relative Veränderungen beobachtet werden; eine Quantifizierung könnte mit dem beschriebenen Verfahren ermöglicht werden.

Vorrichtungen, die durch ihre Eignung zur Aufzeichnung spektraler Datensätze für die Anwendungen des beschriebenen Verfahrens besonders geeignet erscheinen, sind beschrieben worden. Sie umfassen konfokale und nicht-konfokale Fluoreszenzmikroskope (US 5751417 A, US 5861984 A, US 5864139 A, WO 92/22793 A1), aber auch die Fluoreszenz­ gestützte Durchflußzytometrie (in US 4745285 B1 bereits mit den technischen Vorraussetzungen für eine spektrale Auftrennung der Fluoreszenzemission beschrieben) oder die Fluoreszenz-basierende DNA-Sequenzierung (EP 0294524 A1 und dessen Weiterentwicklungen). Die Kalibration der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- Mikroskopie (z. B. WO 98/55026 A1) kann ebenfalls durch das beschriebene Verfahren bedeutend erleichtert werden. Die Fluoreszenzen des "green fluorescent protein" (GFP) und seiner Varianten (US 5777079 A, WO 98/21355 A1, EP 0851874 A1, US 5741668 A, WO 97/42320 A1, WO 97/26333 A1, US 5625048 A, WO 97/11094 A1, WO 96/23810 A1, WO 95/21191 A1) können mit dem beschriebenen spektroskopischen Quantifizierungsverfahren trotz überlappender spektraler Eigenschaften effektiv voneinander separiert werden. Dies ermöglicht erstmals die simultane Bestimmung multipler Expressionsmarker in vitalen Zellen. Durch die Expression von Fusionsproteinen mit den genannten GFP-Varianten können verschiedene zelluläre Proteine simultan in lebenden Zellen beobachtet werden. Kolokalisationsstudien mit Hilfe der Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer-Methode (FRET) können mit dem hier vorgestellten Verfahren durch die exakte Quantifizierung der Einzelfluoreszenzen mit bedeutend größerem Auflösungsvermögen durchgeführt werden.

Claims (6)

1. Verfahren zur Quantifizierung mehrerer Fluorochrome in einer mehrfach gefärbten Probe bei der Fluoreszenzmikroskopie mit folgenden Schritten:

• - Aufzeichnung und Speicherung der Fluoreszenzintensitäten der Fluorochrome in Reinform bei verschiedenen Anregungs und/oder Emissionswellenlängen und für verschiedene Bildfeldbereiche,
• - Aufzeichnung und Speicherung der Fluoreszenzintensitäten der mehrfach gefärbten Probe bei verschiedenen Anregungs und/oder Emissionswellenlängen und für verschiedene Bildfeldbereiche,
• - Aufzeichnung und Speicherung der Hintergrundsignale ohne Fluorochrome,
• - Subtraktion der Hintergrundsignale von den gemessenen spektral aufgelösten Datensätzen der Probe zum Erhalt der Hintergrundsignal-korrigierten Fluoreszenzintensitäten der Probe,
• - Berechnung der relativen Beiträge der einzelnen Fluorochrome in Reinform zu den Hintergrundsignal-korrigierten Fluoreszenzintensitäten der Probe durch multivariate lineare Regressionsanalyse, wobei die Fluoreszenzintensitäten der Reinformen an den der Aufzeichnung der Fluoreszenzintensitäten der Probe entsprechenden Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen sowie Bildfeldbereichen zum Aufbau der Regressionsmatrix genutzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein nichtlineares Regressionsverfahren zur Berechnung der Beiträge der Reinformen zu den Hintergrundsignal-korrigierten Fluoreszenzintensitäten der Probe eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Quantifizierung von Milieubedingungen mindestens ein Fluoreszenzindikator eingesetzt wird, dessen milieuabhängig veränderliche Formen als verschiedene Reinformen von Fluorochromen behandelt werden können.

4. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-3 zur Bestimmung der Ca²⁺- Ionenkonzentration mittels Fura-2.

5. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-3 zur simultanen Erfassung spektraler Varianten des grün fluoreszierenden Proteins.

6. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-3 bei der Durchflußzytometrie oder der Fluoreszenz-unterstützten Zellsortierung.