DE102017221187B4

DE102017221187B4 - Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von verschiedenen, in einem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern und Mikroskopiesystem

Info

Publication number: DE102017221187B4
Application number: DE102017221187.3A
Authority: DE
Inventors: Alois Regensburger; Enrico Geissler; Susanne Kohlhammer; Marco Wilzbach; Christoph Nieten; Frank Keib
Original assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Current assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2020-08-13
Anticipated expiration: 2037-11-28
Also published as: DE102017221187A1

Abstract

Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von verschiedenen, in einem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern, wobei das Verfahren umfasst:Richten von Beleuchtungslicht auf ein Objekt (13), welches mehrere verschiedene Fluoreszenzemitter enthält, wobei das Beleuchtungslicht während verschiedenen Zeitabschnitten (Z1, Z2, Z3) verschiedene Beleuchtungslichtspektren (61, 63) aufweist,wobei das Beleuchtungslicht während wenigstens eines der Zeitabschnitte (Z1) ein Beleuchtungslichtspektrum (61) aufweist, das dazu geeignet ist, die Fluoreszenzemitter gleichzeitig effizient anzuregen;während jedes Zeitabschnitts (Z1, Z2, Z3) Detektieren eines Intensitätswerts von von dem Objekt (13) ausgehendem Licht;Berechnen der Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt (13) basierend auf den verschiedenen Beleuchtungslichtspektren (61, 63), den spektralen Emissionsverhalten der Fluoreszenzemitter und den während der Zeitabschnitte (Z1, Z2, Z3) detektierten Intensitätswerten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von verschiedenen, in einem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern sowie ein Mikroskopiesystem zur Durchführung des Verfahrens.
Fluoreszenzfarbstoffe werden in medizinischen Verfahren beispielsweise zur Hervorhebung bestimmter Gewebebereiche eingesetzt. Die Fluoreszenzfarbstoffe reichern sich in diesen bestimmten Gewebebereichen, beispielsweise Tumorzellen, an. Nach Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe emittieren diese Fluoreszenzlicht, welches räumlich aufgelöst detektiert werden kann und damit den räumlichen Bereich sichtbar macht, in welchem sich das bestimmte Gewebe befindet.
Das zu identifizierende Gewebe (zum Beispiel Tumorzellen) befindet sich dabei üblicherweise innerhalb eines größeren Gewebebereichs, welcher auch gesundes Gewebe enthält. Das zu identifizierende Gewebe wie auch das restliche Gewebe enthalten üblicherweise autofluoreszierende Stoffe. Ein Bestandteil ist autofluoreszierend, wenn er nach Anregung durch Beleuchtungslicht Fluoreszenzlicht emittiert, wobei die Fluoreszenz nicht auf einem dem Gewebe hinzugefügten Fluoreszenzfarbstoff basiert. In der vorliegenden Anmeldung werden daher autofluoreszierende Stoffe und Fluoreszenzfarbstoffe unterschieden und gemeinsam als Fluoreszenzemitter bezeichnet.
Da sich in dem zu untersuchenden Gewebe üblicherweise sowohl autofluoreszierende Stoffe als auch Fluoreszenzfarbstoffe befinden, tritt üblicherweise der Effekt auf, dass bei Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs auch autofluoreszierende Stoffe angeregt werden. Das von dem Gewebe infolge der Anregung emittierte Fluoreszenzlicht besteht daher teilweise aus Fluoreszenzlicht, welches von autofluoreszierenden Stoffen erzeugt wird, und Fluoreszenzlicht, welches von dem Fluoreszenzfarbstoff erzeugt wird. Da sich im allgemeinen Fall die Emissionsspektren von autofluoreszierenden Stoffen und Fluoreszenzfarbstoffen spektral überschneiden, setzt sich das von dem Gewebe emittierte Fluoreszenzlicht sowohl aus Fluoreszenzlicht der autofluoreszierenden Stoffe wie auch aus Fluoreszenzlicht des Fluoreszenzfarbstoffs zusammen.
Zur Identifizierung des zu identifizierenden Gewebes (zum Beispiel Tumorzellen) ist es daher vorteilhaft, das von dem Fluoreszenzfarbstoff emittierte Fluoreszenzlicht von dem von den autofluoreszierenden Stoffen erzeugte Fluoreszenzlicht zu trennen, da lediglich das von dem Fluoreszenzfarbstoff emittierte Fluoreszenzlicht denjenigen räumlichen Bereich angibt, in welchem sich das zu identifizierende Gewebe befindet.
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F. Koberling et al., „Two channel fluorescence lifetime microscope with two colour laser excitation, single molecule sensitivity and sub-micrometer resolution", in Proc. SPIE Biomedical Optics, Vol. 5143, 2003, Seiten 181 bis 192, und T. Niehörster et al., „Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy", in Nature Meth., advance online publication, 2016, DOI: 10.1038/NMETH.3740 betreffen Verfahren und Vorrichtungen zur Untersuchung von Fluoreszenz an einzelnen Molekülen.
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US 9 521 947 B2 und US 2011 / 0 238 325 A1 betreffen jeweils Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung der Konzentrationen von Fluoreszenzfarbstoffen in einem Objekt.
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EP 2 383 554 B1 offenbart ein Verfahren zur Korrektur der Fluoreszenzintensität.
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Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Konzentrationen von verschiedenen, in einem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern zu bestimmen.
Diese Aufgabe wird durch ein erfindungsgemäßes Verfahren gelöst, wobei das Verfahren umfasst: Richten von Beleuchtungslicht auf ein Objekt, welches mehrere verschiedene Fluoreszenzemitter enthält, wobei das Beleuchtungslicht während verschiedenen Zeitabschnitten verschiedene Beleuchtungslichtspektren aufweist, wobei das Beleuchtungslicht während wenigstens eines der Zeitabschnitte ein Beleuchtungslichtspektrum aufweist, das dazu geeignet ist, die Fluoreszenzemitter gleichzeitig effizient anzuregen; während jedes Zeitabschnitts Detektieren eines Intensitätswerts von von dem Objekt ausgehendem Licht; Berechnen der Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt basierend auf den verschiedenen Beleuchtungslichtspektren, den spektralen Emissionsverhalten der Fluoreszenzemitter und den während der Zeitabschnitte detektierten Intensitätswerten.
In dem zu untersuchenden Objekt sind mehrere verschiedene Fluoreszenzemitter enthalten. Die Fluoreszenzemitter können autofluoreszierende Stoffe oder Fluoreszenzfarbstoffe, die dem Objekt vor dessen Analyse hinzugefügt werden, sein. Insbesondere können sich die Anregungsspektren der Fluoreszenzemitter spektral überlappen. Das heißt, es existiert ein Wellenlängenbereich, in welchem die verschiedenen Fluoreszenzemitter effizient angeregt werden können. Insbesondere können die verschiedenen Fluoreszenzemitter Emissionsspektren aufweisen, die sich spektral überlappen. Das heißt, es existiert ein Wellenlängenbereich, in welchem die verschiedenen Fluoreszenzemitter Fluoreszenzlicht emittieren.
Das Objekt wird zeitlich nacheinander mit Beleuchtungslicht verschiedener Beleuchtungslichtspektren belichtet. Beispielsweise wird in einem ersten Zeitabschnitt Beleuchtungslicht mit einem ersten Beleuchtungslichtspektrum auf das Objekt gerichtet und in einem zweiten Zeitabschnitt wird Beleuchtungslicht mit einem zweiten Beleuchtungslichtspektrum auf das Objekt gerichtet, wobei sich das erste Beleuchtungslichtspektrum und das zweite Beleuchtungslichtspektrum voneinander unterscheiden.
Während wenigstens eines der Zeitabschnitte, in denen Beleuchtungslicht auf das Objekt gerichtet wird, beispielsweise während des ersten Zeitabschnitts, weist das Beleuchtungslicht ein Beleuchtungslichtspektrum auf, welches dazu geeignet ist, die verschiedenen in dem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemitter gleichzeitig und effizient anzuregen. Das bedeutet, dass das Beleuchtungslichtspektrum so gestaltet ist, dass es innerhalb derjenigen Wellenlängenbereiche, in denen die Anregungsspektren der verschiedenen Fluoreszenzemitter jeweils eine signifikante Absorption aufweisen, oder innerhalb wenigstens eines Teilbereichs dieser Wellenlängenbereiche gleichzeitig eine signifikante Intensität aufweist.
Ein Fluoreszenzemitter weist beispielsweise in Wellenlängenbereichen eine signifikante Absorption auf, in denen der Wert der Absorption wenigstens 1 % des maximalen Absorptionswerts des Fluoreszenzemitters, bevorzugt wenigstens 10 % des maximalen Absorptionswerts des Fluoreszenzemitters beträgt. Da für das vorliegende Verfahren der Wellenlängenbereich sichtbaren Lichts, insbesondere der Wellenlängenbereich zwischen 380 nm und 800 nm, von besonderem Interesse ist, können sich diese und andere Definitionen auf den Wellenlängenbereich zwischen 380 nm und 800 nm beschränken. So weist beispielsweise ein Fluoreszenzemitter in denjenigen Wellenlängenbereichen eine signifikante Absorption auf, in denen der Wert der Absorption wenigstens 1 % des maximalen Absorptionswerts zwischen 380 nm und 800 nm des Fluoreszenzemitters, bevorzugt wenigstens 10 % des maximalen Absorptionswerts des Fluoreszenzemitters zwischen 380 nm und 800 nm beträgt.
Hierdurch werden die verschiedenen Fluoreszenzemitter gleichzeitig zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Während dieses Zeitabschnitts, in welchem die Fluoreszenzemitter gleichzeitig angeregt werden, setzt sich das von dem Objekt emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Fluoreszenzlicht der verschiedenen Fluoreszenzemitter zusammen. Die verschiedenen Fluoreszenzemitter können dabei im selben Wellenlängenbereich emittieren, sodass sich das Fluoreszenzlicht dieses Wellenlängenbereichs aus dem Fluoreszenzlicht der verschiedenen Fluoreszenzemitter zusammensetzt. D. h. es können Wellenlängenbereiche existieren, in denen mehrere Fluoreszenzemitter emittieren
Während jedes Zeitabschnitts, das heißt während jedes Richtens von Beleuchtungslicht mit verschiedenen Beleuchtungslichtspektren auf das Objekt, wird ein Intensitätswert von Licht detektiert, welches von dem Objekt ausgeht. Das von dem Objekt ausgehende Licht setzt sich dabei aus dem reflektierten Beleuchtungslicht und dem Fluoreszenzlicht der verschiedenen Fluoreszenzemitter zusammen. Zur Verbesserung des Verfahrens kann das reflektierte Beleuchtungslicht unterdrückt werden, das heißt während des Detektierens können diejenigen Spektralbereiche des von dem Objekt ausgehenden Lichts unterdrückt werden, die im Beleuchtungslichtspektrum, das gerade auf das Objekt gerichtet wird, enthalten sind. Beispielsweise wird das reflektierte Beleuchtungslicht um wenigstens um einen Faktor von 10, bevorzugt wenigstens um einen Faktor 100, weiter bevorzugt wenigstens um einen Faktor 1000 oder 10000 unterdrückt. Die Unterdrückung des reflektierten Beleuchtungslichts kann beispielsweise mithilfe eines Filters durchgeführt werden. Ein Verhältnis des mittleren Transmissionsgrads eines Durchlassbereichs zu einem Sperrbereich beträgt demgemäß wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 100, weiter bevorzugt wenigstens 1000 oder 10000.
Mit anderen Worten wird während des ersten Zeitabschnitts ein erster Intensitätswert von von dem Objekt ausgehendem Licht detektiert und während des zweiten Zeitabschnitts wird ein zweiter Intensitätswert von von dem Objekt ausgehendem Licht detektiert. Während also das Objekt mit verschiedenen Beleuchtungslichtspektren belichtet wird, werden mehrere Intensitätswerte von von dem Objekt ausgehendem Licht detektiert.
Das Detektieren der Intensität des von dem Objekt ausgehenden Lichts kann ortsaufgelöst durchgeführt werden, beispielsweise mittels eines ortsauflösenden Lichtdetektors. Ein solcher ortsauflösender Lichtdetektor kann beispielsweise eine Vielzahl von Pixeln umfassen, welche jeweils eine Signal ausgeben, welches die Intensität des (während einer vordefinierten, einstellbaren Zeitdauer) auf das jeweilige Pixel treffenden Lichts repräsentiert.
Nach dem Detektieren der Intensitätswerte, wobei wenigstens ein Intensitätswert während jedes Richtens von Beleuchtungslicht mit verschiedenen Beleuchtungslichtspektren auf das Objekt detektiert wird, werden diese Intensitätswerte zur Berechnung der Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt verwendet. Um die Konzentrationen der verschiedenen Fluoreszenzemitter in dem Objekt berechnen zu können, werden ferner die verschiedenen Beleuchtungslichtspektren sowie die spektralen Emissionsverhalten der Fluoreszenzemitter berücksichtigt.
Hierzu können die verschiedenen Beleuchtungslichtspektren gemessen werden, indem beispielsweise ein Teil des Beleuchtungslichts anstelle auf das Objekt auf einen Detektor geführt wird, mit dessen Hilfe das Beleuchtungslichtspektrum gemessen werden kann. Alternativ kann das Beleuchtungslichtspektrum aus Betriebsparametern einer zur Erzeugung des Beleuchtungslichts verwendeten Beleuchtungsvorrichtung bestimmt werden.
Das spektrale Emissionsverhalten der einzelnen Fluoreszenzemitter gibt an, mit welcher Effizienz Anregungslicht mit einer Wellenlänge λ' von einem Fluoreszenzemitter in Emissionslicht mit der Wellenlänge λ umgesetzt wird. Das spektrale Emissionsverhalten eines jeden der verschiedenen Fluoreszenzemitter kann beispielsweise in einem Speicher eines zur Durchführung des Verfahrens vorgesehenen Systems gespeichert sein. Die spektralen Emissionsverhalten gebräuchlicher Fluoreszenzfarbstoffe sowie die spektralen Emissionsverhalten autofluoreszierender Stoffe sind allgemein bekannt und werden durch andere Verfahren bestimmt. Beispielsweise wird das Emissionsverhalten der verschiedenen Fluoreszenzemitter mittels geeigneter Kalibrationsobjekte direkt mit dem zur Durchführung des Verfahrens vorgesehenen Systems vorab gemessen. Somit fließt in die Berechnung der Konzentrationen der verschiedenen Fluoreszenzemitter in dem Objekt die Kenntnis über das spektrale Emissionsverhalten eines jeden einzelnen der Fluoreszenzemitter ein.
Bevorzugt basiert die Berechnung der Konzentrationen der Fluoreszenzemitter ferner auf einer spektralen Übertragungsfunktion zwischen dem Objekt und einer Detektionsfläche, an welcher das Detektieren der Intensitätswerte durchgeführt wird.
Beispielsweise repräsentiert die spektrale Übertragungsfunktion die Funktionsweise des zur Durchführung des Verfahrens verwendeten Systems zwischen dem Objekt bzw. einem Objektbereich und einer Detektionsfläche eines Detektors des Systems. Die spektrale Übertragungsfunktion repräsentiert daher beispielsweise die Wirkung eines zur Unterdrückung des reflektierten Beleuchtungslichts vorgesehenen Filters, die Übertragungsfunktion der zur Abbildung des Objekts beziehungsweise Objektbereichs auf die Detektionsfläche vorgesehenen Optik des Systems sowie die Umwandlungseffizienz des zur Detektion verwendeten Detektors des Systems. Sofern der Detektor des Systems mehrere Pixel umfasst, kann eine separate Übertragungsfunktion für jedes einzelne Pixel verwendet werden, um die Unterschiede in der Umwandlungseffizienz der einzelnen Pixel sowie eine ortsaufgelöste Übertragungsfunktion der Optik des Systems zu berücksichtigen.
Bevorzugt weist das Beleuchtungslicht während wenigstens eines Zeitabschnitts (z. B. während des zweiten Zeitabschnitts) ein Beleuchtungslichtspektrum auf, welches dazu geeignet ist, genau einen der mehreren Fluoreszenzemitter effizient anzuregen. Hierbei besteht das von dem Objekt emittierte Fluoreszenzlicht im Wesentlichen ausschließlich aus Fluoreszenzlicht eines einzigen der mehreren Fluoreszenzemitter in dem Objekt. Auf diese Weise kann die Konzentration dieses einen Fluoreszenzemitters einfach und genau bestimmt werden, was darüber hinaus die Berechnung der Konzentrationen der anderen Fluoreszenzemitter vereinfacht.
Der Umstand, dass genau einer der mehreren Fluoreszenzemitter effizient angeregt wird, kann beispielsweise beschrieben werden durch: $\int A b s^{i} (λ) \cdot E x (λ) d λ \geq K \cdot \int A b s^{j} (λ) \cdot E x (λ) d λ,$
wobei

Ex(λ): das Beleuchtungslichtspektrum,
Absⁱ (λ): das Absorptionsspektrum eines der Fluoreszenzemitter,
Abs^j (λ): das Absorptionsspektrum der anderen Fluoreszenzemitter,
A: die Wellenlänge und
K: einen Grenzwert repräsentiert,

Die beiden Integrale werden über die Wellenlänge A integriert, wobei die Grenzen der Integrale gleich und so gewählt sind, dass der Wellenlängenbereich, in welchem das Beleuchtungslichtspektrum Ex einen signifikanten Wert aufweist, umfasst ist. Alternativ können die Grenzen des Integrals so gewählt sein, dass der sichtbare und infrarote Wellenlängenbereich umfasst ist. Beispielsweise können die Grenzen der Integrale 350 nm und 850 nm betragen. Bevorzugt weist der Grenzwert K bevorzugt wenigstens den Wert 3, weiter bevorzugt wenigstens den Wert 10, noch weiter bevorzugt wenigstens den Wert 100 oder wenigstens den Wert 1000 auf.
Alternativ zu der obigen Definition kann die effiziente Anregung eines einzigen Fluoreszenzemitters beschrieben werden als: ${max}_{λ} [A b s^{i} (λ) \cdot E x (λ)] \geq K \cdot {max}_{λ} [A b s^{j} (λ) \cdot E x (λ)],$
wobei max_λ den Maximalwert innerhalb seine wellenlängenabhängigen Arguments repräsentiert.
In verschiedenen Zeitabschnitten sind die Beleuchtungslichtspektren verschieden. Beleuchtungslichtspektren sind voneinander verschieden, wenn sie linear unabhängig sind. Im Allgemeinen sind zwei Spektren X (λ) und Y (λ) voneinander unabhängig, wenn kein Skalar k existiert, welches die Gleichung X (λ) = k·Y (λ) erfüllt.
Bevorzugt überlappen sich die Beleuchtungslichtspektren spektral höchstens teilweise. Insbesondere überlappen die Beleuchtungslichtspektren spektral nicht. Beispielsweise können die Beleuchtungslichtspektren während des ersten und zweiten Zeitabschnitts (und gegebenenfalls weiteren Zeitabschnitten) so erzeugt werden, dass das erste Beleuchtungslichtspektrum in einem ersten Wellenlängenbereich eine signifikante Intensität und außerhalb des ersten Wellenlängenbereichs eine geringe Intensität aufweist und dass das zweite Beleuchtungslichtspektrum innerhalb eines zweiten Wellenlängenbereichs eine signifikante Intensität aufweist und außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs eine geringe Intensität aufweist, wobei der erste und zweite Wellenlängenbereich spektral höchstens teilweise, insbesondere nicht überlappen. Ein signifikante Intensität und eine geringe Intensität haben zueinander beispielsweise ein Verhältnis von wenigstens 10, 100 oder 1000.
Bevorzugt wird das Beleuchtungslicht während wenigstens eines der Zeitabschnitte (zum Beispiel während des ersten und/oder zweiten Zeitabschnitts; oder einigen oder allen Zeitabschnitten des später definierten Zyklus oder einer Kalibrationsphase außerhalb des Zyklus) auf einen Bereich des Objekts gerichtet, in welchem die Konzentration von wenigstens einem der Fluoreszenzemitter in dem Objekt bekannt ist. Beispielsweise wird das Beleuchtungslicht auf einen Bereich des Objekts gerichtet, über den bekannt ist, dass darin keine Tumorzellen enthalten sind. Die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs, der sich ausschließlich in Tumorzellen anreichert, beträgt in diesem Bereich des Objekts im Wesentlichen null. Auf diese Weise kann die Berechnungsvorschrift, mit welcher basierend auf den verschiedenen Beleuchtungslichtspektren, den spektralen Emissionsverhalten der Fluoreszenzemitter und den während der Zeitabschnitte detektierten Intensitätswerten die Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt berechnet werden, überprüft und verbessert werden. Alternativ kann die Konzentration der anderen Fluoreszenzemitter einfacher berechnet werden.
Beispielsweise kann Beleuchtungslicht auf einen Bereich des Objekts, in welchem die Konzentration von wenigstens einem der Fluoreszenzemitter in dem Objekt bekannt ist, und zudem auf einen Bereich des Objekts, in welchem die Konzentration von wenigstens einem der Fluoreszenzemitter in dem Objekt unbekannt und damit zu bestimmen ist, gerichtet werden. Wird hierbei die Intensität ortsaufgelöst detektiert, so kann die Berechnungsvorschrift mittels der Intensitätswerte, die für Bereiche des Objekts mit bekannter Konzentration bestimmter Fluoreszenzemitter detektiert wurden, für die Bereiche des Objekts verbessert werden, in denen die Konzentrationen nicht bekannt sind.
Bevorzugt wird während wenigstens eines der Zeitabschnitte (beispielsweise während eines dritten Zeitabschnitts) kein Beleuchtungslicht auf das Objekt gerichtet und die während dieses Zeitabschnitts detektierte Intensität wird zur Korrektur derjenigen Intensitätswerte verwendet, die während der anderen Zeitabschnitte (zum Beispiel während des ersten bis zweiten Zeitabschnitts) detektiert werden/wurden. Wenn kein Beleuchtungslicht auf das Objekt gerichtet wird, wird das Objekt lediglich durch Umgebungslicht belichtet, welches beispielsweise durch Tageslicht oder die Beleuchtung eines Raumes, in welchem das Verfahren durchgeführt wird, entsteht. Um den Fehler, der durch das Umgebungslicht in den detektierten Intensitätswerten enthalten ist, zu kompensieren, werden Intensitätswerte aufgenommen, welche das von dem Objekt infolge der Beleuchtung mit Umgebungslicht ausgehende (Fluoreszenz-)Licht repräsentiert. Die auf diese Weise detektierten Intensitätswerte werden zu Korrektur der während der anderen Zeitabschnitte detektierten Intensitätswerte verwendet. Hierdurch wird die Genauigkeit der Bestimmung der Konzentrationen verbessert.
Bevorzugt wird während wenigstens eines der Zeitabschnitte (zum Beispiel während eines vierten Zeitabschnitts) Beleuchtungslicht mit einem im wesentlichen weißen Beleuchtungslichtspektrum (zum Beispiel von 400 nm bis 700 nm) auf das Objekt gerichtet und ein Farbbild des Objekts aufgenommen. Alternativ zu einer breitbandigen Beleuchtung kann auch Beleuchtungslicht mit einem Beleuchtungslichtspektrum verwendet werden, welches signifikante Intensitäten in mehreren diskreten spektral nicht überlappenden Wellenlängenbereichen aufweist. Zur Aufnahme des Farbbilds kann das zur Durchführung des Verfahrens eingerichtete System einen Farbbilddetektor aufweisen.
Das aufgenommene Farbbild und die berechneten Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt können gemeinsam oder einzeln dargestellt werden. Zur Darstellung des Farbbilds, einer ortsaufgelösten Verteilung der Konzentrationen der Fluoreszenzfarbstoffe oder daraus abgeleiteter/berechneter Bilder kann das zur Durchführung des Verfahrens geeignete System eine Steuerung und eine Anzeigevorrichtung umfassen.
Zur Erzeugung der verschiedenen Beleuchtungslichtspektren während der verschiedenen Zeitabschnitte kann das zur Durchführung des Verfahrens geeignete System beispielsweise eine Lichtquelle und mehrere Filter umfassen, wobei die Filter nacheinander oder gleichzeitig in einen Strahlengang zwischen dem Objekt und der Lichtquelle eingeführt und ausgeführt werden können. Alternativ kann das zur Durchführung des Verfahrens geeignete System mehrere Lichtquellen umfassen, die unterschiedliche Beleuchtungslichtspektren erzeugen (beispielsweise mithilfe von Filtern) und Beleuchtungslicht nacheinander und/oder teilweise gleichzeitig auf das Objekt richten. Das heißt, zwei oder mehr Lichtquellen, die unterschiedliche Beleuchtungslichtspektren erzeugen können, richten das von den jeweiligen Lichtquellen erzeugte Beleuchtungslicht zeitlich nacheinander auf das Objekt und/oder teilweise gleichzeitig auf das Objekt.
Einige oder alle der Zeitabschnitte können einen Zyklus bilden, der wiederholt durchgeführt wird. In einem Zyklus können bestimmte Zeitabschnitte auch mit unterschiedlicher Häufigkeit auftreten. Das heißt, während eines Zyklus können der erste, zweite dritte und vierte Zeitabschnitt und die in Verbindung damit beschriebenen Verfahrensschritte jeweils einmal oder mehrmals auftreten bzw. durchgeführt werden.
Ein Vorteil des vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass das zur Durchführung des Verfahrens geeignete System einfach konfiguriert sein kann. Insbesondere ist zu Durchführung des Verfahrens lediglich ein einziger monochromatischer Detektor erforderlich. Trotz dieser einfachen Konfiguration können die Konzentrationen von verschiedenen in dem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern berechnet werden.
Ein zur Durchführung des vorangehend beschriebenen Verfahrens geeignetes Mikroskopiesystem umfasst beispielsweise eine Beleuchtungsvorrichtung, welche dazu konfiguriert ist, Beleuchtungslicht mit verschiedenen Beleuchtungslichtspektren (zeitlich nacheinander und/oder wenigstens teilweise gleichzeitig) zu erzeugen und das Beleuchtungslicht auf einen Objektbereich zu richten, einen Lichtdetektor, insbesondere einen Bilddetektor, eine Mikroskopieoptik, welche dazu konfiguriert ist, den Objektbereich auf eine Detektionsfläche des Lichtdetektors abzubilden; und eine Steuerung, welche dazu konfiguriert ist, die Beleuchtungsvorrichtung zu steuern und Detektionssignale von dem Lichtdetektor zu empfangen, wobei die Steuerung ferner dazu konfiguriert ist, das vorangehend beschriebene Verfahren durchzuführen.
Wie vorangehend beschrieben, ist zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein monochromatischer (Bild-)Detektor ausreichend. Ein solcher Bilddetektor ist dazu konfiguriert, ein Signal auszugeben, welches das auf die Detektionsfilter des Detektors treffende Intensität von Licht eines Wellenlängenbereichs repräsentiert, wobei der Wellenlängenbereich wenigstens 150 nm, insbesondere wenigstens 300 nm breit ist und/oder wobei der Wellenlängenbereich einen Bereich von 600 nm bis 750 nm umfasst.
Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend anhand von Figuren näher erläutert. Hierbei zeigt:

1 ein erfindungsgemäßes Mikroskopiesystem;
2 die spektrale Konfiguration von Beleuchtungslicht, einem Beobachtungsfilter des in 1 gezeigten Mikroskopiesystems sowie die Anregungsspektren und Emissionsspektren verschiedener Fluoreszenzemitter; und
3 zeigt einen Zyklus von Zeitabschnitten.

1 zeigt ein Mikroskopiesystem 1, welches dazu konfiguriert ist, das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von verschiedenen, in einem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern durchzuführen.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst eine Beleuchtungsvorrichtung 3. Die Beleuchtungsvorrichtung 3 umfasst eine Lichtquelle 5, eine Beleuchtungsoptik 7 und einen Filtersatz 8. Der Filtersatz 8 umfasst im vorliegenden Beispiel zwei optische Filter 9 und 9', welche wahlweise in einem von der Beleuchtungsoptik 7 gebildeten Strahlengang 10 angeordnet werden können. Dies wird durch einen Doppelpfeil in 1 dargestellt. Mit dem Strahlengang 10 richtet die Beleuchtungsvorrichtung 3 Beleuchtungslicht auf einen Objektbereich 11. Mittels der optischen Filter 9 und 9' erzeugt die Beleuchtungsvorrichtung 3 verschiedene Beleuchtungslichtspektren.
Die optischen Filter 9 und 9' des Filtersatzes 8 können beispielsweise in einem Filterrad angeordnet sein. Das Filterrad und die Lichtquelle 5 werden von einer Steuerung 12 so gesteuert, dass die Beleuchtungsvorrichtung 3 zeitlich nacheinander Beleuchtungslicht mit verschiedenen Beleuchtungslichtspektren auf den Objektbereich 11 richtet.
In dem Objektbereich 11 ist ein Objekt 13 angeordnet, welches mehrere verschiedene Fluoreszenzemitter enthält. Beispielsweise kann in dem Objekt 13 ein autofluoreszierender Stoff und ein Fluoreszenzfarbstoff enthalten sein, wobei der Fluoreszenzfarbstoff bestimmte räumliche Bereiche des Objekts 13 (z. B. Tumorzellen) markiert.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst ferner eine Mikroskopieoptik 15, welche im vorliegenden Beispiel ein Objektiv 17 und weitere Linsen 19 und 21 umfasst. Die Mikroskopieoptik 15 ist dazu konfiguriert, den Objektbereich 11, insbesondere eine Objektebene 23 auf eine Detektionsfläche 25 eines Lichtdetektors 27 des Mikroskopiesystems 1 abzubilden. Der Lichtdetektor 27 kann beispielsweise ein monochromatischer Bildsensor oder ein Farbbildsensor sein. Der Lichtdetektor 27 gibt ein Signal 29 aus, welches die Intensität des auf die Detektionsfläche 25 treffenden Lichts repräsentiert. Der Lichtdetektor 27 ist mit der Steuerung 12 verbunden und die Steuerung 12 empfängt von dem Lichtdetektor 27 das von diesem ausgegebene Signal 29. In dem von der Mikroskopieoptik 15 bereitgestellten Strahlengang 31, welcher die Objektebene 23 auf die Detektionsfläche 25 abbildet, kann ein Detektionsfilter 33 angeordnet sein. Ferner kann ein Aktor (nicht gezeigt) vorgesehen sein, welcher das Detektionsfilter 33 in den Strahlengang 31 einführen kann und das Detektionsfilter 33 aus dem Strahlengang 31 heraus führen kann. Dies wird durch einen Doppelpfeil in 1 dargestellt. Es können mehrere Detektionsfilter vorgesehen sein, welche in einem Filterrad angeordnet sind. Der Aktor bzw. das Filterrad werden von der Steuerung 12 gesteuert (nicht gezeigt).
Zur Erläuterung eines Verfahrens zur Bestimmung der Konzentrationen der verschiedenen, in dem Objekt 13 enthaltenen Fluoreszenzemitter wird beispielhaft angenommen, dass das Objekt 13 einen autofluoreszierenden Stoff sowie einen Fluoreszenzfarbstoff enthält. Die Anregungs- und Emissionsspektren dieser Fluoreszenzemitter sind beispielhaft in 2 dargestellt.
Die Kurve 41 repräsentiert das Absorptionsspektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs, im vorliegenden Beispiel das Absorptionsspektrum von Protoporphyrin IX. Das Absorptionsspektrum 41 weist im Wellenlängenbereich von 400 nm bis etwa 445 nm einen hohen Absorptionswert und im Wellenlängenbereich von 445 nm bis 500 nm einen geringen Absorptionswert auf. Ein hoher Absorptionswert beträgt beispielsweise wenigstens 10 % des maximalen Absorptionswerts des Absorptionsspektrums eines Fluoreszenzemitters. Ein geringer Absorptionswert beträgt beispielsweise höchsten 10 % des maximalen Absorptionswerts des Absorptionsspektrums eines Fluoreszenzemitters.
Die Kurve 51 repräsentiert das Emissionsspektrum des Fluoreszenzfarbstoffs Protoporphyrin IX. Das Emissionsspektrum weist bei 635 nm und 705 nm jeweils ein Maximum auf. Das Emissionsspektrum 51 weist im Wellenlängenbereich zwischen 620 nm und 720 nm einen hohen Emissionswert auf. Außerhalb dieses Wellenlängenbereichs weist das Emissionsspektrum 51 einen geringen Emissionswert auf. Ein hoher Emissionswert beträgt beispielsweise wenigstens 10 % des maximalen Emissionswerts des Emissionsspektrums eines Fluoreszenzemitters. Ein geringer Emissionswert beträgt beispielsweise höchsten 10 % des maximalen Emissionswerts des Emissionsspektrums eines Fluoreszenzemitters.
Die Kurve 43 repräsentiert das Absorptionsspektrum des autofluoreszierenden Stoffs. Im Wellenlängenbereich zwischen 400 nm und etwa 500 nm weist das Absorptionsspektrum 43 einen hohen Absorptionswert auf (gemessen in Bezug auf das Absorptionsspektrum 41). Im Wellenlängenbereich oberhalb von 500 nm weist das Absorptionsspektrum 43 einen geringen Absorptionswert auf (gemessen in Bezug auf das Absorptionsspektrum 41).
Die Kurve 53 repräsentiert das Emissionsspektrum des autofluoreszierenden Stoffes. Das Emissionsspektrum weist im Wellenlängenbereich von 550 nm bis etwa 830 nm einen hohen Emissionswert auf und weist im Wellenlängenbereich oberhalb von 800 nm einen geringen Emissionswert auf (gemessen in Bezug auf das Emissionsspektrum 51).
Sowohl das Absorptionsspektrum 41 wie auch das Absorptionsspektrum 43 weisen im Wellenlängenbereich von 400 nm bis etwa 445 nm einen hohen Absorptionswert auf. Wird das Objekt 13 mit Beleuchtungslicht dieses Wellenlängenbereichs belichtet, wird daher sowohl der Fluoreszenzfarbstoff als auch der autofluoreszierende Stoff zur Fluoreszenz angeregt. Im Wellenlängenbereich von etwa 445 nm bis 500 nm weist lediglich das Absorptionsspektrum 43 des autofluoreszierenden Stoffes einen hohen Absorptionswert auf, der Absorptionswert des Fluoreszenzfarbstoffs (Kurve 41) ist in diesem Wellenlängenbereich gering. Wird das Objekt 13 mit Beleuchtungslicht innerhalb dieses Wellenlängenbereichs belichtet, wird daher im Wesentlichen lediglich der autofluoreszierende Stoff angeregt.
Im gesamten Spektralbereich, in welchem das Emissionsspektrum 51 des Fluoreszenzfarbstoffs einen hohen Emissionswert aufweist, weist das Emissionsspektrum 53 des autofluoreszierenden Stoffes ebenfalls einen hohen Emissionswert auf. Werden die Fluoreszenzemitter, das heißt der Fluoreszenzfarbstoff und der autofluoreszierende Stoff, gleichzeitig zur Fluoreszenz angeregt, emittieren beide Fluoreszenzemitter im selben Wellenlängenbereich, so dass sich das von dem Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht aus Fluoreszenzlicht des Fluoreszenzfarbstoffs und Fluoreszenzlicht des autofluoreszierenden Stoffes zusammensetzt.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen der verschiedenen, in dem Objekt 13 enthaltenen Fluoreszenzemitter wird nachfolgend unter Bezug auf die 2 und 3 erläutert.
Während eines in 3 gezeigten ersten Zeitabschnitts Z1 richtet die Beleuchtungsvorrichtung 3 Beleuchtungslicht auf das Objekt 13, wobei das Beleuchtungslicht während des ersten Zeitabschnitts Z1 ein erstes Beleuchtungslichtspektrum 61 aufweist, welches in 2 gezeigt ist. Das erste Beleuchtungslichtspektrum 61 weist im Wellenlängenbereich von 400 nm bis etwa 420 nm eine signifikante Intensität auf, so dass die zwei in dem Objekt 13 enthaltenen Fluoreszenzemitter mit den Absorptionsspektren 41 und 43 gleichzeitig effizient angeregt werden. Dementsprechend setzt sich das von dem Objekt 13 emittierte Fluoreszenzlicht aus Fluoreszenzlicht der zwei Fluoreszenzemitter mit den Emissionsspektren 51 und 53 zusammen.
Während des ersten Zeitabschnitts Z1 wird durch den Lichtdetektor 27 (Bilddetektor) eine ortsaufgelöste Verteilung von Intensitätswerten des von dem Objekt 13 ausgehenden Lichts detektiert. Damit im Wesentlichen ausschließlich Fluoreszenzlicht auf den Lichtdetektor 27 abgebildet wird, ist das Detektionsfilter 33 im Strahlengang 31 angeordnet, welches den in 2 mit dem Bezugszeichen 71 gekennzeichneten Transmissionsgrad aufweist. Das Detektionsfilter 33 weist im Wellenlängenbereich von 600 nm bis etwa 740 nm einen hohen Transmissionsgrad auf und außerhalb dieses Wellenlängenbereichs einen geringen Transmissionsgrad. Der mittlere Transmissionsgrad des Detektionsfilter 33 ist im Durchlassbereich (600 nm bis etwa 740 nm) beispielsweise wenigstens 10-mal, bevorzugt wenigstens 100-mal oder 1000-mal größer als der mittlere Transmissionsgrad des Detektionsfilter 33 im Sperrbereich (außerhalb des Durchlassbereichs).
Während eines nach dem ersten Zeitabschnitts Z1 liegenden zweiten Zeitabschnitts Z2 (vgl. 3) richtet die Beleuchtungsvorrichtung 3 Beleuchtungslicht auf das Objekt 13, wobei das Beleuchtungslicht während des zweiten Zeitabschnitts Z2 ein zweites Beleuchtungslichtspektrum 63 aufweist, welches in 2 gezeigt ist. Das zweite Beleuchtungslichtspektrum ist beispielsweise so gewählt, dass im Wesentlichen genau einer der in dem Objekt 13 enthaltenen Fluoreszenzemitter effizient angeregt wird. In dem in 2 gezeigten Beispiel weist das zweite Beleuchtungslichtspektrum 63 im Wellenlängenbereich von etwa 445 nm bis 465 nm eine signifikante Intensität auf und außerhalb dieses Wellenlängenbereichs eine im Wesentlichen geringe Intensität.
Hierdurch wird der in dem Objekt 13 enthaltene autofluoreszierende Stoff mit dem Absorptionsspektrum 43 effizient angeregt, während der in dem Objekt 13 enthaltene Fluoreszenzfarbstoff mit dem Absorptionsspektrum 41 nur geringfügig angeregt wird. Das von dem Objekt 13 emittierte Fluoreszenzlicht setzt sich während des zweiten Zeitabschnitts Z2 daher überwiegend ausschließlich aus dem Fluoreszenzlicht des autofluoreszierenden Stoffes mit dem Emissionsspektrum 53 zusammen. Es ist jedoch nicht erforderlich, dass während des zweiten Zeitabschnitts Z2 genau einer der Fluoreszenzemitter im Objekt 13 effizient angeregt wird. Stattdessen können auch mehrere Fluoreszenzemitter effizient angeregt werden.
Während des zweiten Zeitabschnitts Z2 detektiert der Lichtdetektor 27 ein Bild, das heißt eine ortsaufgelöste Intensitätsverteilung, von von dem Objekt 13 ausgehendem Licht.
Während eines nach dem zweiten Zeitabschnitts Z2 liegenden dritten Zeitabschnitts Z3 (vgl. 3) wird durch die Beleuchtungsvorrichtung 3 kein Beleuchtungslicht auf das Objekt 13 gerichtet. Hierdurch trifft im Wesentlichen ausschließlich Umgebungslicht auf das Objekt 13. Auch das Umgebungslicht könnte die in dem Objekt 13 angeordneten Fluoreszenzemitter anregen und so zu dem während des ersten Zeitabschnitts Z1 und des zweiten Zeitabschnitts Z2 von dem Objekt 13 ausgehendem Fluoreszenzlicht und damit zu den detektierten Bildern des Objekts 13 beigetragen haben. Dies kann in der nachfolgend erläuterten Berechnung zur Bestimmung der Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt zu Ungenauigkeiten führen. Deshalb wird die während des dritten Zeitabschnitts Z3 detektierte Intensität zur Korrektur der während der anderen Zeitabschnitte, das heißt der Zeitabschnitte Z1 und Z2, detektierten Intensitäten verwendet. In einer einfachen Ausgestaltung dieser Korrektur wird der während des dritten Zeitabschnitts Z3 detektierte Wert der Intensität von den Werten der während der Zeitabschnitte Z1 und Z2 detektierten Intensitäten subtrahiert.
Anschließend werden die Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt basierend auf den während der Zeitabschnitte Z1 bis Z3 detektierten (und korrigierten) Intensitäten (Bildern), den verschiedenen Beleuchtungslichtspektren 61, 63 und den spektralen Emissionsverhalten der Fluoreszenzemitter berechnet, wobei die spektralen Emissionsverhalten auf den Absorptionsspektren 41, 43 und den Emissionsspektren 51, 53 der Fluoreszenzemitter basieren. Eine beispielhafte Berechnung wird nachfolgend erläutert.
Die Gleichung $I_{F E} (λ) = \int C_{F E} \cdot A_{F E} (λ, λ') \cdot E x (λ') d λ'$
beschreibt die Wechselwirkung zwischen einem Fluoreszenzemitter FE und einem Beleuchtungslichtspektrum Ex(λ). Das Beleuchtungslichtspektrum Ex(λ) ist eine wellenlängenabhängige Intensitätsverteilung von Beleuchtungslicht. Die Eigenschaften eines Fluoreszenzemitters FE werden durch C_FE und A_FE beschrieben. Hierin bezeichnet C_FE die (oberflächennahe räumliche Verteilung der) Konzentration des Fluoreszenzemitters FE im Objekt 13. A_FE bezeichnet das spektrale Emissionsverhalten des Fluoreszenzemitters FE und gibt an, mit welcher Effizienz Beleuchtungslicht mit der Wellenlänge λ' durch den Fluoreszenzemitter FE in Emissionslicht der Wellenlänge λ umgewandelt wird. Während die (räumliche Verteilung der) Konzentration C_FE wellenlängenunabhängig ist, ist das spektrale Emissionsverhalten A_FE ortsunabhängig.
Gleichung (1) drückt die spektrale Intensitätsverteilung I_FE (λ) von durch einen Fluoreszenzemitter FE erzeugtem Fluoreszenzlicht aus. Die spektrale Intensitätsverteilung I_FE (λ) des Fluoreszenzemitters FE hängt damit von der (räumlichen Verteilung der) Konzentration C_FE des Fluoreszenzemitters FE, dem spektralen Emissionsverhalten A_FE des Fluoreszenzemitters FE und dem Beleuchtungslichtspektrum Ex(λ) ab.
Die Gleichung $S = \int D (λ) \cdot [\sum_{F E} I_{F E} (λ)] d λ$
gibt den Zusammenhang zwischen dem von dem Lichtdetektor 27 ausgegebenen Signal S (je Pixel), einer spektralen Übertragungsfunktion D (λ) zwischen dem Objekt 13 und dem Lichtdetektor 27 und dem von dem Objekt 13 emittierten Fluoreszenzlicht an. Die spektrale Übertragungsfunktion D(λ) repräsentiert daher die gemeinsame Wirkung der Mikroskopieoptik 15, des Detektionsfilters 33 sowie die Umwandlungseffizienz des Lichtdetektors 27 von Licht in ein Ausgabesignal.
Die Summe $\sum_{F E} I_{F E} (λ)$
bezeichnet das von dem Objekt 13 emittierte Fluoreszenzlicht, das heißt die Summe der Intensitätswerte von Fluoreszenzlicht, welches von den verschiedenen, in dem Objekt 13 enthaltenen Fluoreszenzemittern erzeugt wird. Wie im Zusammenhang mit 2 erläutert, enthält das Objekt 13 zwei verschiedene Fluoreszenzemitter (einen Fluoreszenzfarbstoff und einen autofluoreszierenden Stoff), so dass sich das von dem Objekt 13 emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Fluoreszenzlicht der verschiedenen Fluoreszenzemitter zusammensetzt. Das heißt, die spektrale Intensitätsverteilung des von dem Objekt 13 emittierten Fluoreszenzlichts entspricht der Summe der spektralen Intensitätsverteilungen der verschiedenen Fluoreszenzemitter.
Die Gleichungen (1) und (2) sind prinzipiell für eine beliebige Anzahl von Fluoreszenzemittern FE gültig. Nachfolgend wird, wie bisher, davon ausgegangen, dass in dem Objekt 13 zwei verschiedene Fluoreszenzemitter enthalten sind und bereits zwei (korrigierte) Intensitätswerte (je Pixel) vorliegen, die durch die Signale S^Z1 und S^Z2 repräsentiert werden. Für diesen Fall beschreibt die Gleichung $(_{S^{Z 2}}^{S^{Z 1}}) = M (A_{F l u o,} A_{A u t o}_{,} E x^{Z 1}, E x^{Z 2}, D) \cdot (_{C_{A u t o}}^{C_{F l u o}})$
den Zusammenhang zwischen den (korrigierten) Intensitätswerten S^Z1, S^Z2 und den zu berechnenden Konzentrationen C_Fluo, C_Auto. Die Ausdrücke C_Fluo und C_Auto bezeichnen die (räumliche Verteilung der) Konzentrationen des in dem Objekt 13 enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffs (Index „Fluo“) bzw. autofluoreszierenden Stoffes (Index „Auto“). M ergibt sich aus den Gleichungen (1) und (2) und ist damit von den spektralen Emissionsverhalten A_Fluo, A_Auto der Fluoreszenzemitter, von den verschiedenen während des ersten Zeitabschnitts Z1 und des zweiten Zeitabschnitts Z2 verwendeten Beleuchtungslichtspektren Ex^Z1 , Ex^Z2 und der spektralen Übertragungsfunktion D (λ) abhängig. Beispielsweise kann die Abbildungsvorschrift M als Matrix formuliert werden.
Zur Berechnung der Konzentrationen C_Fluo und C_Auto muss die Abbildungsvorschrift M invertiert werden. Mit der invertierten Abbildungsvorschrift und den detektierten Intensitätswerten S^Z1 und S^Z2 lassen sich sodann die Konzentrationen der Fluoreszenzemitter C_Fluo und C_Auto berechnen.
Wie in 3 dargestellt kann ein Zyklus bestehend aus den Zeitabschnitten Z1 bis Z3 wiederholt durchgeführt werden. Ein Zyklus kann weitere Zeitabschnitte umfassen. Beispielsweise kann ein weiterer Zeitabschnitt zur Aufnahme eines Farbbilds des Objekts 13 vorgesehen sein. Zu diesem Zweck ist der Lichtdetektor 27 als Farbdetektor ausgebildet und das Objekt 13 wird mit Beleuchtungslicht belichtet, welches ein im Wesentlichen weißes Beleuchtungslichtspektrum aufweist.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von verschiedenen, in einem Objekt enthaltenen Fluoreszenzemittern, wobei das Verfahren umfasst: Richten von Beleuchtungslicht auf ein Objekt (13), welches mehrere verschiedene Fluoreszenzemitter enthält, wobei das Beleuchtungslicht während verschiedenen Zeitabschnitten (Z1, Z2, Z3) verschiedene Beleuchtungslichtspektren (61, 63) aufweist, wobei das Beleuchtungslicht während wenigstens eines der Zeitabschnitte (Z1) ein Beleuchtungslichtspektrum (61) aufweist, das dazu geeignet ist, die Fluoreszenzemitter gleichzeitig effizient anzuregen; während jedes Zeitabschnitts (Z1, Z2, Z3) Detektieren eines Intensitätswerts von von dem Objekt (13) ausgehendem Licht; Berechnen der Konzentrationen der Fluoreszenzemitter in dem Objekt (13) basierend auf den verschiedenen Beleuchtungslichtspektren (61, 63), den spektralen Emissionsverhalten der Fluoreszenzemitter und den während der Zeitabschnitte (Z1, Z2, Z3) detektierten Intensitätswerten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Berechnen der Konzentrationen der Fluoreszenzemitter ferner auf einer spektralen Übertragungsfunktion zwischen dem Objekt (13) und einer Detektionsfläche (25), an welcher das Detektieren durchgeführt wird, basiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei während des Detektierens diejenigen Spektralbereiche des von dem Objekt (13) ausgehenden Lichts, die im Beleuchtungslichtspektrum (61, 63) enthalten sind, unterdrückt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Beleuchtungslichtwährend wenigstens einer der Zeitabschnitte (Z2) ein Beleuchtungslichtspektrum (63) aufweist, das dazu geeignet ist, genau einen der mehreren Fluoreszenzemitter effizient anzuregen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei gilt: $\int A b s^{i} (λ) \cdot E x (λ) d λ \geq K \cdot \int A b s^{j} (λ) \cdot E x (λ) d λ,$
wobei Ex(λ) das Beleuchtungslichtspektrum, Absⁱ (λ) das Absorptionsspektrum eines der Fluoreszenzemitter, Abs^j (λ) das Absorptionsspektrum der anderen Fluoreszenzemitter, A die Wellenlänge und K einen Grenzwert repräsentiert, wobei K wenigstens 2 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Beleuchtungslichtspektren (61, 63) spektral höchstens teilweise überlappen, insbesondere nicht überlappen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Beleuchtungslicht während wenigstens einer der Zeitabschnitte oder während einer Kalibrationsphase auf einen Bereich des Objekts gerichtet wird, in welchem die Konzentration von wenigstens einem der Fluoreszenzemitter bekannt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die bekannte Konzentration im Wesentlichen Null ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei während wenigstens einer der Zeitabschnitte (Z3) kein Beleuchtungslicht auf das Objekt (13) gerichtet wird und die während dieses Zeitabschnitts (Z3) detektierte Intensität zur Korrekturvon während anderer Zeitabschnitte (Z1, Z2) detektierten Intensitäten verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei während wenigstens einer der Zeitabschnitte Beleuchtungslicht mit einem im Wesentlichen weißen Beleuchtungslichtspektrum auf das Objekt gerichtet wird und ein Farbbild des Objekts aufgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Beleuchtungslichtspektren (61, 63) erzeugt werden durch: • wenigstens eine Lichtquelle (5) und wenigstens ein Filter (9, 9'), welches in einen Strahlengang (10) zwischen dem Objekt (13) und der wenigstens einen Lichtquelle (5) eingeführt und ausgeführt wird; oder • wenigstens zwei Lichtquellen, die unterschiedliche Beleuchtungslichtspektren erzeugen und Beleuchtungslicht nacheinander und/oder teilweise gleichzeitig auf das Objekt richten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Zeitabschnitte (Z1, Z2, Z3) einen Zyklus (Z) bilden, welcher wiederholt durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Detektieren umfasst: Abbilden des von dem Objekt (13) ausgehenden Lichts auf eine Detektionsfläche (25) und Detektieren der Intensität des auf die Detektionsfläche (25) abgebildeten Lichts.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Intensität des auf die Detektionsfläche (25) abgebildeten Lichts ortsaufgelöst detektiert wird.
Mikroskopiesystem (1), umfassend: eine Beleuchtungsvorrichtung (3), welche dazu konfiguriert ist, Beleuchtungslicht mit verschiedenen Beleuchtungslichtspektren (61, 63) zu erzeugen und das Beleuchtungslicht auf einen Objektbereich (11) zu richten; einen Lichtdetektor (27), eine Mikroskopieoptik (15), welche dazu konfiguriert ist, den Objektbereich (11) auf eine Detektionsfläche (25) des Lichtdetektors (27) abzubilden; und eine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die Beleuchtungsvorrichtung (3) zu steuern und Detektionssignale (29) von dem Lichtdetektor (27) zu empfangen; wobei die Steuerung (12) ferner dazu konfiguriert ist, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 durchzuführen.
Mikroskopiesystem (1) nach Anspruch 15, wobei der Lichtdetektor (27) dazu konfiguriert ist, ein Signal (29) auszugeben, welches die auf die Detektionsfläche (25) des Detektors (27) auftreffende Intensität von Licht eines Wellenlängenbereichs repräsentiert, wobei der Wellenlängenbereich wenigstens 300 nm, insbesondere wenigstens 400 nm breit ist und/oder wobei der Wellenlängenbereich einen Bereich von 600 nm bis 750 nm umfasst.
Mikroskopiesystem (1) nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Lichtdetektor dazu konfiguriert ist, auf die Detektionsfläche (25) des Lichtdetektors (27) auftreffendes Licht ortsaufgelöst zu detektieren.