DE102017101309A1

DE102017101309A1 - Verfahren zum quantitativen Bestimmen einer fluoreszierenden Komponente in Blut und Messgerät

Info

Publication number: DE102017101309A1
Application number: DE102017101309.1A
Authority: DE
Inventors: Christian HOMANN; Herbert Stepp; Georg Hennig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2018-06-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Messgerät und ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut (14), wobei zumindest ein Teil eines Basis-Fluoreszenzspektrums (S0) der mindestens einen Komponente für eine bekannte Menge der mindestens einen Komponente bereitgestellt wird und ein erstes Fluoreszenzspektrum (S1) des Bluts (14) aufgenommen wird. Weiterhin wird das erste Fluoreszenzspektrum (S1) durch eine parametrierte Funktion (F) approximiert und dabei mindestens ein Funktionsparameter der parametrierten Funktion (F) bestimmt. Zudem wird die Funktion (F) mit dem mindestens einen bestimmten Funktionsparameter vom ersten Fluoreszenzspektrum (S1) subtrahiert und dadurch ein zweites Fluoreszenzspektrums (S2) bereitgestellt, in Abhängigkeit von welchem ein drittes Fluoreszenzspektrum dargestellt wird, welches sich zumindest aus einem Vielfachen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums (S0) und einem Restspektrum (U1) zusammensetzt, wobei das Vielfache derart bestimmt wird, dass ein Betrag der zweiten Ableitung (U1") des Restspektrums (U1) minimal wird. Weitierhin wird das bestimmte Vielfachen zu einem eine Mengenangabe der Komponente definierenden Wert gemäß einer vorbestimmten Zuordnung zugeordnet.

Description

BESCHREIBUNG:
Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut, wobei zumindest ein Teil eines Basis-Fluoreszenzspektrums der mindestens einen Komponente für eine bekannte Menge der mindestens einen Komponente bereitgestellt wird und ein erstes Fluoreszenzspektrum des Bluts aufgenommen wird. Zur Erfindung gehört auch ein Messgerät zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut.
Die Erfindung ist auf dem Gebiet der quantitativen Fluoreszenzmessungen angesiedelt. Quantitative Fluoreszenzmessungen können dazu genutzt werden, um beispielsweise Komponenten in Blut, insbesondere blutgebundene Komponenten, im speziellen blutgebundene Fluorophore, wie beispielsweise Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX, quantitativ aus dem spektralen Verlauf einer Fluoreszenzmessung zu bestimmen.
Hierzu wird üblicherweise das sogenannte spektrale Anfitten, d.h. eine Kurvenanpassung, verschiedener Komponenten an ein gemessenes Spektrum genutzt, um die quantitative Zusammensetzung einer Probe zu ermitteln. Ein solches Anfitten ist insbesondere dann notwendig, wenn die Fluoreszenzemissionen der verschiedenen Komponenten im gleichen spektralen Bereich liegen und daher eine saubere Trennung des Beitrags der Komponenten zur gesamten gemessenen Fluoreszenz nichttrivial ist. Für das erfolgreiche Anfitten verschiedener Komponenten an ein Fluoreszenzemissionsspektrum ist es notwendig, Kenntnis über den spektralen Verlauf der Fluoreszenzemission der einzelnen Komponenten separat zu haben. Ist dies nicht der Fall, so kann der Verlauf über analytische Funktionen, wie beispielsweise Gaußfunktionen, angenähert werden. Dies funktioniert allerdings nur dann gut, wenn der spektrale Verlauf wenigstens annähernd bekannt ist. Der spektrale Verlauf der Fluoreszenzemission der einer einzelnen Komponenten separat oder zumindest die Annäherung eines solchen Verlaufs durch eine analytische Funktion stellt somit ein Basis-Fluoreszenzspektrum der mindestens einen Komponente für eine bekannte Menge der mindestens einen Komponente bereit. Beim spektralen Anfitten wird dann ein Vielfaches dieses Basis-Fluoreszenzspektrums so gewählt, dass das Vielfache dieses Basis-Fluoreszenzspektrums sozusagen „möglichst gut“ in das gemessene Fluoreszenzspektrum passt.
Hierbei ergeben sich jedoch zahlreiche Probleme. Soll also in einem konkreten Anwendungsfall die Fluoreszenz von Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX aus Gewebefluoreszenzspektren quantitativ bestimmt werden, so wird dies erschwert durch einen großen, unbekannten Untergrund, der von anderen Blutbestandteilen oder Gewebebestandteilen, zum Beispiel Kollagen, stammt. Zudem kann diese Untergrundfluoreszenz etwa 100-fach stärker sein als die Fluoreszenz des Zink-Protoporphyrins und des Protoporphyrin IX, sodass deren Strukturen nicht ohne weiteres erkennbar sind. Für ein erfolgreiches Anfitten der Komponenten Zink-Protoporphyrin und Protoporphyrin IX an das Fluoreszenzsignal, das heißt an das gemessene Fluoreszenzspektrum, wäre eigentlich die Kenntnis über den genauen Verlauf des Untergrundes notwendig. Dieser Verlauf ist aber starken intra- und interindividuellen Unterschieden unterworfen, und daher für einen bestimmten Patienten unbekannt.
Weiterhin ist es Stand der Technik, die Untergrundfluoreszenz mittels 2-Wellenlängen-Anregung zu reduzieren, wie in der WO 2013/040398 A1 beschrieben. Dabei wird über die Fluoreszenzanregung in einem Wellenlängenband hinaus mit Licht in einem zweiten Wellenlängenband angeregt. Beide Wellenlängenbänder sind so gewählt, dass die Blutabsorption identisch ist. Die beiden Fluoreszenzsignale werden subtrahiert und mittels Filteralgorithmus aus diesem Differenzspektrum quantitativ die Zink-Protoporphyrin- und Protoporphyrin-IX-Fluoreszenz bestimmt.
Dies hat jedoch den Nachteil, dass dies technisch sehr aufwendig zu realisieren ist, weil zwei Lichtquellen, mehrere Filter und gegebenenfalls zusätzliche optische Komponenten erforderlich sind. Außerdem kann die sukzessive Fluoreszenzmessung zweier zu subtrahierender Signale dazu führen, dass Änderungen zwischen diesen Messungen, zum Beispiel bei Bewegungen von Untersucher oder Patient, die Messung verfälschen. Darüber hinaus wird nur ein Teil der Untergrundfluoreszenz durch die 2-Wellenlängen-Methode subtrahiert, was die Genauigkeit der Bestimmung der Zink-Protoporphyrin- und Protoporphyrin-IX-Fluoreszenz reduziert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und ein Messgerät bereitzustellen, welche eine möglichst genaue quantitative Bestimmung mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut mit möglichst geringem Aufwand ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren und ein Messgerät zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut mit den Merkmalen gemäß den jeweiligen unabhängigen Ansprüchen. Vorteilhafte Ausführungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche, der Beschreibung und der Figuren.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut wird zumindest ein Teil eines Basis-Fluoreszenzspektrums der mindestens einen Komponente für eine bekannte Menge der mindestens einen Komponente bereitgestellt. Weiterhin wird ein erstes Fluoreszenzspektrum des Bluts aufgenommen. Darüber hinaus wird das erste Fluoreszenzspektrum durch eine parametrierte Funktion approximiert und dabei mindestens ein Funktionsparameter der parametrierten Funktion bestimmt. Des Weiteren wird die Funktion mit dem mindestens einen bestimmten Funktionsparameter vom ersten Fluoreszenzspektrum subtrahiert und dadurch ein zweites Fluoreszenzspektrum bereitgestellt. In Abhängigkeit von dem zweiten Fluoreszenzspektrum wird ein drittes Fluoreszenzspektrum dargestellt, welches sich zumindest aus einem Vielfachen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums und einem Restspektrum zusammensetzt, und das Vielfache derart bestimmt, dass ein Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums minimal wird. Des Weiteren wird das bestimmte Vielfache zu einem eine Mengenangabe der Komponente definierenden Wert gemäß einer vorbestimmten Zuordnung zugeordnet.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise die fluoreszierende Komponente in Blut quantitativ zum Beispiel mit nur einem aufgenommenen ersten Fluoreszenzspektrum bestimmt werden. Hierdurch kann der Aufwand beim quantitativen Bestimmen dieser Komponente enorm reduziert werden und das Verfahren lässt sich durch ein deutlich kostengünstigeres und kompakteres Messgerät ausführen. Weiterhin können so auch zeitlich sequentielle Messungen vermieden werden, die bei zwischenzeitlichen Veränderungen zu großen Ungenauigkeiten in den letztendlichen Messergebnissen führen. Zudem lassen sich durch das beschriebene Verfahren auch aus anderen Gründen deutlich genauere Messergebnisse erzielen. Die Erfindung beruht dabei auf der Erkenntnis, dass, obwohl der Untergrund unbekannt ist, d.h. die Beiträge zum ersten Fluoreszenzspektrum, die von anderen als die quantitativ zu bestimmende Komponente im Blut oder des durchbluteten Gewebes stammen, dennoch bestimmte Annahmen über diesen unbekannten Untergrund getroffen werden können, die entsprechend vorteilhafterweise genutzt werden können, um die quantitative Bestimmung der fluoreszierenden Komponente auf besonders genaue Weise zu ermöglichen. Diese Annahmen bzw. Erkenntnisse bestehen darin, dass die Fluoreszenzanteile der zu bestimmenden fluoreszierenden Komponente in der Regel stärker ausgeprägte spektrale Signaturen aufweist als die Untergrundfluoreszenz. Solche ausgeprägte spektrale Signaturen äußern sich in einem starken Krümmungsverhalten in den korrespondierenden Bereichen des gemessenen ersten Fluoreszenzspektrums. Entsprechen können nun vorteilhafterweise Bereiche des Fluoreszenzspektrums mit starker Krümmung den Fluoreszenzanteilen der zu bestimmenden Komponente zugeschrieben werden. Dies erlaubt es vorteilhafterweise das gemessene erste Fluoreszenzspektrum bzw. das letztendlich daraus hergeleitete und nachfolgend näher beschriebene dritte Fluoreszenzspektrum in einen der zu bestimmenden fluoreszierenden Komponente zugeordneten Anteil, der durch das Vielfache des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums repräsentiert wird, und einen dem Untergrund zugeordnet Anteil, der durch das Restspektrum repräsentiert wird, zu gliedern und das Vielfache derart zu bestimmen, dass ein Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums minimal wird. Die zweite Ableitung des Restspektrums stellt dabei die Krümmung des Restspektrums dar. Das Vielfache, welches letztendlich die quantitativ zu bestimmende Menge der Komponente wiederspiegelt, kann also vorteilhafterweise im Hinblick darauf bestimmt werden, dass die Krümmung des Restspektrums möglichst gering ist.
Die Erfindung beruht zudem auf der weiteren Erkenntnis, dass diese Annahme der möglichst geringen Krümmung der Untergrundfluoreszenz üblicherweise jedoch nicht ausreichend zutrifft, und insbesondere nicht für das Untergrundfluoreszenzspektrum von Blut oder dem durchbluteten Gewebe im Wellenlängenbereich der typischen spektralen Signaturen von Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX. Dies wird erfindungsgemäß nun auf besonders vorteilhafte Weise dadurch berücksichtigt, dass das aufgenommene erste Fluoreszenzspektrum durch eine parametrierte Funktion approximiert wird und dabei mindestens einen Funktionsparameter der parametrierten Funktion bestimmt wird. Beispielsweise wird also die Funktion mit einem oder mehreren Fitparametern an das gemessene erste Fluoreszenzspektrum angefittet. Hierdurch kann der Verlauf des Fluoreszenzspektrums durch die parametrierte Funktion nachgebildet werden, wodurch letztendlich auch das Krümmungsverhalten des Untergrunds letztendlich zumindest approximativ nachgebildet wird. Durch Subtraktion der so bestimmten approximierten Funktion von dem aufgenommenen ersten Fluoreszenzspektrum wird somit vorteilhafterweise ein zweites Fluoreszenzspektrum bereitgestellt, dessen Untergrundanteil nun eine deutlich geringere Krümmung aufweist. Durch die Subtraktion dieser Funktion wird es also bewerkstelligt, dass die letztendliche Krümmung des Untergrunds reduziert wird, wodurch auch die Bedingungen für die Bestimmung des Vielfachen, nämlich dass der Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums minimal wird, viel zutreffender ist als ohne die vorherige Subtraktion der Funktion, sodass sich letztendlich deutlich bessere Messergebnisse bereitstellen lassen.
Unter einem Spektrum, wie dem ersten, zweiten, dritten Fluoreszenzspektrum und dem Basis-Fluoreszenzspektrum ist dabei im Allgemeinen der Verlauf der Strahlungsintensität in Abhängigkeit von der Wellenlänge zu verstehen. Das Approximieren des ersten Fluoreszenzspektrums durch die parametrierte Funktion kann beispielsweise durch Anfitten der parametrierten Funktion an das erste Fluoreszenzspektrum durch Regression oder Ausgleichsrechnung erfolgen. Weiterhin kann das Bereitstellen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums der mindestens einen Komponente, wie eingangs beschrieben, dadurch erfolgen, dass die Fluoreszenzemission bzw. deren spektraler Verlauf der einzelnen Komponenten separat gemessen wurde oder dieser spektrale Verlauf der Fluoreszenzemission der einzelnen Komponente separat zumindest durch eine analytische Funktion angenähert wurde. Darüber hinaus kann es sein, dass der spektrale Verlauf eines solchen Basis-Fluoreszenzspektrums nicht nur in einem sondern in verschiedenen Wellenlängenbereichen Signaturen aufweist. Dies ist beispielsweise für Zink-Protoporphyrin der Fall. Da eine einzelne von mehreren solchen spektralen Signaturen bereits zur Bestimmung der Komponente ausreichend Signifikanz besitzen kann, ist es prinzipiell auch ausreichend, nur einen Teil des Basis-Fluoreszenzspektrums der mindestens einen Komponente bereitzustellen, insbesondere eines Teils, welcher zumindest eine Signatur aufweist. Eine Signatur kann dabei beispielsweise dadurch definiert sein, dass der spektrale Verlauf in einem dieser Signatur zugeordneten Wellenlängenbereich einen vorbestimmten Intensitätswert übersteigt. Weist das Basis-Fluoreszenzspektrum der Komponente beispielsweise mehrere solcher Signaturen auf, so kann optional auch ein Basis-Fluoreszenzspektrum der Komponente bereitgestellt werden, welches alle Signaturen aufweist. Die Beschränkung auf einen Teil des Basis-Fluoreszenzspektrums, welches nur eine oder wenige Strukturen bzw. spektrale Signaturen der Komponente aufweist, kann jedoch unter Umständen von großem Vorteil sein. Insbesondere dann, wenn nicht nur eine fluoreszierende Komponente im Blut bestimmt werden soll, sondern mehrere, wobei die jeweiligen Basis-Fluoreszenzspektren in überlappenden Wellenlängenbereichen jeweilige Signaturen aufweisen. Zur quantitativen Bestimmung einer jeweiligen Komponente kann dann entsprechend nur der Bereich des Basis-Fluoreszenzspektrums betrachtet werden, der eine Signatur aufweist, die nicht mit einer Signatur einer anderen Komponente in einem bestimmten Wellenbereich überlappt.
Weiterhin ist unter dem Aufnehmen eines ersten Fluoreszenzspektrums des Bluts auch ein erstes Fluoreszenzspektrum zu verstehen, welches von durchblutetem Gewebe aufgenommen wurde, und entsprechend die von Blut stammenden Fluoreszenzanteile umfasst.
Unter dem Darstellen des dritten Fluoreszenzspektrums in Abhängigkeit von dem zweiten Fluoreszenzspektrum kann auch verstanden werden, dass das dritte Fluoreszenzspektrum mit dem zweiten Fluoreszenzspektrum identisch ist. In bestimmten Situationen, die später näher erläutert werden, ist es jedoch vorteilhaft, das zweite Fluoreszenzspektrum zum Darstellen bzw. Bereitstellen des dritten Fluoreszenzspektrums noch zu modifizieren, und insbesondere auch zu parametrieren. Ein solcher Parameter des parametrierten dritten Fluoreszenzspektrums kann dann gleichzeitig mit dem Bestimmen des Vielfachen bestimmt werden. Insbesondere kann hierzu ein Iterationsverfahren angewandt werden, wie beispielsweise ein nichtlineares Fitverfahren, wie der Levenberg-Marquardt-Algorithmus. Gemäß einem solchen Verfahren kann dann das Vielfache sowie auch optional der Parameter des parametrierten dritten Fluoreszenzspektrums iterativ so bestimmt werden, dass der Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums minimal wird. Mit anderen Worten wird das Vielfache und optional weitere Parameter derart bestimmt, dass sich ein Restspektrum ergibt, dessen Betrag der zweiten Ableitung zum Beispiel im Mittel über einen vorbestimmten Wellenlängenbereich, der nachfolgend als sechster Wellenlängenbereich bezeichnet wird, minimal ist, insbesondere im Vergleich zu Restspektren, die sich für andere Werte des Vielfachen ergeben würden.
Unter dem Darstellen des dritten Fluoreszenzspektrums kann also ein Bereitstellen des dritten Fluoreszenzspektrums oder Ausdrücken des dritten Fluoreszenzspektrums in Abhängigkeit von dem zweiten Fluoreszenzspektrum verstanden werden, insbesondere abhängig von einem oder mehrerer Parameter, die noch zu bestimmen sind und insbesondere gleichzeitig mit dem Vielfachen bestimmt werden.
Weiterhin kann zusätzlich oder anstelle der Fluoreszenz auch Phosphoreszenz und/oder Chemolumineszenz und/oder eine andere Form von Lumineszenz erfasst werden. Im Allgemeinen kann das beschriebene Verfahren auch analog zur quantitativen Bestimmung einer lumineszierenden Komponente verwendet werden, zu welcher ein korrespondierende Basis-Emissionsspektrum bereitgestellt wird, und entsprechend von einer die Komponente enthaltenden Probe ein erstes Emissionsspektrum aufgenommen wird, aus welchem, analog zu oben beschriebener Vorgehensweise, letztendlich der die Mengenangabe definierende Wert der Komponente ermittelt wird.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die mindestens eine fluoreszierende Komponente Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX. Gerade die Komponenten Zink-Protoporphyrin und Protoporphyrin IX sind aus medizinischer Sicht von besonderer Bedeutung. Daher ist es besonders vorteilhaft, wenn als die mindestens eine fluoreszierende Komponente zumindest eine dieser Komponenten bestimmt wird. Zink-Protoporphyrin stellt dabei ein blutgebundenes Fluorophor dar. Protoporphyrin IX kann sowohl als blutgebundene Fluorophor vorkommen, oder auch oberflächlich im Gewebe. Entsprechend unterscheiden sich auch die Basis-Fluoreszenzspektren des Protoporphyrin IX, je nachdem, ob dieses im blutgebundenen Zustand oder oberflächlich im Gewebe vorkommenden Zustand vorliegt. Je nachdem ob die blutgebundene oder die oberflächlich im Gewebe vorkommende Komponente Protoporphyrin IX bestimmt werden soll, oder auch beide Anteile, kann in das entsprechende Basis-Fluoreszenzspektrum, oder auch entsprechend beide Basis-Fluoreszenzspektren bereitgestellt werden.
Auch können durch das erfindungsgemäße Verfahren mehrere verschiedene Komponenten im Blut gleichzeitig quantitativ bestimmt werden, insbesondere anhand des gleichen aufgenommenen ersten Fluoreszenzspektrums. Hierzu wird dann für eine jeweilige zu bestimmende Komponente zumindest ein Teil eines korrespondierenden Basis-Fluoreszenzspektrums bereitgestellt. Entsprechend setzt sich dann das dritte Fluoreszenzspektrum aus einem jeweiligen Vielfachen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums für eine jeweilige zu bestimmende Komponente und dem Restspektrum zusammen. Hierdurch ist vorteilhafterweise die quantitative Bestimmung beliebig vieler fluoreszierende Komponenten gleichzeitig möglich.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung gibt der die Mengenangabe definierende Wert eine Konzentration oder ein Verhältnis an, insbesondere das Verhältnis Zink-Protoporphyrin/Häm und/oder Protoporphyrin IX/Häm. Besonders vorteilhaft ist es mit Bezug auf Zink-Protoporphyrin und Protoporphyrin IX als zu bestimmende Komponente, wenn der die Mengenangabe definierende Wert das Verhältnis angibt, weil die Fluoreszenzintensität von Zink Protoporphyrin bzw. Protoporphyrin IX im blutgebundenen Zustand proportional zu diesen Verhältnissen ist, und nicht zu deren Konzentration. Entsprechend kann auch das betreffende Basis-Fluoreszenzspektrum der mindestens einen Komponente mit Bezug auf das Verhältnis dieser Komponente zu Häm als die bekannte Menge bereitgestellt werden.
Die Zuordnung, gemäß welcher dem bestimmten Vielfachen dem die Mengenangabe definierenden Wert zugeordnet wird, kann beispielsweise anhand von Referenzmessungen bereitgestellt werden. Dabei können die Referenzmessungen anhand von Blutproben mit unabhängiger Bestimmung von den Fluoreszenzanteilen der zu bestimmenden Komponente, d.h. also beispielsweise von Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX und/oder der Blutabsorption, durchgeführt werden. Diese Referenzmessungen dienen dann dazu, den bestimmten Wert, d.h. das bestimmte Vielfache, in absolute Einheiten zum Beispiel „Mikromol pro Mol Häm“ zu skalieren. Eine Skalierung kann auch unterschiedliche Anregungswellenlängen für die Referenzmessungen und das aufgenommene erste Fluoreszenzspektrum berücksichtigen.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt das Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums über ein vorbestimmtes Körperteil, insbesondere über eine Mundhöhle, insbesondere über eine Unterlippeninnenseite oder eine Mundschleimhaut. Das Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums über die Mundhöhle, insbesondere über die Unterlippeninnenseite, wie beispielsweise über das feuchte Lippenrot der Unterlippe, oder der Mundschleimhaut ist dabei besonders vorteilhaft, da diese Körperteile sehr nahe an der Oberfläche verlaufende Blutgefäße aufweisen. Im Blut befindliche Komponenten sowie insbesondere auch blutgebundene Komponenten lassen sich damit auf besonders einfache und effektive Weise durch Anregungsstrahlung anregen und damit das korrespondierende erste Fluoreszenzspektrum mit hoher Intensität erfassen, was zu geringeren Rauschanteilen führt und damit letztendlich besonders genaue Messungen ermöglicht. Ein weiterer besonders großer Vorteil des Aufnehmens des ersten Fluoreszenzspektrums über ein Körperteil besteht zudem darin, dass keine invasiven Maßnahmen erforderlich sind, um das Blut eines Patienten zu untersuchen. Die Messung des ersten Fluoreszenzspektrums kann somit vorteilhafterweise direkt an einem Körperteil des Patienten durchgeführt werden, ohne diesem Blut entnehmen zu müssen. In diesem Fall umfasst das erste Fluoreszenzspektrum des Bluts nicht nur die spektralen Komponenten bzw. spektralen Anteile der Komponenten des Bluts selbst sondern auch Anteile des durchbluteten Gewebes an sich. Gerade in diesem Zusammenhang ist das erfindungsgemäße Verfahren und seine Ausgestaltungen besonders vorteilhaft, da vor allem ein Gewebe-Fluoreszenzspektrum deutlich mehr unbekannte Untergrundfluoreszenzanteile aufweist, als beispielsweise das Spektrum von reinem Blut.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt das Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums über einen optisch zumindest zum Teil oder auch vollständig transparenten oder transluzenten, blutgefüllten Schlauch, insbesondere welcher während einer Dialyse oder einer Blutspende verwendet wird. Auch hierdurch ist eine besonders wenig invasive Möglichkeit bereitgestellt, die zumindest eine Komponente in Blut quantitativ zu bestimmen, denn die Messung dieser Komponente kann vorteilhafterweise mit Verfahren verknüpft sein, bei denen ohnehin eine Führung von Blut durch einen Schlauch nötig ist, wie dies bei einer Dialyse oder Blutspende der Fall ist. In diesem Fall umfasst das erste Fluoreszenzspektrum keine von einem Gewebe stammenden Anteile, dafür mögliche von dem Schlauch stammende Anteile.
Auch kann es vorgesehen sein, dass einem Patienten zunächst Blut entnommen wird, von welchen anschließend das erste Fluoreszenzspektrum aufgenommen wird. Auch in diesem Fall umfasst das erste Fluoreszenzspektrum keine spektralen Gewebeanteile.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zum Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums zumindest das Blut mit Anregungsstrahlung mit zumindest einer Wellenlänge in einem vorbestimmten ersten Wellenlängenbereich, insbesondere zwischen 395 nm und 435 nm bestrahlt. D.h. also zumindest das Blut, oder auch das durchblutete Gewebe, wird mit einer Wellenlänge von zum Beispiel 395 nm, 396 nm, 397 nm, 398 nm, 399 nm, 400 nm, 401 nm, 402 nm, 403 nm, 404 nm, 405 nm, 406 nm, 407 nm, 408 nm, 409 nm, 410 nm, 411 nm, 412 nm, 413 nm, 414 nm, 415 nm, 416 nm, 417 nm, 418 nm, 419 nm, 420 nm, 421 nm, 422 nm, 423 nm, 424 nm, 425 nm, 426 nm, 427 nm, 428 nm, 429 nm, 430 nm, 431 nm, 432 nm, 433 nm, 434 nm und/oder 435 nm bestrahlt. Bei einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist die Anregungsstrahlung eine Wellenlänge von 425 nm auf. Dies stellt die für Zink-Protoporphyrin optimale Anregungswellenlänge dar. Aber auch die anderen oben genannten Anregungswellenlängen eignen sich zur Anregung von Zink-Protoporphyrin bzw. Protoporphyrin IX. Insbesondere ist der oben genannte Wellenlängenbereich so bemessen, dass Anregungsstrahlung mit einer Wellenlänge aus diesem Wellenlängenbereich dazu geeignet ist, Fluorophore im Blut derart anzuregen, dass deren Fluoreszenzemissionsspektrum ausreichend signifikante Strukturen zeigt, d.h. Strukturen die sich in ausreichender Weise von der Untergrundfluoreszenz abheben. Besonders vorteilhaft ist dabei vor allem eine Wellenlänge aus einem Wellenlängenbereich, die maximal um zum Bespiel 15 nm von der besonders bevorzugten Anregungswellenlänge 425 nm abweicht. Durch Anregung mit Anregungsstrahlung in diesem bevorzugten Wellenlängenbereich lassen sich besonders ausgeprägte spektrale Signaturen für Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX erzielen, was wiederum bei der quantitativen Bestimmung dieser Komponenten zu besonders genauen Messergebnissen führt.
Besonders vorteilhaft ist es dabei ebenfalls, wenn auch das Basis-Fluoreszenzspektrum in Bezug auf eine vorbestimmte Anregungslichtwellenlänge bereitgestellt wird, welche ebenfalls in dem oben genannten ersten Wellenlängenbereich liegen kann. Beispielsweise kann diese auch mit der Wellenlänge der Anregungsstrahlung zum Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums übereinstimmen. Weicht die Wellenlänge der Anregungsstrahlung, mit welcher das Basis-Fluoreszenzspektrum aufgenommen wurde, von der Wellenlänge der Anregungsstrahlung, mit welcher das erste Fluoreszenzspektrum aufgenommen wurde, ab, so kann dies durch die vorbestimmte Zuordnung, welche dem bestimmten Vielfachen den die Mengenangabe der Komponente definierenden Wert zuordnet, berücksichtigt werden. Mit anderen Worten kann diese Zuordnung auch in Abhängigkeit von der Wellenlänge der Anregungsstrahlung, mit welcher das erste Fluoreszenzspektrum aufgenommen wurde, und insbesondere auch in Abhängigkeit von der Wellenlänge der Anregungsstrahlung, mit welcher das Basis-Fluoreszenzspektrum aufgenommen wurde, erfolgen.
Zur Detektion des ersten Fluoreszenzspektrums können aus dem Stand der Technik bekannte Detektoren verwendet werden. Während also die Probe, d.h. entweder nur das Blut oder das durchblutete Gewebe, mit der Anregungsstrahlung bestrahlt wird, wird die vom Blut bzw. dem durchbluteten Gewebe emittierte Strahlung von dem Detektor erfasst und insbesondere spektral aufgelöst. Das erste Fluoreszenzspektrum liegt dabei typischerweise in einem Wellenlängenbereich, der vom ersten Wellenlängenbereich der Anregungsstrahlung verschieden ist, sodass das erste Fluoreszenzspektrum von der Anregungsstrahlung durch die Verwendung eines geeigneten Filters auf einfache Weise separiert werden kann.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung stellt die parametrierte Funktion, welche also das aufgenommene erste Fluoreszenzspektrum approximiert, eine hinreichend glatte Funktion dar, welche zumindest zum Teil eine von Null verschiedene Krümmung aufweist. Unter einer hinreichend glatten Funktion ist dabei eine Funktion zu verstehen, welche bis zu einer vorbestimmbaren Ordnung stetig differenzierbar ist.
Hierbei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Funktion zumindest bis einschließlich zur zweiten Ableitung stetig differenzierbar ist, da das erfindungsgemäße Verfahren und seine vorteilhaften Ausgestaltungen Betrachtungen in Bezug auf die zweite Ableitung, insbesondere bezüglich des Restspektrums, einschließen. Die parametrierte Funktion kann aber auch eine glatte Funktion sein, welche unendlich oft stetig differenzierbar ist, wie beispielsweise eine parametrierte Gauß-Funktion. Dadurch, dass die parametrierte Funktion eine zumindest zum Teil von Null verschiedene Krümmung aufweist, ist diese besonders gut dazu geeignet, das Krümmungsverhalten des Untergrundes nachzubilden.
Die parametrierte Funktion kann beispielsweise eine parametrierte Gaußkurve oder eine parametrierte Lorenzkurve oder eine parametrierte Hyperbel oder einen parametrierten Polygonzug n-ten Grades darstellen oder durch eine Glättung des ersten Fluoreszenzspektrums bereitgestellt werden. Darüber hinaus gibt es vielzählige weitere Möglichkeiten für die parametrierte Funktion. All diese genannten Kurven bzw. Funktionen weisen eine von Null verschiedene Krümmung auf, die beispielsweise durch geeignete Wahl des Parameters an den Verlauf des ersten Fluoreszenzspektrums angefittet werden kann. Auch Kombinationen der genannten parametrierten Funktionen können verwendet werden. Im Prinzip ist dabei die genaue Funktion nicht entscheidend, vorteilhaft ist dabei lediglich, wenn die Funktion zum einen in dem Bereich, in dem sich das zu bestimmende Signal, das heißt die Strukturen bzw. spektralen Signaturen der zu bestimmenden Komponente befindet, keine Strukturen ähnlicher Ausprägung wie das zu bestimmende Signal aufweist, und zum anderen den Verlauf der Fluoreszenzemission ausreichend gut nachbildet, sodass nach Subtraktion das resultierende zweite Fluoreszenzspektrum näher bei Null liegt als das ursprüngliche erste Fluoreszenzemissionsspektrum, ohne jedoch die Strukturen der zu analysierenden Beiträge von zum Beispiel Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX, und unter Umständen auch von Blut, zu beeinträchtigen.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das dritte Fluoreszenzspektrum dadurch bereitgestellt, dass eine Modifikation des zweiten Fluoreszenzspektrums durchgeführt wird. Eine derartige Modifikation ist gerade dann besonders vorteilhaft, wenn das erste Fluoreszenzspektrum von durchbluteten Gewebe aufgenommen wurde und beispielsweise nicht von reinem Blut. Wird das erste Fluoreszenzspektrum nämlich von durchblutetem Gewebe aufgenommen, so stellt das gemessene erste Fluoreszenzspektrum nicht das eigentliche durch die jeweiligen Komponenten und Bestandteile des Bluts und des Gewebes emittierte Spektrum dar, sondern vielmehr ein beim Durchgang durch verschiedene Gewebeschichten gedämpftes beziehungsweise geschwächtes Spektrum dar. Daher ist es besonders vorteilhaft, eine entsprechende Modifikation des zweiten Fluoreszenzspektrums durchzuführen, um einer derartigen Dämpfung bzw. Abschwächung Rechnung zu tragen, und um so die gleichen Voraussetzungen wie für das Basis-Fluoreszenzspektrum zu schaffen, welches sich auf die mindestens eine Komponente als solche, d.h. ohne Abschwächung, bezieht. Die Modifikation stellt damit vorteilhafterweise die Möglichkeit bereit, den Einfluss der Strahlungsabsorption beim Durchgang durch das Gewebe bis zum Erreichen des Detektors, rechnerisch zu kompensieren.
Daher stellt es eine besonders vorteilhafte weitere Ausgestaltung der Erfindung dar, wenn die Modifikation eine Abschwächung von Strahlungsintensität gemäß dem Lambert-Beersche Gesetz berücksichtigt. Das Lambert-Beersche Gesetz beschreibt die Abschwächung der Intensität einer Strahlung beim Durchgang durch ein Medium mit einer absorbierenden Substanz.
Da der Grad der Abschwächung mitunter auch von der Konzentration der Absorbierenden Substanz abhängig ist, stellt es eine weitere besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung dar, wenn der Grad der Abschwächung während der Bestimmung des Vielfachen, insbesondere iterativ, bestimmt wird. Mit anderen Worten kann dieser Grad der Abschwächung durch einen Parameter repräsentiert werden, der während der iterativen Bestimmung des Vielfachen ebenfalls nach der Maßgabe bestimmt wird, dass der Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums minimal wird.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Absorptionsspektrum betreffend die wellenlängenabhängigen Absorptionseigenschaften des Bluts bereitgestellt und die Berücksichtigung der Abschwächung erfolgt in Abhängigkeit von dem Absorptionsspektrum des Bluts. Dies ist besonders vorteilhaft, da bei der Abschwächung der Strahlungsintensität beim Messen des ersten Fluoreszenzspektrums die Absorptionseigenschaften des Bluts beziehungsweise des Hämoglobins maßgeblich sind. Das dritte Fluoreszenzspektrum kann sich also beispielsweise durch Division des zweiten Fluoreszenzspektrums durch eine Exponentialfunktion mit parametrierten Exponenten ergeben. Dieser parametrierte Exponent der Exponentialfunktion, der die parametrierte und wellenlängenabhängige Blutabsorption darstellt, wird dann gleichzeitig mit der Bestimmung des Vielfachen durch das Iterationsverfahren angepasst unter der Vorgabe, die zweite Ableitung des Restspektrums zu minimieren. Somit kann besonders vorteilhafterweise durch das beschriebene Verfahren nicht nur die fluoreszierende Komponente quantitativ bestimmt werden, sondern gleichzeitig auch den Beitrag der Blutabsorption zum gemessenen ersten Fluoreszenzspektrum. Mit anderen Worten werden während dieses Iterationsverfahrens das durch das Vielfache als Parameter parametrierte bekannte Basis-Fluoreszenzspektrum und der parametrierte spektrale Verlauf der Blutabsorption an das (optional durch die unten beschriebene Konstante verschobene) zweite Fluoreszenzspektrum angefittet, sodass die Ableitung des Restspektrums bzw. deren Betrag minimal wird.
Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei der Modifikation das zweite Fluoreszenzspektrum um einen vorbestimmten konstanten Amplitudenwert bzw. Intensitätswert verschoben. Durch diese Maßnahme lässt sich wieder eine deutliche Verbesserung hinsichtlich der Genauigkeit der Messergebnisse erzielen. Insbesondere wird hierbei die Verschiebung des zweiten Fluoreszenzspektrums um den vorbestimmten konstanten Amplitudenwert vorgenommen, bevor eine zweite Modifikation des resultierenden Terms durch die Berücksichtigung der Abschwächung der Strahlungsintensität erfolgt. Dies beruht auf der Erkenntnis, dass die Abschwächung der Strahlungsintensität wellenlängenabhängig ist, d.h. also, dass sich die Absorption der Strahlungsintensität durch das Blut bzw. das Hämoglobin in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen des ersten Fluoreszenzspektrum und damit auch des zweiten Fluoreszenzspektrum unterschiedlich stark bemerkbar macht. Das zweite Fluoreszenzspektrum ergibt sich wiederum aus Subtraktion der parametrierten Funktion von dem aufgenommenen ersten Fluoreszenzspektrum. Jedoch ist es unter Umständen bedingt durch diese Subtraktion der Fall, dass das zweite Fluoreszenzspektrum zum Teil positiv sowie auch zum Teil negativ verläuft. Daher würde nun eine Division oder Multiplikation dieses zweiten Fluoreszenzspektrums mit einer wellenlängenabhängigen Funktion, die die Abschwächung der Strahlungsintensität, insbesondere durch Blut, beschreibt, zu Fehlern führen, da sich für positive und für negative Werte des zweiten Fluoreszenzspektrums unterschiedliche Modifikationen ergeben würden, sodass die zweite Ableitung des Resultats neue, größere Strukturen aufweisen würde, die eigentlich nicht vorhanden sind. Damit würde der Fit, das heißt das Iterationsverfahren, nicht die richtige Amplitude finden. Durch die Verschiebung des zweiten Fluoreszenzspektrums um die beschriebene Konstante kann dies vorteilhafterweise vermieden werden.
Besonders vorteilhaft ist es dabei, wenn das zweite Fluoreszenzspektrum derart verschoben wird, dass die Amplitudenwerte des dritten Fluoreszenzspektrums für einen vorbestimmten zweiten Wellenlängenbereich alle positiv oder alle negativ sind. Dieser zweite Wellenlängenbereich stellt dabei vorzugsweise den Wellenwellenlängenbereich dar, in welchem die Optimierung, insbesondere Minimierung, des Betrags der zweiten Ableitung des Restspektrums erfolgen soll. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn der vorbestimmte konstante Amplitudenwert positiv ist und zum zweiten Fluoreszenzspektrum addiert wird und derart bemessen ist, dass dieser in etwa der Amplitude des aufgenommenen ersten Fluoreszenzspektrums oder der parametrierten Funktion mit dem bestimmten Parametern im Wellenlängenbereich der maximalen Blutabsorption, d.h. ca. bei 576 nm, entspricht. Dies ist wie folgt zu erklären: Die Modifikation zur Bereitstellung des dritten Fluoreszenzspektrums durch Berücksichtigung der Abschwächung der Strahlungsintensität wird mit Bezug auf das zweite Fluoreszenzspektrum durchgeführt und nicht in Bezug auf das ursprünglich gemessene erste Fluoreszenzspektrum. Dies führt zu einem kleinen Fehler, der entsprechend durch die Subtraktion der parametrierten Funktion mit dem bestimmten Parameter bedingt ist. Dieser Fehler macht sich insbesondere an der Stelle der maximalen Blutabsorption bemerkbar. Entsprechend kann dieser Fehler kompensiert werden, indem als Konstante gerade der Wert der subtrahierten Funktion an der Stelle dieser maximalen Blutabsorption wieder zum zweiten Fluoreszenzspektrum addiert wird. Im allgemeinen jedoch führt jeder beliebige Wert einer konstanten Amplitudenverschiebung des zweiten Fluoreszenzspektrums zu einer Verbesserung der Messergebnisse, sofern durch diese Amplitudenverschiebung ein rein positives oder rein negatives resultierendes Fluoreszenzspektrum, insbesondere das dritte Fluoreszenzspektrum, erreicht wird, zumindest im relevanten, betrachteten, zweiten Wellenlängenbereich, in welchem anschließend auch vorzugsweise das Iterationsverfahren ausgeführt werden soll. Durch einen zehnfach höheren konstanten Amplitudenwert als der Amplitudenwert des ersten Fluoreszenzspektrums bzw. der Funktion an der Stelle der maximalen Blutabsorption bei ca. 576 nm führt beispielsweise ebenso zu sehr guten Messergebnissen, während ein zu kleiner Wert, wie beispielsweise Faktor 10 kleiner als dieser beschriebene Wert an der Stelle der maximalen Blutabsorption, dagegen weniger bevorzugt ist.
Die Verschiebung des zweiten Fluoreszenzspektrums um den vorbestimmten konstanten Amplitudenwert hat also gerade dann besonders große Vorteile in Bezug auf die Genauigkeit der letztendlichen Messergebnisse wenn zusätzlich auch eine Modifikation zur Berücksichtigung der Abschwächung der Strahlungsintensität, welche wellenlängenabhängig ist, zur Darstellung bzw. Bereitstellung des dritten Fluoreszenzspektrums durchgeführt wird. Diese Maßnahmen d.h. die Berücksichtigung der Abschwächung der Strahlungsintensität und in gleicher Weise auch die Addition bzw. Subtraktion der genannten Konstante ist entsprechend auch besonders vorteilhaft, wenn die Messung an durchblutetem Gewebe durchgeführt wird, da sich diese Abschwächung und der Einfluss der Blutabsorption beim Durchgang durch mehrere Gewebeschichten deutlich bemerkbar macht. So können durch diese Maßnahmen enorme Vorteile in Bezug auf die letztendliche Genauigkeit der Messergebnisse erreicht werden.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist das Basis-Fluoreszenzspektrum in zumindest einem dritten Wellenlängenbereich einen spektralen Anteil mit einer Amplitude größer als ein vorbestimmbarer Grenzwert auf und/oder das Absorptionsspektrum des Bluts weist in zumindest einem vierten Wellenlängenbereich einen spektralen Anteil mit einer Amplitude größer als ein vorbestimmbarer Grenzwert auf. Der dritte bzw. vierte Wellenlängenbereich definiert also jeweils einen Wellenlängenbereich, in welchem das Basis-Fluoreszenzspektrum bzw. das Absorptionsspektrum des Bluts signifikante Strukturen aufweisen. Der vorbestimmbare Grenzwert kann beispielsweise als 10 % der maximalen Amplitude des entsprechenden Spektrums vorbestimmt sein. Des Weiteren wird das erste Fluoreszenzspektrum in zumindest einem fünften Wellenlängenbereich durch die Funktion approximiert. Dabei umfasst der zumindest eine fünfte Wellenlängenbereich den zumindest einen vierten und/oder den zumindest einen dritten Wellenlängenbereich und ist breiter als der zumindest eine dritte und/oder vierte Wellenlängenbereich, und/oder der zumindest eine fünfte Wellenlängenbereich überschneidet sich nicht mit dem zumindest einen dritten und/oder vierten Wellenlängenbereich.
Die parametrierte Funktion, die das erste Fluoreszenzspektrum approximieren soll, soll dabei nach Möglichkeit nur das Krümmungsverhalten des Untergrundes nachbilden, ohne jedoch dabei die signifikanten Strukturen, bedingt durch die zu bestimmende Komponente und/oder durch die Blutabsorption, nachzubilden. Hierzu gibt es zwei besonders vorteilhafte Möglichkeiten die durch oben genannte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung beschrieben sind. Zum einen kann der Fitbereich, das heißt der fünfte Wellenlängenbereich, zum Anfitten der parametrierten Funktion an das erste Fluoreszenzspektrum entsprechend größer als der Wellenlängenbereich gewählt werden, in welchem die signifikanten Strukturen der zu bestimmenden Komponenten sowie der Blutabsorption zu finden sind, das heißt also als der dritte und vierte Wellenlängenbereich, gewählt werden. Alternativ oder zusätzlich, um eine weitere Verbesserung zu erzielen, können beim Anfitten dieser Funktion an das erste Fluoreszenzspektrum auch die Wellenlängenbereiche, in welchen diese signifikanten Strukturen der zu bestimmenden Komponenten und/oder der Blutabsorption zu finden sind, aus dem Fitbereich ausgenommen werden. Beide Varianten führen zu einer besonders guten Nachbildung des Krümmungsverhaltens der Untergrundfluoreszenz, was wiederum zu einer deutlichen Verbesserung der Messergebnisse bei der quantitativen Bestimmung der Komponente führt. Liegt also beispielsweise der dritte und/oder vierte Wellenlängenbereich, wie dies für die Blutabsorption unters Fluoreszenzspektrum von Zink-Protoporphyrin der Fall ist, zwischen 560 nm und 615 nm, so ist es vorteilhaft, wenn der fünfte Wellenlängenbereich zum Beispiel den Bereich 525 nm bis 750 nm umfasst oder darstellt. Der Fitbereich zum Anfitten der Funktion an das erste Fluoreszenzspektrum ist damit deutlich größer als der Wellenlängenbereich, in welchem die signifikanten Strukturen der Blutabsorption oder des Zink-Protoporphyrin zu finden sind. Eine weitere Verbesserung lässt sich beispielsweise erzielen, wenn dieser Fitbereich, das heißt also der fünfte Wellenlängenbereich, die Bereiche zwischen 525 nm und 570 nm und/oder zwischen 700 nm und 750 nm umfasst oder darstellt. Somit lässt sich die Funktion gezielt in den Wellenlängenbereich an das erste Fluoreszenzspektrum anfitten, in welchem keine oder kaum Strukturen der Blutabsorption bzw. der zu bestimmenden Komponente zu finden sind. Es ist also vorteilhaft, wenn der fünfte Wellenlängenbereich, in welchen also die Funktion an das erste Fluoreszenzspektrum approximiert wird, einem oder mehrere Wellenlängen aus dem Bereich zwischen 525 nm und 570 nm aufweist, d.h. also 525 nm, 526 nm, 527 nm, 528 nm, 529 nm, 530 nm, 531 nm, 532 nm, 533 nm, 534 nm, 535 nm, 536 nm, 537 nm, 538 nm, 539 nm, 540 nm, 541 nm, 542 nm, 543 nm, 544 nm, 545 nm, 546 nm, 547 nm, 548 nm, 549 nm, 550 nm, 551 nm, 552 nm, 553 nm, 554 nm, 555 nm, 556 nm, 557 nm, 558 nm, 559 nm, 560 nm, 561 nm, 562 nm, 563 nm, 564 nm, 565 nm, 566 nm, 567 nm, 568 nm, 569 nm und/oder 570 nm, wobei vorzugsweise dabei weiterhin eine oder mehrere Wellenlängen aus dem Bereich zwischen 560 nm und 615 nm, das heißt also 560 nm, 561 nm, 562 nm, 563 nm, 564 nm, 565 nm, 566 nm, 567 nm, 568 nm, 569 nm, 570 nm, 571 nm, 572 nm, 573 nm, 574 nm, 575 nm, 576 nm, 577 nm, 578 nm, 579 nm, 580 nm, 581 nm, 582 nm, 583 nm, 584 nm, 585 nm, 586 nm, 587 nm, 588 nm, 589 nm, 590 nm, 591 nm, 592 nm, 593 nm, 594 nm, 595 nm, 596 nm, 597 nm, 598 nm, 599 nm, 600 nm, 601 nm, 602 nm, 603 nm, 604 nm, 605 nm, 606 nm, 607 nm, 608 nm, 609 nm, 610 nm, 611 nm, 612 nm, 613 nm, 614 nm und/oder 615 nm, ausgenommen werden.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das Vielfache derart bestimmt, dass der Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums in Bezug auf einen vorbestimmten sechsten Wellenlängenbereich minimal wird, der zumindest den zweiten Wellenlängenbereich umfasst, der wiederum vorzugsweise auch den dritten und/oder vierten Wellenwellenlängenbereich umfasst. Zum einen ist es besonders vorteilhaft, die Optimierung bzw. Minimierung des Betrags der zweiten Ableitung des Restspektrums auf einen interessierenden Wellenlängenbereich zu beschränken, um Rechenleistung und damit auch Zeit zu sparen. Dieser interessierende Bereich sollte dabei jedoch die signifikanten Strukturen der zu bestimmenden Komponente sowie auch optional der Blutabsorption umfassen. Gleichzeitig sollte das dritte Fluoreszenzspektrum in diesem Bereich auch ausschließlich positiv oder ausschließlich negativ sein, insbesondere aus den oben bereits beschriebenen Gründen. Beispielsweise können somit auch der zweite Wellenlängenbereich und der dritte Wellenlängenbereich identisch definiert sein und vorzugsweise den dritten und vierten Wellenlängenbereich umfassen.
Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn der sechste Wellenlängenbereich zwischen 560 nm und 615 nm liegt oder diesen Bereich darstellt, da ein derart gewählter sechster Wellenlängenbereich vorteilhafterweise die oben genannten vorteilhaften Bedingungen erfüllt.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das erste Fluoreszenzspektrum für zumindest eine erste Anregungswellenlänge aufgenommen und mindestens ein zweites erstes Fluoreszenzspektrum für zumindest eine zweite von der ersten verschiedenen Anregungswellenlänge aufgenommen. Weiterhin wird ein Faktor in Abhängigkeit von der ersten Anregungswellenlänge und der zweiten Anregungswellenlänge bereitgestellt, insbesondere in Abhängigkeit von einer Differenz einer Anregungseffizienz zwischen der ersten und zweiten Anregungswellenlänge. Das zweite erste Fluoreszenzspektrum wird durch eine zweite parametrierte Funktion approximiert, und dabei mindestens ein zweiter Funktionsparameters der zweiten parametrierten Funktion bestimmt. Weiterhin wird die zweite Funktion mit dem mindestens einen bestimmten zweiten Funktionsparameter vom zweiten ersten Fluoreszenzspektrum subtrahiert und dadurch ein zweites zweites Fluoreszenzspektrum bereitgestellt, wobei in Abhängigkeit von dem zweiten zweiten Fluoreszenzspektrum ein zweites drittes Fluoreszenzspektrum dargestellt wird, welches sich zumindest aus dem Vielfachen des mit dem Faktor multiplizierten zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums und einem zweiten Restspektrum zusammensetzt. Des Weiteren wird das Vielfache derart bestimmt, dass der Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums und ein Betrag der zweiten Ableitung des zweiten Restspektrums insgesamt, zum Beispiel im Mittel, minimal werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren oder eines seiner Ausgestaltungen kann also in gleicher Weise für ein weiteres erstes aufgenommenes Fluoreszenzspektrum, das hier als zweites erstes Fluoreszenzspektrum bezeichnet wird, oder auch beliebig vieler weiterer erster bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen aufgenommener Fluoreszenzspektren durchgeführt werden, wobei dann bei der Bestimmung des Vielfachen der Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums und der Betrag der zweiten Ableitung des zweiten Restspektrums, insbesondere auch der eines jeden weiteren zweiten Restspektrums, gleichzeitig minimiert werden. Diese vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung beruht dabei auf der Erkenntnis, dass sich die Fluoreszenzemission der Komponente, wie beispielsweise Zink-Protoporphyrin, bei verschiedenen Anregungswellenlängen in ihrer Intensität auf bekannte oder zumindest empirisch einfach bestimmbare Weise unterscheiden. Dieser Unterschied kann durch Angabe der Anregungseffizienz bei verschiedenen Anregungswellenlängen quantifiziert werden. Um beispielsweise die Anregungseffizienz einer Komponente für verschiedene Anregungswellenlängen zu ermitteln, kann eine Probe mit der Komponente als Reinsubstanz nacheinander mit Licht unterschiedlicher Anregungswellenlängen bestrahlt und die der jeweiligen Anregungswellenlängen zugeordneten Emissionsspektren der Komponente aufgenommen werden. Diese weisen den gleichen spektralen Verlauf auf, unterscheiden sich jedoch in ihrer Intensität. Die Anregungseffizienz kann damit als Verhältnis der Intensität, zum Beispiel im Mittel, für eine bestimmte Emissionswellenlänge oder eine bestimmten Emissionswellenlängenbereich oder ähnliches, für eine bestimmte Anregungswellenlänge zu einer Referenz bestimmt werden. Die Referenz kann zum Beispiel das Fluoreszenzspektrum mit maximaler Intensität, welchem dann entsprechend eine Anregungseffizienz von 100% bzw. 1 zugeordnet werden kann, darstellen. Im Allgemeinen kann jedoch jedes Fluoreszenzspektrum einer bestimmten Anregungswellenlänge als Referenz dienen, da nur die Verhältnisse im vorliegenden Fall eine Rolle spielen.
Liegt also beispielsweise das Basis-Fluoreszenzspektrum für eine bestimmte erste Anregungswellenlänge vor, und wird das erste Fluoreszenzspektrum mit Licht dieser ersten Anregungswellenlänge aufgenommen, und das zweite erste Fluoreszenzspektrum mit Licht einer anderen, zweiten Anregungswellenlänge, so kann der oben beschriebene Faktor durch das Verhältnis der Anregungseffizienz der zweiten Anregungswellenlänge zur Anregungseffizienz der ersten Anregungswellenlänge bereitgestellt werden.
Alternativ könnte auch für eine jeweilige Anregungswellenlänge ein entsprechendes Basis-Fluoreszenzspektrum bereitgestellt werden, so dass keine Berücksichtig unterschiedlicher Anregungseffizienzen durch den beschriebenen Faktor bei der gleichzeitigen Minimierung der Beträge der jeweiligen Restspektren erfolgen muss. Die oben beschriebene Variante hat jedoch den großen Vorteil, dass ein gemeinsames Basis-Fluoreszenzspektrum genutzt werden kann. Dieses Verfahren lässt sich auf beliebig viele Aufnahmen von ersten Fluoreszenzspektren mit jeweiligen unterschiedlichen Anregungswellenlängen auf besonders einfache Weise verallgemeinern. Hierdurch lässt sich die Genauigkeit vorteilhafterweise noch zusätzlich erhöhen.
Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Messgerät zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut. Dabei weist das Messgerät einen Speicher auf, in welchem zumindest ein Teil eines Basis-Fluoreszenzspektrums der mindestens einen Komponente für eine bekannte Menge der mindestens einen Komponente ablegbar ist, sowie eine Messeinrichtung zum Aufnehmen eines ersten Fluoreszenzspektrums zumindest des Bluts. Diese Messeinrichtung kann beispielsweise eine Lichtquelle bzw. Strahlungsquelle zum Aussenden von Anregungsstrahlung im ersten Wellenlängenbereich aufweisen, sowie eine Detektionseinrichtung zum Detektieren, insbesondere zum spektral aufgelösten Detektieren des ersten Fluoreszenzspektrums. Des Weiteren weist das Messgerät eine Auswerteeinrichtung auf, die dazu ausgelegt ist, das erste Fluoreszenzspektrums durch eine parametrierte Funktion zu approximieren, und dabei mindestens einen Funktionsparameter der parametrierten Funktion zu bestimmen, die Funktion mit dem mindestens einen bestimmten Funktionsparameter vom ersten Fluoreszenzspektrum zu subtrahieren und dadurch ein zweites Fluoreszenzspektrum bereitzustellen, in Abhängigkeit von dem zweiten Fluoreszenzspektrum ein drittes Fluoreszenzspektrum darzustellen, welches sich aus einem Vielfachen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums und einem Restspektrum zusammensetzt, das Vielfache derart zu bestimmen, dass ein Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums minimal wird und das bestimmte Vielfache zu einem eine Mengenangabe der Komponente definierenden Wert gemäß einer vorbestimmten Zuordnung zuzuordnen.
Die mit Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren und seinen Ausgestaltungen genannten Merkmale, Merkmalskombinationen und deren Vorteile gelten in gleicher Weise für das erfindungsgemäße Messgerät. Darüber hinaus ermöglichen die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und seinen Ausgestaltungen genannten Verfahrensschritte die Weiterbildung des erfindungsgemäßen Messgeräts durch weitere gegenständliche Merkmale. Zudem kann das Messgerät beispielsweise auch eine Anzeigeeinrichtung aufweisen, auf welcher der letztendlich bestimmte die Mengenangabe der Komponente definierende Wert ausgegeben bzw. angezeigt wird.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen, den Figuren und der Figurenbeschreibung. Die vorstehend in der Beschreibung genannten Merkmale und Merkmalskombinationen sowie die nachfolgend in der Figurenbeschreibung genannten und/oder in den Figuren alleine gezeigten Merkmale und Merkmalskombinationen sind nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen verwendbar, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Es sind somit auch Ausführungen von der Erfindung als umfasst und offenbart anzusehen, die in den Figuren nicht explizit gezeigt und erläutert sind, jedoch durch separierte Merkmalskombinationen aus den erläuterten Ausführungen hervorgehen und erzeugbar sind. Es sind auch Ausführungen und Merkmalskombinationen als offenbart anzusehen, die somit nicht alle Merkmale eines ursprünglich formulierten unabhängigen Anspruchs aufweisen. Es sind darüber hinaus Ausführungen und Merkmalskombinationen, insbesondere durch die oben dargelegten Ausführungen, als offenbart anzusehen, die über die in den Rückbezügen der Ansprüche dargelegten Merkmalskombinationen hinausgehen oder abweichen.
Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Messgeräts zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
2 eine grafische Darstellung des aufgenommenen ersten Fluoreszenzspektrums und der an dieses angefitteten parametrierten Funktion;
3 eine grafische Darstellung des zweiten Fluoreszenzspektrums, welches sich aus der Subtraktion der Funktion vom ersten Fluoreszenzspektrum ergibt, das Basis-Fluoreszenzspektrum für Zink-Protoporphyrin, den spektralen Verlauf der Blutabsorption und das Restspektrum;
4 eine grafische Darstellung von zweiten Ableitungen von Restspektren, von denen eines mit Subtraktion der Funktion vom ersten Fluoreszenzspektrum ermittelt wurde und eines ohne Subtraktion;
5 eine grafische Darstellung Restspektren, von denen eines mit Subtraktion der Funktion vom ersten Fluoreszenzspektrum ermittelt wurde und eines ohne Subtraktion;
6 eine grafische Darstellung von zweiten Ableitungen von Restspektren, von denen eines mit Addition einer Konstante zum zweiten Fluoreszenzspektrum ermittelt wurde und eines ohne Addition einer Konstante;
7 eine graphische Darstellung von Ergebnissen für das quantitativ bestimmte Zink-Protoporphyrin, welches einerseits mit Subtraktion der parametrierten Funktion vom ersten Fluoreszenzspektrum bestimmt wurde, und andererseits ohne Subtraktion; und
8 ein Ablaufdiagram zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.

1 zeigt eine schematische Darstellung eines Messgeräts 10 zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Das Messgerät 10 weist hierzu eine Lichtquelle 12, wie beispielsweise eine Laserlichtquelle, auf, welche dazu ausgelegt ist, Anregungsstrahlung mit zumindest einer Wellenlänge in einem vorbestimmten Wellenlängenbereich, wie beispielsweise zwischen 395 nm und 435 nm, vorzugsweise bei ca. 425 nm, zu emittieren. Insbesondere ist die Lichtquelle 12 dazu ausgelegt, diese Anregungsstrahlung auf eine Probe 14, wie beispielsweise durchblutetes und intaktes Gewebe, zum Beispiel die orale Mucosa, insbesondere das feuchte Lippenrot der Unterlippe, einzustrahlen. Die Bestrahlung kann über eine in Kontakt mit der Probe 14 gebrachte Glasfaser erfolgen, oder auch im Freistrahl oder mit angepasster Optik. Die beleuchtete Probe 14 wird infolgedessen zur Emission von Fluoreszenzstrahlung 16 angeregt, die durch einen Detektor 18 des Messgeräts 10 spektral aufgelöst erfasst wird. Die Probe stellt im Allgemeinen vorzugsweise eine Matrix, wie das oben genannte Gewebe, dar, in welche ein Fluorophor, wie beispielsweise Zink-Protoporphyrin oder Protoporphyrin IX, eingebettet ist. Das Fluorophor wird durch Beleuchtung der gesamten Matrix in einem geeigneten Wellenlängenband zur Fluoreszenz angeregt, wobei unvermeidlich andere in der Matrix vorhandene Fluorophore ebenfalls zur Fluoreszenz angeregt werden, wobei das Fluorophor eine mit der Wellenlänge höherfrequente spektrale Signatur aufweist als die Gesamtheit der anderen in der Matrix vorhandenen Fluorophore. Das Fluoreszenzsignal des blutgebundenen Fluorophors und das Untergrundsignal der anderen, unvermeidlich angeregten Fluorophore werden in drei oder mehr Wellenlängenbändern spektral aufgelöst durch den Detektor 18 erfasst.
Weiterhin weist das Messgerät 10 eine Auswerteeinrichtung 20 auf, welche dazu ausgelegt ist, das durch den Detektor 18 aufgenommene Fluoreszenzspektrum auszuwerten und dabei insbesondere zumindest eine bestimmte fluoreszierende Komponente, welche in der Probe 14 enthalten ist, quantitativ zu bestimmen. Im vorliegenden Fall handelt es sich bei dieser Komponente vorzugsweise um Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX. Weiterhin weist das Messgerät 10 einen Speicher 22 auf, in welchem zumindest ein Teil eines Basis-Fluoreszenzspektrums der zu bestimmenden Komponente, also beispielsweise Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX, abgelegt ist und welches den spektralen Verlauf der Fluoreszenzemission dieser Komponente für eine bekannte Menge, insbesondere einem bekannten Verhältnis dieser Komponente zu Häm, angibt. Auch kann weiterhin im Speicher ein Basis-Absorptionsspektrum, welches die wellenlängenabhängige Strahlungsabsorption durch Blut für eine gegebene Konzentration beschreibt, abgelegt sein. Das Ergebnis der Auswertung kann dann auf einer Anzeigeeinrichtung 24, wie beispielsweise ein Display, des Messgeräts 10 angezeigt werden. Die bei der durch die Auswerteeinrichtung 20 ausgeführten Verfahrensschritte zur quantitativen Bestimmung der zumindest einen bestimmten Komponenten in Blut werden nachfolgend anhand von 2 bis 8 näher beschrieben.
2 zeigt eine grafische Darstellung des durch das Messgerät 10 aufgenommenen ersten Fluoreszenzspektrums S1, wobei insbesondere der Verlauf der Intensität I in willkürlichen Einheiten gegen die Wellenlänge A aufgetragen ist. An dieses erste Fluoreszenzspektrum Spektrum S1 wird nun eine parametrierte Funktion F gefittet. In diesem Bespiel stellt die Funktion eine parametrierte Gaußkurve dar, wie beispielsweise $F = p 1 \cdot e^{- {\frac{λ^{2}}{p 2}}_{,}}$
wobei p1 und p2 die beim Anfitten zu bestimmenden Parameter darstellen. Beim Anfitten an das erste Fluoreszenzspektrum S1 werden entsprechend die Parameter p1 und p2 so bestimmt, dass der Verlauf des ersten Fluoreszenzspektrums S1 möglichst gut approximiert wird. Die genaue Funktion ist nicht entscheidend, vorteilhaft ist nur, dass die Funktion erstens in dem Bereich, in dem sich das zu bestimmende Signal von zum Beispiel Zink-Protoporphyrin befindet, keine Strukturen ähnlicher Ausprägung wie das zu bestimmende Signal aufweist, d.h. zum Beispiel glatt ist, und zweitens den Verlauf der Fluoreszenzemission, d.h. des ersten Fluoreszenzspektrums S1, ausreichend gut nachbildet, sodass nach einer Subtraktion das resultierende Spektrum näher bei Null liegt als das ursprüngliche erste Fluoreszenzspektrum S1, ohne jedoch die Strukturen der zu analysierenden Beiträge von Zink-Protoporphyrin und Protoporphyrin IX, und unter Umständen auch von Blut zu beeinträchtigen.
Zum Anfitten eignen sich entsprechend auch vielzählige andere Funktionen neben einer Gaußfunktion, wie beispielsweise eine Lorenzkurve, eine Spline-Interpolation zwischen gewählten Stützstellen, Funktionen proportional zu 1/(λⁿ), oder ähnliches. Beispielsweise kann das erste Fluoreszenzspektrum auch geglättet werden, zum Beispiel durch eine entsprechende Mittelung benachbarter Intensitätswerte oder durch Filterung, und das geglättete Spektrum kann die Funktion F darstellen. Auch kann das erste Fluoreszenzspektrum geglättet werden und erst anschließend die Funktion F, wie beispielsweise die parametrierte Gaußkurve, an das geglättete Spektrum angefittet werden.
Um weitere Verbesserungen zu erzielen, und um insbesondere durch die Funktion F möglichst nur den unbekannten Untergrund nachzubilden, jedoch nicht die Strukturen, die vom zu bestimmenden Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX und der Blutabsorption herrühren, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Beispielsweise kann die Funktion F in einem Wellenlängenbereich, insbesondere dem fünften Wellenlängenbereich, angefittet werden, indem keine ausgeprägten Signaturen der Zink-Protoporphyrin Fluoreszenz und der Blutabsorption liegen. Dies kann beispielsweise ein benachbarter Bereich sein. Zum Beispiel liegen für die oben genannten Komponenten die ausgeprägten Signaturen im Bereich zwischen 570 nm bis 610 nm. Daher wäre ein geeigneter benachbarter Bereich kleiner 570 nm, also beispielsweise 525 nm bis 570 nm. Auch können mehrere Bereiche ohne ausgeprägte Signaturen für das Anfitten der Funktion F verwendet werden, wie zum Beispiel 525 nm bis 570 nm und 700 nm bis 750 nm. Der Bereich dazwischen kann entsprechend ausgespart werden. Weitere Möglichkeit besteht darin, dass die Funktion F auch in dem Bereich an das erste Fluoreszenzspektrum S1 angefittet wird, der die spektralen Signaturen enthält, wobei die Signaturen erwartungsgemäß klein gegenüber dem Untergrund sind. Vorteilhaft ist es aber dann, den Wellenwellenlängenbereich, indem die Funktion an das erste Fluoreszenzspektrum S1 angefittet wird, nach Möglichkeit größer zu wählen, als der Wellenlängenbereich, in dem sich diese Signaturen befinden. Beispielsweise kann hierzu ein Wellenlängenbereich von 525 nm bis 720 nm als fünfter Wellenlängenbereich verwendet werden. Auch ein kleinerer Fitbereich als fünfter Wellenlängenbereich kommt infrage, wie beispielsweise von 570 nm bis 610 nm. Die Verwendung des fünften Wellenlängenbereichs meint in diesem Zusammenhang, dass nur die Messwerte des ersten Fluoreszenzspektrums zum Anfitten für die Funktion F verwendet werden, die dem beschriebenen fünften Wellenlängenbereich zugeordnet sind.
Die an das erste Fluoreszenzspektrum S1 angefittete Funktion F wird letztendlich von diesem ersten Fluoreszenzspektrum S1 abgezogen. Hintergrund ist, dass die zweite Ableitung des resultierenden Spektrums dann näher bei Null liegt, als dies der Fall wäre, wenn man das erste Fluoreszenzemissionsspektrum selbst zweimal ableiten würde. Dies ermöglicht es vorteilhafterweise, zur Bestimmung der blutgebundenen Komponenten als Kriterium die Glattheit des Verlaufs des Untergrunds zu benutzen, wie nachfolgend zu 3 näher beschrieben wird.
3 zeigt dabei eine grafische Darstellung des zweiten Fluoreszenzspektrums S2, welches sich aus der Subtraktion der Funktion F vom ersten Fluoreszenzspektrum S1 ergibt. Aus diesem Spektrum S2 sollen nun die Beiträge von Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX und/oder der Blutabsorption bestimmt werden. Weiterhin in 3 dargestellt ist auch das Fluoreszenzemissionsspektrum von Zink-Protoporphyrin als Reinsubstanz, welches nachfolgend als Basis-Fluoreszenzspektrum S0 bezeichnet wird. Zudem ist in 3 auch der Einfluss der Blutabsorption A dargestellt. Wie in 3 zu sehen ist, können die Signaturen der Zink-Protoporphyrin-Fluoreszenz, d.h. des Basis-Fluoreszenzspektrums S0, und der Blutabsorption A in dem zweiten Fluoreszenzspektrum S2 wiedergefunden werden. Um dies besser veranschaulichen zu können, wurde die Blutabsorption A in 3 sowie auch in 5 und 6 skaliert und negativ dargestellt. Werden diese Beiträge herausgerechnet, so verbleibt ein zumindest im Fitbereich, der den Wellenlängenbereich darstellt, in welchem das Herausrechnen erfolgt, und der in diesem Beispiel den Bereich zwischen 560 nm bis 615 nm darstellt, ein weitgehend glattes Spektrum, welches im Folgenden auch als Restspektrum U1 bezeichnet wird, und die Untergrundfluoreszenz widerspiegelt. Das Herausrechnen der oben genannten Beiträge erfolgt nun folgendermaßen:
Zunächst wird in Abhängigkeit vom zweiten Fluoreszenzspektrum S2 ein drittes Fluoreszenzspektrum wie folgt dargestellt, welches sich aus einem Vielfachen b des Basis-Fluoreszenzspektrums S0 und dem Restspektrum U1 zusammensetzt: $(S 2 (λ) + c) \cdot A (a, λ) - c = b \cdot S 0 (λ) + U 1 (λ)$
Das dritte Fluoreszenzspektrum, das heißt der linke Term der obigen Gleichung, ergibt sich durch Modifikation des zweiten Fluoreszenzspektrums S2 wie folgt: Zum einen beschreibt die Multiplikation mit der Funktion A (a, λ), den Einfluss der Blutabsorption. Dieser lässt sich insbesondere wie folgt darstellen: $A (a, λ) = e^{a \cdot B (λ)}$
Die Exponentialfunktion wird gewählt, da sie die Dämpfung von Licht beim Durchgang durch ein absorbierendes Medium, in diesem Fall Blut, gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz beschreibt. Das Fluoreszenzlicht durchdringt Gewebe bzw. Gewebeschichten verschiedener Dicke, wobei in diesem Fall ein Mittelwert angenommen wurde. Die Funktion B (λ) beschreibt die wellenlängenabhängige Absorption durch Blut, wobei der Parameter a noch zu bestimmen und den Grad der Abschwächung, welcher von der Konzentration des Absorbierenden Mediums abhängt, beschreibt. Zudem ist die Blutabsorption auch vom Sauerstoffgehalt des Bluts abhängig. Da die Messung des ersten Fluoreszenzspektrums vorzugsweise an der Innenseite der Unterlippe durchgeführt wird, wird entsprechend ein mittlerer Sauerstoffgehalt für die Beschreibung der Blutabsorption angenommen.
Entsprechend berücksichtigt also die Funktion A(a, A) die parametrierte, wellenlängenabhängige Blutabsorption. c bezeichnet eine Konstante, die zum zweiten Fluoreszenzspektrum S2 dazu addiert wird. Dies hat den Hintergrund, dass das Ausgangsspektrum, das heißt das zweite Fluoreszenzspektrum S2, positive sowie negative Anteile aufweisen kann, wie in 3 zu sehen ist. So würde die Multiplikation mit dem Term A(a, λ) in manchen Fällen die Kurve erhöhen, d.h. bei positiven Werten, und in manchen erniedrigen, d.h. bei negativen Werten, wodurch der Einfluss der Blutabsorption nicht zutreffend berücksichtigt werden kann. Diese Konstante c wird vorzugsweise so gewählt, dass das zweite Fluoreszenzspektrum S2 so verschoben wird, dass das resultierende Spektrum zumindest im vorbestimmten Fitbereich, das heißt dem sechsten Wellenlängenbereich, vorzugsweise nur positiv, optional auch nur negativ, ist. Die Konstante c kann auch wieder abgezogen werden, wie in obiger Gleichung dargestellt. Da jedoch nachfolgen nur die zweite Ableitung dieser Gleichung relevant ist, kann auch auf diese Subtraktion der Konstante verzichtet werden.
Gemäß obiger Gleichung lässt sich nun das unbekannte Restspektrum U1 wie folgt ausdrücken: $U 1 (λ) = (S 2 (λ) + c) \cdot A (a, λ) - b \cdot S 0 (λ) - c$
Diese Gleichung bildet nun die Grundlage für die Bestimmung der einzelnen Komponenten, d.h. des Anteils b der Zink-Protoporphyrin Fluoreszenz und des Anteils a der Blutabsorption. Hierzu werden die Beiträge bzw. die Parameter a und b iterativ so angepasst, dass die numerisch berechnete zweite Ableitung bzw. zweiter Differenzenquotient, des Restspektrums U1 nahe bei Null liegt, d.h. für den festgelegten Fitbereich, das heißt den sechsten Wellenlängenbereich, betragsmäßig minimiert wird. In einer Ausgestaltung erfolgt die numerische Berechnung der zweiten Ableitung über die zweifache Berechnung der Differenz jeweils zweier benachbarter spektraler Stützstellen. Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn vor und/oder nach der Berechnung eines jeweiligen Differenzenquotienten das berechnete Spektrum durch Mittelung über benachbarte Stützstellen und/oder Frequenzfilterung geglättet wird. Die iterative Anpassung der Parameter a und b kann beispielsweise über ein nichtlineares Fitverfahren wie dem Levenberg-Marquardt-Algorithmus erfolgen. Demgemäß werden also die der Beitrag a der Blutabsorption, sowie der Beitrag b von Zink-Protoporphyrin bestimmt, woraus sich letztendlich auch der unbekannte Untergrund gemäß dem Restspektrum U1 bestimmen lässt, wie dieser in 3 dargestellt ist. Durch das Herausrechnen der Beiträge der Zink-Protoporphyrin Fluoreszenz und der Blutabsorption auf die beschriebene Weise können die Strukturen in der zweiten Ableitung des Ausgangsspektrums stark reduziert werden, wie dies am nahezu krümmungsfreien Verlauf des Restspektrums U1 in 3 zumindest im Fitbereich, der hier zwischen 560 nm bis 615 nm gewählt wurde, zu sehen ist.
4 zeigt grafisch die zweite Ableitung U1" des berechneten Restspektrums U1, wobei die gestrichelte Linie M1 den Mittelwert der zweiten Ableitung U1" im Fitbereich darstellt. Zum Vergleich ist auch die zweite Ableitung U2" und deren Mittelwert M2 eines zweiten Restspektrums U2 (vergleiche 5) dargestellt, wie es sich ergeben würde, wenn das beschriebene Verfahren auf Basis des ersten Fluoreszenzspektrums S1 durchgeführt werden würde, ohne jedoch die Funktion F (vergleiche 2) von dem ersten Fluoreszenzspektrum S1 zu subtrahieren. Aus 4 wird deutlich, dass das Abziehen der Funktion F vor der Fitroutine dafür sorgt, dass die zweite Ableitung U1" des Resultats, das heißt des letztendlich bestimmten Restspektrums U1, deutlich näher bei Null liegt, als zöge man diese Funktion F vorher nicht ab. Dies sorgt dafür, dass der Fit präzisere, vom Untergrund unabhängigere Ergebnisse liefert.
Auf ähnliche Weise kann man auch den Beitrag der Protoporphyrin-IX-Fluoreszenz bestimmen, wobei es unter Umständen verschiedene Protoporphyrin IX-Signaturen gibt, je nachdem, ob das Protoporphyrin IX blutgebunden (Emissionsmaximum ca. bei 626 nm) oder oberflächlich im Gewebe (Emissionsmaximum ca. bei 636 nm) vorkommt. Um zum Beispiel die Protoporphyrin-IX-Fluoreszenz zusätzlich zu bestimmen, kann dies durch folgende Gleichung erfolgen: $U 1 (λ) = (S 2 (λ) + c) \cdot A (a, λ) - b \cdot S 0 (λ) - d \cdot S 02 (λ) - ...$
Hierbei wird ganz analog ein weiterer Term d · S02(λ) für die Protoporphyrin-IX-Fluoreszenz berücksichtigt, wobei S02(A) wiederum das Basis-Fluoreszenzspektrum für Protoporphyrin IX darstellt und der Parameter d den zu bestimmenden Anteil bzw. Vielfache darstellt. In diesem Beispiel werden dann in der Fitroutine sowohl die Parameter a, b sowie auch d iterativ angepasst, sodass zweite Ableitung des Restspektrums U1 im vorbestimmten Fitbereich minimal wird. Die Punkte „...“ sollen zum Ausdruck bringen, dass sich diese Gleichung für beliebig viele zu bestimmende Komponenten ganz analog entsprechend erweitern lässt, indem weitere zu bestimmende Vielfache mit dem jeweiligen bekannten Basis-Spektrum multipliziert und vom dritten Fluoreszenzspektrum subtrahiert werden. So lassen sich auch Beiträge von weiteren Komponenten bestimmen. Beispielsweise können weitere Beiträge von Chlorin-artigen Substanzen, oft mit einem Emissionsmaximum um 680 nm, ebenfalls vorhanden sein und angefittet werden.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und seinen Ausgestaltungen, die vor allem durch die Subtraktion der Funktion F vom ersten Fluoreszenzspektrum S1 bedingt sind, sowie zudem auch durch die Addition der Konstanten c, die dazu führt, dass der Einfluss der Blutabsorption erfolgreich herausgerechnet werden kann, wenn die Funktion F vorher abgezogen wurde, werden nun anhand von 5, 6 und 7 beschrieben.
5 zeigt dabei nochmal eine grafische Darstellung des spektralen Verlauf des berechneten Restspektrums U1, welches mit Subtraktion der Funktion F vom ersten Fluoreszenzspektrum S1 berechnet wurde, und im Vergleich dazu ein Restspektrum U2, welches ohne die vorhergehende Subtraktion der Funktion F vom ersten Fluoreszenzspektrum S1 berechnet wurde. Das Herausrechnen der Blutabsorption A, die ebenfalls nochmal dargestellt ist, erfolgt vollständig für den Fall, dass die Funktion F vom ersten Fluoreszenzspektrum S1 abgezogen wurde, während im anderen Fall ein deutlich sichtbarer Einfluss der Blutabsorption A im Restspektrum U2 verbleibt. Dieser sorgt für eine deutlich stärkere Krümmung dieses Restspektrums U2, was wiederum zur Folge hat, dass eine Bestimmung des Parameters b unter der Bedingung, dass die zweite Ableitung dieses Restspektrums U2 möglichst nahe bei Null liegt, deutlich schlechtere Ergebnisse liefert.
6 illustriert welchen Einfluss die Addition der Konstante c in der oben genannten Gleichung hat. Dargestellt ist in 6 wiederum das Restspektrum U1, das unter Berücksichtigung der Konstante c berechnet wurde, und im Vergleich dazu ein Restspektrum U3, wie es ohne die Addition der Konstante c berechnet wurde. Wird also die Konstante c nicht addiert, so kann der Einfluss der Blutabsorption A nicht korrigiert werden, während dies andernfalls schon gelingt.
Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und seinen Ausgestaltungen ist in 7 noch mal dargestellt. Illustriert ist hierbei die Abweichung D des Ergebnisses der quantitativen Bestimmung der Zink-Protoporphyrin-Fluoreszenz von einer Referenzmessung an 78 Probanden, aufgetragen gegen das Ergebnis der Referenzmessung R. Die Ergebnisse E2, für den Fall dass keine glatte Funktion F vom anfänglichen ersten Fluoreszenzspektrum S1 subtrahiert wurde, sind dabei durch runde Kreise illustriert, während die Ergebnisse E1, für welche die Funktion F vom ersten Fluoreszenzspektrum S1 subtrahiert wurde, durch Dreiecke illustriert sind. Weiterhin sind für die jeweiligen Messergebnisse E1, E2 auch die Limits of Agreement, welche die 1,96-fache Standardabweichung darstellen, eingezeichnet. Dabei liegt das mit L1 bezeichnete Limit of Agreement für die Ergebnisse E1 bei 25 Mikromol Zink-Protoporphyrin pro Mol Häm, während das Limit of Agreement L2 für die Ergebnisse E2 bei 39 Mikromol Zink-Protoporphyrin pro Mol Häm liegt und damit deutlich größer ist. Die Streuung der Ergebnisse E2, bei der keine glatte Funktion F subtrahiert wurde, ist erkennbar größer als die, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren oder eines seiner Ausführungsformen angewandt wurde.
In einer weiteren Ausgestaltung kann das Ergebnis des Verfahrens noch weiter verbessert werden, indem beispielsweise mehrere erste Fluoreszenzspektren, die bei weiteren Anregungswellenlängen aufgenommen wurden, benutzt werden. Bei verschiedenen Anregungswellenlängen wird sich die Fluoreszenzemission der Komponenten wie beispielsweise Zink-Protoporphyrin auf bekannte Weise unterscheiden. Im Beispiel Zink-Protoporphyrin liegt die Emission bei etwa 30 % bei Anregung mit einer Anregungswellenlänge von etwa 407 nm im Vergleich zur Anregung mit einer Anregungswellenlänge bei etwa 425 nm. Wird die Amplitude, das heiß das Vielfache, des Beitrags der Zink-Protoporphyrin Fluoreszenz zu den beiden Spektren gleichzeitig optimiert, insbesondere mit konstantem Vorfaktor, in diesem Beispiel 30 %, kann der Fit noch genauer den Beitrag der Zink-Protoporphyrin Fluoreszenz bestimmen. Daher ist es im Allgemeinen auch vorteilhaft, wenn mehrere Fluoreszenzsignale, das heißt mehrere erste Fluoreszenzspektren, in verschiedenen Anregungswellenlängenbändern aufgenommen werden und gleichzeitig zur iterativen Optimierung des Beitrags des zu bestimmenden Fluorophors benutzt werden. In diesem Beispiel könnte wiederum für das erste Fluoreszenzspektrum, das bei einer ersten Anregungswellenlänge aufgenommen wurde, für welche insbesondere auch das Basis-Fluoreszenzspektrum bereitgestellt ist, das Respektrum U1 durch die oben beschriebene Gleichung: $U 1 (λ) = (S 2 (λ) + c) \cdot A (a, λ) - b \cdot S 0 (λ) - c$
ausgedrückt werden, sowie analog dazu ein Restspektrum U12 für das bei der zweiten Anregungswellenlänge aufgenommene zweite erste Fluoreszenzspektrum durch: $U 12 (λ) = (S 22 (λ) + c 2) \cdot A 2 (a 2, λ) - F \cdot b \cdot S 0 (λ) - c 2.$
Hierbei bezeichnet dann S22 das zweite zweite Fluoreszenzspektrum, welches sich aus dem zweiten ersten aufgenommenen Fluoreszenzspektrum durch Subtraktion einer dieses approximierenden Funktion ergibt, c2 eine zweite Konstante, A2 der Einfluss der Blutabsorption bei dieser zweiten Anregungswellenlänge und F einen Faktor, der das Verhältnis der Anreungseffizienzen bei den unterschiedlichen Anregungswellenlängen angibt, also zum Beispiel 0,3 gemäß dem obigen Zahlenbeispiel bei einer ersten Anregungswellenlänge von 425 nm und einer zweiten Anregungswellenlänge von 407 nm für Zink-Protoporphyrin. Der nun in beiden Gleichungen vorkommende Beitrag b der Komponente kann nun analog wie oben bereits beschreiben bestimmt werden, indem nun die Beträge der zweiten Ableitungen der Restspektren U1 und U12 gleichzeitig minimiert werden, das heißt beispielsweise der Beitrag b, insbesondere auch wiederum die Beiträge der Blutabsorption A und A2, wird derart bestimmt, dass die Beträge der zweiten Ableitungen der Restspektren im Mittel oder in Summe minimal werden, insbesondere wiederum bezogen auf einen vorbestimmten betrachteten Wellenlängenbereich.
Das letztendlich durch das beschriebene Verfahren, insbesondere als Ergebnis des Optimierungsverfahrens, ermittelte Vielfache b und/oder d für eine jeweilige zu bestimmende fluoreszierende Komponente kann gemäß einer vorbestimmten Zuordnung, zum Beispiel mittels einer im Speicher 22 hinterlegten Kalibrationskurve, in Einheiten Mikromol Zink-Protoporphyrin pro Mol Häm und/oder Mikromol Protoporphyrin IX pro Mol Häm umgerechnet und auf der Anzeigeeinrichtung 22 des Messgeräts 10 angezeigt werden.
Referenzmessungen anhand von Blutproben mit unabhängiger Bestimmung von Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX und/oder der Blutabsorption können dabei zur Bestimmung solcher Kalibrationskurven dienen. Der letztendlich angezeigte Wert kann optional auch mit Angabe eines Normalbereichs angezeigt werden, zum Beispiel 20 bis 40 Mikromol Zink-Protoporphyrin pro Mol Häm.
8 zeigt ein Ablaufdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum quantitativen Bestimmen zumindest einer fluoreszierenden Komponente in Blut gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung. Hierbei wird in Schritt S10 zunächst ein Basis-Fluoreszenzspektrum der Komponente, wie beispielsweise Zink-Protoporphyrin, bereitgestellt. Weiterhin wird in Schritt S12 ein erstes Fluoreszenzspektrum von Blut oder durchblutetem Gewebe aufgenommen. In Schritt S14 wird dann eine parametrierte Funktion in einem vorbestimmten Wellenlängenbereich an das aufgenommene Fluoreszenzspektrum angefittet. Diese Funktion wird anschließend in Schritt S16 vom ersten Fluoreszenzspektrum subtrahiert. Zu diesem resultierenden zweiten Fluoreszenzspektrum weiterhin eine Konstante addiert, um in einem vorbestimmten Wellenlängenbereich ausschließlich positive oder ausschließlich negative Werte zu erreichen. In Schritt S20 wird durch eine weitere Modifikation, insbesondere durch die Berücksichtigung der Blutabsorption, ein drittes Fluoreszenzspektrum dargestellt, welches sich aus einem zu bestimmenden Vielfachen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums und einem noch zu bestimmenden und unbekannten Restspektrum zusammensetzt. Anschließend wird in Schritt S22 durch ein iteratives Verfahren sowohl die parametrierte Blutabsorption sowie auch das Vielfache derart bestimmt, dass der Betrag der zweiten Ableitung des Restspektrums in einem weiteren vorbestimmbaren Wellenlängenbereich minimal wird. Das so bestimmte Vielfache wird anschließend in Schritt S24 gemäß einer vorbestimmten Zuordnung skaliert und hierdurch auf einen die Mengenangabe der zu bestimmenden Komponente angegebenen Wert umgerechnet, welcher anschließend in Schritt S26 angezeigt wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2013/040398 A1 [0005]

Claims

Verfahren zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut (14), mit den Schritten: a) Bereitstellen zumindest eines Teils eines Basis-Fluoreszenzspektrums (S0) der mindestens einen Komponente für eine bekannte Menge der mindestens einen Komponente; b) Aufnehmen eines ersten Fluoreszenzspektrums (S1) des Bluts (14); gekennzeichnet durch c) Approximieren des ersten Fluoreszenzspektrums (S1) durch eine parametrierte Funktion (F), und dabei Bestimmen mindestens eines Funktionsparameters der parametrierten Funktion (F); d) Subtrahieren der Funktion (F) mit dem mindestens einen bestimmten Funktionsparameter vom ersten Fluoreszenzspektrum (S1) und dadurch Bereitstellen eines zweiten Fluoreszenzspektrums (S2); e) In Abhängigkeit von dem zweiten Fluoreszenzspektrum (S2) Darstellen eines dritten Fluoreszenzspektrums, welches sich zumindest aus einem Vielfachen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums (S0) und einem Restspektrum (U1) zusammensetzt; f) Bestimmen des Vielfachen derart, dass ein Betrag der zweiten Ableitung (U1") des Restspektrums (U1) minimal wird; und g) Zuordnen des bestimmten Vielfachen zu einem eine Mengenangabe der Komponente definierenden Wert gemäß einer vorbestimmten Zuordnung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine fluoreszierende Komponente Zink-Protoporphyrin und/oder Protoporphyrin IX umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der die Mengenangabe definierende Wert eine Konzentration oder ein Verhältnis angibt, insbesondere das Verhältnis Zink-Protoporphyrin/Häm und/oder Protoporphyrin IX/Häm.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums (S1) über ein vorbestimmtes Körperteil erfolgt, insbesondere über eine Mundhöhle, insbesondere über eine Unterlippeninnenseite oder eine Mundschleimhaut.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums (S1) über einen optisch zumindest zum Teil transparenten, blutgefüllten Schlauch erfolgt, insbesondere welcher während einer Dialyse oder einer Blutspende verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufnehmen des ersten Fluoreszenzspektrums (S1) zumindest das Blut (14) mit Anregungsstrahlung mit zumindest einer Wellenlänge in einem vorbestimmten ersten Wellenlängenbereich, insbesondere zwischen 395 nm und 435 nm, besonders bevorzugt mit 425 nm, bestrahlt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die parametrierte Funktion (F) eine hinreichend glatte Funktion darstellt, welche zumindest zum Teil eine von Null verschiedene Krümmung aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die parametrierte Funktion (F) eine parametrierte Gauß-Kurve oder eine parametrierte Lorenz-Kurve oder eine parametrierte Hyperbel oder einen parametrierten Polygonzug n-ten Grades darstellt oder durch eine Glättung des ersten Fluoreszenzspektrums (S1) bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Fluoreszenzspektrum dadurch bereitgestellt wird, dass eine Modifikation des zweiten Fluoreszenzspektrums (S2) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation eine Abschwächung von Strahlungsintensität gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz berücksichtigt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Grad der Abschwächung während der Bestimmung des Vielfachen in f), insbesondere iterativ, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Absorptionsspektrum (A) betreffend die wellenlängenabhängigen Absorptionseigenschaften des Bluts bereitgestellt wird und die Berücksichtigung der Abschwächung in Abhängigkeit von dem Absorptionsspektrum (A) des Bluts erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Modifikation das zweite Fluoreszenzspektrum (S2) um einen vorbestimmten konstanten Amplitudenwert verschoben wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Fluoreszenzspektrum (S2) derart verschoben wird, dass die Amplitudenwerte des dritten Fluoreszenzspektrums für einen vorbestimmten zweiten Wellenlängenbereich alle positiv oder alle negativ sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass - das Basis-Fluoreszenzspektrum (S0) in zumindest einem dritten Wellenlängenbereich einen spektralen Anteil mit einer Amplitude größer als ein vorbestimmbarer Grenzwert aufweist; und/oder - das Absorptionsspektrum (A) des Bluts (14) in zumindest einem vierten Wellenlängenbereich einen spektralen Anteil mit einer Amplitude größer als ein vorbestimmbarer Grenzwert aufweist, wobei das erste Fluoreszenzspektrum (S1) in zumindest einem fünften Wellenlängenbereich durch die Funktion (F) approximiert wird, und - wobei der zumindest eine fünfte Wellenlängenbereich den zumindest einen vierten und/oder den zumindest einen dritten Wellenlängenbereich umfasst und breiter ist als der zumindest eine dritte und/oder vierte Wellenlängenbereich, und/oder - wobei der zumindest eine fünfte Wellenlängenbereich sich nicht mit dem zumindest einen dritten und/oder vierten Wellenlängenbereich überschneidet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Vielfache derart bestimmt wird, dass der Betrag der zweiten Ableitung (U1") des Restspektrums (U1) in Bezug auf einen vorbestimmten sechsten Wellenlängenbereich minimal wird, der zumindest den zweiten Wellenlängenbereich umfasst, wobei der zweite Wellenlängenbereich auch den dritten und/oder vierten Wellenlängenbereich umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite und/oder dritte und/oder vierte Wellenlängenbereich zwischen 560 nm und 615 nm liegt, und wobei der fünfte Wellenlängenbereich zwischen 525 nm und 750 nm liegt, insbesondere zwischen 525 nm und 570 nm und/oder zwischen 700 nm und 750 nm, und wobei der sechste Wellenlängenbereich vorzugsweise zwischen 560 nm und 615 nm liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass - das erste Fluoreszenzspektrum für zumindest eine erste Anregungswellenlänge aufgenommen wird, - mindestens ein zweites erstes Fluoreszenzspektrum für zumindest eine zweite von der ersten verschiedenen Anregungswellenlänge aufgenommen wird, - wobei ein Faktor in Abhängigkeit von der ersten Anregungswellenlänge und der zweiten Anregungswellenlänge bereitgestellt wird, insbesondere in Abhängigkeit von einer Differenz einer Anregungseffizienz zwischen der ersten und zweiten Anregungswellenlänge, - wobei das zweite erste Fluoreszenzspektrum durch eine zweite parametrierte Funktion approximiert wird, und dabei mindestens ein zweiter Funktionsparameters der zweiten parametrierten Funktion bestimmt wird, - wobei die zweite Funktion mit dem mindestens einen bestimmten zweiten Funktionsparameter vom zweiten ersten Fluoreszenzspektrum subtrahiert wird und dadurch ein zweites zweites Fluoreszenzspektrum bereitgestellt wird, - wobei in Abhängigkeit von dem zweiten zweiten Fluoreszenzspektrum ein zweites drittes Fluoreszenzspektrum dargestellt wird, welches sich zumindest aus dem Vielfachen des mit dem Faktor multiplizierten zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums und einem zweiten Restspektrum zusammensetzt; und - wobei das Vielfache in Schritt f) derart bestimmt wird, dass der Betrag der zweiten Ableitung (U1") des Restspektrums (U1) und ein Betrag der zweiten Ableitung (U1") des zweiten Restspektrums (U1) insgesamt minimal wird.
Messgerät (10) zum quantitativen Bestimmen mindestens einer fluoreszierenden Komponente in Blut (14), das Messgerät aufweisend: a) einen Speicher (22), in welchem zumindest ein Teil eines Basis-Fluoreszenzspektrums (S0) der mindestens einen Komponente für eine bekannte Menge der mindestens einen Komponente ablegbar ist; b) eine Messeinrichtung (12) zum Aufnehmen eines ersten Fluoreszenzspektrums (S1) des Bluts; gekennzeichnet durch eine Auswerteeinrichtung (20), die dazu ausgelegt ist, c) das erste Fluoreszenzspektrum (S1) durch eine parametrierte Funktion (F) zu approximieren, und dabei mindestens einen Funktionsparameter der parametrierten Funktion (F) zu bestimmen; d) die Funktion (F) mit dem mindestens einen bestimmten Funktionsparameter vom ersten Fluoreszenzspektrum (S1) zu subtrahieren und dadurch ein zweites Fluoreszenzspektrum (S2) bereitzustellen; e) in Abhängigkeit von dem zweiten Fluoreszenzspektrum (S2) ein drittes Fluoreszenzspektrum darzustellen, welches sich aus einem Vielfachen des zumindest einen Teils des Basis-Fluoreszenzspektrums (S0) und einem Restspektrum (U1) zusammensetzt; f) das Vielfache derart zu bestimmen, dass, ein Betrag der zweiten Ableitung (U1") des Restspektrums (U1) minimal wird; und g) das bestimmte Vielfache zu einem eine Mengenangabe der Komponente definierenden Wert gemäß einer vorbestimmten Zuordnung zuzuordnen.