DE102005062673A1

DE102005062673A1 - Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium

Info

Publication number: DE102005062673A1
Application number: DE200510062673
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Dr. Schaefer
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2007-07-05
Also published as: WO2007076839A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters (D) für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium in einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, insbesondere zum Bestimmen eines Diffusionskoeffizienten, unter Verwendung von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit den Fluorochromen in dem Umgebungsmedium, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellen von experimentell ermittelten Meßreihen DOLLAR I1 (n = 1, 2, ...; i= 1, 2, ...) der Photobleich-Untersuchung in der Auswerteeinrichtung, wobei die experimentell ermittelten Meßreihen DOLLAR I2 für unterschiedliche Meßzeitpunkte t·n· jeweils Fluoreszenzwerte DOLLAR I3 für verschiedene Positionen x¶i¶ in einem Untersuchungsbereich des Umgebungsmediums umfassen; Verarbeiten einer ersten experimentell ermittelten Meßreihe, DOLLAR I4 wobei das Verarbeiten der ersten Meßreihe P·1· in der Auswerteeinrichtung die folgenden Schritte umfaßt: i) Multiplizieren jedes Fluoreszenzwertes DOLLAR I5 der ersten Meßreihe P·1· mit einer Gaußverteilungsfunktion G¶i¶, die mit einer von dem Bewegungsparameter abhängigen Standardabweichung sigma(D) gebildet wird, so daß für die Fluoreszenzwerte DOLLAR I6 der ersten Meßreihe P·1· jeweils eine berechnete Gaußverteilung DOLLAR I7 (..., x¶i-l¶, x¶i¶, x¶i+l¶, ...) über Positionen ..., x¶i-l¶, x¶i¶, x¶i+l¶, ... bestimmt wird, wobei ein Maximum der berechneten Gaußverteilung DOLLAR I8 (..., x¶i-l¶, x¶i¶, x¶i+l¶, ...) bei der Position x¶i¶ liegt; und ii) Summieren von jeweils ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium.
Hintergrund der Erfindung
Die Beweglichkeit fluoreszierender Moleküle (Fluorochrom) kann in vielfacher Hinsicht Informationen einerseits über Eigenschaften eines mit dem Fluorochrom verknüpften Moleküls, Makromoleküls oder Eiweißkörpers und andererseits über das umgebende Milieu erbringen. So können beispielsweise Bindungszustände eines Eiweißkörpers, eine Komplexbildung oder homo- oder heterophile Oligomerisierung über die Bestimmung lateraler Fluorochrombeweglichkeiten erfaßt und zur Analyse zellulärer Funktionszustände genutzt werden.

Die laterale Beweglichkeit von Fluorochromen kann mit Hilfe eines lokalen Ausbleichens und der Beobachtung der dann nachfolgenden Fluoreszenz-Erholung erfolgen, wobei die Erholung durch eine laterale Bewegung nicht geblichener Fluorochrome in die zuvor ausgeblichene Zone bedingt ist (D. Axelrod et al., Biophys J., 16, 1055–1069 (1976)). Diese allgemeine Technik wird auch als FRAP („fluorescence recovery after photobleaching") bezeichnet. Die Meßdatenaufzeichnung kann hierbei entweder nur im geblichenen Punkt erfolgen, in einer Linie, die den geblichenen Punkt überstreicht oder in zwei- oder dreidimensionalen bildgebenden Verfahren.

Die bislang etablierten Verfahren zur Bestimmung der lateralen Bewegung eines Fluorochroms (vgl. beispielsweise T. Tsay et al., Biophys J., 60, 360–368 (1991); U. Kubitscheck et al., Biophys J., 67, 948–956 (1994); P. Wedekind et al., Biophys J., 71, 1621–1632 (1996); Y. Sniekers et al.:, Biophys J., 89, 1302–1307 (2005)) gehen von verschiedenen Vorbedingungen aus, ohne die eine nachfolgende Ermittlung der Beweglichkeit nicht zulässig wäre. Hierzu gehören je nach Verfahren entweder die genaue Kenntnis des Durchmessers des geblichenen Punktes, die Annahme, daß die Menge des ausgeblichenen Fluorochroms im Verhältnis zur gesamten Fluorochrom-Menge vernachlässigbar klein ist, eine Annahme, daß das Fluorochrom im geblichenen Punkt tatsächlich vollständig ausgeblichen wurde, eine Annahme, daß die Umgebung des geblichenen Punktes eine homogene Fluorochrom-Verteilung besitzt und in Relation zum geblichene Punkt deutlich größer ist.

Neben diesen Randbedingungen liegt ein weiterer Nachteil bekannter Verfahren darin, daß räumlich aufgelöste Meßdatensätze nicht oder nur zum Teil in die Berechnungen einfließen und somit die Genauigkeit der Bestimmung erhöhen können. Mit Hilfe einer „fast-Fourier-Analyse" wurde dieser Nachteil nur teilweise kompensiert (vgl. T. Tsay et al., Biophys J., 60, 360–368 (1991)), da die Anwendung dieses Verfahrens eine homogene Fluorochrom-Verteilung vor dem Ausbleichen erfordert.

Zusammenfassung der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium zu schaffen, bei dem die oben erläuterten Nachteile des Standes der Technik vermieden sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach dem unabhängigen Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand von abhängigen Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters (D) für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium in einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, insbesondere zum Bestimmen eines Diffusionskoeffizienten, unter Verwendung von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit den Fluorochromen in dem Umgebungsmedium, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

– Bereitstellen von experimentell ermittelten Meßreihen Pn = {Ini } (n = 1, 2, ...; i = 1, 2, ...) der Photobleich-Untersuchung in der Auswerteeinrichtung, wobei die experimentell ermittelten Meßreihen Pn = {Ini } für unterschiedliche Meßzeitpunkte tⁿ jeweils Fluoreszenzwerte Ini (xi, tn) für verschiedene Positionen x_i in einem Untersuchungsbereich des Umgebungsmediums umfassen;
– Verarbeiten einer ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 = {I1i }, wobei das Verarbeiten der ersten Meßreihe P¹ in der Auswerteeinrichtung die folgenden Schritte umfaßt: i) Multiplizieren jedes Fluoreszenzwertes I 1 / i der ersten Meßreihe P¹ mit einer Gaußverteilungsfunktion G_i, die mit einer von dem Bewegungsparameter abhängigen Standardabweichung σ(D) gebildet wird, so daß für die Fluoreszenzwerte Ini (xi, tn) der ersten Meßreihe P¹ jeweils eine berechnete Gaußverteilung G1i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) über Positionen ..., x_i-1, x_i, x_i+1, ... bestimmt wird, wobei ein Maximum der berechneten Gaußverteilung G1i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) bei der Position x_i liegt; und ii) Summieren von jeweils zugehörigen Werten der berechneten Gaußverteilungen G1i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) für i = 1, 2, ... für alle Positionen x_i der ersten Meßreihe P¹, um eine simulierte Meßreihe P1* = {I1*i } mit simulierte Fluoreszenzwerten I1*i (xi, t1) zu bilden, wobei die simulierte Fluoreszenzwerte I1*i (xi, t1) wahlweise normiert werden;
– Simulieren von weiteren experimentell ermittelten Meßreihen, wobei das Simulieren einer nachfolgenden experimentell ermittelten Meßreihe P^k (k = 2, 3, ...) in der Auswerteeinrichtung jeweils die folgenden Schritte umfaßt: iii) Multiplizieren jedes Fluoreszenzwertes I (k-1)* / i einer simulierten vorangehenden Meßreihe P^(k-1)* mit der Gaußverteilungsfunktion G_i, die mit der von dem Bewegungsparameter abhängigen Standardabweichung σ(D) gebildet wird, so daß für die Fluoreszenzwerte I(k-1)*i (xi, tk-1) der simulierten vorangehenden Meßreihe P^(k-1)* jeweils eine berechnete Gaußverteilung G(k-1)*i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) über Positionen ..., x_i-1, x_i, x_i+1, ... bestimmt wird, wobei ein Maximum der berechneten Gaußverteilung G(k-1)*i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) bei der Position x_i liegt; iv) Summieren von jeweils zugehörigen Werten der berechneten Gaußverteilungen G(k-1)*i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) für i = 1, 2, ... für alle Positionen x_i der simulierten vorangehenden Meßreihe P^(k-1)*, um eine simulierte nachfolgende Meßreihe Pk* = {Ik*i } mit simulierte Fluoreszenzwerten Ik*i (xi, tk) zu bilden, wobei die simulierte Fluoreszenzwerte Ik*i (xi, tk) wahlweise normiert werden;
– Berechnen eines Maßes für die Abweichung AW^k zwischen der simulierten Meßreihe P(k-1)* = {I(k-1)*i } für k = 2, 3, ... und einer zugehörigen experimentell ermittelten Meßreihe Pk = {Iki }; und
– Ermitteln einer Simulation, für die die Abweichung AW^y (y = 1, 2, ...; y = k – 1) am geringsten ist, und Bestimmen des Bewegungsparameters D für die Fluorochrome in dem Umgebungsmedium aus der Standardabweichung σ(D).

Mit Hilfe der Erfindung ist ein Verfahren zum computergestützten Auswerten von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit Fluorochromen in einem Umgebungsmedium geschaffen, bei dem keine Annahmen über Durchmesser, Form und/oder Quantität des ausgeblichenen Bereiches als Voraussetzung für die Meßdatenauswertung gemacht werden. Auf diese Weise können Einschränkungen hinsichtlich der Aussagekraft und Genauigkeit der ermittelten Ergebnisse für den Bewegungsparameter, wie sie im Stand der Technik häufig vorhanden sind, vermieden werden.

Alle Meßinformationen über Intensitäten an verschieden weit vom geblichenen Areal oder von mehreren geblichenen Arealen entfernten Meßpunkten werden in die Analyse eingeschlossen und erhöhen somit die Genauigkeit der Bestimmung des Bewegungsparameters, wobei die Analyse weitgehend robust gegenüber einem Rauschen des Meßsignals ist.

Weiterhin besteht der Vorteil, daß das bei bekannten Verfahren vorgegebene Erfordernis entfällt, nach dem ein zweiter Bleichimpuls oder mehrere darauf folgende Bleichimpulse erst dann appliziert werden dürfen, wenn die vorausgehende Erholung weitestgehend abgeschlossen ist. Gerade aufgrund dieser Unabhängigkeit von partieller Erholung können Bleichimpulse in rascher Abfolge appliziert werden, was mehrere weitere Vorteile bedingt: Erstens kann die Bestimmung jeweils Zeitbereiche nutzen, innerhalb derer große Gradienten einer bewegungsabhängigen Erholung unterliegen und hierdurch bei geringer Probenbelastung eine maximale Robustheit der Bestimmung fördern, zweitens werden Normierungsverfahren, die geeignet sind, lokale Inhomogenitäten der Fluorochrom-Signalintensität zu kompensieren werden weniger durch langsame Veränderungen dieser lokalen Inhomogenität (z. B. aufgrund von Zellbewegung) gestört, und drittens kann eine rasche Abfolge unabhängiger Bestimmungen der Bewegungsparameter entweder durch Mittelwertbildung die Bestimmungsgenauigkeit weiter erhöhen oder für eine zeitaufgelöste Bestimmung der Fluorochrombeweglichkeit und damit für die Analyse Mobilitäts-gestützter Bioindikatoren genutzt werden.

Eine zweckmäßige Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, daß das Simulieren der ersten experimentell ermittelten Meßreihe und das Simulieren von weiteren experimentell ermittelten Meßreihen für verschiedene Standardabweichungen durchgeführt werden. Hierdurch ist eine weitere Optimierung des Verfahrens ermöglicht, da eine optimierte Standardabweichung ermittelt wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß als Maß für die Abweichung AW^y die jeweilige Summe von Abweichungsquadraten zwischen der simulierten Meßreihe und der zugehörigen experimentell ermittelten Meßreihe verwendet wird. Auf diese Weise wird ein mit wenig Aufwand ermittelbares und zuverlässiges Maß für die Bewertung der Unterschiede zwischen simulierten Werten und experimentellen Daten verwendet.

Eine weitergehende Bestimmung des Bewegungsverhaltens der Fluorochromen in dem Umgebungsmedium ist bei einer vorteilhaften Fortbildung der Erfindung dadurch erreicht, daß zum Ermitteln eines zeitlichen Verlaufes einer Bewegung der Fluorochrome in dem Untersuchungsbereich mehrere aufeinaderfolgende Photobleich-Untersuchungen für den Untersuchungsbereich analysiert werden. Darüber hinaus kann vorgesehen sein, daß Photobleich-Untersuchungen für mehrere Untersuchungsbereiche des Umgebungsmediums analysiert werden.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf Figuren einer Zeichnung näher erläutert. Hierbei zeigen:

1 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für eine Meßreihe einer Photobleich-Untersuchung an Fluorochromen in einem Umgebungsmedium;

2 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für eine simulierte Verteilung (graue Balken) der Fluorochrome für eine Einzelintensität (weißer Balken) aus der Meßreihe in 1;

3 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für eine Kurvenschar simulierter Verteilungen der Fluorochrome für die Einzelintensitäten aus Meßreihe in 1;

4 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für aufsummierte Werte der simulierten Verteilungen in 3;

5 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für aufsummierte Werte der simulierten Verteilungen vor und nach den Anwenden einer Randbedingung, daß die außerhalb des in 1 gemessenen Untersuchungsbereiches gelegenen Anteile der in 3 gezeigten Gaußfunktionen an den Rändern des Untersuchungsbereiches spiegelt und auf die Werte aufsummiert werden;

6 experimentelle Ergebnisse einer Untersuchung mit einem Laser-Scanning-Mikroskop an lebenden Fibroblasten-Zellen;

7 eine grafische Darstellung einer YFP-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zeit;

8 eine grafische Darstellung einer CFP-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zeit;

9 eine grafische Darstellung eines experimentell ermittelten Fluoreszenzsignals F_YFP in Abhängigkeit vom Abstand;

10 eine grafische Darstellung eines experimentell ermittelten Fluoreszenzsignals F_CFP in Abhängigkeit vom Abstand;

11 eine grafische Darstellung experimenteller Ergebnisse des Quotienten F_YFP/F_CFP in Abhängigkeit vom Abstand für die experimentell ermittelten Fluoreszenzsignale aus den 9 und 10;
12 eine grafische Darstellung des Quotienten F_YFP/F_CFP in Abhängigkeit vom Abstand für eine erste Meßreihe nach dem Anwenden des Bleichimpulses und mehrere simulierte Meßreihen;
13 eine grafische Darstellung der Summe von Abweichungsquadraten in Abhängigkeit von einer lateralen Beweglichkeit λ; und
14 eine grafische Darstellung der lateralen Beweglichkeit λ in Abhängigkeit von der Zeit.
Im folgenden wird unter Bezugnahme auf die 1 bis 14 ein Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters D für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium in einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, insbesondere zum Bestimmen eines Diffusionskoeffizienten, unter Verwendung von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit den Fluorochromen in dem Umgebungsmedium beschrieben. Hierbei wird das Verfahren zunächst in allgemeiner Weise erläutert, um es anschließend auf experimentelle Meßergebnisse anzuwenden.
Das nachfolgend erläuterte Verfahren zum Ermitteln des Bewegungsparameters D aus den experimentell gewonnenen Meßdaten trifft und erfordert keine Annahmen über Durchmesser, Form und Quantität des ausgeblichenen Bereiches in der untersuchten Meßprobe oder die darin enthaltenen Fluorochrome. Deshalb kann der geblichene Bereich beliebige Formen und Größen aufweisen.
Es werden orts- und zeitaufgelöste Meßdaten einer Fluorochrom-Signalintensität eines oder mehrerer gleich schnell beweglicher Fluorochrome unterschiedlicher Farbe während und nach einem selektiven Ausbleichen eines der aufgezeichneten Fluorochrome gemessen und als elektronische Daten aufgezeichnet. Bleichimpulse können hierbei auch wiederholt appliziert werden, wobei in der nachfolgenden Auswertung der experimentell ermittelten Meßdaten jedem Bleichimpuls eine unabhängige Bestimmung des Diffusionskoeffizienten zugeordnet werden kann.
Bei gleichzeitiger Datenerfassung mehrerer, farblich getrennter Fluorochrome erfolgt eine „ratiometrische Normierung" der Fluorochrome zum Eliminieren einer lokalen Inhomogenität der Fluorochrom-Konzentration. Bei Nutzung nur eines Fluorochroms kann anstelle der ra tiometrischen Normierung auf Intensitäten eines Referenz-Fluorochroms eine Normierung auf das anfängliche Intensitätsprofil des einzelnen Fluorochroms vor Applikation des Bleichimpulses treten. Letzteres wird im Folgenden mit dem Begriff „interne Normalisierung" bezeichnet.
Die ortsaufgelöste Bestimmung der Fluorochrom-Signalintensität kann vorzugsweise in einem Fluoreszenzmikroskop mit Laser-scanning-Verfahren, durch CCD-Kameras oder vergleichbare Linien- oder Flächensensoren. Die Zeitauflösung der Datenerfassung sollte hierbei genügend hoch sein, um in Relation zur Erholungsgeschwindigkeit der Fluorochrom-Signalintensität nach dem Bleichimpuls möglichst mehrere Datensätze oder Meßreihen zu erfassen. Bei gleichzeitiger optischer Erfassung zweier Fluorochrome wird eines der Flurochrome möglichst selektiv ausgeblichen, während das andere oder die anderen Fluorochrome als Referenzen dienen, die sich in der selben Weise verteilen wie das auszubleichende Fluorochrom und die sich mit gleicher Bewegungsgeschwindigkeit bewegen. Ein typisches Anwendungsbeispiel sind fluoreszierende Fusionsproteine, wobei das selbe Protein mit unterschiedlichen Farbvarianten der aus Aequora victoria oder Discosoma spp. abgeleiteten fluoreszierenden Proteine verknüpft wird.
Alternativ kann auch eine Doppelfusion mit zwei verschiedenfarbig fluoreszierenden Proteinen eingesetzt werden, wobei dann die Stöchiometrie beider Fluoreszenzproteine fixiert ist und die ratiometrische Normalisierung (zum Beispiel Akzeptorfluoreszenz/Donorfluoreszenz) durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zu einer weiteren Verstärkung der ratiometrisch ermittelten Gradienten nach Ausbleichen des Akzeptors führt.
Typischerweise wird der Bleichimpuls mittels eines Laser erzeugt, der beispielsweise mit Hilfe eines Akusto-optischen Filters (AOTF) in seiner Intensität moduliert werden kann. Ein Laser-Scanning-Mikroskop ist hierfür eine geeignete Umgebung, das gezeigte Anwendungsbeispiel wurde mit einem Laser-Scanning-Mikroskop und AOTF-gesteuerter Laserintensität aufgezeichnet.
Die Meßreihen können entweder als Linienprofile, pseudo-eindimensionale, langgestreckte Bilder mit einer Bildbreite, die wesentlich größer als die Bildhöhe ist und deren Bildpixel in der Bildhöhe aufsummiert oder gemittelt sind, oder als beliebige zweidimensionale Darstellungen grafisch dargestellt werden. Es wird die Fluoreszenzintensität für verschiedene Orte, die mittels eines Orts- oder Abstandsparameters identifizierbar sind, in dem zu analysierenden Untersuchungsmedium gemessen. Die gemessenen Intensitäten lassen sich in einem x-y-Diagramm als Funktion des Ortes/Abstandes auftragen.
Bei Verwendung zweier oder mehrerer Fluorochrome werden die Meßdatensätze spektral getrennt aufgezeichnet, wobei die Fluorochrom-Separation in der Anregungs- oder/und Emissionsdomäne mittels geeigneter Anregungs- und Emissionswellenlängen geschehen kann. Bei unvollständiger spektraler Trennbarkeit der von den verschiedenfarbigen Fluorochromen generierten Fluoreszenzsignale kann entweder eine einfache Quotientenbildung zwischen Meßdatensätzen, die vorwiegend das geblichene bzw. das Referenz-Fluorochrom repräsentieren oder eine vorgelagerte spektrale Entmischung (vgl. beispielsweise DE 199 15 137 ) und nachfolgende Quotientenbildung stattfinden.
Im Fall einer „internen Normalisierung" ist bei wiederholter Applikation von Bleichimpulsen darauf zu achten, daß vor Applikation eines weiteren Bleichpulses und erneuter „interner Normalisierung" eine nahezu vollständige Erholung der lokalen Fluoreszenz aufgrund der lateralen Beweglichkeit der Fluorochrome stattgefunden hat, da sonst in den Folgezyklen die Äquilibrierung scheinbar schneller ablaufen und somit die laterale Beweglichkeit überschätzt würde. Diese Einschränkung gilt nicht bei Normalisierung auf eine gleich schnell bewegliches Referenzfluorochrom.
Bei der Ermittlung des Bewegungsparameters D aus experimentellen Ergebnissen einer Photobleich-Untersuchung mittels einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, bei der es sich beispielsweise um einen Personalcomputer handelt, wird davon ausgegangen, daß das für ein Volumenelement oder ein Flächenelement (Pixel) des Untersuchungsmediums erfaßte Intensitätssignal den dort befindlichen und im Volumen-/Flächenelement konzentrierten Fluoroch romen proportional ist. Ein Intensitätsprofil einer Meßreihe setzt sich demnach aus einer Summierung der in Einzelpixeln jeweils idealisiert konzentriert liegenden Signale zusammen. Daher kann ein Intensitätsprofil mit hinreichender Genauigkeit als eine regelmäßige Abfolge von jeweils in einem Punkt konzentrierten Fluorochromen betrachtet werden.
1 zeigt eine grafische Darstellung einer Verteilung von Fluoreszenzintensitäten Ini (xi, tn), zu einem Meßzeitpunkt tⁿ über Abstände x_i, die bestimmte Orte in dem bei der Photobleich-Untersuchung gemessenen Untersuchungsbereiches definieren. Deutlich erkennbar ist in 1 ein geblichener Bereich der Verteilung, in welchem die Intensitäten geringer als außerhalb des geblichenen Bereiches sind.
Für die Ermittlung des Bewegungsparameters D der untersuchten Fluorochrome, nämlich der lateralen Beweglichkeit λ, können weiterhin die gemessenen Zeitskalen und die bekannten Abstände x_i zwischen den Untersuchungsorten genutzt werden, um zu berechnen, wie sich die Fluorochrome nach einem Zeitintervall, welches dem tatsächlichen Aufzeichnungsintervall entspricht, verteilen müßten. Zur Simulation einer solchen diffusionsbedingten Verteilung wird eine Gauß-Funktion G verwendet. Die Gauß-Funktion G erhält hierfür eine Standardabweichung σ(D), die von dem zu ermittelnden Bewegungsparameter D abhängt.
Die Standardabweichung σ(D) ergibt sich dabei aus dem Diffusionskoeffizienten D und dem Zeitintervall zwischen zwei Meßreihen t als σ = √2Dt . Sie gibt an, wie weit im arithmetischen Mittel ein Teilchen während des Zeitintervalls t in einer Raumrichtung verschoben wurde. Die Gaußverteilung wird nun für Abstandsschritte x_i ermittelt, die den bei der Photobleich-Untersuchung verwendeten Pixel-/Meßabständen entsprechen, wobei Abstände berücksichtigt werden, die innerhalb der zwei- bis vierfachen Standardabweichung liegen. Entfallen Teile der Gaußfunktionen auf Bereiche, die nicht in der Meßreihe enthalten waren, so werden die Teile der Gaußfunktion, die außerhalb des Meßbereiches liegen an den Grenzen des Meßbereichs gespiegelt und deren Funktionswerte entsprechend ihrer neuen Position aufsummiert.
Die Verteilungsermittlung wird nun über alle Pixel/Intensitäten der Meßreihe aus 1 durchgeführt (vgl. 3), wobei die ermittelten Werte für alle Abstände aufsummiert werden, so daß sich ein erstes simuliertes Profil ergibt, was in 4 dargestellt ist.
An den Rändern der Profile wird als Randbedingung eine Reflexion simuliert (5) oder alternativ die Intensität des/der äußersten, innerhalb des untersuchten Bereiches liegenden Pixel/s entsprechend der gewählten Breite der Gaußfunktion über den Aufzeichnungsbereich hinaus fortgeführt, und zwar vorzugsweise über einen Bereich, welcher zwei bis vier Standardabweichungen σ(D) entspricht. Es wird so eine hochgenaue Simulation der Diffusion über den gesamten Meßbereich bei einem vorgegebenen Diffusionskoeffizienten erhalten, wobei die Form und die Homogenität der ausgeblichenen Region unerheblich ist.
Um einen Fluorochrom-Verlust durch Ausbleichen der gesamten Zelle oder der gemessenen Region zu kompensieren wird die Summe der in der Simulation erhaltenen Intensitäten gebildet, und die Simulationsdaten werden auf die Summe der in der Messung gefundenen Fluoreszenzsignale normiert. Somit ergeben sich keine Summendifferenzen, die zu einem Offset der Signalhöhe gegenüber den Meßdaten führen könnten.
Die Simulationsprozedur wird nun für alle Folgezyklen wiederholt, wobei der jeweils vorangehende simulierte Datensatz als Ausgangspunkt der Multiplikation mit der Gauß-Funktion dient. Alternativ kann auch der jeweils gemessene Datensatz als Vorlage dienen, wobei allerdings zu beachten ist, daß ein hohes Meßrauschen einen störenden Einfluß hätte, indem dann eine hohe Mobilität vorgetäuscht werden könnte.
Als Meß- und Simulationszyklen können unterschiedliche Zeitbereiche in die Analyse eingeschlossen werden, wobei bei einer einfachen Diffusion beispielsweise alle Meßintervalle einbezogen werden sollten, innerhalb derer etwa 50% bis 90% der Äquilibrierung eines von dem Bleichimpuls erzeugten Intensitätsgradienten vollzogen werden.
Liegen für alle in die Berechnung einzuschließenden Meßreihen simulierte Datensätze vor, wird die Summe der Abweichungsquadrate der Simulation von den zugehörigen experimentellen Meßdaten gebildet und in einer Tabelle gemeinsam mit dem zur Simulation eingesetzten Diffusionskoeffizienten abgelegt.
Der gesamte Vorgang wird nun für verschiedene Diffusionskoeffizienten wiederholt, wobei beispielsweise eine fortlaufende Reihe (linear oder logarithmisch skaliert) von Diffusionskoeffizienten angenommen wird, und die in der Simulation berechneten Summen der Abweichungsquadrate ein Minimum durchschreiten, bei welchem der zur Simulation eingesetzte Diffusionskoeffizient dem tatsächlichen Diffusionskoeffizienten in bester Näherung entspricht.
Alternativ können zur Minimierung des Rechenaufwandes und zur Beschleunigung der Analyse nach Abtastung mit verschiedenen Diffusionskoeffizienten in groben Schritten und Berechnung der jeweils besten Näherung in der Folge iterativ Diffusionskoeffizienten in immer engeren Intervallen geprüft werden, wobei die Iteration mit einem Abbruchskriterium bei hinreichender Genauigkeit der Iteration beendet wird.
Werden in den Messungen die Bleichimpulse wiederholt oder/und in verschiedenen Bereichen des Untersuchungsmediums appliziert, so wird die Ermittlung des lateralen Diffusionskoeffizienten für alle Bleichimpulse und/oder alle Bereiche durchgeführt werden, um im Ergebnis einen Zeitverlauf der Molekülbeweglichkeit oder eine statistische Bestimmung der Mobilität in verschiedenen Bereichen zu erreichen, zum Beispiel in mehreren Zellen oder in verschiedenen Zellkompartimenten.
Im folgenden wird die Nutzung des beschriebnen Verfahrens anhand von experimentellen Ergebnissen für eine Photobleich-Untersuchung an einer lebenden Fibroblasten-Zelle erläutert.
In einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop wurde eine lebende Fibroblasten-Zelle, die ein intramolekular fusioniertes CFP-YFP-Fusionsprotein exprimierte, mit einem Argon-Mehrlinien-Laser bei 458 nm über ein 100 × 1.45 Objektiv angeregt, und die Fluoreszenzemission wurde nach Durchgang durch eine konfokale Lochblende bei acht verschiedenen Emissionswellenlängen im Bereich zwischen 482 nm und 566 nm aufgezeichnet und mittels spektralem Entmischen in die Signale der CFP- und YFP-Fluorochrome getrennt (vgl. 6).
Die in der Folge in schneller Bildrate abgetasteten Bildanteile überstrichen einen inhomogenen Anteil des Zytosols („Meßbereich" in 6), der bereits ohne Bleichimpuls zu einem nicht horizontalen Intensitätsprofil der Einzelfluorochrome führt (vgl. eingezeichnete horizontal ausgerichtete Region in 6). Nach jeweils 30 Bildzyklen wurde für kurze Zeit in der Bildmitte eine Region mit maximaler Intensität der 488 nm und 514 nm Linien des Argon-Lasers bestrahlt („geblichener Bereich" in 6), um lokal und selektiv die Fluoreszenz des YFP-Anteils im Fusionsprotein zu bleichen.
Daraufhin wurde die Bildaufzeichnung fortgesetzt, wobei die YFP-Fluoreszenzintensität im geblichenen Bereich im jeweiligen Folgezyklus um etwa 40% reduziert wurde (entsprechend „Region 1" in 7). Eine am rechten Rand des Profils gelegene Region ist zum Vergleich und als Nachweis der lokalen Ausbleichwirkung des Lasers mit dargestellt („Region 2" in 7). 8 zeigt eine solche Messung für die CFP-Fluoreszenzintensität mit leichter Zunahme der Fluoreszenzintensität in der geblichenen „Region 1" nach Bleichen des YFP als FRET-Akzeptor.
Die über die Bildhöhe gemittelten Fluoreszenzintensitäten ergeben Intensitätsprofile, welche durch zelluläre Kompartimente und Zellgrenzen sowohl für das in der Bildmitte partiell ausgeblichene YFP (9) als auch für das nicht geblichene CFP (10) eine stark gewellte Form aufweisen und somit ungeeignet für eine rein Intensitäts-gestützte FRAP-Analyse sind. Dargestellt sind die Meßzyklen direkt nach dem zweiten Bleichimpuls sowie einige darauf folgende Meßzyklen. Nach Bildung eines Quotienten der beiden Fluorochrom-Signale glei chen sich die Inhomogenitäten aus (11), und der Meßdatensatz kann als Vorlage für die Simulation dienen.
Die Simulation des zweiten von insgesamt 22 sequentiell applizierten Bleichimpulsen in diesem Experiment ist exemplarisch für den Erholungsvorgang über sieben Zeitintervalle dargestellt (12), wobei der mit den Meßdaten am besten übereinstimmende Wert λ(x) von 5,9 μm herangezogen wurde. Trägt man die Abweichungen der simulierten Daten von dem Meßdaten als Summe der Abweichungsquadrate über die laterale Beweglichkeit λ(x) auf, so erkennt man daß die Funktion ein globales Minimum aufweist, welches den korrekten Wert für λ(x) ausweist, der im genannten Fall bei 5,9 μm (bezogen auf 1 s) lag (13). Da die Funktion der Summe der Abweichungsquadrate über die Beweglichkeit in diesem Verfahren stets ein einziges Minimum ausweist, ist die Bestimmung des optimalen Wertes für λ(x) (bezogen auf t = 1 s) und des Diffusionskoeffizienten D = λ(x)²/2t) eindeutig.
Appliziert man das Analyseverfahren sequentiell über alle in der Messung enthaltenen Bleichpulse, so erhält man einen Zeitverlauf der lateralen Beweglichkeit des Fluorochroms bzw. des damit verknüpften Makromoleküls. Die Auswertung aller einzelner Bleichpulse der in den 7 gezeigten Messungen ist in 14 als Funktion der lateralen Verschiebungsquadrate über die Zeit aufgetragen.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung sein.

Claims

Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters (D) für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium in einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, insbesondere zum Bestimmen eines Diffusionskoeffizienten, unter Verwendung von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit den Fluorochromen in dem Umgebungsmedium, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: – Bereitstellen von experimentell ermittelten Meßreihen Pn = {Ini } (n = 1, 2, ...; i = 1, 2, ...) der Photobleich-Untersuchung in der Auswerteeinrichtung, wobei die experimentell ermittelten Meßreihen Pn = {Ini } für unterschiedliche Meßzeitpunkte tⁿ jeweils Fluoreszenzwerte Ini (xi, tn) für verschiedene Positionen x_i in einem Untersuchungsbereich des Umgebungsmediums umfassen; – Verarbeiten einer ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 = {I1i }, wobei das Verarbeiten der ersten Meßreihe P¹ in der Auswerteeinrichtung die folgenden Schritte umfaßt: i) Multiplizieren jedes Fluoreszenzwertes I 1 / i der ersten Meßreihe P¹ mit einer Gaußverteilungsfunktion G_i, die mit einer von dem Bewegungsparameter abhängigen Standardabweichung σ(D) gebildet wird, so daß für die Fluoreszenzwerte Ini (xi, tn) der ersten Meßreihe P¹ jeweils eine berechnete Gaußverteilung G1i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) über Positionen ..., x_i-1, x_i, x_i+1, ... bestimmt wird, wobei ein Maximum der berechneten Gaußverteilung G1i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) bei der Position x_i liegt; und ii) Summieren von jeweils zugehörigen Werten der berechneten Gaußverteilungen G1i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) für i = 1, 2, ... für alle Positionen x_i der ersten Meßreihe P¹, um eine simulierte Meßreihe P1* = {I1*i } mit simulierte Fluoreszenzwerten I1*i (xi, t1) zu bilden, wobei die simulierte Fluoreszenzwerte I1*i (xi, t1) wahlweise normiert werden; – Simulieren von weiteren experimentell ermittelten Meßreihen, wobei das Simulieren einer nachfolgenden experimentell ermittelten Meßreihe P^k (k = 2, 3, ...) in der Auswerteeinrichtung jeweils die folgenden Schritte umfaßt: iii) Multiplizieren jedes Fluoreszenzwertes I (k-1)* / i einer simulierten vorangehenden Meßreihe P^(k-1)* mit der Gaußverteilungsfunktion G_i, die mit der von dem Bewegungsparameter abhängigen Standardabweichung σ(D) gebildet wird, so daß für die Fluoreszenzwerte I(k-1)*i (xi, tk-1) der simulierten vorangehenden Meßreihe P^(k-1)* jeweils eine berechnete Gaußverteilung G(k-1)*i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) über Positionen ..., x_i-1, x_i, x_i+1, ... bestimmt wird, wobei ein Maximum der berechneten Gaußverteilung G(k-1)*i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) bei der Position x_i liegt; iv) Summieren von jeweils zugehörigen Werten der berechneten Gaußverteilungen G(k-1)*i (..., xi-1, xi, xi+1, ...) für i = 1, 2, ... für alle Positionen x_i der simulierten vorangehenden Meßreihe P^(k-1)*, um eine simulierte nachfolgende Meßreihe Pk* = {Ik*i } mit simulierte Fluoreszenzwerten Ik*i (xi, tk) zu bilden, wobei die simulierte Fluoreszenzwerte Ik*i (xi, tk) wahlweise normiert werden; – Berechnen eines Maßes für die Abweichung AW^k zwischen der simulierten Meßreihe P(k-1)* = {I(k-1)*i } für k = 2, 3, ... und einer zugehörigen experimentell ermittelten Meßreihe Pk = {Iki }; und – Ermitteln einer Simulation, für die die Abweichung AW^y (y = 1, 2, ...; y = k – 1) am geringsten ist, und Bestimmen des Bewegungsparameters D für die Fluorochrome in dem Umgebungsmedium aus der Standardabweichung σ(D).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Simulieren der ersten experimentell ermittelten Meßreihe und das Simulieren von weiteren experimentell ermittelten Meßreihen für verschiedene Standardabweichungen durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Maß für die Abweichung AW^y die jeweilige Summe von Abweichungsquadraten zwischen der simu lierten Meßreihe und der zugehörigen experimentell ermittelten Meßreihe verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Ermitteln eines zeitlichen Verlaufes einer Bewegung der Fluorochrome in dem Untersuchungsbereich mehrere aufeinaderfolgende Photobleich-Untersuchungen für den Untersuchungsbereich analysiert werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Photobleich-Untersuchungen für mehrere Untersuchungsbereiche des Umgebungsmediums analysiert werden.