DE10355150B4

DE10355150B4 - Verfahren und System zur Analyse von Co-Lokalisationen

Info

Publication number: DE10355150B4
Application number: DE10355150.6A
Authority: DE
Inventors: Frank Olschewski
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2021-01-14
Anticipated expiration: 2023-11-27
Also published as: US7282724B2; US20050109949A1; DE10355150A1

Abstract

Verfahren zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt (15) vorhandenen Farbstoffen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Bestimmen der Fluoreszenzspektren der aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe;
- Angabe eines Toleranzbereichs um das Fluoreszenzspektrum des jeweils einzelnen Farbstoffs;
- pixelweises Aufnehmen von Spektren des Objekts, in dem sich mindestens zwei Farbstoffe befinden;
- Berechnen der Menge der aufgenommenen Spektren innerhalb des Toleranzbereichs um das Fluoreszenzspektrum;
- Ermitteln eines Lambda-Vektors für jedes aufgenommene Pixel;
- Bestimmen der Zuordnung eines jeden Pixels zum Spektrum;
- Ausgabe eines aus den einzelnen Pixeln zusammengesetzten Bilds für jedes Spektrum; und
- Ausgabe mindestens eines Bildes für Co-Lokalisationen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Co-Lokalisationen.
Ferner betrifft die Erfindung ein System zur Analyse von Co-Lokalisationen.
Die deutsche Patentanmeldung DE 100 06 800 A1 offenbart eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens eines Spektralbereichs eines spektral aufgefächerten Lichtstrahls (SP-Modul). Im aufgefächerten des von dem zu untersuchenden Objekt kommenden Lichts sind Selektionsmittel vorgesehen, die als Schieber ausgebildet sind, um somit Teile des aufgefächerten Lichtstrahls auf verschiedene Detektoren zu lenken. Die Signale der Detektoren werden dann zu Bilderzeugung verwendet. Die DE 100 06 800 A1 offenbart nicht die Betätigung der Schieber in der Art und Weise, dass eine schnelle und zuverlässige Detektion eines speziellen Spektrums möglich ist.
Aus der deutschen Patentanmeldung DE 102 27 111 A1 ist ein Spektralmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop bekannt. Es werden Verfahren und Systeme zur Erfassung maximaler Information von einem fluoreszierenden mikroskopischen Objekt erfasst. Mit diesem Verfahren ist jedoch nicht eine fehlertolerante und adaptive Datenaufnahme möglich.
Aus der US 2003/0204379 A1 ist ein Verfahren zur Ermittlung eines spektralen Bereichs, in dem eine unbekannte Probe Fluoreszenzlicht emittiert, bekannt, bei dem zunächst ein Lambda-Scan über das komplette Detektionsspektrum ausgeführt und dieser Scan dann in Teilbereiche aufgeteilt wird. Abhängig von der in dem Teilbereich detektierten Lichtintensität wird der jeweilige Teilbereich dann verworfen oder genauer untersucht, wenn die detektierte Fluoreszenzintensität oberhalb eines Grenzwerts liegt. Dazu wird der jeweilige Teilbereich dann wiederum aufgeteilt, bis die Messgenauigkeit des Systems erreicht ist.
Reagiert eine Struktur auf mehr als einen Farbstoff gleichzeitig spricht man von Ko-Lokalisation. Dem Anwender ermöglicht die Analyse von Colokalisation z.B. die Analyse biologischer Strukturen in denen zwei (oder mehr) eingefärbte Proteine interagieren oder in denen zwei Strukturmerkmale auf kleinstem Raum zusammenfallen. Betrachtet man ein mehrdimensionales Histogramm, in dem Intensitätshäufigkeiten aus unterschiedlichen Bändern gezählt werden, so wird jeder reine Farbstoff als verbreiterte Gerade (Zigarre) wahrgenommen. Im Falle der Kolokalisation ist die Anzahl der im Intensitäts-Häufigkeitsraum zu beobachtenden Geraden größer als die Anzahl der Farbstoffe. Dieser Sachverhalt wird häufig durch eine geschickte Visualisierung bei der Analyse sichtbar gemacht. Die von Demandolx und Davoust eingeführten Techniken des Zytofluorogramms, visualisiert ein Ensemble zweidimensionaler Intensitäten ${{\vec{I}}_{i}}$
(in der Mikroskopie die Pixel eines Bildes, Voxel eines Volumens oder einer zeitlich aufeinanderfolgenden Serie dergleichen, in der Zytofluorometrie die Messungen mehrerer Proben) als zweidimensionalen Scatter-Plot, welches im Wesentlichen eine zweidimensionales Häufigkeitsverteilung darstellt. Auf dieser Basis erhält man eine Schätzung der Verbundwahrscheinlichkeitsfunktion der Intensitäten
, ein Verfahren, das in der mathematischen Datenanalyse Stand der Technik ist und dessen Güte nur von der Größe des Ensembles abhängt. Durch eine geeignete Farbcodierung und grafischer Darstellung erhält man ein Bild der Intensitätsverteilung, in dem die Geraden als verbreiterte Spuren durch das Auge des Benutzers zu lokalisieren ist. Die Verbreiterung existiert aufgrund aller Formen des Rauschens und evtl. im Hintergrund wirkender chemischer Einflüsse. Die Technik der Visualisierung lässt sich allerdings nur bis zu maximal 3 Farbstoffen durchführen, da die Visualisierung höherdimensionaler Datensätze schwierig ist und in der Regel mehr kognitive Probleme im Anwender als Nutzen erzeugt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen zu schaffen, mit dem die Bestimmung von Co-Lokalisationen von im Objekt vorhandenen Farbstoffen möglich ist, ohne durch die Dimensionalität beschränkt zu sein. Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 1 aufweist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein System zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen zu schaffen, mit dem ebenfalls die Bestimmung von Co-Lokalisationen von im Objekt vorhandenen Farbstoffen möglich ist. Die objektive Aufgabe wird durch ein System gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 9 aufweist.
Im Vergleich zum Stand der Technik hat das Verfahren den Vorteil, dass Co-Lokalisationen von mehreren Farbstoffen in einer Probe bestimmt. Dazu ermittelt man die verschiedenen Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandenen Farbstoffe. Ein Toleranzbereich um jedes der Fluoreszenzspektren wird durch den Benutzer definiert. Pixelweise werden dann die Spektren des Objekts aufgenommen, in dem sich mindestens zwei Farbstoffe befinden. Anschließend werden diejenigen Spektren verrechnet, wobei Spektren, die sich innerhalb des Toleranzbereichs um ein Fluoreszenzspektrum befinden, als reine Farbstoffe gewertet werden. Spektren, die sich außerhalb des Toleranzbandes befinden, werden als Colokalisation gewertet. Die Analyse der nicht zu einem Toleranzband zuzuordnenenden Daten können mit einer Clusteranalyse weiter verfeinert werden. Bilder - original und zurückgerechnet - können auf dem Display entsprechend der Zuordnung zu den Spektren ausgegeben werden. Es bleibt zu bemerken, dass die zurückgerechneten Bilddaten auf den Schwerpunkt der Toleranzbänder, bzw. den von der Clusteranalyse gefundenen zentralen Kolokalisationsgeraden projiziert werden, um ein Bildsignal zu erhalten, das einem puren Farbstoff oder einer eindeutigen Kombination zweier interagierender Farbstoffe entspricht.
Das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandenen Farbstoffe erfolgt durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe. Ebenso ist das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandenen Farbstoffe durch ein Abrufen von Fluoreszenzspektren aus einer Datenbank möglich. In der Datenbank des Rechnersystems sind die zu den einzelnen Farbstoffen gehörigen Fluoreszenzspektren abgelegt, wobei die Pflege der Datenbank durch den Anwender erfolgt der auf den Erfahrungsschatz zurückliegender Experimente und spezieller für seine Zwecke notwendige Referenzmessungen zurückgreifen kann. Die Ausgabe des aus den einzelnen Pixeln zusammengesetztes Bild und die Ausgabe des Bildes für die Co-Lokalisationen erfolgt naturgemäß auf einem Display.
Der Toleranzbereich wird durch eine obere Grenze festgelegt. Die obere Grenze kann durch den Benutzer eingegeben werden. Ebenso kann ein Zahlenwert eingegeben werden, der eine prozentuale Abweichung für die obere und die untere Grenze eines Bereichs um das Fluoreszenzspektrum festlegt, innerhalb dessen das gemessene Spektrum liegen muss. Im mehrdimensionalen Intensitätsraum definiert diese Grenze einen Kegel, der um die Gerade des Farbstoffspektrums im Hyperraum plaziert ist.
Die Form dieses Kegels ist in einer einfachen Ausprägung des Verfahrens als symetrisch zu betrachten wobei die Definition des Kegelradius an einen Referenzintensitätswert gekoppelt ist, welcher den absoluten Level definiert. Die konkrete Ausgestaltung kann ein Fachmann vornehmen. In einer komplizierteren Variante des Verfahrens wird die Lage aller Farbstoffspektren ausgenutzt. Unter Nutzung dieses Vorwissens kann man den Kegel in einer systematischen Art verbeulen, indem Richtungen im Intensitätsraum in denen Farbstoffe nah beieinanderliegen höher gewichtet werden als Richtungen in denen Farbstoffe nicht nah beieinanderliegen. Die reale Ausgestaltung kann heuristisch aber auch modellgetrieben erfolgen (Bayes, Maximum Liklihood, Entropiebasiert, Varianzanalyse, Fuzzy Logik), wobei bemerkt werden muss daß alle diese Verfahren letztendlich heuristisch sind. Für diese Erfindungsmeldung ist nur das generelle Vorgehen wichtig, ohne sich an den Glaubenskriegen der mathematischen Entscheidungstechnik beteiligen zu wollen.
Das System zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt vorhandener Farbstoffe umfasst ein Mikroskop, eine Detektionseinrichtung, die eine pixelweise Detektion des vom Objekt kommenden Lichts durchführt, ein Rechnersystem mit einem Eingabemittel, ein Display, und eine Speichereinheit. Das Rechnersystem führt die Ermittlung eines Lambda-Vektors oder Mehrfarben-Vektors für jedes aufgenommene Pixel durch. Jedem Pixel ist ein Spektrum bzw. ein Farbvektor zugeordnet, und auf dem Display wird jeweils die Ausgabe eines aus den einzelnen Pixeln zusammengesetztes Bild für jedes Spektrum und die Ausgabe eines Bildes für die Co-Lokalisationen dargestellt.
Die Detektionseinrichtung dient zur pixelweisen Detektion des vom Objekt kommenden Lichts und kann aus mindestens einem ersten und einem zweiten Detektor bestehen. Ist mehr als ein Detektor vorgesehen, dann ist vor dem ersten und dem zweiten Detektor ein SP-Modul vorgesehen.
Zur Beleuchtung ist ein Scanmodul vorgesehen, mit der das Beleuchtungslicht pixelweise über oder durch das Objekt geführt wird. Ferner ist ein Mittel vorgesehen, mit dem ein Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandener Farbstoffe durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe erfolgt.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Scanmikroskops, wobei dem Detektor ein SP Modul vorgeschaltet ist;
2 eine schematische Darstellung des SP-Moduls im Detail;
3 eine schematische Darstellung des Fluoreszenzspektrums eines Farbstoffes, der in der Probe vorhanden ist;
4 eine beispielhafte Darstellung der Berechnung eines Richtungsvektors an Hand des Spektrums aus 3;
5 eine graphische Darstellung der räumlichen Trennung von Fluoreszenzspektren zweier in der Probe vorhanden Farbstoffe in einem zweidimensionalen Intensitätshistogramm;
6 eine graphische Darstellung eines um das Fluoreszenzspektrum aus 3 festgelegten Toleranzbereichs das im Intensitätshistogram einem Kegel um den Schwerpunkt der „Zigarre“ entspricht; und
7 eine Darstellung der Klassifikation von Fluoreszenzspektren von in der Probe vorhanden Farbstoffe, wobei der Toleranzbereich aus 6. zur Trennung herangezogen wird.

In 1 ist das Ausführungsbeispiel eines konfokalen Scanmikroskops 100 schematisch gezeigt. Dies soll jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden und dem Fachmann ist hinreichend bekannt das die gleichen erfindungsrelevanten Komponenten auch in Fluorometern, Cytometern und Mikroskopsystem anderer Bauart verbaut sind. Das von mindestens einem Beleuchtungssystem 1 kommende Beleuchtungslicht 3 wird von einem Strahlteiler oder einem geeigneten Umlenkmittel 5 zu einem Scanmodul 7 geleitet. Bevor das Beleuchtungslicht 3 auf das Umlenkmittel 5 trifft, passiert dieses ein Beleuchtungspinhole 6. Das Scanmodul 7 umfasst einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9, der das Beleuchtungslicht 3 durch eine Scanoptik 12 und eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. durch ein Objekt 15 führt. Das Beleuchtungslicht 3 wird bei nicht transparenten Objekten 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten 15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann das Beleuchtungslicht 3 auch durch das Objekt 15 geführt werden. Zu diesen Zwecken werden nichtleuchtende Präparate ggf. mit einem oder mehreren geeigneten Farbstoffen präpariert (nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in dem Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe werden durch das Beleuchtungslicht 3 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Die Spektren der verschiedenen Farbstoffe sind überlagert und es gilt nun das Scanmikroskop 100 derart einzustellen, dass eine Trennung und somit Detektion der einzelnen im Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe möglich ist.
Das vom Objekt 15 ausgehende Licht ist ein Detektionslicht 17. Dieses gelangt durch die Mikroskopoptik 13, die Scanoptik 12 und über das Scanmodul 7 zum Umlenkmittel 5, passiert dieses und gelangt über ein Detektionspinhole 18 auf mindestens einen Detektor 36, 37, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Es ist dem Fachmann klar, dass auch andere Detektionskomponenten, wie z.B. Dioden, Diodenarrays, Photomultiplierarrays, CCD Chips oder CMOS Bildsensoren eingesetzt werden können. Das vom Objekt 15 ausgehende bzw. definierte Detektionslicht 17 ist in 1 als gestrichelte Linie dargestellt. In den Detektoren 36, 37 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt 15 ausgehenden Lichtes, proportionale Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, vom Objekt 15 Licht mit einem charakteristischen Spektrum ausgesandt wird, ist es sinnvoll vor dem mindestens einen Detektor 36, 37 ein SP-Modul 20 vorzusehen. Die von dem mindestens einen Detektor 36, 37 erzeugten Daten werden an ein Rechnersystem 23 weitergegeben. Dem Rechnersystem 23 ist mindestens ein Peripheriegerät 27 zugeordnet. Das Peripheriegerät kann z.B. ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung des Scanmikroskops 100 erhält oder den aktuellen Setup und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner ist mit dem Rechnersystem 23 ein Eingabemittel zugeordnet, das z.B. aus einer Tastatur 28, einer Einstellvorrichtung 29 für die Komponenten des Mikroskopsystems und einer Maus 30 besteht.
Das SP Modul 20 (2) ist derart ausgebildet, dass es einen kompletten Lambda Scan aufnehmen kann, d.h., dass alle vom Objekt 15 ausgehenden Wellenlängen aufgezeichnet werden. Mit anderen Worten es wird ein kompletter Wellenlängenbereich aufgenommen, um somit alle von einem Objekt ausgehenden Wellen zu erfassen. Die Daten werden an das Rechnersystem 23 übertragen und können dann in einer von Benutzer bestimmbaren Weise auf dem Display 27 dargestellt werden. Das Detektionslicht 17 wird mit einem Prisma 31 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 32 wird mit der Fokussieroptik 33 fokussiert und trifft anschließend auf eine Spiegelblendenanordnung 34, 35. Die Spiegelblendenanordnung 34, 35, die Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung, die Fokussieroptik 33 und die Detektoren 36 und 37 werden zusammen als SP-Modul 20 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet.
Wie aus 2 ersichtlich ist, kann mittels der Spiegelblendenanordnung 34, 35 ein gewünschter Teil des Spektrums des Detektionslichts 17 ausgewählt bzw. systematisch selektiert werden. In dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Spaltblendenanordnung 34, 35 mit einem ersten und einem zweiten Schieber 40 und 41 ausgestattet. Es ist selbstverständlich, dass für die Selektion von mehr als zwei spektralen Bereichen eine entsprechende Anzahl von Schiebern vorgesehen sein muss. Eine entsrpechende Erhöhung der Speigelschieber ergibt direkt eine Erhöhung der parallel zu erfassenden spektralen Bändern. Dem ersten Schieber 40 ist ein erster Motor 44 und dem zweiten Schieber 41 ist ein zweiter Motor 45 zugeordnet. Die Motore 44 und 45 veranlassen eine gemäß den nachstehenden Verfahren beschriebene Verstellung der Schieber 40 und 41. Durch die Verstellung der Schieber 40 und 41 passiert nur ein Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 des Detektionslichts 17, der nur Licht des vorgewählten Spektralbereichs die Spiegelblendenanordnung 34, 35 und wird von dem Detektor 36, der als Photomultiplier ausgeführt ist detektiert. Ein anderer Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 wird an der Spiegelblendenanordnung 35 reflektiert und gelangt zu Detektor 37, der ebenfalls als Photomultiplier ausgeführt ist. Durch eine geeignete Verschiebung der Spiegelblendenanordnung 35 kann ein spektraler Scan des Objekts 15 durchgeführt werden. Als Ergebnis erhält man die Daten in der Form eines Feldes $\vec{I} (x, y, z t)$
wobei die einzelnen Pixel einen n-dimensionalen Vektor von spektralen Messungen $\vec{I} (z_{0}, y_{0}, z_{0}, t_{0}) = (\begin{matrix} I ([λ_{1} ... λ_{2}]) \\ I ([λ_{3} ... λ_{4}]) \\ \dots \\ I ([λ_{2 n - 1} ... λ_{2 n}]) \end{matrix})$
beinhalten. Durch das Scanmodul 7 wird das Beleuchtungslicht 3 über bzw. durch das Objekt 15 geführt. Das Objekt 15 wird somit punkt- bzw. pixelweise beleuchtet und dadurch auch in gleicher Weise detektiert. Hat man zwei Farbstoffe, so liegen alle Beobachtungen in einer Ebene und die Spuren der einzelnen Spektren liegen auf jeweils einer Geraden im 2-dimensionalen Raum, der durch die beiden Farbstoffreferenzvektoren aufgespannt wird. Bei n Farbstoffen liegen die einzelnen Spektren auf Geraden im n-dimensionalen Raum. Bei drei Farbstoffen hat man ein Volumen, bei vier ein Hypervolumen,
In 3 ist beispielhaft ein Spektrum 50 eines Farbstoffs dargestellt. Auf der Abszisse 51 ist die Wellenlänge λ des vom Objekt bzw. von einem Pixel des Objekts ausgehenden Lichts aufgetragen. Auf der Ordinate 52 ist die Intensität des von dem Objekt ausgehenden Fluoreszenzlichts aufgetragen. Das in 3 dargestellte Spektrum 50 kann der Benutzer z.B. aus einer Datenbank entnehmen, die im Rechnersystem 23 implementiert ist. Ebenso kann der Benutzer das Spektrum 50 durch eine Referenzmessung am jeweiligen Farbstoff selbst bestimmen. Das Bild entspricht ggf. auch dem Messsignal an einem Messpunkt/Pixel an dem dieser spezifische Farbstoff pur vorliegt.
Das Spektrum 50 kann man im n-dimensionalen Raum direkt in einen Richtungsvektor überführen, wenn man die Integrationsbereiche, wie in 4 dargestellt, kennt und bestimmt. Für jedes spektrale Band 55, lässt sich die Fläche unter dem Emissionsspektrum wie folgt bestimmen. $α_{i} = \int_{λ_{2 i - 1}}^{λ_{2 i}} ε (λ) d λ$
Die einzelnen Ergebnisse α_i kann man zu einem Richtungsvektor $\vec{α} = (\begin{matrix} α_{1} \\ α_{2} \\ \dots \\ α_{n} \end{matrix})$
zusammenfassen, wobei nicht unbedingt alle Wellenlängen gemessen werden müssen, sondern Lücken und Überlappungen dem Verfahren nicht schaden.
5 ist eine graphische Darstellung der räumlichen Trennung von Fluoreszenzspektren zweier in der Probe vorhandenen Farbstoffe. Im 2 - dimensionalen Fall kann man die Spektren der zwei Farbstoffe in einer Intensitäts-Histogramm-Darstellung als Keulen 56 auf dem Peripheriegerät 27 darstellen. Hierbei ist auf der Abszisse 58 die Intensität der erste Kanal und auf der Ordinate 59 die Intensität der zweite Kanal dargestellt. Das Problem sind Co-Lokalisationen. Co-Lokalisationen sind Pixel des aufgenommenen Bildes einer Probe, bei denen, wie für den 2-dimensionalen Fall zutreffend, die beiden Farbstoffe gleichzeitig auftreten. Diese bilden im Intensitäts-Histogramm-Diagramm Inseln zwischen dem Keulen 56 und sind nur schwer von diesen zu trennen bzw. diesen zuzuordnen. Im 2-dimensionalen Fall gibt es graphische Lösungen die durch vom Benutzer interaktiv gezeichneter Figuren einen Bereich (regions of interest = ROI) definieren der zur Markierung, Klassifikation und Sortierung genutzt werden kann. Für den Fall von mehr als zwei Dimensionen ist in 6 eine Lösung offenbart. 6 ist eine graphische Darstellung eines um das Fluoreszenzspektrum 50 aus 3 festgelegten Toleranzbereichs. Der Toleranzbereich legt somit einen Bereich 60 um das Fluoreszenzspektrum 50 fest innerhalb dessen eine tolerierbare Variation des Spektrums möglich ist. Die Variation kann der Benutzer durch Angabe von Toleranzen festlegen. In dem in 6 dargestellten Beispiel ist die Situation dargestellt, dass z.B. 10% Variation toleriert wird, die auf eine Intensität (z.B. Maximale, Mittlere) des Bildes beziehen. Die konkrete Ausgestaltung ist ein Freiheitsgrad des Verfahrens und wird der Implementierungskunst des Fachmanns überlassen. Eine obere Grenze 61 und einer untere Grenze 62 die sich aus der Variation automatisch ableiten kennzeichnen somit den Bereich 60 innerhalb dessen ein gemessenes Spektrum liegen muss oder kann, damit es den gewählten Farbstoff zugeordnet wird.
In 7 ist eine Darstellung der räumlichen Trennung von Fluoreszenzspektren von im Objekt vorhanden Farbstoffe gezeigt. Dabei sind die Spektren als Vektor dargestellt und zur Trennung wird der Toleranzbereich herangezogen. Zur Berechnung der Toleranzbänder wird zunächst ein Referenzspektrum eingegeben. Das Referenzspektrum kann aus einer Datenbank abgerufen werden. Ebenso kann das Referenzspektrum vom Benutzer selbst aufgenommen werden, indem der Benutzer das Fluoreszenzspektrum des reinen Farbstoffes vermisst. Unter dem Begriff „reiner Farbstoff“ versteht man, dass das Fluoreszenzspektrum des Farbstoffs alleine vermessen wird. Zumindest aber soll die Bestimmung des Fluoreszenzspektrums ohne den Einfluss eines oder mehrerer weiterer Farbstoffe erfolgen. Der Benutzer kann einen Toleranzbereich festlegen. Ebenso ist es denkbar, dass das System dem Benutzer einen Toleranzbereich vorschlägt. An Hand des Toleranzbereichs werden für jedes einzelne Spektrum die Toleranzspektren berechnet. Aus den vom Scanmikroskop aufgenommenen Daten wird die Menge der Spektren berechnet, die innerhalb der Toleranzbänder liegen. Dabei muss selbstverständlich jedes Toleranzspektrum in dieser Menge enthalten sein.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

Claims

Verfahren zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt (15) vorhandenen Farbstoffen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Bestimmen der Fluoreszenzspektren der aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe; - Angabe eines Toleranzbereichs um das Fluoreszenzspektrum des jeweils einzelnen Farbstoffs; - pixelweises Aufnehmen von Spektren des Objekts, in dem sich mindestens zwei Farbstoffe befinden; - Berechnen der Menge der aufgenommenen Spektren innerhalb des Toleranzbereichs um das Fluoreszenzspektrum; - Ermitteln eines Lambda-Vektors für jedes aufgenommene Pixel; - Bestimmen der Zuordnung eines jeden Pixels zum Spektrum; - Ausgabe eines aus den einzelnen Pixeln zusammengesetzten Bilds für jedes Spektrum; und - Ausgabe mindestens eines Bildes für Co-Lokalisationen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe durch ein Abrufen von Fluoreszenzspektren aus einer Datenbank erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Datenbank des Rechnersystems (23) die zu den einzelnen Farbstoffen gehörigen Fluoreszenzspektren abgelegt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Fluoreszenzspektrum aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe mittels eines SP-Moduls (20) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgabe des aus den einzelnen Pixeln zusammengesetzten Bildes und die Ausgabe mindestens eines Bildes für die Co-Lokalisationen auf einem Display erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Toleranzbereich durch eine obere Grenze (61) und eine untere Grenze (62) festgelegt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Grenze (61) und die untere Grenze (62) durch einen Benutzer definiert wird und ggf. eine Verfeinerung durch eine Diskriminanzanalyse zwischen allen vorliegenden Farbstoffen erfährt.
System zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt (15) vorhandenen Farbstoffen mit einem Mikroskop, einer Detektionseinrichtung, die eine pixelweise Detektion des vom Objekt (15) kommenden Lichts durchführt, einem Rechnersystem (23) mit einem Eingabemittel, einem Display (27) und einer Speichereinheit, wobei das Rechnersystem (23) die Ermittlung eines Lambda-Vektors für jedes aufgenommene Pixel durchführt, jedes Pixel einem Spektrum zuordnet, und wobei auf dem Display (27) jeweils die Ausgabe eines aus den einzelnen Pixeln zusammengesetzten Bildes für jedes Spektrum und eine Ausgabe eines Bildes für die Co-Lokalisationen erfolgt, dadurch gekennzeichnet, dass das Rechnersystem eine Menge aufgenommener Spektren innerhalb eines zuvor angegebenen Toleranzbereichs um ein Fluoreszenzspektrum eines einzelnen im Objekt vorhandenen Farbstoffs berechnet.
System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung zur pixelweisen Detektion des vom Objekt (15) kommenden Lichts aus mindestens einem ersten und einem zweiten Detektor (36, 37) besteht und dass vor dem ersten und dem zweiten Detektor (36, 37) ein SP-Modul vorgesehen ist.
System nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Scanmodul (7) vorgesehen ist, das Beleuchtungslicht (3) pixelweise über oder durch das Objekt (15) führt.
System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel vorgesehen ist, mit dem ein Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt (15) vorhandener Farbstoffe durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe erfolgt.
System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Speichereinheit eine Datenbank umfasst, in der Fluoreszenzspektren verschiedener Farbstoffe abgelegt sind, die der Benutzer je nach Vorhandensein im Objekt (15) abruft.
System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel vorgesehen ist, mit dem ein Toleranzbereich (60) für jedes Fluoreszenzspektrum eines Farbstoffs eingebbar ist.