DE10355150A1 - Verfahren und System zur Analyse von Co-Lokalisationen - Google Patents
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Abstract
Es ist ein Verfahren und ein System zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt (15) vorhandener Farbstoffe offenbart. Dazu bestimmt man die verschiedenen Fluoreszenzspektren aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe. Ein Toleranzbereich um jedes der Fluoreszenzspektren wird ausgewählt. Pixelweise werden dann die Spektren des Objekts (15) aufgenommen, in dem sich mindestens zwei Farbstoffe befinden. Anschließend werden diejenigen Spektren berechnet, die sich innerhalb des Toleranzbereichs um das Fluoreszenzspektrum legen. Für jedes Pixel wird ein Lambda-Vektor berechnet und einem Spektrum zugeordnet. Bilder können auf dem Display entsprechend der Zuordnung zu den Spektren ausgegeben werden.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Co-Lokalisationen.
- Ferner betrifft die Erfindung ein System zur Analyse von Co-Lokalisationen.
- Die deutsche Patentanmeldung
DE 100 06 800.6 offenbart eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens eines Spektralbereichs eines spektral aufgefächerten Lichtstrahls (SP-Modul). Im aufgefächerten des von dem zu untersuchenden Objekt kommenden Lichts sind Selektionsmittel vorgesehen, die als Schieber ausgebildet sind, um somit Teile des aufgefächerten Lichtstrahls auf verschiedene Detektoren zu lenken. Die Signale der Detektoren werden dann zu Bilderzeugung verwendet. DieDE 100 06 800.6 offenbart nicht die Betätigung der Schieber in der Art und Weise, dass eine schnelle und zuverlässige Detektion eines speziellen Spektrums möglich ist. - Aus der deutschen Patentanmeldung
DE 102 27 111.9 ist ein Spektralmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop bekannt. Es werden Verfahren und Systeme zur Erfassung maximaler Information von einem fluoreszierenden mikroskopischen Objekt erfasst. Mit diesem Verfahren ist jedoch nicht eine fehlertolerante und adaptive Datenaufnahme möglich. - Reagiert eine Struktur auf mehr als einen Farbstoff gleichzeitig spricht man von Ko-Lokalisation. Dem Anwender ermöglicht die Analyse von Co-lokalisation z.B. die Analyse biologischer Strukturen in denen zwei (oder mehr) eingefärbte Proteine interagieren oder in denen zwei Strukturmerkmale auf kleinstem Raum zusammenfallen. Betrachtet man ein mehrdimensionales Histogramm in dem Intensitätshäufigkeiten aus unterschiedlichen Bändern gezählt werden, so wird jeder reine Farbstoff als verbreiterte Gerade (Zigarre) wahrgenommen. Im Falle der Kolokalisation ist die Anzahl der im Intensitäts-Häufigkeitsraum zu beobachtenden Geraden größer als die Anzahl der Farbstoffe. Dieser Sachverhalt wird häufig durch eine geschickte Visualisierung bei der Analyse sichtbar gemacht. Die von Demandolx und Davoust eingeführten Techniken des Zytofluorogramms, visualisiert ein Ensemble zweidimensionaler Intensitäten {I →i} (in der Mikroskopie die Pixel eines Bildes, Voxel eines Volumens oder einer zeitlich aufeinanderfolgenden Serie dergleichen, in der Zytofluorometrie die Messungen mehrerer Proben) als zweidimensionalen Scatter-Plot, welches im wesentlichen eine zweidimensionales Häufigkeitsverteilung darstellt. Auf dieser Basis erhält man eine Schätzung der Verbundwahrscheinlichkeitsfunktion der Intensitäten I →, ein Verfahren das in der mathematischen Datenanalyse Stand der Technik ist und dessen Güte nur von der Größe des Ensembles abhängt. Durch eine geeignete Farbcodierung und grafischer Darstellung erhält man ein Bild der Intensitätsverteilung, in dem die Geraden als verbreiterte Spuren durch das Auge des Benutzers zu lokalisieren ist. Die Verbreiterung existiert aufgrund aller Formen des Rauschens und evtl. im Hintergrund wirkender chemischer Einflüsse. Die Technik der Visualisierung lässt sich allerdings nur bis zu maximal 3 Farbstoffen durchführen, da die Visualisierung höherdimensionaler Datensätze schwierig ist und in der Regel mehr kognitive Probleme im Anwender als Nutzen erzeugt.
- Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen zu schaffen, mit dem die Bestimmung von Co-Lokalisationen von im Objekt vorhandenen Farbstoffen möglich ist ohne durch die Dimensionalität beschränkt zu sein. Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 1 aufweist.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es ein System zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen zu schaffen, mit dem ebenfalls die Bestimmung von Co-Lokalisationen von im Objekt vorhandenen Farbstoffen möglich ist. Die objektive Aufgabe wird durch ein System gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 11 aufweist.
- Im Vergleich zum Stand der Technik hat das Verfahren den Vorteil, dass Co-Lokalisationen von mehreren Farbstoffen in einer Probe bestimmt. Dazu ermittelt man die verschiedenen Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandenen Farbstoffe. Ein Toleranzbereich um jedes der Fluoreszenzspektren wird durch den Benutzer definiert. Pixelweise werden dann die Spektren des Objekts aufgenommen, in dem sich mindestens zwei Farbstoffe befinden. Anschließend werden diejenigen Spektren verrechnet, wobei Spektren die sich innerhalb des Toleranzbereichs um einem Fluoreszenzspektren befinden als reine Farbstoffe gewertet werden. Spektren die sich ausserhalb des Toleranzbandes befinden werden als Co-lokalisation gewertet. Die Analyse der nicht zu einem Toleranzband zuzuordnenenden Daten können mit einer Clusteranalyse weiter verfeinert werden. Bilder – original und zurückgerechnet – können auf dem Display entsprechend der Zuordnung zu den Spektren ausgegeben werden. Es bleibt zu bemerken, das die zurückgerechneten Bilddaten auf den Schwerpunkt der Toleranzbänder, bzw. Den von der Clusteranalyse gefundenen zentralen Kolokalisationsgeraden projeziert werden, um ein Bildsignal zu erhalten daß einem puren Farbstoff oder einer eindeutigen Kombination zweier interagierender Farbstoffe entspricht.
- Das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandenen Farbstoffe erfolgt durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe. Ebenso ist das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandenen Farbstoffe durch ein Abrufen, der den im Objekt vorhandenen Fluoreszenzspektren aus einer Datenbank möglich. In der Datenbank des Rechnersystems sind die zu den einzelnen Farbstoffen gehörigen Fluoreszenzspektren abgelegt, wobei die Pflege der Datenbank durch den Anwender erfolgt der auf den Erfahrungsschatz zurückliegender Experimente und spezieller für seine Zwecke notwendige Referenzmessungen zurückgreifen kann. Die Ausgabe des aus den einzelnen Pixeln zusammengesetztes Bild und die Ausgabe des Bildes für die Co-Lokalisationen erfolgt naturgemäß auf einem Display.
- Der Toleranzbereich wird durch eine obere Grenze festgelegt. Die obere Grenze kann durch den Benutzer eingegeben werden. Ebenso kann ein Zahlenwert eingegeben werden, der eine prozentuale Abweichung für die obere und die untere Grenze eines Bereichs um das Fluoreszenzspektrum festlegt, innerhalb dessen das gemessene Spektrum liegen muss. Im mehrdimensionalen Intensitätsraum definiert diese Grenze einen Kegel, der um die Gerade des Farbstoffspektrums im Hyperraum plaziert ist.
- Die Form dieses Kegels ist in einer einfachen Ausprägung des Verfahrens als symetrisch zu betrachten wobei die Definition des Kegelradius an einen Referenzintensitätswert gekoppelt ist, welcher den absoluten Level definiert. Die konkrete Ausgestaltung kann ein Fachmann vornehmen. In einer komplizierteren Variante des Verfahrens wird die Lage aller Farbstoffspektren ausgenutzt. Unter Nutzung dieses Vorwissens kann man den Kegel in einer systematischen Art verbeulen, indem Richtungen im Intensitätsraum in denen Farbstoffe nah beieinanderliegen höher gewichtet werden als Richtungen in denen Farbstoffe nicht nah beieinanderliegen. Die reale Ausgestaltung kann heuristisch aber auch modellgetrieben erfolgen (Bayes, Maximum Liklihood, Entropiebasiert, Varianzanalyse, Fuzzy Logik), wobei bemerkt werden muss daß alle diese Verfahren letztendlich heuristisch sind. Für diese Erfindungsmeldung ist nur das generelle Vorgehen wichtig, ohne sich an den Glaubenskriegen der mathematischen Entscheidungstechnik beteiligen zu wollen.
- Das System zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt vorhandener Farbstoffe umfasst ein Mikroskop, eine Detektionseinrichtung, die eine pixelweise Detektion des vom Objekt kommenden Lichts durchführt, ein Rechnersystem mit einem Eingabemittel, ein Display, und eine Speichereinheit. Das Rechnersystem führt die Ermittlung eines Lamba-Vektors oder Mehrfarben-Vektors für jedes aufgenommene Pixel durch. Jedes Pixel ist ein Spektrum bzw. ein Farbvektor zugeordnet und auf dem Display wird jeweils die Ausgabe eines aus den einzelnen Pixeln zusammengesetztes Bild für jedes Spektrum und die Ausgabe eines Bildes für die Co-Lokalisationen dargestellt.
- Die Detektionseinrichtung dient zur pixelweisen Detektion des vom Objekt kommenden Lichts und kann aus mindestens einem ersten und einem zweiten Detektor bestehen. Ist mehr als ein Detektor vorgesehen, dann ist vor dem ersten und dem zweiten Detektor ein SP-Modul vorgesehen.
- Zur Beleuchtung ist ein Scanmodul vorgesehen, mit der das Beleuchtungslicht pixelweise über oder durch das Objekt geführt wird. Ferner ist ein Mittel vorgesehen, mit dem ein Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt vorhandener Farbstoffe durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe erfolgt.
- In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
-
1 eine schematische Darstellung eines Scanmikroskops, wobei dem Detektor ein SP Modul vorgeschaltet ist; -
2 eine schematische Darstellung des SP-Moduls im Detail; -
3 eine schematische Darstellung des Fluoreszenzspektrums eines Farbstoffes, der in der Probe vorhanden ist; -
4 eine beispielhafte Darstellung der Berechnung eines Richtungsvektors an Hand des Spektrums aus3 ; -
5 eine graphische Darstellung der räumlichen Trennung von Fluoreszenzspektren zweier in der Proben vorhanden Farbstoffe in einem zweidimensionalen Intensitätshistogramm; -
6 eine graphische Darstellung eines um das Fluoreszenzspektrum aus3 festgelegten Toleranzbereichs das im Intensitätshistogram einem Kegel um den Schwerpunkt der „Zigarre" entspricht; und -
7 eine Darstellung der Klassifikation von Fluoreszenzspektren von in der Proben vorhanden Farbstoffe, wobei der Toleranzbereich aus6 . zur Trennung herangezogen wird. - In
1 ist das Ausführungsbeispiel eines konfokalen Scanmikroskops100 schematisch gezeigt. Dies soll jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden und dem Fachmann ist hinreichend bekannt das die gleichen erfindungsrelevanten Komponenten auch in Fluorometern, Cytometern und Mikroskopsystem anderer Bauart verbaut sind. Das von mindestens einem Beleuchtungssystem1 kommende Beleuchtungslicht3 wird von einem Strahlteiler oder einem geeigneten Umlenkmittel5 zu einem Scanmodul7 geleitet. Bevor das Beleuchtungslicht3 auf das Umlenkmittel5 trifft, passiert dieses ein Beleuchtungspinhole6 . Das Scanmodul7 umfasst einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel9 , der das Beleuchtungslicht3 durch eine Scanoptik12 und eine Mikroskopoptik13 hindurch über bzw. durch ein Objekt15 führt. Das Beleuchtungslicht3 wird bei nicht transparenten Objekten15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann das Beleuchtungslicht3 auch durch das Objekt15 geführt werden. Zu diesen Zwecken werden nichtleuchtende Präparate ggf. mit einem oder mehreren geeigneten Farbstoffen präpariert (nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in dem Objekt15 vorhandenen Farbstoffe werden durch das Beleuchtungslicht3 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Die Spektren der verschiedenen Farbstoffe sind überlagert und es gilt nun das Scanmikroskop100 derart einzustellen, dass eine Trennung und somit Detektion der einzelnen im Objekt15 vorhandenen Farbstoffe möglich ist. - Das vom Objekt
15 ausgehende Licht ist ein Detektionslicht17 . Dieses gelangt durch die Mikroskopoptik13 , die Scanoptik12 und über das Scanmodul7 zum Umlenkmittel5 , passiert dieses und gelangt über ein Detektionspinhole18 auf mindestens einen Detektor36 ,37 , der als Photomultiplier ausgeführt ist. Es ist dem Fachmann klar, dass auch andere Detektionskomponenten, wie z.B. Dioden, Diodenarrays, Photomultiplierarrays, CCD Chips oder CMOS Bildsensoren eingesetzt werden können. Das vom Objekt15 ausgehende bzw. definierte Detektionslicht17 ist in1 als gestrichelte Linie dargestellt. In den Detektoren36 ,37 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt15 ausgehenden Lichtes, proportionale Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, vom Objekt15 Licht mit einem charakteristischen Spektrum ausgesandt wird, ist es sinnvoll vor dem mindestens einen Detektor36 ,37 ein SP-Modul20 vorzusehen. Die von dem mindestens einen Detektor36 ,37 erzeugten Daten werden an ein Rechnersystem23 weitergegeben. Dem Rechnersystem23 ist mindestens ein Peripheriegerät27 zugeordnet. Das Peripheriegerät kann z.B. ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung des Scanmikroskops100 erhält oder den aktuellen Setup und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner ist mit dem Rechnersystem23 ein Eingabemittel zugeordnet, das z.B. aus einer Tastatur28 , einer Einstellvorrichtung29 für die Komponenten des Mikroskopsystems und einer Maus30 besteht. - Das SP Modul
20 (2 ) ist derart ausgebildet, dass es einen kompletten Lambda Scan aufnehmen kann, d.h., das alle vom Objekt15 ausgehenden Wellenlängen aufgezeichnet werden. Mit anderen Worten es wird ein kompletter Wellenlängenbereich aufgenommen, um somit alle von einem Objekt ausgehenden Wellen zu erfassen. Die Daten werden an das Rechnersystem23 übertragen und können dann in einer von Benutzer bestimmbaren Weise auf dem Display27 dargestellt werden. Das Detektionslicht17 wird mit einem Prisma31 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer32 wird mit der Fokussieroptik33 fokussiert und trifft anschließend auf eine Spiegelblendenanordnung34 ,35 . Die Spiegelblendenanordnung34 ,35 , die Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung, die Fokussieroptik33 und die Detektoren36 und37 werden zusammen als SP-Modul20 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet. - Wie aus
2 ersichtlich ist, kann mittels der Spiegelblendenanordnung34 ,35 eine gewünschter Teil des Spektrums des Detektionslichts17 ausgewählt bzw. systematisch selektiert werden. In dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Spaltblendenanordnung34 ,35 mit einem ersten und einem zweiten Schieber40 und41 ausgestattet. Es ist selbstverständlich, dass für die Selektion von mehr als zwei spektralen Bereichen eine entsprechende Anzahl von Schiebern vorgesehen sein muss. Eine entsrpechende Erhöhung der Speigelschieber ergibt direkt eine Erhöhung der parallel zu erfassenden spektralen Bändern. Dem ersten Schieber40 ist ein erster Motor44 und dem zweiten Schieber41 ist ein zweiter Motor45 zugeordnet. Die Motore44 und45 veranlassen eine gemäß den nachstehenden Verfahren beschriebene Verstellung der Schieber40 und41 . Durch die Verstellung der Schieber40 und41 passiert nur ein Teil des aufgespaltenen Lichtfächers32 des Detektionslichts17 , der nur Licht des vorgewählten Spektralbereichs die Spiegelblendenanordnung34 ,35 und wird von dem Detektor36 , der als Photomultiplier ausgeführt ist detektiert. Ein anderer Teil des aufgespaltenen Lichtfächers32 wird an der Spiegelblendenanordnung35 reflektiert und gelangt zu Detektor37 , der ebenfalls als Photomultiplier ausgeführt ist. Durch eine geeignete Verschiebung der Spiegelblendenanordnung35 kann ein spektraler Scan des Objekts15 durchgeführt werden. Als Ergebnis erhält man die Daten in der Form eines Feldes
I →(x, y, z, t)
wobei die einzelnen Pixel einen n-dimensionalen Vektor von spektralen Messungen beinhalten. Durch das Scanmodul7 wird das Beleuchtungslicht3 über bzw. durch das Objekt15 geführt. Das Objekt15 wird somit punkt- bzw. pixelweise beleuchtet und dadurch auch in gleicher Weise detektiert. Hat man zwei Farbstoffe, so liegen alle Beobachtungen in einer Ebene und die Spuren der einzelnen Spektren liegen auf jeweils einer Geraden im 2-dimensionalen Raum, der durch die beiden Farbstoffreferenzvektoren aufgespannt wird. Bei n Farbstoffen liegen die einzelnen Spektren auf Geraden im n-dimensionalen Raum. Bei drei Farbstoffen hat man ein Volumen, bei vier ein Hypervolumen, ... - In
3 ist beispielhaft ein Spektrum50 eines Farbstoffs dargestellt. Auf der Abszisse51 ist die Wellenlänge λ des vom Objekt bzw. von einem Pixel des Objekts ausgehenden Lichts aufgetragen. Auf der Ordinate52 ist die Intensität des von dem Objekts ausgehenden Fluoreszenzlichts aufgetragen. Das in3 dargestellte Spektrum50 kann der Benutzer z.B. aus einer Datenbank entnehmen, die im Rechnersystem23 implementiert ist. Ebenso kann der Benutzer das Spektrum50 durch eine Referenzmessung am jeweiligen Farbstoff selbst bestimmen. Das Bild entspricht ggf. auch dem Messsignal an einem Messpunkt/Pixel an dem dieser spezifische Farbstoff pur vorliegt. - Das Spektrum
50 kann man im n-dimensionalen Raum direkt in einen Richtungsvektor überführen, wenn man die Integrationsbereiche, wie in4 dargestellt, kennt und bestimmt. Für jedes spektrale Band55 , lässt sich die Fläche unter dem Emissionsspektrum wie folgt bestimmen. -
-
5 ist eine graphische Darstellung der räumlichen Trennung von Fluoreszenzspektren zweier in der Proben vorhanden Farbstoffe. Im 2-dimensionalen Fall kann man die Spektren der zwei Farbstoffe in einer Intensitäts-Histogramm-Darstellung als Keulen56 auf dem Peripheriegerät27 darstellen. Hierbei ist auf der Abszisse58 die Intensität der erste Kanal und auf der Ordinate59 die Intensität der zweite Kanal dargestellt. Das Problem sind Co-Lokalisationen. Co-Lokalisationen sind Pixel des aufgenommenen Bildes einer Probe, bei denen, wie für den 2-dimensionalen Fall zutreffend, die beiden Farbstoffe gleichzeitig auftreten. Diese bilden im Intensitäts-Histogramm-Diagramm Inseln zwischen dem Keulen56 und sind nur schwer von diesen zu trennen bzw. diesen zuzuordnen. Im 2-dimensionalen Fall gibt es graphische Lösungen die durch vom Benutzer interaktiv gezeichneter Figuren einen Bereich (regions of interest = ROI) definieren der zur Markierung, Klassifikation und Sortierung genutzt werden kann. Für den Fall von mehr als zwei Dimensionen ist in6 eine Lösung offenbart.6 ist eine graphische Darstellung eines um das Fluoreszenzspektrum50 aus3 festgelegten Toleranzbereichs. Der Toleranzbereich legt somit einen Bereich60 um das Fluoreszenzspektrum50 fest innerhalb dessen eine tolerierbare Variation des Spektrums möglich ist. Die Variation kann der Benutzer durch Angabe von Toleranzen festlegen. In dem in6 dargestellten Beispiel ist die Situation dargestellt, dass z.B. 10% Variation toleriert wird, die auf eine Intensität (z.B. Maximale, Mittlere) des Bildes beziehen. Die konkrete Ausgestaltung ist ein Freiheitsgrad des Verfahrens und wird der Implementierungskunst des Fachmanns überlassen. Eine obere Grenze61 und einer untere Grenze62 die sich aus der Variation automatisch ableiten kennzeichnen somit den Bereich60 innerhalb dessen ein gemessenes Spektrum liegen muss oder kann, damit es den gewählten Farbstoff zugeordnet wird. - In
7 ist eine Darstellung der räumlichen Trennung von Fluoreszenzspektren von im Objekt vorhanden Farbstoffe gezeigt. Dabei sind die Spektren als Vektor dargestellt und zur Trennung wird der Toleranzbereich herangezogen. Zur Berechnung der Toleranzbänder wird zunächst ein Referenzspektrum eingegeben. Das Referenzspektrum kann aus einer Datenbank abgerufen werden. Ebenso kann das Referenzspektrum vom Benutzer selbst aufgenommen werden, indem der Benutzer das Fluoreszenzspektrum des reinen Farbstoffes vermisst. Unter dem Begriff „reiner Farbstoff" versteht man, dass das Fluoreszenzspektrum des Farbstoff alleine vermessen wird. Zumindest aber soll die Bestimmung des Fluoreszenzspektrums ohne den Einfluss eines oder mehrere weiterer Farbstoffe erfolgen. Der Benutzer kann einen Toleranzbereich festlegen. Ebenso ist es denkbar, dass das System dem Benutzer einen Toleranzbereich vorschlägt. An Hand des Toleranzbereichs werden für jedes einzelne Spektrum die Toleranzspektren berechnet. Aus den von Scanmikroskop aufgenommenen Daten wird die Menge der Spektren berechnet, die innerhalb der Toleranzbänder liegen. Dabei muss selbstverständlich jedes Toleranzspektrum in dieser Menge enthalten sein. - Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
Claims (14)
- Verfahren zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt (
15 ) vorhandenen Farbstoffe, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: – Bestimmen der Fluoreszenzspektren der aller im Objekt (15 ) vorhandenen Farbstoffe; – Angabe eines Toleranzbereichs um das Fluoreszenzspektren des jeweils einzelnen Farbstoffs; – pixelweises Aufnehmen von Spektren des Objekts in dem sich mindestens zwei Farbstoffe befinden; – Berechnen der Menge der aufgenommenen Spektren innerhalb des Toleranzbereichs um das Fluoreszenzspektren; – Ermitteln eines Lamba-Vektors für jedes aufgenommene Pixel; – Bestimmen der Zuordnung eines jeden Pixels zum Spektrum; – Ausgabe eines aus den einzelnen Pixeln zusammengesetztes Bild für jedes Spektrum; und – Ausgabe mindestens eines Bildes für Co-Lokalisationen. - Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt (
15 ) vorhandenen Farbstoffe durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe erfolgt. - Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt (
15 ) vorhandenen Farbstoffe durch ein Abrufen der den im Objekt (15 ) vorhandenen Fluoreszenzspektren aus einer Datenbank erfolgt. - Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Datenbank des Rechnersystems (
23 ) die zu den einzelnen Farbstoffen gehörigen Fluoreszenzspektren abgelegt sind. - Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass von der Probe ausgehende Fluoreszenzspektrum, aller im Objekt (
15 ) vorhandenen Farbstoffe, mittels eines SP-Moduls (20 ) durchgeführt wird. - Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgabe des aus den einzelnen Pixeln zusammengesetztes Bild und die Ausgabe mindestens eines Bildes für die Co-Lokalisationen auf einem Display erfolgt.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Toleranzbereich durch eine obere Grenze (
61 ) und eine untere Grenze (62 ) festgelegt ist. - Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Grenze (
61 ) und die untere Grenze (62 ) durch einen Benutzer definiert wird und ggf. eine Verfeinerung durch eine Diskriminanzanalyse zwischen allen vorliegenden Farbstoffen erfährt. - System zur Analyse von Co-Lokalisationen von in einem Objekt (
15 ) vorhandener Farbstoffe, mit einem Mikroskop, einer Detektionseinrichtung, die eine pixelweise Detektion des vom Objekt (15 ) kommenden Lichts durchführt, einem Rechnersystem (23 ) mit einem Eingabemittel, einem Display (27 ), und einer Speichereinheit, dadurch gekennzeichnet, dass das Rechnersystem (23 ) die Ermittlung eines Lamba-Vektors für jedes aufgenommene Pixel durchführt, jedes Pixel einem Spektrum zuordnet, und dass auf dem Display (27 ) jeweils die Ausgabe eines aus den einzelnen Pixeln zusammengesetztes Bild für jedes Spektrum und eine Ausgabe eines Bildes für die Co-Lokalisationen erfolgt. - System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung zur pixelweisen Detektion des vom Objekt (
15 ) kommenden Lichts aus mindestens einem ersten und einem zweiten Detektor (36 ,37 ) besteht und dass vor dem ersten und dem zweiten Detektor (36 ,37 ) ein SP-Modul vorgesehen ist. - System nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Scanmodul (
7 ) vorgesehen ist, das Beleuchtungslicht (3 ) pixelweise über oder durch das Objekt (15 ) führt. - System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel vorgesehen ist, mit dem ein Bestimmen der Fluoreszenzspektren aller im Objekt (
15 ) vorhandener Farbstoffe durch die Aufnahme von Referenzspektren der einzelnen Farbstoffe erfolgt. - System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Speichereinheit eine Datenbank umfasst, in der Fluoreszenzspektren verschiedener Farbstoffe abgelegt sind, die der Benutzer je nach Vorhanden sein im Objekt (
15 ) abruft. - System nach Anspruch
9 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel vorgesehen ist, mit dem ein Toleranzbereich (60 ) für jedes Fluoreszenzspektrum eines Farbstoffs eingebbar ist.
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102020120114A1 (de) | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Abberior Instruments Gmbh | Detektionseinrichtung für ein Laserscanning-Mikroskop |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10339312A1 (de) * | 2003-08-27 | 2005-03-31 | Leica Microsystems Heidelberg Gmbh | Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6411838B1 (en) * | 1998-12-23 | 2002-06-25 | Medispectra, Inc. | Systems and methods for optical examination of samples |
DE10006800A1 (de) | 2000-02-15 | 2001-08-16 | Leica Microsystems | Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens eines Spektralbereichs eines spektral aufgefächerten Lichtstrahls |
US6958811B2 (en) * | 2000-06-29 | 2005-10-25 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Method for the detection of dyes in fluorescence microscopy |
DE10065783B4 (de) * | 2000-12-30 | 2007-05-03 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren, Anordnung und System zur Ermittlung von Prozessgrößen |
DE10218706B4 (de) * | 2002-04-26 | 2008-02-28 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren zur zeitoptimierten Erfassung von speziellen Spektren mit einem Scanmikroskop |
DE10227111B4 (de) | 2002-06-17 | 2007-09-27 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Spektralmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop |
-
2003
- 2003-11-26 DE DE10355150.6A patent/DE10355150B4/de not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-11-09 US US10/984,627 patent/US7282724B2/en active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102020120114A1 (de) | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Abberior Instruments Gmbh | Detektionseinrichtung für ein Laserscanning-Mikroskop |
Also Published As
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DE10355150B4 (de) | 2021-01-14 |
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