DE102020107762A1

DE102020107762A1 - Fluoreszenzmikroskop und Verfahren zur Abbildung eines Objekts

Info

Publication number: DE102020107762A1
Application number: DE102020107762.9A
Authority: DE
Inventors: Christian Schumann
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-09-23
Also published as: JP2023518448A; US20230129462A1; EP4121743A1; WO2021185557A1

Abstract

Ein Fluoreszenzmikroskop (100) zur Abbildung eines Objekts (102), das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält. Das Fluoreszenzmikroskop (100) umfasst ein optisches System (104), das so ausgebildet ist, dass es das von den verschiedenen Fluorophorspezies emittierte Fluoreszenzlicht (220) innerhalb eines Sichtfelds (FOV) sammelt und das Fluoreszenzlicht zur Detektion fokussiert. Das Fluoreszenzmikroskop (100) enthält eine Spektralteileranordnung (218), die so ausgebildet ist, dass sie das innerhalb des Sichtfelds (FOV) gesammelte Fluoreszenzlicht (220) in mindestens zwei spektral unterschiedliche Fluoreszenzlichtkomponenten (316, 318) teilt, und ein Mehrkanal-Detektorsystem (230), das mindestens zwei Bildsensoren (232, 234) umfasst, die so ausgebildet sind, dass sie mindestens zwei räumliche Lichtintensitätsverteilungen basierend auf den mindestens zwei spektral unterschiedlichen Fluoreszenzlichtkomponenten (223, 225) erfassen, wobei jede räumliche Lichtintensitätsverteilung ein Bild des Objekts (102) über das Sichtfeld (FOV) darstellt. Das Fluoreszenzmikroskop (100) enthält ferner einen Prozessor (110), der so ausgebildet ist, dass er räumliche Verteilungen der verschiedenen Fluorophorspezies auf der Grundlage einer spektralen Entmischungsanalyse jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung bestimmt, wobei der Prozessor (110) ferner so ausgebildet ist, dass er Kompensationsinformationen erhält, die eine Variation der spektralen Charakteristiken der Spektralteileranordnung (218) über das Sichtfeld (FOV) darstellen, und dass er eine räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies unter Berücksichtigung der Kompensationsinformationen bestimmt.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop und ein Verfahren zur Abbildung eines Objekts, das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält.
Stand der Technik
Auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie haben sich Mehrkanalsysteme etabliert, die es dem Anwender ermöglichen, eine Vielzahl von Fluorophorspezies mit unterschiedlichen Emissionsspektren gleichzeitig auf mehrere Bildsensoren abzubilden. Um das von den verschiedenen Fluorophorspezies emittierte Fluoreszenzlicht spektral zu teilen, werden spektrale Bildteileranordnungen verwendet. Eine solche Bildteileranordnung umfasst mindestens eine Teilerfläche, die aus einer verkitteten Schicht, z. B. bei verkitteten dichroitischen Beschichtungen in Prismenanordnungen, oder einer Außenfläche eines dünnen Substrats, wie es in normalen dichroitischen Spiegeln vorgesehen ist, gebildet sein kann.
Neben einer moderaten Flankensteilheit und spektralen Selektivität ist die durch eine solche Teilerfläche erzielte spektrale Teilung stark vom Einfallswinkel des Fluoreszenzlichts abhängig. Das heißt, die spektrale Trennung ist stark abhängig von dem Winkel, unter dem das Fluoreszenzlicht auf die Teilerfläche auftrifft, wobei dieser Winkel einem bestimmten Punkt innerhalb des Sichtfeldes (FOV) zugeordnet ist, aus dem das Fluoreszenzlicht in Richtung Teilerfläche austritt. Der vorgenannte Winkel ist also als Hauptstrahlwinkel für diesen bestimmten Objektpunkt zu verstehen.
Um eine FOV-unabhängige spektrale Trennung zu erreichen, kann es in Erwägung gezogen werden, ein optisches System zu verwenden, das bildseitig telezentrisch aufgebaut ist. So variiert bei einem telezentrischen System der Hauptstrahleinfallswinkel, unter dem das Fluoreszenzlicht auf die Teilerfläche trifft, nicht über das FOV. Wenn eine FOV-unabhängige spektrale Trennung sichergestellt ist, können außerdem lineare Entmischungsverfahren, wie sie z. B. in der Veröffentlichung von Zimmermann, Advanced Biocemical Engineering/Biotechnology (2005), Band 95, 245-265 offenbart sind, zur Analyse der detektierten Bilder angewendet werden.
Ein telezentrisches optisches System hat jedoch Nachteile in Bezug auf die Größe seiner optischen Komponenten. So dürfen die Linsen und die Teilerfläche, die im optischen System enthalten sind, nicht kleiner als das FOV sein, was sich nachteilig auf die Kosten und das optische Design auswirkt. Auch die Anforderungen der Pupillenabbildung an die Telezentrie vergrößern in der Regel das optische System.
Zusammenfassung
Es ist eine Aufgabe, ein Fluoreszenzmikroskop und ein Verfahren bereitzustellen, die eine zuverlässige Mehrkanalabbildung eines Objekts, das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält, mit Hilfe eines kompakten Detektordesigns ermöglichen.
Die vorgenannte Aufgabe wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen und der folgenden Beschreibung definiert.
Ein Fluoreszenzmikroskop zur Abbildung eines Objekts, das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält, umfasst ein optisches System, das so ausgebildet ist, dass es das von den verschiedenen Fluorophoren emittierte Fluoreszenzlicht innerhalb eines Sichtfelds (FOV) sammelt und das Fluoreszenzlicht zur Detektion fokussiert. Das Fluoreszenzmikroskop umfasst eine Spektralteileranordnung (Spektralteilervorrichtung), die so ausgebildet ist, dass sie das innerhalb des FOV gesammelte Fluoreszenzlicht in mindestens zwei spektral unterschiedliche Fluoreszenzlichtkomponenten teilt. Das Fluoreszenzmikroskop umfasst ein Mehrkanal-Detektorsystem, das mindestens zwei Bildsensoren umfasst, die so konfiguriert sind, dass sie mindestens zwei räumliche Lichtintensitätsverteilungen basierend auf den mindestens zwei spektral unterschiedlichen Fluoreszenzlichtkomponenten erfassen, wobei jede räumliche Lichtintensitätsverteilung ein Bild des Objekts über das FOV darstellt. Das Fluoreszenzmikroskop umfasst ferner einen Prozessor, der so ausgebildet ist, dass er räumliche Verteilungen der verschiedenen Fluorophorspezies auf der Grundlage einer spektralen Entmischungsanalyse jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung bestimmt. Der Prozessor ist ferner so ausgebildet, dass er eine Kompensationsinformation erhält, die eine Variation der spektralen Charakteristiken des dispersiven Systems über das FOV darstellt, und dass er eine räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies unter Berücksichtigung der Kompensationsinformation bestimmt.
Das beanspruchte Fluoreszenzmikroskop erlaubt die Berücksichtigung einer FOV-abhängigen Variation der durch die Spektralteileranordnung bewirkten spektralen Trennung. Dadurch ist es zum einen nicht erforderlich, das optische System bildseitig oder im Bereich der Spektralteileranordnung telezentrisch auszubilden, was Vorteile hinsichtlich der Kosten und des optischen Designs bietet. Insbesondere müssen die Linsen und die Spektralteileranordnung, die im optischen System enthalten sind, nicht so groß sein wie das FOV, um eine einwandfreie Abbildung zu gewährleisten. Andererseits ermöglicht die Nutzung der Kompensationsinformation, die eine FOV-abhängige Variation der spektralen Trennung angibt, eine geeignete Entmischungsanalyse, ohne auf herkömmliche lineare Entmischungsverfahren zurückgreifen zu müssen.
Vorzugsweise ist der Prozessor so ausgebildet, dass er basierend auf der spektralen Entmischungsanalyse die Intensitätsbeiträge zu jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung bestimmt, die durch die verschiedenen Fluorophorspezies induziert werden.
Das optische System kann durch eine Weitfeldoptik gebildet sein. Das Fluoreszenzmikroskop ist jedoch nicht darauf beschränkt. Gemäß einem alternativen Ausführungsbeispiel kann das optische System dazu dienen, das Objekt sequentiell Pixel für Pixel abzubilden, wobei ein resultierendes Bild aus einer Vielzahl von Pixeln zusammengesetzt ist.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann das optische System so ausgebildet sein, dass es im Bereich der Spektralteileranordnung, im häufigsten Fall auf einer Bildseite, nicht-telezentrisch ist. Wie oben erläutert, hat die Verwendung einer nicht-telezentrischen Konfiguration erhebliche Vorteile in Bezug auf Design und Kosten. Außerdem kann die Weitfeldoptik eine Austrittspupille mit einer endlichen Pupillenposition aufweisen. Dies ermöglicht mehr Flexibilität bei der Verwendung eines Vergrößerungswechselsystems, das als afokales System mit einer konstanten Austrittspupillenposition konfiguriert werden muss, um die Telezentrie beizubehalten. Da bei der hier offenbarten Konfiguration keine Telezentrie erforderlich ist, kann insbesondere ein einfacher Tubuslinsenwechsler verwendet werden, der im Allgemeinen nicht für alle Vergrößerungseinstellungen bildseitig telezentrisch ist.
Vorzugsweise umfasst die Spektralteileranordnung mindestens eine Teilerfläche, deren spektrale Charakteristik in Abhängigkeit von einem Einfallswinkel eines Hauptstrahls des Fluoreszenzlichts variiert. Die FOV-abhängige Charakteristik der Teilerfläche kann genutzt werden, um die oben erwähnte Kompensationsinformation zu erhalten.
Die Teilerfläche kann so ausgebildet sein, dass sie das Fluoreszenzlicht in einem ersten Spektralbereich transmittiert und das Fluoreszenzlicht in einem zweiten Spektralbereich reflektiert, wobei der erste und der zweite Spektralbereich durch einen spektralen Übergangsbereich getrennt sind, der in Abhängigkeit vom Einfallswinkel des Hauptstrahls des Fluoreszenzlichts variiert.
Die Spektralteileranordnung kann mindestens ein Prisma umfassen. Beispielsweise kann das dispersive System als ein aus dem Stand der Technik bekanntes Bauernfeind-Prisma ausgebildet sein. Alternativ kann die Spektralteileranordnung mindestens einen Platten-Strahlteiler umfassen.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der Prozessor so ausgebildet, dass er eine modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung für jeden Bildsensor verwendet, wobei die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung die oben erwähnte Kompensationsinformation als einen voreingestellten Parameter und die räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies als einen Anpassungsparameter enthält. Der Prozessor ist ferner so ausgebildet, dass er die räumliche Verteilung der Fluorophorspezies bestimmt, indem er die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung so optimiert, dass sie mit der von dem jeweiligen Bildsensor erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilung übereinstimmt. Zum Beispiel kann der Prozessor ein Optimierungsverfahren anwenden, das ausgeführt wird, um eine Zielfunktion zu maximieren. Die Zielfunktion kann eine Wahrscheinlichkeit für den Erhalt der experimentellen Daten, d. h. der von dem jeweiligen Bildsensor erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilung, darstellen, wenn alle möglichen räumlichen Verteilungen der Fluorophorspezies berücksichtigt werden.
Die modellbasierte räumliche Lichtverteilung $I_{m} (\vec{x'})$
kann durch die folgende Beziehung wiedergegeben werden: $I_{m} (\vec{x'}) = ∭ c_{n} (\vec{x}) \cdot h (\vec{x}, \vec{x'}, λ') \cdot E x_{n} (λ) \cdot I l l_{m} (\vec{x}, λ) \cdot E m_{n} (λ') \cdot D_{m} (\vec{x}, λ') d λ d λ' d^{2} \vec{x}$
wobei:

m ein Index ist, der einen Spektralkanal bezeichnet, der den jeweiligen Bildsensor und eine Beleuchtungsverteilung enthält, die von einer dem Spektralkanal zugeordneten Lichtquelle erzeugt wird;
n ein Index ist, der die jeweilige Fluorophorspezies bezeichnet;
$\vec{x}, \vec{x'}$
räumliche Koordinaten sind;
λ eine Anregungswellenlänge des Beleuchtungslichts ist;
λ' eine Emissionswellenlänge des Fluoreszenzlichts ist;
$c_{n} (\vec{x})$
eine räumliche Verteilung der Fluorophorspezies n ist;
$h (\vec{x}, \vec{x'}, λ')$
eine Punktspreizfunktion des optischen Systems ist;
Ex_n(λ) ein Fluoreszenzanregungsspektrum der Fluorophorspezies n ist; $I l l_{m} (\vec{x}, λ)$
die Beleuchtungsverteilung des Bildsensors m ist;
Em_n(λ') ein Fluoreszenzemissionsspektrum der Fluorophorspezies n ist;
$D_{m} (\vec{x}, λ')$
ein Detektionsspektrum des Bildsensors ist, das dem Spektralkanal m entspricht.

Auf der rechten Seite der Gleichung (1) können alle Terme mit Ausnahme von $c_{n} (\vec{x})$
bekannt sein. Mit anderen Worten, diese Terme können als voreingestellte Parameter betrachtet werden, sodass der Term $c_{n} (\vec{x})$
der die räumliche Verteilung der Fluorophorspezies n bezeichnet, der einzige unbekannte Parameter ist, der bestimmt werden muss.
Die modellbasierte räumliche Lichtverteilung $I_{m} (\vec{x'})$
nach Gleichung (1) kann wie folgt hergeleitet werden:
In einem Mehrfarben-Fluoreszenzexperiment kann eine Anregungswahrscheinlichkeit eines Fluorophors der Spezies n = a1, ..., N - 1 bei der Abbildung in einem Farbkanal m = 0, 1, ..., M - 1 (M ≥ N) wie in Gleichung (2) angegeben modelliert werden: $p_{n m}^{e x c} (\vec{x}) = \int E x_{n} (λ) \cdot I l l_{m} (\vec{x}, λ) d λ$
Wie bereits oben erwähnt, bezeichnet der Term Ex_n(λ) das Fluoreszenzanregungsspektrum der Fluorophorspezies n, und der Term $I l l_{m} (\vec{x}, λ)$
bezeichnet das Beleuchtungsspektrum der Lichtquelle des Kanals m, der den oben erwähnten Farbkanal darstellt.
Ferner kann eine Erkennungswahrscheinlichkeit wie in Gleichung (3) angegeben modelliert werden: $p_{n m}^{d e t} (\vec{x}) = \int E m_{n} (λ') \cdot D_{m} (\vec{x}, λ') d λ'$
Wie oben erwähnt, bezeichnet Em_n(λ') das Fluoreszenzemissionsspektrum der Fluorophorspezies n, und der Term $D_{m} (\vec{x}, λ')$
bezeichnet das Detektionsspektrum des Bildsensors von Kanal m in Gleichung (3).
Es ist zu beachten, dass sowohl das Detektionsspektrum $D_{m} (\vec{x}, λ')$
als auch das Beleuchtungsspektrum $I l l_{m} (\vec{x}, λ)$
ortsabhängig sein können. Dementsprechend ergibt sich die räumliche Lichtverteilung $I_{m} (\vec{x'})$
nach Gleichung (1) aus einem Modell, wie es durch die Gleichungen (2) und (3) definiert ist.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann der Prozessor so ausgebildet sein, dass er das Fluoreszenzmikroskop so steuert, dass es nacheinander die folgenden Schritte ausführt: einen ersten Schritt des Erfassens der mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen mittels der mindestens zwei Bildsensoren; und einen zweiten Schritt des Bestimmens der räumlichen Verteilung jeder Fluorophorspezies, indem die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung so optimiert wird, dass sie mit der von dem jeweiligen Bildsensor erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilung übereinstimmt.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel kann der Prozessor so ausgebildet sein, dass er das Fluoreszenzmikroskop so steuert, dass es die folgenden Schritte sequentiell ausführt: einen ersten Schritt des Erfassens der mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen mittels der mindestens zwei Bildsensoren; einen zweiten Schritt des Verschiebens des Objekts relativ zu dem optischen System; einen dritten Schritt des Erfassens der mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen mittels der mindestens zwei Bildsensoren auf dem in dem zweiten Schritt verschobenen Objekt, wobei der zweite und der dritte Schritt mindestens einmal nacheinander ausgeführt werden; und einen vierten Schritt des Bestimmens der räumlichen Verteilung jeder Fluorophorspezies, indem die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung so optimiert wird, dass sie mit den räumlichen Lichtintensitäts-Lichtverteilungen übereinstimmt, die von dem jeweiligen Bildsensor in dem ersten und dritten Schritt erfasst wurden. Vorzugsweise wird im zweiten Schritt das Objekt relativ zum optischen System derart verschoben, dass sich die spektrale Abbildung mindestens eines Objektpunktes nach der Verschiebung unterscheidet. Insbesondere kann das Objekt senkrecht zur optischen Achse des optischen Systems verschoben werden. Durch die Anwendung dieses Verfahrens kann die spektrale Information, die für die Entmischungsanalyse verwendet werden soll, verbessert werden.
Das Fluoreszenzmikroskop kann einen Mikroskoptisch umfassen, der so ausgebildet ist, dass er relativ zu dem optischen System senkrecht zu einer optischen Achse desselben verschoben werden kann.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst das Fluoreszenzmikroskop eine Beleuchtungsvorrichtung, die so ausgebildet ist, dass sie eine Epifluoreszenzbeleuchtung, eine TIRF-Beleuchtung und/oder eine Lichtblattbeleuchtung bereitstellt.
Gemäß einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Abbildung eines Objekts vorgesehen, das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält, umfassend die folgenden Schritte: Sammeln von Fluoreszenzlicht, das von den verschiedenen Fluorophorspezies innerhalb eines FOV emittiert wird, und Fokussieren des Fluoreszenzlichts zur Erfassung mittels eines optischen Systems; Teilen des innerhalb des FOV gesammelten Fluoreszenzlichts in eine Vielzahl von spektral unterschiedlichen Fluoreszenzlichtkomponenten mittels einer Spektralteileranordnung; Erfassen von mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen auf der Basis der mindestens zwei spektral unterschiedlichen Fluoreszenzlichtkomponenten mittels eines Mehrkanal-Detektorsystems, wobei jede räumliche Lichtintensitätsverteilung ein Bild des Objekts über das FOV darstellt; und Bestimmen von räumlichen Verteilungen der verschiedenen Fluorophorspezies auf der Grundlage einer spektralen Entmischungsanalyse jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung, wobei eine Kompensationsinformation erhalten wird, wobei die Kompensationsinformation eine Variation der spektralen Charakteristiken der Spektralteileranordnung über das FOV darstellt, und um eine räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies unter Berücksichtigung der Kompensationsinformation zu bestimmen.
Figurenliste
Nachstehend werden spezifische Ausführungsbeispiele unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, wobei:

1 ein schematisches Diagramm ist, das ein Fluoreszenzmikroskop gemäß einem Ausführungsbeispiel zeigt;
2 ein schematisches Diagramm ist, das einen nicht-telezentrischen Strahlengang in einem Mehrkanal-Detektorsystem des Fluoreszenzmikroskops zeigt;
3 ein Diagramm ist, das eine Variation der spektralen Charakteristiken einer Teilerfläche abhängig von einem Einfallswinkel von Fluoreszenzlicht zeigt;
4 ein schematisches Diagramm ist, das einen optischen Strahlengang in einem herkömmlichen telezentrischen Mehrkanal-Detektorsystem als Vergleichsbeispiel zeigt;
5 ein Flussdiagramm ist, das ein Ausführungsbeispiel für ein Verfahren zum Bestimmen einer räumlichen Verteilung einer Fluorophorspezies zeigt; und
6 ein Flussdiagramm ist, das ein modifiziertes Ausführungsbeispiel des Verfahrens zum Bestimmen der räumlichen Verteilung der Fluorophorspezies zeigt.

Detaillierte Beschreibung
1 zeigt ein Fluoreszenzmikroskop 100, das angepasst ist, ein Objekt 102 abzubilden, das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält. Dementsprechend kann das in 1 gezeigte Fluoreszenzmikroskop 100 verwendet werden, um ein Mehrfarben-Fluoreszenzexperiment durchzuführen, bei dem Fluorophore verschiedener Spezies zur Emission von Fluoreszenzlicht in verschiedenen Wellenlängenbereichen angeregt werden. Gemäß dem Ausführungsbeispiel der 1 ist das Fluoreszenzmikroskop 100 als ein Weitfeldmikroskop konfiguriert, ohne darauf beschränkt zu sein.
Das Fluoreszenzmikroskop 100 umfasst ein optisches System 104 mit einem Objektiv 106, das von unterhalb eines Mikroskoptisches 108 auf das Objekt 102 gerichtet ist. Der Mikroskoptisch 108 kann ein motorisierter Tisch sein, der in einer Richtung senkrecht zu einer optischen Achse O des optischen Systems 104 bewegt werden kann. Das Fluoreszenzmikroskop 100 umfasst ferner eine Beleuchtungsvorrichtung 110, die so ausgebildet ist, dass sie Beleuchtungslicht 112 emittiert, um die in dem Objekt 102 enthaltenen Fluorophorspezies zur Emission von Fluoreszenzlicht anzuregen. Die konkrete Ausführung der Beleuchtung kann in Abhängigkeit von der spezifischen Anwendung gewählt werden. Beispielsweise kann die Beleuchtungsvorrichtung 110 so ausgebildet sein, dass sie eine Epifluoreszenzbeleuchtung, eine TIRF-Beleuchtung oder eine Lichtblattbeleuchtung, wie in 1 dargestellt, durch unterschiedliche optische Beleuchtungspfade 112 ermöglicht.
Das Fluoreszenzmikroskop 100 umfasst ferner eine Spektraldetektoreinheit 114 (in 2 näher dargestellt) und einen Prozessor 116, der zur Steuerung des gesamten Betriebs des Fluoreszenzmikroskops 100 konfiguriert sein kann. Im vorliegenden Zusammenhang wird der Prozessor 116 zur Steuerung der Spektraldetektoreinheit 114 und des motorisierten Mikroskoptisches 108 verwendet.
Wie in 2 gezeigt, umfasst die Spektraldetektoreinheit 114 eine Spektralteileranordnung 218, die so ausgebildet ist, dass sie Fluoreszenzlicht 220, das innerhalb eines Sichtfelds FOV durch das optische System 104 gesammelt wird, räumlich aufteilt. Es wird darauf hingewiesen, dass das Objektiv 106, das Teil des optischen Systems 104 ist, in 2 weggelassen ist. Ferner umfasst das optische System 104 zusätzlich zum Objektiv 106 eine Tubuslinse 224, wie in 2 gezeigt.
Die Spektraldetektoreinheit 114 umfasst ein Mehrkanal-Detektorsystem 230, das durch mindestens zwei Bildsensoren 232 und 234 gebildet wird. Dementsprechend stellt das Mehrkanal-Detektorsystem 230 mindestens zwei Farbkanäle bereit, die eine mehrfarbige Abbildung des Objekts 102 ermöglichen.
Gemäß dem in 2 gezeigten spezifischen Ausführungsbeispiel kann die Spektralteileranordnung 218 durch eine Prismenanordnung 236, z. B. ein Bauernfeind-Prisma, gebildet sein, die eine verkittete Teilerfläche 238 umfasst. Die Teilerfläche 238 transmittiert das Fluoreszenzlicht 220 in einem ersten Spektralbereich, um eine erste Fluoreszenzlichtkomponente 223 zu erzeugen, die von dem ersten Bildsensor 232 empfangen wird. Gleichermaßen reflektiert die Teilerfläche 238 das Fluoreszenzlicht 220 in einem zweiten Spektralbereich, der sich vom ersten Spektralbereich unterscheidet, um eine zweite Fluoreszenzlichtkomponente 225 zu erzeugen, die vom zweiten Bildsensor 234 empfangen wird.
Wie in dem Diagramm der 3 gezeigt, weist die durch eine verkittete Schicht gebildete Teilerfläche 238 eine spektrale Charakteristik auf, die je nach Einfallswinkel des Fluoreszenzlichts 220 variiert. Genauer gesagt hängt die spektrale Charakteristik der Teilerfläche 238 von dem Einfallswinkel ab, unter dem ein Hauptstrahl eines Fluoreszenzlichtbündels, der von einem bestimmten Punkt innerhalb des Sichtfelds FOV ausgeht, auf die Teilerfläche 238 fällt. 2 zeigt drei Fluoreszenzlichtbündel 220a, 220b, 220c, deren Hauptstrahlen Pa, Pb, Pc (d.h. der zentrale Strahl des jeweiligen Bündels) von drei verschiedenen Punkten innerhalb des FOV ausgehen. In 2 ist jedes Lichtbündel 220a, 220b, 220c durch drei parallele Lichtstrahlen dargestellt, wobei ein zentraler Strahl dieser Lichtstrahlen den jeweiligen Hauptstrahl Pa, Pb, Pc darstellt. Entsprechend variiert die spektrale Charakteristik der Teilerfläche über das FOV. Gemäß dem in 3 dargestellten Beispiel sind der erste und der zweite Spektralbereich, die von der Teilerfläche 238 bereitgestellt werden, durch einen spektralen Übergangsbereich mit einer Breite von mehr als 50 nm voneinander getrennt, in dem die Transmission von 0 auf 1 (für einen bestimmten Einfallswinkel) ansteigt. Die Breite des Übergangsbereichs definiert eine Flankensteilheit der spektralen Charakteristik der Teilerfläche 238. Ferner verschiebt sich der Übergangsbereich mit zunehmendem Einfallswinkel des Fluoreszenzlichts zu größeren Wellenlängen, wie durch einen Pfeil Q in 3 dargestellt. Im Beispiel von 3 führt eine Erhöhung des Einfallswinkels von 26° auf 34° zu einer Verschiebung des Übergangsbereichs um etwa 20 bis 30 nm.
Aufgrund der in 3 gezeigten spektralen Charakteristik variiert die spektrale Teilung des Fluoreszenzlichts 220 in die spektral unterschiedlichen Fluoreszenzlichtkomponenten 223, 225 über das FOV, d.h. sie ist für die verschiedenen Punkte innerhalb des FOV, die den unterschiedlichen Hauptstrahlen Pa, Pb, Pc entsprechen, nicht konstant. Es entsteht also ein spektraler Gradient in Richtung der Teilung. Dies hat zur Folge, dass herkömmliche spektrale Entmischungsverfahren nicht angewendet werden können, da diese Verfahren eine konstante spektrale Teilung über das gesamte FOV voraussetzen.
Um die Probleme zu vermeiden, die sich aus einer Variation der spektralen Teilung über das FOV ergeben, kann in Erwägung gezogen werden, das optische System 104 als ein bildseitig telezentrisches System zu konfigurieren. 4 zeigt eine solche telezentrische Konfiguration als Vergleichsbeispiel.
Damit die Teilerfläche 238 eine konstante spektrale Teilung über das gesamte FOV erreichen kann, ist eine Eintrittspupille 442 erforderlich, die nach unendlich abgebildet wird. Wird die Eintrittspupille 442 nach unendlich abgebildet, fallen die Hauptstrahlen Pa, Pb, Pc aller Fluoreszenzlichtbündel 220a, 220b, 220c, die von den verschiedenen Punkten innerhalb des FOV ausgehen, unter dem gleichen Einfallswinkel auf die Teilerfläche 238. Folglich gibt es keine Variation der spektralen Charakteristik der Teilerfläche 238 über das FOV. Mit anderen Worten, die spektrale Charakteristik ist über das FOV translatorisch invariant, sodass herkömmliche Entmischungsverfahren angewendet werden können.
Wie jedoch auch aus 4 ersichtlich ist, sind die Querschnitte des Strahlengangs an der Tubuslinse 224 und der Teilerfläche 238 relativ groß. Insbesondere müssen die Linsen- und Prismenflächen mindestens so groß sein wie das FOV.
Um den Nachteil der großen Linsen- und Prismenflächen zu vermeiden, ist die in 2 gezeigte Konfiguration so ausgebildet, dass sie bildseitig nicht-telezentrisch ist. Dazu ist die Eintrittspupille 222 z. B. so angeordnet, dass sie mit der Tubuslinse 224 zusammenfällt. Dementsprechend umfasst das optische System 104 eine Austrittspupille mit einer endlichen Pupillenposition. Wie in 2 zu sehen ist, können durch die nicht-telezentrische Konfiguration die Querschnitte des Strahlengangs an den Stellen der Tubuslinse 224 und der Teilerfläche 238 reduziert werden. Dadurch kann eine kompakte Bauform erreicht werden.
Gemäß der in 2 gezeigten Konfiguration steuert der Prozessor 116 jeden Bildsensor 232, 234, um eine räumliche Lichtintensitätsverteilung basierend auf der jeweiligen Fluoreszenzlichtkomponente 223, 225 zu erfassen. Jede der von den Bildsensoren 232, 234 erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilungen stellt ein Bild des Objekts über das gesamte FOV dar. Dann führt der Prozessor 116 eine spektrale Entmischungsanalyse jeder von dem jeweiligen Bildsensor 232, 234 erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilung durch, um die räumlichen Verteilungen der verschiedenen Fluorophorspezies zu bestimmen.
Um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass gemäß der Konfiguration von 2 die durch die Teilerfläche 238 verursachte spektrale Teilung über das FOV variiert, ist der Prozessor 116 so ausgebildet, dass er bei der Durchführung der spektralen Entmischungsanalyse eine Kompensationsinformation berücksichtigt, die die Variation der spektralen Charakteristik der Teilerfläche 238 über das FOV darstellt.
Genauer gesagt, bestimmt der Prozessor 116 bei der Durchführung der spektralen Entmischungsanalyse die Intensitätsbeiträge zu jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung. Zum Beispiel kann der Prozessor eine modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung für jeden Bildsensor anwenden. Diese modellbasierte räumliche Lichtverteilung kann, wie oben erläutert, durch die Gleichung (1) gegeben sein. Die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung enthält die erforderlichen Kompensationsinformationen als einen voreingestellten Parameter und die räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies als einen Anpassungsparameter. Dann bestimmt der Prozessor 116 die räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies, indem er die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung so optimiert, dass sie mit der räumlichen Lichtintensitätsverteilung übereinstimmt, die von dem jeweiligen Bildsensor erfasst wird.
5 zeigt ein Flussdiagramm, das eine Ausführungsbeispiel eines Verfahrens zur Bestimmung der räumlichen Verteilung jeder Fluorophorspezies zeigt.
In Schritt S2 veranlasst der Prozessor 116 jeden der Bildsensoren 232, 234, eine räumliche Lichtintensitätsverteilung zu erfassen, die ein Bild des Objekts über das gesamte FOV darstellt.
In Schritt S4 optimiert der Prozessor 116 die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung gemäß Gleichung (1) derart, dass sie mit den experimentellen Daten übereinstimmt, die durch die von dem jeweiligen Bildsensor 232, 234 erfasste räumliche Lichtintensitätsverteilung dargestellt werden. Mit anderen Worten rekonstruiert der Prozessor den in der modellbasierten räumlichen Lichtintensitätsverteilung nach Gleichung (1) enthaltenen Term $c_{n} (\vec{x})$
durch Anwendung eines geeigneten Optimierungsverfahrens.
6 zeigt ein Flussdiagramm, das ein modifiziertes Verfahren veranschaulicht, das eine zusätzliche spektrale Information verwendet.
In Schritt S6 des in 6 gezeigten Verfahrens veranlasst der Prozessor 116 jeden der Bildsensoren 232, 234 eine räumliche Lichtintensitätsverteilung zu erfassen, die ein Bild des Objekts über das gesamte FOV darstellt.
In Schritt S8 steuert der Prozessor 116 den motorisierten Mikroskoptisch 108, um das Objekt 102 relativ zum optischen System 104 senkrecht zu dessen optischer Achse O zu bewegen. Mit anderen Worten steuert der Prozessor das über das Objekt 102 zu bewegende FOV. Anschließend veranlasst der Prozessor 116 in Schritt S10 jeden der Bildsensoren 232, 234, eine räumliche Lichtintensitätsverteilung auf dem in Schritt S8 verschobenen Objekt 102 zu erfassen. Somit stellt die von jedem Bildsensor 232, 234 erfasste Lichtintensitätsverteilung das verschobene FOV dar.
Die Schritte S8 und S10 werden nacheinander einmal durchgeführt oder in einer Anzahl von Schleifen L wiederholt, um die spektrale Information, die in der spektralen Entmischungsanalyse verwendet werden soll, zu erhöhen.
Schließlich bestimmt der Prozessor 116 in Schritt S12 die räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies. Dazu wendet der Prozessor 116 ein Optimierungsverfahren auf die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung gemäß der Gleichung (1) derart an, dass diese mit den von dem jeweiligen Bildsensor 232, 234 in den Schritten S6 und S8 erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilungen übereinstimmt.
Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung nicht auf die oben beschriebenen spezifischen Ausführungsbeispiele beschränkt ist. So ist das optische System 104 beispielsweise durch ein Weitfeldsystem gebildet. Das optische System kann jedoch auch so konfiguriert sein, dass es das Objekt sequenziell Pixel für Pixel abbildet, z. B. in einem Rastermikroskop. in diesem Fall ist der Prozessor so ausgebildet, dass er eine Vielzahl von Pixelsignalen zu einem resultierenden Bild kombiniert, das wie oben erläutert zu analysieren ist.
Weiterhin ist die Optimierung auf Basis von Gleichung (1) lediglich als Beispiel zu verstehen. Jeder andere geeignete Algorithmus kann angewendet werden, um die FOV-abhängige spektrale Teilung zu kompensieren.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „und/oder“ alle Kombinationen von einem oder mehreren der zugehörigen aufgeführten Elemente und kann mit „/“ abgekürzt werden.
Obwohl einige Aspekte im Rahmen einer Vorrichtung beschrieben wurden, ist es klar, dass diese Aspekte auch eine Beschreibung des entsprechenden Verfahrens darstellen, wobei ein Block oder eine Vorrichtung einem Verfahrensschritt oder einer Funktion eines Verfahrensschritts entspricht. Analog dazu stellen Aspekte, die im Rahmen eines Verfahrensschritts beschrieben werden, auch eine Beschreibung eines entsprechenden Blocks oder Elements oder einer Eigenschaft einer entsprechenden Vorrichtung dar.
Bezugszeichenliste

100: Fluoreszenzmikroskop
102: Objekt
104: optisches System
106: Objektiv
108: Mikroskoptisch
110: Beleuchtungsvorrichtung
112: optischer Beleuchtungspfad
114: Spektraldetektoreinheit
116: Prozessor
218: dispersives System
220: Fluoreszenzlicht
220a, 220b, 220c: Fluoreszenzlichtbündel
224: Tubuslinse
223, 225: Fluoreszenzlichtkomponenten
230: Mehrkanal-Detektorsystem
232, 234: Bildsensoren
236: Prismenanordnung
238: Teilerfläche
FOV: Sichtfeld
O: optische Achse
P1, P2, P3: Punkte innerhalb des FOV
T: Übergangsbereich

Claims

Fluoreszenzmikroskop (100) zur Abbildung eines Objekts (102), das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält, umfassend: ein optisches System (104), das so ausgebildet ist, dass es das von den verschiedenen Fluorophorspezies emittierte Fluoreszenzlicht (220) innerhalb eines Sichtfelds (FOV) sammelt und das Fluoreszenzlicht zur Detektion fokussiert, eine Spektralteileranordnung (218), die so ausgebildet ist, dass sie das innerhalb des Sichtfelds (FOV) gesammelte Fluoreszenzlicht (220) in mindestens zwei spektral unterschiedliche Fluoreszenzlichtkomponenten (316, 318) teilt, ein Mehrkanal-Detektorsystem (230), das mindestens zwei Bildsensoren (232, 234) umfasst, die so ausgebildet sind, dass sie mindestens zwei räumliche Lichtintensitätsverteilungen basierend auf den mindestens zwei spektral unterschiedlichen Fluoreszenzlichtkomponenten (223, 225) erfassen, wobei jede räumliche Lichtintensitätsverteilung ein Bild des Objekts (102) über das Sichtfeld (FOV) darstellt, einen Prozessor (110), der so ausgebildet ist, dass er räumliche Verteilungen der verschiedenen Fluorophorspezies auf der Grundlage einer spektralen Entmischungsanalyse jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung bestimmt, wobei der Prozessor ferner so ausgebildet ist, dass er eine Kompensationsinformation erhält, die eine Variation der spektralen Charakteristiken der Spektralteileranordnung (218) über das Sichtfeld (FOV) darstellt, und dass er eine räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies unter Berücksichtigung der Kompensationsinformation bestimmt.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, wobei der Prozessor (116) so ausgebildet ist, dass er basierend auf der spektralen Entmischungsanalyse die Intensitätsbeiträge zu jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung bestimmt, die durch die verschiedenen Fluorophorspezies induziert werden.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, wobei das optische System (104) durch eine Weitfeldoptik gebildet ist.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das optische System (104) so ausgebildet ist, dass es im Bereich der Spektralteileranordnung nicht-telezentrisch ist.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Weitfeldoptik (102) eine Austrittspupille mit einer endlichen Pupillenposition aufweist.
Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Spektralteileranordnung (218) mindesten eine Teilerfläche (238) umfasst, deren spektrale Charakteristik in Abhängigkeit eines Einfallswinkels eines Hauptstrahls des Fluoreszenzlichts (220) variiert.
Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Teilerfläche (238) so ausgebildet ist, dass sie das Fluoreszenzlicht (220) in einem ersten Spektralbereich transmittiert und das Fluoreszenzlicht (220) in einem zweiten Spektralbereich reflektiert, wobei der erste und der zweite Spektralbereich durch einen spektralen Übergangsbereich (T) getrennt sind, der in Abhängigkeit vom Einfallswinkel des Hauptstrahls des Fluoreszenzlichts (220) variiert.
Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Spektralteileranordnung mindestens ein Prisma (236) umfasst.
Fluoreszenzmikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der der Prozessor (116) so konfiguriert ist, dass er eine modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung für jeden Bildsensor (232, 234) verwendet, wobei die modellbasierte räumliche lichtintensitätsverteilung die genannten Kompensationsinformationen als einen voreingestellten Parameter und die räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies als einen Anpassungsparameter enthält, und wobei der Prozessor (116) ferner so ausgebildet ist, dass er die räumliche Verteilung der Fluorophorspezies bestimmt, indem er die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung so optimiert, dass sie mit der von dem jeweiligen Bildsensor erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilung übereinstimmt.
Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 9, wobei die modellbasierte räumliche Lichtverteilung $I_{m} (\vec{x'})$
durch die folgende Gleichung wiedergegeben wird: $I_{m} (\vec{x'}) = ∭ c_{n} (\vec{x}) \cdot h (\vec{x}, \vec{x'}, λ') \cdot E x_{n} (λ) \cdot I l l_{m} (\vec{x}, λ) \cdot E m_{n} (λ') \cdot D_{m} (\vec{x}, λ') d λ d λ' d^{2} \vec{x}$
wobei: m ein Index ist, der einen Spektralkanal bezeichnet, der den jeweiligen Bildsensor (232, 234) und eine Beleuchtungsverteilung enthält, n ein Index ist, der die jeweilige Fluorophorspezies bezeichnet, $\vec{x}, \vec{x'}$
räumliche Koordinaten sind, λ eine Anregungswellenlänge des Beleuchtungslichts ist, λ' eine Emissionswellenlänge des Fluoreszenzlichts ist, $c_{n} (\vec{x})$
eine räumliche Verteilung der Fluorophorspezies n ist, $h (\vec{x}, \vec{x'}, λ')$
eine Punktspreizfunktion des optischen Systems (104) ist, Ex_n(λ) ein Fluoreszenzanregungsspektrum der Fluorophorspezies n ist, $I l l_{m} (\vec{x}, λ)$
die Beleuchtungsverteilung des Spektralkanals m ist, Em_n(λ') ein Fluoreszenzemissionsspektrum der Fluorophorspezies n ist, und $D_{m} (\vec{x}, λ')$
A') ein Detektionsspektrum des Bildsensors m ist.
Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Prozessor (116) so ausgebildet ist, dass er das Fluoreszenzmikroskop (100) so steuert, dass es nacheinander die folgenden Schritte ausführt: einen ersten Schritt des Erfassens der mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen mittels der mindestens zwei Bildsensoren (232, 234), und einen zweiten Schritt des Bestimmens der räumlichen Verteilung jeder Fluorophorspezies, indem die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung so optimiert wird, dass sie mit der von dem jeweiligen Bildsensor (232, 234) erfassten räumlichen Lichtintensitätsverteilung übereinstimmt.
Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Prozessor (116) so ausgebildet ist, dass er das Fluoreszenzmikroskop (100) so steuert, dass es die folgenden Schritte sequentiell ausführt: einen ersten Schritt des Erfassens der mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen mittels der mindestens zwei Bildsensoren (232, 234), einen zweiten Schritt des Verschiebens des Objekts (102) relativ zu dem optischen System (104), einen dritten Schritt des Erfassens der mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen mittels der mindestens zwei Bildsensoren (232, 234) auf dem in dem zweiten Schritt verschobenen Objekt (102), wobei der zweite und der dritte Schritt mindestens einmal nacheinander ausgeführt werden, und einen vierten Schritt des Bestimmens der räumlichen Verteilung jeder Fluorophorspezies, indem die modellbasierte räumliche Lichtintensitätsverteilung so optimiert wird, das sie mit den räumlichen Lichtintensitäts-Lichtverteilungen übereinstimmt, die von dem jeweiligen Bildsensor (232, 234) in dem ersten und dritten Schritt erfasst wurden.
Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen Mikroskoptisch (108), der so ausgebildet ist, dass er relativ zu dem optischen System (104) senkrecht zu einer optischen Achse (O) desselben verschoben werden kann.
Verfahren zum Abbilden eines Objekts (102), das verschiedene Fluorophorspezies mit unterschiedlichen spektralen Emissionscharakteristiken enthält, umfassend die folgenden Schritte: Sammeln von Fluoreszenzlicht (220), das von den verschiedenen Fluorophorspezies innerhalb eines Sichtfelds (FOV) emittiert wird, und Fokussieren des Fluoreszenzlichts (220) zur Erfassung mittels eines optischen Systems (104), Teilen des innerhalb des Sichtfelds (FOV) gesammelten Fluoreszenzlichts (220) in mindestens zwei spektral unterschiedliche Fluoreszenzlichtkomponenten (223, 225) mittels einer Spektralteileranordnung (218), Erfassen von mindestens zwei räumlichen Lichtintensitätsverteilungen auf der Basis der mindestens zwei spektral unterschiedlichen Fluoreszenzlichtkomponenten (223, 225) mittels eines Mehrkanal-Detektorsystems (230), wobei jede räumliche Lichtintensitätsverteilung ein Bild des Objekts (102) über das Sichtfeld (FOV) darstellt, und Bestimmen von räumlichen Verteilungen der verschiedenen Fluorophorspezies auf der Grundlage einer spektralen Entmischungsanalyse jeder räumlichen Lichtintensitätsverteilung, wobei Kompensationsinformationen erhalten werden, wobei die Kompensationsinformationen eine Variation der spektralen Charakteristiken des dispersiven Systems (218) über das Sichtfeld (FOV) darstellen, und um eine räumliche Verteilung jeder Fluorophorspezies unter Berücksichtigung der Kompensationsinformationen zu bestimmen.
Computerprogramm mit einem Programmcode zum Durchführen des Verfahrens nach Anspruch 14, wenn das Computerprogramm auf einem Prozessor läuft.