WO2010037488A1

WO2010037488A1 - Verfahren zum auswerten von fluoreszenzkorrelationsspektroskopiemessdaten (fcs)

Info

Publication number: WO2010037488A1
Application number: PCT/EP2009/006819
Authority: WO
Inventors: Stephan Wagner-Conrad; Yauheni Novikau; Klaus Weisshart
Original assignee: Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2010-04-08
Also published as: US20110208478A1; US8892400B2; DE102008049877A1

Abstract

2.1. Mit den verschiedenen Formen der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie können physikalische und biologische Transportprozesse in oder zwischen Zellen im mikroskopischen Größenbereich, beispielsweise Diffusionsprozesse, untersucht werden. Dazu werden für verschiedene Probenbereiche Korrelationen der Fluoreszenzmessdaten ermittelt und mathematische Transportmodelle daran angepasst. Fehlerhafte Fluoreszenzkorrelationsanalysen wurden bisher anhand von Eigenschaften der angepassten Modellfunktionsparameter identifiziert und verworfen. Das für die Identifikation notwendige a-priori-Wissen musste in zeitaufwendigen Versuchsreihen ermittelt werden. Mit der Erfindung können Probeneigenschaften aus Fluoreszenzkorrelationen einfacher, schneller und genauer ermittelt werden. 2.2. Es wird für eine oder mehrere Regionen der Probe ein Eignungsgrad für eine Korrelationsauswertung ermittelt, der quantitativ den Informationsgehalt der betreffenden Region oder den bei einer Korrelationsauswertung zu erwartenden Fehler beschreibt und dadurch bereits vor einer Korrelationsauswertung als Kriterium zur Filterung/Auswahl der betreffenden Region verwendet werden kann. Dadurch kann in nicht-informativen Probenbereichen auf aufwendige Korrelationsrechnungen verzichtet werden. 2.3. Fluoreszenzmikroskopie.

Description

VERFAHREN ZUM AUSWERTEN VON FLUORESZENZKORRELATIONSSPEKTROSKOPIEMESSDATEN (FCS)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auswerten von mindestens eindimensional ortsaufgelösten Fluoreszenzmessdaten einer Probe sowie eine Steuereinheit für ein Laser-Scanning-Mikroskop.

Zur Untersuchung von veränderlichen Stoffkonzentrationen im mikroskopischen Größenbereich, hervorgerufen durch Diffusions- und andere Transportprozesse in einer Probe, kann die sogenannte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl, „fluorescence correlation spectroscopy"; FCS) verwendet werden. Damit können physikalische und biologische Transportprozesse in einem einzelnen beziehungsweise durch ein einzelnes Volumen mit einem Durchmesser von etwa 200 nm beobachtet werden. Eine räumliche Auflösung von mikroskopischen Transportvorgängen wird durch die abtastende Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl, „scanning FCS"; S-FCS), auch als Bildkorrelationsspektroskopie (engl, „image correlation spectroscopy"; ICS) bezeichnet, erreicht. Hierbei können zeitliche Größenordnungen von Sekunden bis Minuten verfolgt werden.

Die zwei- oder dreidimensional ortsaufgelöste Verfolgung innerhalb einer Zelle oder zwischen durch Membranen getrennten Zellen im Zeitbereich zwischen Mikro- und Millisekunden wird durch die Rasterbildkorrelationsspektroskopie (engl, „raster image correlation spectroscopy"; RICS) ermöglicht (Digman et al.: „Measuring Fast Dynamics in Solutions and CeIIs with a Laser Scanning Microscope" in „Biophysical Journal", Vol. 89, August 2005, 1317-1327). Hier wird die Probe in zwei oder drei Dimensionen rasterförmig optisch abgetastet (engl, „scanning"). Typischerweise werden Zeitreihen (engl, „time series") aufgenommen. Für die abtastende Korrelationsspektroskopie wird zweckmäßigerweise ein Laser-Scanning- Mikroskop (LSM) eingesetzt. Während der optischen Abtastbewegung einer RICS- Messung werden mit typischerweise konstanter Abtastwertaufnahmefrequenz („Sampling-Frequenz") digitale Abtastwerte (engl, „sampling values", „samples") längs einer ersten Abtastrichtung („Scan-Zeile") elektronisch aufgenommen und zu Pixelwerten weiterverarbeitet. Jeder Pixelwert wird dabei aus einem oder mehreren Abtastwerten ermittelt. Die Abtastung längs der ersten Abtastrichtung wird nach Versetzung des Abtaststrahls längs einer zweiten Abtastrichtung („Scan-Spalte") wiederholt durchgeführt, so dass eine Folge von Pixelzeilen aufgenommen wird.

Um Aussagen über die Transportvorgänge in der Probe machen zu können, werden korrelationsspektroskopische Messverfahren typischerweise ausgewertet, indem Korrelationen der Fluoreszenzmessdaten, beispielsweise Auto- oder Kreuzkorrelationen, ermittelt und mathematische Transportmodelle an diese Korrelationen angepasst werden, beispielsweise mittels Ausgleichsrechnungen. So können aus den angepassten Modellen Probeneigenschaften, beispielsweise Diffusionskonstanten, bestimmt werden. Die Transportmodelle liegen in Form mathematischer Funktionen vor, deren Parameter angepasst werden. Solche Korrelationsanalysen werden bei RICS-Messungen in der Regel für mehrere, typischerweise überlappende Regionen des Abtastfelds (engl, „scan field") separat durchgeführt. Die Bestimmung der Modellparameter in den einzelnen Regionen, also die Bestimmung der räumlichen Verteilung der Modellparameter in der Probe, wird als Kartierung bezeichnet. Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen können für die einzelnen Regionen bildlich dargestellt werden, beispielsweise mittels Falschfarben.

Problematisch ist, dass in einer oder mehreren Probenregionen Bereiche enthalten sein können, die nur wenig oder gar keine Information enthalten und dadurch die Ergebnisse der Auswertung verfälschen. Beispielsweise kann es sich um dunkle, nahezu fluoreszenzfreie Bereiche handeln, in denen allenfalls Rauschen detektiert wird. In Bereichen mit niedriger Fluoreszenzstärke ist es hingegen möglich, dass eine Korrelation der Messdaten der betreffenden Probenregion mangels ausreichender Statistik nicht ausgewertet werden kann. Werden in solchen Probenregionen trotz des geringen Informationsgehalts Probeneigenschaften bestimmt, beispielsweise eine Diffusionskonstante, so ergibt die Anpassung der Parameter einer Modellfunktion im Rahmen einer Ausgleichsrechnung trotz guter Qualität der Anpassung unsinnige Werte für die gesuchten Probeneigenschaften. Im Fall einer Diffusionskonstante ergeben sich beispielsweise Werte, die um mehrere Größenordnungen zu hoch sind.

Im Stand der Technik ist es bekannt, fehlerhafte Fluoreszenzkorrelationsanalysen zu filtern, indem die Ergebnisse der Ausgleichsrechnungen, also die angepassten Modellfunktionsparameter, mit sinnvollen Wertebereichen verglichen werden. Liegen die Ergebnisse außerhalb dieser Wertebereiche, werden sie verworfen, also nicht zur Bestimmung der gesuchten Probeneigenschaften verwendet. Neben der Begrenzung auf Wertebereiche ist es auch bekannt, die Ausgleichsrechnungsergebnisse zu verwerfen, wenn die Mittelwertabweichungen der Modellfunktionsparameter einen vorgegebenen Schwellwert überschreiten oder wenn das Verhältnis der Standardabweichungen der Modellfunktionsparameter zu deren Bestwerten einen vorgegebenen Schwellwert überschreitet. Alle genannten Vorgehensweisen haben den Nachteil, dass die sinnvollen Wertebereiche beziehungsweise die Schwellwerte als sogenanntes a-priori-Wissen in zeitaufwendigen Versuchsreihen ermittelt werden müssen. Durch die starre Begrenzung auf einen bestimmten Wertebereich beziehungsweise auf Schwellwerte wird die Genauigkeit der Auswertung verringert, denn statistisch korrekte Korrelationen, die jedoch Modellparameterwerte außerhalb der Grenzen ergeben, werden zu unrecht verworfen. Zudem müssen vor der Prüfung auf sinnvolle Ergebnisse erst eine oder, bei der Kartierung mehrerer Probenregionen, sogar mehrere rechen- und zeitaufwendige Ausgleichsrechnungen durchgeführt werden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Steuereinheit der eingangs genannten Arten anzugeben, mit deren Hilfe Probeneigenschaften aus Fluoreszenzkorrelationen einfacher, schneller und genauer ermittelt werden können.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, sowie durch eine Steuereinheit, welche die in Anspruch 16 angegebenen Merkmale aufweist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Erfindungsgemäß wird für eine oder mehrere Regionen der Probe ein Eignungsgrad für eine Korrelationsauswertung ermittelt. Als Eignungsgrad wird im Sinne der Erfindung jede Größe angesehen, die quantitativ den Informationsgehalt der betreffenden Region oder den bei einer Korrelationsauswertung zu erwartenden Fehler beschreibt und dadurch in einem Vergleich als Kriterium zur Filterung und/oder Auswahl der betreffenden Region vor einer Korrelationsauswertung verwendet werden kann. Insbesondere kann es sich um einen skalaren Wert, einen mehrkomponentigen Vektor oder einen Tensor höherer Ordnung handeln. Mit anderen Worten wird erfindungsgemäß für die betreffende Region ein charakteristischer Wert ermittelt, der die Eignung für eine Korrelationsauswertung quantitativ angibt. Als Korrelationsauswertung oder Korrelationsanalyse wird im Sinne der Erfindung die quantitative Prüfung von aus diskreten Punkten bestehenden Daten auf Ähnlichkeit unter Berücksichtigung von Translationen zwischen den Datenpunkten angesehen.

Die Erfindung ermöglicht eine feinere Filterung, ohne dass eine rechen- und zeitaufwendige Ausgleichsrechnung notwendig ist. Durch die feinere Filterung kann eine höhere Genauigkeit bei der Ermittlung der Probeneigenschaften erreicht werden. Anhand des ermittelten Eignungsgrads kann sodann entschieden werden, ob überhaupt eine Ausgleichsrechnung durchgeführt wird. Insbesondere können auf diese Weise einzelne von mehreren Regionen für eine Ausgleichsrechnung ausgewählt und andere verworfen werden. Alternativ können Ausgleichsrechnungen für alle Regionen bedingungslos durchgeführt und als Qualitätsmerkmal der betreffende Eignungsgrad für die Korrelationsanalyse neben den angepassten Modellfunktionsparametem gespeichert werden. Dadurch ist später ohne nachträgliche Ausgleichsrechnung eine Filterung nach dem Eignungsgrad möglich. In jedem Fall ist die Filterung vorteilhafterweise nicht an die werthafte Ausprägung eines oder mehrerer bestimmter Modellparameter gebunden. Es wird also insbesondere möglich, für die Auswertung relevante Probenregionen von nicht relevanten Probenregionen schon vor der rechenaufwendigen Ausgleichsrechnung zu unterscheiden, indem vorteilhafterweise der Eignungsgrad ermittelt wird, bevor eine Ausgleichsrechnung zum Anpassen einer Modellfunktion an die Korrelation durchgeführt wird. Dies ist mit den bekannten Verfahren nicht möglich, insbesondere nicht in Probenregionen, die ausschließlich Rauschen enthalten.

Vorteilhafterweise wird der Eignungsgrad bestimmt, indem eine mindestens eindimensionale Korrelation mit mehreren Korrelationsdatenpunkten anhand von Messdaten aus der betreffenden Region ermittelt wird und Korrelationsdatenpunkte, die statistisch signifikant von einer Vergleichsmenge innerhalb der Korrelation abweichen, gezählt werden. Die Erfindung kann dabei sowohl auf räumliche als auch auf zeitliche Korrelationen angewandt werden. Die so ermittelte Anzahl wird zweckmäßigerweise ausgegeben oder gespeichert, sie kann aber auch unmittelbar weiterverarbeitet werden, beispielsweise in einer Entscheidung über die Durchführung einer Ausgleichsrechnung.

Erfindungsgemäß wird als Eignungsgrad der Region die Anzahl der signifikant abweichenden Korrelationsdatenpunkte in der betreffenden Korrelation verwendet. Sie stellt eine hochgenaue Aussage über den Informationsgehalt der betreffenden Probenregion im Hinblick auf eine Korrelationsanalyse, beispielsweise mittels Ausgleichsrechnung, dar.

Vorzugsweise wird ausschließlich eine unterbrochene oder ununterbrochene Reihe von benachbarten Korrelationsdatenpunkten gezählt, die am Maximum der Korrelation beginnt. Die für eine Korrelationsanalyse informativsten Datenpunkte liegen im Bereich um das Maximum der Korrelation. Durch Beschränkung der Zählung auf einen am Maximum beginnenden, linearen Bereich wird das Verfahren bei nahezu unveränderter Genauigkeit vereinfacht und beschleunigt. Bei einer Autokorrelation liegt das Maximum am Koordinatenursprung, bei einer Kreuzkorrelation kann es hingegen abseits des Koordinatenursprungs liegen, so dass vor der Zählung zunächst das Korrelationsmaximum ermittelt werden muss.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Vergleichsmenge eine echte Untermenge der Korrelation (also ihrer Datenpunkte), insbesondere eine echte oder eine unechte Untermenge eines Quadranten der Korrelation, verwendet. Die echte Untermenge kann dabei eine rechteckige, insbesondere eine quadratische Form haben. Auch dadurch kann das Verfahren bei nahezu unveränderter Genauigkeit vereinfacht und beschleunigt werden. Der Eckpunkt des Quadranten kann dabei anstelle des Koordinatenursprungs auch ein Maximum der Korrelation sein. Die Beschränkung auf maximal einen Quadranten nutzt die mathematische Gegebenheit aus, dass insbesondere im vierten Quadranten (bezogen auf das Korrelationsmaximum) die für die Erkennung einer Verschiebung wesentlichen Informationen enthalten sind. Vorteilhafterweise wird zum Ermitteln der signifikant abweichenden Korrelationsdatenpunkte ein Wert einer statistischen Größe innerhalb der Vergleichsmenge ermittelt und es werden diejenigen Korrelationsdatenpunkte als signifikant abweichend ermittelt, deren Wert relativ zu dem Wert der statistischen Größe der Vergleichsmenge über einem vorgebbaren oder vorgegebenen Schwellwert liegt. So können die informativen Datenpunkte einfach und schnell ermittelt werden.

Zweckmäßigerweise wird als statistische Größe ein Mittelwert der Vergleichsmenge und als Schwellwert ein Vielfaches einer Standardabweichung des Mittelwerts verwendet. Diese Größen können mit geringem Rechenaufwand bestimmt werden und ermöglichen eine hochgenaue Aussage über den Informationsgehalt der Datenpunkte.

In einer anderen Ausgestaltung des Verfahrens werden zum Ermitteln des Eignungsgrads eine mindestens eindimensionale Korrelation mit mehreren Korrelationsdatenpunkten anhand von Messdaten aus der betreffenden Region und ein Verhältnis von positiven zu negativen Korrelationswerten ermittelt. Bei hinsichtlich einer Korrelationsanalyse aussagekräftigen Korrelationen ist das Verhältnis von positiven und negativen Korrelationswerten zugunsten der positiven Werte verschoben. Das Verhältnis der positiven und negativen Werte bestimmt somit eine Eignung für eine Korrelationsanalyse. Das ermittelte Verhältnis wird zweckmäßigerweise ausgegeben oder gespeichert, es kann aber auch unmittelbar weiterverarbeitet werden, beispielsweise in einer Entscheidung über die Durchführung einer Ausgleichsrechnung. Das ermittelte Verhältnis kann neben oder zusätzlich zu der oben beschriebenen Bestimmung der statistisch signifikant herausragenden Datenpunkte zur Ermittlung eines Eignungsgrads der Region verwendet werden.

Vorzugsweise wird das Verhältnis der positiven und negativen Werte entweder als Quotient aus dem positiven Maximalwert der Korrelation und dem negativen Minimalwert der Korrelation oder aus der Anzahl der positiven Korrelationswerte und der Anzahl der negativen Korrelationswerte ermittelt. Diese Quotienten können mit geringem Rechenaufwand ermittelt werden. In einer ersten Ausführungsform wird für mehrere Regionen ein jeweiliger Eignungsgrad ermittelt, anhand der Eignungsgrade mindestens eine der Regionen für eine Ausgleichsrechnung ausgewählt und die betreffende Ausgleichsrechnung durchgeführt. Dadurch werden unnötige, das Ergebnis nur negativ beeinflussende Ausgleichsrechnungen vermieden.

In einer alternativen zweiten Ausführungsform wird für mehrere Regionen jeweils eine Ausgleichsrechnung durchgeführt und zu den Ergebnissen der Ausgleichsrechnungen der jeweilige Eignungsgrad gespeichert. Das erlaubt es, die Ergebnisse der Ausgleichsrechnungen nachträglich zu filtern und die Genauigkeit der Modellparameter zu bestimmen.

Zweckmäßigerweise werden zunächst die Korrelationsspektroskopiemessdaten mittels eines Laser-Scanning-Mikroskops aufgenommen.

Die Erfindung umfasst auch ein Computerprogramm, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist, und eine Steuereinheit für ein Laser- Scanning-Mikroskop, die programmtechnisch zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist, sowie ein entsprechend ausgerüstetes Laser-Scanning-Mikroskop.

Insbesondere umfasst die Erfindung eine Steuereinheit für ein Laser-Scanning- Mikroskop, wobei die Steuereinheit zum Auswerten von mindestens eindimensional ortsaufgelösten Fluoreszenzmessdaten einer Probe für eine oder mehrere Regionen der Probe einen Eignungsgrad für eine Korrelationsauswertung ermittelt.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 ein Schema eines Laser-Scanning-Mikroskops,

Fig. 2 eine konfokale Fluoreszenzaufnahme des Randbereiches einer Zelle, Fig. 3 ein Flussdiagramm eines erfindungsgemäßen Auswerteverfahrens,

Fig. 4 eine Korrelation eines langsamen Diffusionsprozesses,

Fig. 5 eine Korrelation eines schnellen Diffusionsprozesses,

Fig. 6 eine angepasste zweidimensionale Modellfunktion mit Restfehlern und

Fig. 7 resultierende Diffusionskartierungen ohne Filterung, mit Filterung nach dem Stand der Technik und mit der erfindungsgemäßen Filterung.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines LSM, das mittels einer Steuereinheit 34 gesteuert wird. Das LSM ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23, einem Abtastmodul S (engl, „scanning module"), einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31 zusammengesetzt. Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden, bevor es über Lichtleitfasern und Koppeloptiken 20 in die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über den Hauptstrahlteiler 33 und die X-Y-Abtasteinheit 30, die zwei Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22, wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet. Von der Probe reflektiertes Licht oder emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 über die Abtasteinheit 30 durch den Hauptstrahlteiler 30 in das Detektionsmodul D. Zur Fluoreszenzdetektion kann der Hauptstrahlteiler 30 beispielsweise als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul D weist mehrere Detektionskanäle mit jeweils einer Lochblende 31 , einem Filter 28 und einem Photovervielfacher 32 auf, die durch Farbteiler 29 separiert sind. Anstelle von Lochblenden 31 können, beispielsweise bei linienförmiger Beleuchtung, auch Schlitzblenden (nicht abgebildet) verwendet werden. Die konfokalen Loch- oder Schlitzblenden 31 dienen der Diskriminierung von Probenlicht, das nicht aus dem Fokusvolumen stammt. Die Photovervielfacher 32 detektieren daher ausschließlich Licht aus dem Fokusvolumen. Das konfokal beleuchtete und aufgenommene Fokusvolumen der Probe 22 kann mittels der Abtasteinheit 30 über die Probe 22 bewegt werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der Beleuchtung mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme von den Photovervielfachern 32 erfolgt ebenfalls über die Peripherieschnittstelle 4.

Fig. 2 zeigt eine Fluoreszenzaufnahme im Randbereich einer biologischen Zelle als Probe 22 mit einer beispielhaften Bildgröße von 512x512 Bildpunkten (Pixel), bei der die Photovervielfacher 32 im Photonenzählmodus betrieben wurden. Zum Zweck einer besseren Darstellung wurde das Bild schwarz-weiß gerastert. Der Zellrand verläuft im Bild etwa diagonal von links oben nach rechts unten. Es ist deutlich zu erkennen, dass der linke untere Bereich des Bildes keine Informationen enthält und dass die Fluoreszenzaktivität im rechten oberen Bereich des Bildes nicht einheitlich verteilt ist. Für eine beispielhafte Diffusionskartierung wird das Bild in mehrere Regionen B_mn derselben Größe, beispielsweise 128x128 Pixel, unterteilt, in denen jeweils eine Diffusionskonstante durch eine Korrelationsanalyse zu bestimmen ist. Diese Regionen können einander überlappen. Bei einer Überlappung um die Hälfte jeweils in horizontaler und vertikaler Richtung ergibt sich die Zahl von 49 zu auszuwertenden Probenregionen (m=0...6; n=0...6).

In Fig. 3 ist eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Flussdiagramms abgebildet. Für jede Probenregion B_mn wird eine separate zweidimensionale Korrelation G_mn, beispielsweise die Autokorrelation der betreffenden Region, aus den Intensitätswerten der Bildpunkte berechnet. Jede Korrelation besteht aus einer zweidimensionalen Menge von i=0...(r x s), beispielsweise 0...128x128, Datenpunkten (Xi.Vj) mit einem Wert G_mn(Xi,yi), der längs einer dritten Koordinate oder durch Farbkodierung bildlich dargestellt werden kann. Alternativ können je nach Anwendungsfall ein-, drei- oder mehrdimensionale Korrelationen mit einer entsprechenden Menge von Datenpunkten (nicht abgebildet) verwendet werden.

Fig. 4 und Fig. 5 zeigen zwei beispielhafte Korrelationen G(Xi,yi) in Pseudo-3D- Darstellungen. Die Teilfiguren zeigen jeweils zwei unterschiedliche Blickwinkel. Der Koordinatenursprung der Korrelation G liegt jeweils im Maximum der Korrelation. Die in Fig. 4 abgebildete Korrelation repräsentiert einen langsamen Diffusionsprozess, was anhand des flachen Abfalls sowohl in x- als auch in y-Richtung erkennbar ist. Die in Fig. 5 abgebildete Korrelation repräsentiert hingegen einen schnellen Diffusionsprozess, da sie in y-Richtung sehr steil abfällt.

Gemäß dem in Fig. 3 abgebildeten Verfahren wird anschließend für jede Region B_mn der Kartierung eine informative Datenpunktanalyse zur Ermittlung eines Eignungsgrads der betreffenden Region B_mn durchgeführt. Die informative Datenpunktanalyse umfasst zunächst die Auswahl einer statistisch repräsentativen Vergleichsmenge V aus den Korrelationsdatenpunkten G_mn(Xi,yi). Beispielsweise wird aus dem vierten Quadranten der Korrelation ein Bereich von 80x80 Datenpunkten (Xj.yi) als Vergleichsmenge V ausgewählt. Zur Illustration ist in Fig. 4 eine quadratische Vergleichsmenge V durch einen unterbrochen umrandeten Bereich angedeutet. Es handelt sich um eine echte Untermenge des vierten Quadranten der Korrelation G. Alternativ könnte der volle Quadrant oder ein noch größerer Bereich als Vergleichsmenge V verwendet werden. Zweckmäßigerweise wird aber die Größe der Vergleichsmenge beschränkt, beispielsweise auf 80x80 Datenpunkte. Bei grundsätzlicher Verwendung eines vollen Quadranten ergibt sich so bei einer Korrelationsgröße von 128x128 Datenpunkten eine Vergleichsmenge V der Größe 64x64. Bei einer Korrelationsgröße von 256x256 hingegen ergibt sich aufgrund der Beschränkung nur eine Vergleichsmenge V der Größe 80x80. In Fig. 5 ist eine alternative Form einer Vergleichsmenge V auf dieselbe Weise wie in Fig. 4 angedeutet. Es handelt sich um eine fortlaufende, einzelne Reihe benachbarter Korrelationsdatenpunkte, die im Koordinatenursprung am Maximum der Korrelation G beginnt. Alternativ könnten nur einzelne Punkte aus einer solchen Reihe als Vergleichsmenge V verwendet werden.

Alternativ zu einem einzelnen rechteckigen Bereich kann die Vergleichsmenge aus mehreren disjunkten, regelmäßig oder unregelmäßig geformten Abschnitten von Korrelationsdaten zusammengesetzt sein, die zufällig oder nach einem vorgegebenen Muster ausgewählt werden (nicht abgebildet). Beispielsweise könnte im zweidimensionalen Fall ein regelmäßiges Schachbrettmuster oder eine Zufallsverteilung von Einzelpunkten (Xj.yj) verwendet werden, im dreidimensionalen Fall beispielsweise eine regelmäßiges, unterbrochenes Würfelmuster. Die Auswahl der Vergleichsmenge kann vollautomatisch nach einem vorgegebenen Schema erfolgen. Alternativ kann die Art, Form, Lage und Größe der Vergleichsmenge vom Benutzer festgelegt werden.

Nach der automatischen Auswahl der Vergleichsmenge werden in einem ersten Schritt zur Bestimmung des Eignungsgrads zwei statistische Parameter der Vergleichsmenge ermittelt, nämlich der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung der Vergleichsmenge. In einem zusätzlichen Schritt kann optional der Wertebereich der Korrelationsdatenpunkte auf ein Verhältnis der positiven Datenpunkte G_mn(Xi,yi)>0 zu den negativen Datenpunkten G_mn(Xi_>yi)^<0 in einem vorgegebenen Fenster der Korrelation G_mn untersucht werden, was unterstützend als Indiz für die Ermittlung des Eignungsgrades verwendet werden kann. Das auf den Wertebereich untersuchte Fenster kann beispielsweise längs der x-Achse der Korrelation G_mn liegen. Das Verhältnis kann beispielsweise mathematisch als Differenz oder Quotient der Anzahl der positiven und der Anzahl der negativen Datenpunkte ermittelt werden. Stellvertretend für die Anzahl können die Minimal- und Maximalwerte der Korrelation verglichen werden. Bei einer Übereinstimmung der Anzahlen beziehungsweise einer betragsmäßigen Übereinstimmung der Minimal- und Maximalwerte wird beispielsweise der Eignungsgrad willkürlich auf Null festgesetzt. In der Folge kann anhand des resultierenden Verhältnisses ein Eignungsgrad, der ausschließlich anhand der statistischen Parameter ermittelt wird, skaliert werden. Alternativ kann ausschließlich das ermittelte Verhältnis als Eignungsgrad weiterverwendet werden, beispielsweise durch entsprechende Skalierung auf eine vergleichbare Pixelanzahl.

Allgemein kann als Eignungsgrad der untersuchten Region B_mn die Anzahl derjenigen Datenpunkte (xi.Vj) verwendet werden, deren Wert G_mn(Xi,yi) von der Vergleichsmenge signifikant abweicht. Diese Datenpunkte (XJ.VJ) können anhand der statistischen Parameter der Vergleichsmenge ermittelt werden, beispielsweise durch Vergleichen des Korrelationswerts G_mn(Xi,yj) mit dem Mittelwert der Vergleichsmenge. Es wird beispielsweise geprüft, ob der Korrelationswerts G_mn(Xi,yi) mehr als das zweifache der Standardabweichung über dem Mittelwert liegt. Wenn diese Bedingung zutrifft, wird der betreffende Datenpunkt (Xj.yi) als informativ für eine Korrelationsanalyse angesehen, weil er sich signifikant von der Vergleichsmenge abhebt. Die Anzahl der auf diese Weise sukzessive ermittelten informativen Datenpunkte (XJ.VJ) in der Korrelation G_mn wird am Ende der informativen Datenpunktanalyse als Eignungsgrad verwertet. Der Eignungsgrad wird mit einem vom Benutzer vorgebbaren Schwellwert verglichen. Beispielsweise wird nur dann, wenn der Eignungsgrad größer als der Schwellwert ist, ohne weiteres eine Ausgleichsrechnung durchgeführt und deren Ergebnisse abgespeichert. Ist der Eignungsgrad niedriger, so wird in dem gezeigten Beispiel der Benutzer explizit gefragt, ob dennoch eine Ausgleichsrechnung erfolgen soll. In anderen Ausprägungen (nicht abgebildet) erfolgt in diesem Fall keine Benutzerabfrage, sondern die Region B_mn wird automatisch als nicht informativ markiert und das Verfahren mit der nächsten Region fortgesetzt.

Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass auch die Ermittlung der informativen Datenpunkte vorteilhafterweise auf ein vorgegebenes Fenster in der Korrelation G_mn beschränkt werden kann, beispielsweise auf Datenpunkte längs der x-Achse der Korrelation G_mn, beispielsweise maximal 30 unmittelbar benachbarte Datenpunkte, wobei neben dem Ursprung am Datenpunkt G_mn(1 ,0) mit der Untersuchung und Zählung begonnen wird. Durch ein solches Fenster kann die Ermittlung des Ereignisgrads bei ausreichend hoher Genauigkeit schnell durchgeführt werden, da eine Korrelationskurve über einen Bereich von zehn bis dreißig Datenpunkte abfallen sollte, um eine gute Auswertung mittels einer Ausgleichsrechnung zu erzielen. Zweckmäßigerweise wird der Datenpunkt am Ursprung G_mn(0,0) generell ausgelassen, da er nicht aussagekräftig ist. Fällt die Korrelation sofort nach dem Ursprungswert G_mn(0,0) ab, weist das darauf hin, dass in der betreffenden Probenregion B_mn nur Rauschen aufgezeichnet wurde. Vorzugsweise wird eine ununterbrochene Reihe von benachbarten Korrelationsdatenpunkten längs der x- Achse untersucht, es können jedoch auch Muster oder eine bestimmte (beispielsweise nicht-lineare) Funktion zur Auswahl von zu untersuchenden Datenpunkten verwendet werden. Die Vergleichsmenge sollte in jedem Fall statistisch relevant sein und einen nicht unbedeutenden Teil der jeweiligen Korrelation G_mn ausmachen. Die informative Datenpunktanalyse und gegebenenfalls die Korrelationsanalyse werden beispielsweise unabhängig von den resultierenden Eignungsgraden iterativ für alle Probenregionen B_mn durchgeführt und zusammen mit dem jeweiligen Eignungsgrad für eine spätere Filterung abgespeichert. Die Korrelationsanalyse kann in einer alternativen Ausführungsform (nicht abgebildet) unabhängig von den resultierenden Eignungsgraden für alle Probenregionen B_mn durchgeführt und zusammen mit dem jeweiligen Eignungsgrad für eine spätere Filterung abgespeichert werden.

Neben oder alternativ zu Mittelwert und Standardabweichung können andere statistische Parameter aus der Vergleichsmenge ermittelt und in Bedingungen für die Werte der einzelnen Korrelationsdatenpunkte verwendet werden, um statistisch signifikant von der Vergleichsmenge abweichende Datenpunkte (Xj.yi) zu bestimmen.

Fig. 6 zeigt in Pseudo-3D-Darstellung eine angepasste zweidimensionale Modellfunktion G_mn(Xi,yi) (Teilfigur 6A) mit Restfehlern Rmnte.yi) (Teilfigur 6B). Die gezeigte Modellfunktion ist rein exemplarisch.

In Fig. 7 sind Beispiele für Diffusionskartierungen dargestellt, die mit unterschiedlichen Auswerteverfahren aus dem Fluoreszenzbild der Fig. 2 ermittelt wurden. In der linken Spalte sind die Kartierungen farbkodiert, in der rechten Spalte wurde jeweils eine korrespondierende Schwarz-Weiß-Rasterung dargestellt. Teilfigur 7A zeigt eine ungefilterte Kartierung. Deutlich ist zu erkennen, dass durch die erzwungene Ausgleichsrechnung einigen Regionen außerhalb der Zelle extrem hohe Diffusionskoeffizienten zugewiesen werden, während in weiten Teilen der Zelle aufgrund der notwendigen Skalierung der Falschfarben keine sinnvollen Diffusionskoeffizienten erkennbar sind. Teilfigur 7B zeigt eine nachträglich auf die Modellparameterwerte hin gefilterte Kartierung. Hier entfernt die bekannte Filterung nach Modellparametern beispielsweise die schwarz abgebildeten Regionen im Inneren der Zelle, obwohl diese einen normalen Korrelationsabfall aufweisen. Dies kann zwar durch spezifisches Einstellen der Filtergrenzwerte verbessert werden. Es ist jedoch zeitaufwendig, diese zu bestimmen. Schließlich zeigt Teilfigur 7C das Ergebnis einer Filterung nach erfindungsgemäß ermittelten Eignungsgraden, beispielsweise der Anzahl der informativen Korrelationsdatenpunkte in der jeweiligen Region B_mn. Die Eignungsgrade ermöglichen eine hochgenaue Filterung, so dass Innerhalb der Zelle keine Regionen B_mn ausgelassen werden, wobei dennoch der Übergang zu den informationslosen Regionen B_mn korrekt ermittelt wird.

Zweckmäßigerweise kann die Größe und der Überlapp oder die Anzahl der zu kartierenden Regionen B_mn vom Benutzer ebenso wie das spezifische Probenmodell und einzelne Modellparameter vorgegeben werden. In einer Vorverarbeitung können die Fluoreszenzbilddaten auf immobile Strukturen gefiltert werden. Auch eine Bleichbehandlung ist möglich. Nach der Kartierung kann beispielsweise die visuelle Darstellung der angepassten Modellparameterwerte oder abgeleiteter Größen anhand der Eignungsgrade und/oder weiterer Kriterien gefiltert werden. So kann beispielsweise schwellwertbasiert nach einzelnen oder mehreren angepassten Modellparameterwerten oder nach dem Verhältnis der Standardabweichung der Modellparameter zu den Modellparameterwerten gefiltert werden.

Bezuαszeichenliste

20 Kollimationsoptik

21 Mikroskopobjektiv

22 Probe

23 Laser

24 Lichtklappe

25 Abschwächer

26 Faserkoppler

27 Tubuslinse

28 Filter

29 Dichroitischer Strahlteiler

30 Scannerspiegel

31 Lochblende

32 Photovervielfacher

33 Hauptstrahlteiler

34 Steuereinheit

D Detektionsmodul

M Mikroskop

L Beleuchtungsmodul

S Abtastmodul

Bmn Probenregion

Xi.yi Datenpunkt

G Korrelation

R Restfehler

V Vergleichsmenge

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Auswerten von mindestens eindimensional ortsaufgelösten Fluoreszenzmessdaten einer Probe (22), wobei für eine oder mehrere Regionen (B_mn) der Probe (22) ein Eignungsgrad für eine Korrelationsauswertung ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei zum Ermitteln des Eignungsgrads folgende Schritte durchgeführt werden:

- Ermitteln einer mindestens eindimensionalen Korrelation (G_mn) mit mehreren Korrelationsdatenpunkten (G_mn(Xi,yi)) anhand von Messdaten aus der betreffenden Region (B_mn),

- Zählen von Korrelationsdatenpunkten (G_mn(Xi,yi)), die statistisch signifikant von einer Vergleichsmenge innerhalb der Korrelation (G_mn) abweichen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei als Eignungsgrad der Region die Anzahl der signifikant abweichenden Korrelationsdatenpunkte (G_mn(Xj,yi)) in der betreffenden Korrelation (G_mn) ermittelt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei ausschließlich eine Reihe von benachbarten Korrelationsdatenpunkten (G_mn(Xi,Vi)) gezählt wird, die am Koordinatenursprung (G_mn(0,0)) der Korrelation (G_mn) beginnt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei als Vergleichsmenge eine echte Untermenge der Korrelation (Gm_n), insbesondere eine echte oder eine unechte Untermenge eines Quadranten der Korrelation (G_mn), verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei zum Ermitteln der signifikant abweichenden Korrelationsdatenpunkte (G_mn(Xi,yj)) ein Wert einer statistischen Größe innerhalb der Vergleichsmenge ermittelt wird und diejenigen Korrelationsdatenpunkte (G_mn(Xi,yi)) als signifikant abweichend ermittelt werden, deren Wert relativ zu dem Wert der statistischen Größe der Vergleichsmenge über einem vorgebbaren oder vorgegebenen Schwellwert liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei als statistische Größe ein Mittelwert der Vergleichsmenge und als Schwellwert ein Vielfaches einer Standardabweichung des Mittelwerts verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei zum Ermitteln des Eignungsgrads folgende Schritte durchgeführt werden:

- Ermitteln eines Verhältnisses von positiven zu negativen Korrelationswerten (G_mn(Xi,yj)).

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Verhältnis als Quotient aus dem positiven Maximalwert der Korrelation (G_mn) und dem negativen Minimalwert der Korrelation (G_mn) oder aus der Anzahl der positiven Korrelationswerte und der Anzahl der negativen Korrelationswerte ermittelt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei als Eignungsgrad der Region (B_mn) das ermittelte Verhältnis von positiven zu negativen Korrelationswerten in der betreffenden Korrelation ermittelt wird.

11.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Eignungsgrad ermittelt wird, bevor eine Ausgleichsrechnung zum Anpassen einer Modellfunktion an die Korrelation durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei für mehrere Regionen (B_mn) ein jeweiliger Eignungsgrad ermittelt und anhand der Eignungsgrade mindestens eine der Regionen (B_mn) für eine Ausgleichsrechnung ausgewählt und die betreffende Ausgleichsrechnung durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei für mehrere Regionen (B_mn) jeweils eine Ausgleichsrechnung durchgeführt und zu den Ergebnissen der Ausgleichsrechnungen der jeweilige Eignungsgrad gespeichert wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zunächst die Korrelationsspektroskopiemessdaten mittels eines Laser-Scanning-Mikroskops aufgenommen werden.

15. Computerprogramm, eingerichtet zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Verfahrensansprüche.

16.Steuereinheit für ein Laser-Scanning-Mikroskop, programmtechnisch eingerichtet zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Verfahrensansprüche.

17. Steuereinheit (34) für ein Laser-Scanning-Mikroskop, wobei die Steuereinheit (34) zum Auswerten von mindestens eindimensional ortsaufgelösten Fluoreszenzmessdaten einer Probe (22) für eine oder mehrere Regionen (B_mn) der Probe (22) einen Eignungsgrad für eine Korrelationsauswertung ermittelt.

18. Steuereinheit (34) nach Anspruch I^ die folgende Schritte durchführt:

- Ermitteln einer mindestens eindimensionalen Korrelation mit mehreren Korrelationsdatenpunkten anhand von Messdaten aus der betreffenden Region,

- Zählen von Korrelationsdatenpunkten, die statistisch signifikant von einer Vergleichsmenge innerhalb der Korrelation abweichen

- Ausgeben und/oder Speichern der ermittelten Anzahl als Eignungsgrad.

19. Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Steuereinheit (34) nach Anspruch 17 oder 18.