DE102018210606A1

DE102018210606A1 - Mikroskopisches Abbildungsverfahren unter Verwendung eines Korrekturfaktors

Info

Publication number: DE102018210606A1
Application number: DE102018210606.1A
Authority: DE
Inventors: Viktor Drescher; Nils Langholz
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2020-01-02
Also published as: CN110658617A; JP7254643B2; US20200005442A1; US11238575B2; CN110658617B; JP2020003793A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikroskopisches Abbildungsverfahren mit den Schritten: Beleuchten einer Probe (1) mit einer Beleuchtungsstrahlung und Erfassen von durch die Beleuchtungsstrahlung bewirkter Detektionsstrahlung entlang einer Detektionsachse zu einem ersten Zeitpunkt als ein Weitfeldsignal (WF) und zu einem zweiten Zeitpunkt als ein Komposit-Signal (CI), das aus einer Überlagerung eines konfokalen Bildes und eines Weitfeldbildes gebildet ist; Extrahieren des konfokalen Bildes mittels Subtrahieren des Weitfeld-Signals (WF) von dem Komposit-Signal (CI), wobei ein Korrekturfaktor verwendet wird.Gekennzeichnet ist das Verfahren dadurch, dass für jede ausgeführte Abbildung und/oder für jede abgebildete Probe (1) ein aktueller Korrekturfaktor ermittelt wird und die Extraktion des konfokalen Bildes unter Verwendung des jeweils aktuellen Korrekturfaktors erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein mikroskopisches Abbildungsverfahren gemäß dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs.
Im technischen Gebiet der Mikroskopie, beispielsweise der hochauflösenden dreidimensionalen Darstellung von biologischen/technischen Proben oder Probenbereichen, besteht das Problem, die Probe mit möglichst geringen Intensitäten einer Beleuchtungsstrahlung zu beaufschlagen und zugleich hohe Intensitäten einer Detektionsstrahlung für eine hochauflösende Detektion und Bildgebung zur Verfügung zu haben. Zugleich soll die Bereitstellung der Bilddaten und die abschließende Bildgebung in möglichst kurzer Zeit, idealerweise in Echtzeit, erfolgen.
Aus der DE 10 2014 004 249 A1 ist der Ansatz der korrelativen Spinning-Disk-Mikroskopie bekannt. In einem dort offenbarten Verfahren zur Bestimmung einer Topographie einer Probe mittels korrelativer Spinning-Disc-Mikroskopie, werden folgende Schritte ausgeführt: Es erfolgt ein vertikales Bewegen eines Objekttisches und/oder eines Fokustriebes während einer alternierenden Erfassung erster und zweiter Bilder einer auf dem Objekttisch platzierten Probe. Dabei wird zu jedem Bild eine vertikale Fokusposition als Metadatum gespeichert. Zwei erste oder zwei zweite Bilder werden in einem weiteren Schritt interpoliert und ein Zwischenbild oder intermediäres Bild erhalten. Das intermediäre Bild wird zum Erzeugen eines konfokalen Bildes für eine bestimmte vertikale Position mit dem zweiten oder ersten Bild an der Position verrechnet.
Die Verwendung geeigneter Masken im Beleuchtungs- und/oder Detektionsstrahlengang zur Erzeugung von Kompositbildern und nicht-konfokalen Bildern ist aus der WO 97/31282 A1 bekannt. Ein konfokales Bild wird durch eine entsprechende Verrechnung aus diesen beiden Bildtypen extrahiert. Auf diese Weise ist eine sehr schnelle Bildgebung möglich. Zugleich wird ein hoher Anteil des Detektionslichts genutzt, so dass es ausreicht, die Probe mit Beleuchtungsstrahlung geringer Intensität zu beleuchten.
Auch die Publikationen von Neil et al. (Neil, M. A. A et al. (1997), A light efficient optically sectioning microscope; Journal of Microscopy 189: 114 - 117) und Wilson et al. (Wilson, T. et al. (1996), Confocal microscopy by aperture correlation; OPTICS LETTERS 21: 1879 - 1881) schlagen Möglichkeiten vor, mittels denen konfokale Signale aus Kompositbildern und Weitfeldbildern extrahiert werden können.
Bei der Berechnung des konfokalen Bildes kann die folgende Formel verwendet werden: $Konfokales Signal = Komposit-Signal - n * Weitfeld-Signal .$
Der Faktor n ist dabei ein Korrekturfaktor, der einmalig und probenunabhängig für ein Abbildungssystem ermittelt und unverändert angewandt wird. Mit dem Korrekturfaktor n werden systembedingte Abweichungen, beispielsweise unterschiedliche Transmissionswerte der optischen Strecken von Komposit-Signal und Weitfeld-Signal, ausgeglichen. Mit diesem Vorgehen können beispielsweise Stapel von Bildern (z-Stapel) entlang einer Detektionsachse, fortan auch als z-Achse bezeichnet, erfasst und zu einer dreidimensionalen Bildgebung, beispielsweise einer Topographie der Probe, kombiniert werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Möglichkeit der dreidimensionalen Bildgebung, insbesondere unter Nutzung geringer Beleuchtungsintensitäten, vorzuschlagen.
Die Aufgabe wird durch ein mikroskopisches Abbildungsverfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen finden sich in den abhängigen Ansprüchen.
Das mikroskopische Abbildungsverfahren weist den Schritt des Beleuchtens einer Probe mit einer Beleuchtungsstrahlung und Erfassen von durch die Beleuchtungsstrahlung bewirkter Detektionsstrahlung entlang einer Detektionsachse auf. Zu einem ersten Zeitpunkt wird die Detektionsstrahlung als ein Weitfeld-Signal und zu einem zweiten Zeitpunkt als ein Komposit-Signal, das aus einer Überlagerung eines konfokalen Bildes, beziehungsweise dessen Signale, und eines Weitfeld-Signals gebildet ist, erfasst. Ein konfokales Bild wird mittels Subtrahieren des Weitfeldbildes von dem Kompositbild erhalten, wobei ein Korrekturfaktor verwendet wird. Dabei werden die Weitfeldbild-Signale von den Komposit-Signalen unter Berücksichtigung des Korrekturfaktors subtrahiert.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass für jede ausgeführte Abbildung und/oder für jede abgebildete Probe ein aktueller Korrekturfaktor ermittelt wird. Die Extraktion des jeweiligen konfokalen Bildes erfolgt unter Verwendung des jeweils aktuellen Korrekturfaktors.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass eine einmalige Festlegung eines Korrekturfaktors für das Abbildungssystem für die ursprünglich vorgesehenen Anwendungen zwar völlig ausreichend ist, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens jedoch nicht nur Abbildungsfehler reduziert, sondern auch neue Klassen von Werkstoffen untersucht werden können.
Kern der Erfindung ist es daher, sich von dem probenunabhängigen Korrekturfaktor zu lösen und diesen dynamisch für jede Messung beziehungsweise jede Probe zu bestimmen.
Die Oberfläche der Probe wird durch den verwendeten Auswertealgorithmus anhand eines erfassten Intensitätsmaximums der Detektionsstrahlung erkannt. Unter bestimmten Umständen, beispielsweise bei Vorliegen hoher Kontraste in der Probe und/oder Autofluoreszenz der abzubildenden Probe, kann sich das Verhältnis der Intensitäten zwischen Weitfeldbild und Kompositbild, beziehungsweise zwischen deren Signalen, verändern. Infolge einer Änderung des Intensitätsverhältnisses von Weitfeldbild und Kompositbild kann ein Intensitätsmaximum fehlerhaft über oder unter der eigentlichen Oberfläche der Probe erkannt werden beziehungsweise wird die Position der Oberfläche falsch berechnet. Dabei ist die fälschlicherweise erfasste Intensität so hoch, dass diese nicht als Artefakte erkannt werden und daher nicht beispielsweise mittels eines Noisecut-Filters eliminiert werden. Im Ergebnis kommt es zur Berechnung von Vertiefungen oder Erhebungen der Probe, die tatsächlich nicht vorhanden sind.
Für die Analyse der oben beschriebenen Fehler wurden berechnete Bildern in Richtung der z-Achse übereinander angeordnet (z-Stapel) und diese z-Stapel seitlich betrachtet (sogenannter Orthoview). Die Verteilung der Intensitäten entlang der z-Achse wurde ausgewertet. Dabei wurde erkannt, dass Streulicht über einen relativ breiten z-Bereich (siehe 1) recht gleichmäßig oder konstant verteilt ist.
Ausgehend von dieser Erkenntnis werden Möglichkeiten zur Ermittlung des aktuellen Korrekturfaktors vorgeschlagen, die weiter unten ausführlicher erläutert werden.
In einer Ausgestaltung des Verfahrens werden zur Ermittlung des aktuellen Korrekturfaktors in einer Korrekturebene, die entlang der Detektionsachse in einem Abstand von einer Oberfläche der Probe gewählt wird, jeweils mindestens ein Korrektur-Weitfeldbild und ein Korrektur-Kompositbild erfasst. Die Bilddaten (Signale) der auch als Korrekturbilder bezeichneten Korrektur-Weitfeldbilder und Korrektur-Kompositbilder werden ermittelt und anhand der ermittelten Bilddaten wird ein aktueller Korrekturfaktor ermittelt, beispielsweise berechnet oder abgeleitet.
In die erwartete Position (erwartete z-Position) der Oberfläche wird zur Erfassung von Bilddaten ein Fokus des Detektionsobjektivs beziehungsweise des Detektionssystems gerichtet und somit eine Fokusebene definiert. Der Abstand ist die Distanz zwischen der Fokusebene und der Korrekturebene.
Es ist vorteilhaft, wenn der Abstand der Korrekturebene so groß gewählt ist, dass keine Strukturen der Oberfläche die Korrekturebene durchstoßen. So kann der Abstand aus einem Bereich zwischen vier und sechs Halbwertsbreiten der Punktspreizfunktion des zur Erfassung der Detektionsstrahlung verwendeten Detektionsobjektivs beziehungsweise des Detektionssystems gewählt werden. Der Abstand kann beispielsweise vier, viereinhalb, fünf oder sechs Halbwertsbreiten betragen.
Bei jeder Messung wird in hinreichendem Abstand von der Oberfläche ein Korrektur-Weitfeldbild und ein Korrektur-Kompositbild erzeugt und erfasst. Aus diesen beiden Korrekturbildern wird dann der probenspezifische und aktuelle Korrekturfaktor bestimmt, der in die oben angegebene Formel eingesetzt wird.
Variationen im Abstand der Korrekturebene zur Oberfläche der Probe sind in einem gewissen Bereich möglich, da der Streulichtanteil relativ konstant entlang der z-Achse verteilt ist. Es sind zudem Variationen in der Erzeugung des Kompositbildes möglich, indem beispielsweise eine Schlitzmaske verwendet wird. Es ist auch möglich, eine Spinning Disk mit schlecht angepasster Pinhole-Größe, ein Mikrodisplay mit schlecht angepasster Pinhole-Größe oder ein Laserscanningmikroskop (LSM) mit schlecht angepasster Pinhole-Größe zu verwenden.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten zur Ermittlung des aktuellen Korrekturfaktors. Dieser kann aus den mittleren Helligkeiten der Korrekturbilder ermittelt werden. Dabei werden die Grauwerte jedes der Korrekturbilder gemittelt und der berechnete Mittelwert verwendet.
Anstelle der einfachen arithmetischen Mittelung der Grauwerte, können die Bilder auch pixelweise ausgewertet werden. Jedem Bildelement oder Pixel kann ein eigener aktueller Korrekturfaktor zugewiesen werden.
Da die pixelweise Erzeugung eines aktuellen Korrekturfaktors und dessen Verwendung bei der Bilderzeugung zu Unstetigkeiten und damit zu Artefakten führen kann, werden erforderlichenfalls nachträglich geeignete rechnerische Filter, beispielsweise Medianfilter oder Gaussfilter, auf die Bilddaten angewandt, um diese zu glätten. Der aktuelle Korrekturfaktor wird also für jedes Bildelemente-Paar der Korrekturbilder ermittelt. Dabei ist jedes Bildelemente-Paar durch ein bestimmtes Bildelement des Korrektur-Weitfeldbilds und dem dazu korrespondierenden Bildelement des Korrektur-Kompositbildes gebildet.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens besteht darin, dass sowohl oberhalb als auch unterhalb der Fokusebene mit der erwarteten Position der Oberfläche der Probe - also in einer Korrekturebene vor und hinter einer aktuellen Fokusebene - die beiden Korrekturbilder aufgenommen werden und beide Korrekturbildpaare in die Berechnung einfließen. Diese Ausgestaltung ist insbesondere bei hinreichend transparenten Proben einsetzbar.
Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Aufnahme-Workflow vorteilhaft, der die Aufnahme der mindestens zwei Korrekturbilder für die Bestimmung des aktuellen Korrekturfaktors beinhaltet.
In einer weiteren Ausgestaltung wird das Korrektur-Weitfeldbild aus dem z-Stapel berechnet und zur Ermittlung des Korrekturfaktors verwendet. Beispielsweise wird ein Mittelwert unter Nutzung dreidimensionaler Daten des z-Stapels gebildet.
Die Vorteile der Erfindung liegen unter anderem darin, dass das einmalige Einmessen des probenunabhängigen Korrekturfaktors während der Inbetriebnahme wegfallen kann. Darüber hinaus entfallen bei der Auswertung aufgrund der erheblich besseren Signalqualität Filterschritte, die in Verfahren gemäß dem Stand der Technik zum Entfernen von zufälligen oder systematischen positiven und/oder negativen Signalüberhöhungen (Ausreißer) dienen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass auch bei der klassischen Aperturkorrelation automatisiert ein angepasster Korrekturfaktor bestimmt werden kann, was die Nutzerfreundlichkeit und die Qualität der Bilddaten erheblich verbessert.
Das Verfahren lässt sich besonders vorteilhaft mit solchen Bilderfassungsvorrichtungen verwenden, bei denen Weitfeldbilder und Kompositbilder getrennt und sukzessive erfasst werden und insbesondere als Stapelaufnahme gespeichert und verarbeitet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich besonders vorteilhaft zur Abbildung von Topographien der Oberfläche von Proben verwenden. Dabei ist das Verfahren insbesondere im Bereich der Materialprüfung und Qualitätskontrolle einsetzbar. Beispielsweise können spanend bearbeitete metallische Oberflächen mit einer erheblich verbesserten Qualität abgebildet werden. Reflexionen und/oder scharfe Übergänge auf der Oberfläche führen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht oder nur in einem geringen Maße zu Signalüberhöhungen.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eröffnet die Möglichkeit, auch stark reflektierende Proben wie lackierte Proben, lichtempfindliche Proben wie zum Beispiel biologische Proben sowie autofluoreszierende Proben wie zum Beispiel viele Papiersorten zu untersuchen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Schnitts durch einen z-Stapel (Orthoview);
2 eine schematische Darstellung einer ersten Möglichkeit zur Bestimmung eines aktuellen Korrekturfaktors;
3 eine schematische Darstellung einer Oberfläche einer Probe mit ausgewählten Signalverläufen gemäß dem Stand der Technik;
4 eine schematische Darstellung der Oberfläche der Probe mit ausgewählten Signalverläufen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren;
5 ein Diagramm von Signalverläufen entlang eines z-Stapels einer spanend bearbeiteten Metalloberfläche gemäß dem Stand der Technik;
6 ein Diagramm von Signalverläufen entlang des z-Stapels der spanend bearbeiteten Metalloberfläche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren;
7 ein Diagramm von Signalverläufen entlang eines z-Stapels einer mit Metalliclack versehenen Oberfläche einer Probe gemäß dem Stand der Technik;
8 ein Diagramm von Signalverläufen entlang des z-Stapels der mit Metalliclack versehenen Oberfläche der Probe gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren;
9 ein Diagramm von Signalverläufen entlang eines z-Stapels einer Oberfläche einer Probe aus Papier gemäß dem Stand der Technik; und
10 ein Diagramm von Signalverläufen entlang des z-Stapels der Oberfläche der Probe aus Papier gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Die 1 zeigt ein Beispiel eines sogenannten Orthoview eines z-Stapels von Bildern einer Probe 1. Die Bilder wurden jeweils anhand der Formel $Konfokales Signal = Komposit-Signal - n * Weitfeld-Signal$
berechnet. Die Position der Oberfläche Ao der Probe 1 ist durch einen Pfeil und eine unterbrochene Linie gezeigt. Außerdem sind die Intensitätsmaxima über der x-Achse aufgetragen. Die x-Achse verläuft orthogonal zur z-Achse und etwas parallel zur Oberfläche Ao.
Die Oberfläche Ao ist über große Abschnitte der x-Achse durch starke Reflexionen und damit verbundene Intensitätsmaxima etwa in Höhe derselben z-Koordinate gekennzeichnet. In einem Abschnitt im linken Teil der Kurve Imax finden sich die Intensitätsmaxima bei höheren z-Koordinaten. Das kann bedeuten, dass sich in diesem Bereich der Probe 1, der mit den betreffenden x-Koordinaten korrespondiert, eine Vertiefung oder eine Erhebung befindet, je nachdem wie das Koordinatensystem in der 1 vorab gelegt wurde.
Eine Möglichkeit zur Ermittlung des aktuellen Korrekturfaktors n ist schematisch in 2 dargestellt. Über der z-Achse sind die Werte der Amplitude des Weitfeld-Signals WF und des Komposit-Signals CI (composite image) beispielhaft aufgetragen. In einer Fokusebene ist ein Maximum (peak) der Amplitudenwerte des Komposit-Signals CI zu erkennen. Dieses Intensitätsmaximum Imax kennzeichnet beispielsweise die Oberfläche Ao der Probe 1 (siehe z. B. 1). In einer Korrekturebene mit der z-Koordinate zn werden die Amplitudenwerte xWF des Weitfeld-Signals WF und die Amplitudenwerte xCI des Komposit-Signals CI ermittelt. Aus dem Verhältnis von Amplitudenwerte xWF und Amplitudenwerte xCI kann der aktuelle Korrekturfaktor n ermittelt werden.
Die 3 zeigt schematisch die Messergebnisse an einer Probe 1, die an ihrer Oberfläche Ao von einer rinnenförmigen Vertiefung 2 durchzogen ist. Die mit einem Verfahren gemäß dem Stand der Technik berechneten Bilddaten zeigen hohe Intensitätsspitzen Imax entlang der Kanten der Vertiefung 2. Im Ergebnis wird in einem daraus resultierenden Bild ein erhabener Rand der Vertiefung 2 dargestellt, obwohl ein solcher tatsächlich gar nicht vorhanden ist.
Dagegen sind die Intensitätsspitzen Imax entlang der Kanten der Vertiefung 2 wesentlich niedriger, wenn die Bilddaten mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelt wurden (4). Die Vertiefung 2 wird ohne oder nur mit einem sehr kleinen erhabenen Rand dargestellt, was der tatsächlichen Topographie der Probe 1 entspricht.
In den weiteren 5 bis 10 sind jeweils die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Bilddaten als Höhenwerte entlang der z-Achse über der x-Achse aufgetragen. Statt über der x-Achse könnten die Höhenwerte auch über der zur x-Achse und zur z-Achse orthogonal verlaufenden y-Achse (nicht gezeigt) aufgetragen werden.
In der 5 sind Bilddaten der Topographie einer Probe 1 aus einem metallischen Werkstoff gezeigt. Die Probe 1 wurde durch Fräsen bearbeitet. Die einzelnen Bahnen des Fräswerkzeugs sind durch die periodische Abfolge von Amplitudenwerten um den Nullpunkt herum zu erkennen.
Die Bilddaten derselben Probe 1 zeigen in den Bereichen der periodischen Richtungswechsel Intensitätsspitzen Imax, die nicht das tatsächliche Profil der Oberfläche Ao wiedergeben (6). Bereits der Umstand, dass die Intensitätsspitzen Imax extrem schmal sind deutet auf ein Vorliegen von Abbildungsfehlern statt tatsächlicher Oberflächenformen hin.
Gleiches ist in den 7 und 8 zu sehen. Eine mit einem Metalliclack versehene Oberfläche Ao der Probe 1 wird bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Topographie einer Schwankungsbreite von etwa 1,5 bis 2 µm um die Nulllage herum erkannt und dargestellt (7). Dagegen weist die mittels eines Verfahrens gemäß dem Stand der Technik erstellte Topographie der Probe 1 Schwankungsbreiten von etwa 5 bis mehr als 10 µm auf (8).
Ganz ähnlich verhält sich eine Probe 1 aus Papier. Die 9 zeigt die vergleichsweise raue Oberfläche Ao der Probe 1 mit einer Schwankungsbreite von etwa 10 µm um die Nulllage.
Dagegen führen die fehlerhaft auftretenden Intensitätsspitzen bei Nutzung eines Verfahrens nach dem Stand der Technik zu Schwankungsbreiten von 30 bis 40 µm um die Nulllage.
Dieses Ausführungsbeispiel zeigt, dass Proben 1 aus Papier beziehungsweise mit einer (auto-)fluoreszierenden Oberfläche Ao mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hinsichtlich ihrer Topographie untersucht werden können. Verfahren gemäß dem Stand der Technik führen dagegen zu keinem zufriedenstellenden Ergebnis beziehungsweise erfordern zusätzliche Schritte, um die Intensitätsspitzen zu reduzieren.
Bezugszeichenliste

1: Probe
2: Vertiefung
Ao: Oberfläche (der Probe 1)
CI: Komposit-Signal
Imax: Intensitätsmaximum, Intensitätsspitze
WF: Weitfeld-Signal
xCI: Amplitudenwert (des Komposit-Signals CI)
xWF: Amplitudenwert (des Weitfeld-Signals WF)
zn: Position (der Korrekturebene)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102014004249 A1 [0003]
WO 9731282 A1 [0004]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Neil et al. (Neil, M. A. A et al. (1997), A light efficient optically sectioning microscope; Journal of Microscopy 189: 114 - 117) [0005]
Wilson et al. (Wilson, T. et al. (1996), Confocal microscopy by aperture correlation; OPTICS LETTERS 21: 1879 - 1881) [0005]

Claims

Mikroskopisches Abbildungsverfahren mit den Schritten: Beleuchten einer Probe (1) mit einer Beleuchtungsstrahlung und Erfassen von durch die Beleuchtungsstrahlung bewirkter Detektionsstrahlung entlang einer Detektionsachse, zu einem ersten Zeitpunkt als ein Weitfeld-Signal (WF) und zu einem zweiten Zeitpunkt als ein Komposit-Signal (CI), das aus einer Überlagerung eines konfokalen Signals und eines Weitfeld-Signals (WF) gebildet ist, Extrahieren des konfokalen Signals mittels Subtrahieren des Weitfeld-Signals (WF) von dem Komposit-Signal (CI), wobei ein Korrekturfaktor verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass für jede ausgeführte Abbildung und/oder für jede abgebildete Probe (1) ein aktueller Korrekturfaktor ermittelt wird und die Extraktion des konfokalen Signals unter Verwendung des jeweils aktuellen Korrekturfaktors erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Ermittlung des aktuellen Korrekturfaktors in einer Korrekturebene, die entlang der Detektionsachse in einem Abstand von einer Oberfläche (Ao) der Probe (1) gewählt wird, jeweils mindestens ein Korrektur-Weitfeldbild und ein Korrektur-Kompositbild erfasst werden, deren Bilddaten ermittelt werden und anhand der ermittelten Bilddaten ein aktueller Korrekturfaktor ermittelt wird; wobei der Abstand der Korrekturebene so groß gewählt ist, dass keine Strukturen der Oberfläche (Ao) die Korrekturebene durchstoßen.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand aus einem Bereich von vier bis sechs Halbwertsbreiten der Punktspreizfunktion des zur Erfassung der Detektionsstrahlung verwendeten Objektivs gewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils mindestens ein Korrektur-Weitfeldbild und ein Korrektur-Kompositbild in einer Korrekturebene vor und hinter einer aktuellen Fokusebene erfasst werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der aktuelle Korrekturfaktor aus den mittleren Helligkeiten der Korrekturbilder Korrektur-Weitfeldbild und ein Korrektur-Kompositbild ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein aktueller Korrekturfaktor für jedes Bildelemente-Paar der Korrekturbilder ermittelt wird.