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Die Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit einer Vorrichtung zur Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie.
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In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen.
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Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatenaufnahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u. s. w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Eine Auflösungssteigerung in Richtung der optischen Achse lässt sich, wie in der Europäischen Patentschrift
EP 0 491 289 A1 mit dem Titel: „Doppelkonfokales Rastermikroskop beschrieben ist, durch eine Doppelobjektivanordnung (4π-Anordnung) erreichen. Das vom Beleuchtungssystem kommende Licht wird in zwei Teilstrahlen aufgespalten, die die Probe einander entgegenlaufend durch zwei spiegelsymmetrisch angeordnete Objektive gleichzeitig beleuchten. Die beiden Objektive sind auf verschiedenen Seiten der ihnen gemeinsamen Objektebene angeordnet. Im Objektpunkt bildet sich durch diese interferometrische Beleuchtung ein Interferenzmuster aus, dass bei konstruktiver Interferenz ein Hauptmaximum und mehrere Nebenmaxima aufweist. Mit einem doppelkonfokalen Rastermikroskop kann im Vergleich zum konventionellen Rastermikroskop durch die interferometrische Beleuchtung eine erhöhte axiale Auflösung erzielt werden.
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Konfokale Rastermikroskope werden auch in der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) eingesetzt. Dabei ist das effektive Messvolumen im wesentlichen durch das konfokale Volumen gegeben. Mit Hilfe von FCS lässt sich molekulare Dynamik vorzugsweise in Lösungen untersuchen, wobei das zufällige Durchlaufen der mit einem oder mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markierten Moleküle durch das Messvolumen detektiert wird, um beispielsweise Rückschlüsse auf Reaktionsraten oder Diffusionszeiten zu ziehen.
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FCS-Messungen mit einem konfokalen Rastermikroskop, bei denen Diffusionsgeschwindigkeiten bestimmt werden, sind nicht richtungssensitiv. zusätzlich ergibt sich u. a. dadurch ein Problem, dass die Point-Spread-Function (Punktbildfunktion, PSF) – die Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichtes im Fokusvolumen – zylindersymmetrisch ist und in z-Richtung ein ähnliches Profil wie in lateraler Richtung besitzt. Das Korrelationssignal liefert daher keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich der Diffusions- und Flussgeschwindigkeiten in den verschiedenen Richtungen. Der Einfluss von Reaktionen der beobachteten Probe auf die Korrelationskurve erschwert die Auswertung zusätzlich.
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Aus der
DE 101 55 002 A1 ist ein Verfahren und ein Scanmikroskop zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe bekannt, wobei das Beleuchtungslicht eine Modulation in zumindest einer Raumrichtung aufweist. Vorteilhafterweise handelt es sich dabei um eine räumlich periodische Struktur. Allerdings wird hier nur ein räumliche Modulation beschrieben, so dass mit dem beschriebenen Verfahren keine zeitlich dynamischen Prozesse untersucht werden können.
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In der
DE 102 57 237 A1 wird eine Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter Lichtstrahlung in einem Mikroskop beschreiben. Da bei Fluoreszenzfarbstoffen das emittierte Fluoreszenzlicht eine gegenüber der Anregungswellenlänge verschobene Wellenlänge hat, ist es wichtig für eine hohe Auflösung das Anregungslicht von dem emittierten Licht zu trennen. Hierdurch kann jedoch nicht das Problem gelöst werden, zeitlich sich verändernde Prozesse wie die Bewegung von Molekülen oder die Reaktionsdynamik von chemisch-biologischen Prozessen zu untersuchen.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Rastermikroskop vorzuschlagen, das die richtungs- und zeitabhängige Messung von Diffusionsgeschwindigkeiten bzw. Flussgeschwindigkeiten von Bestandteilen einer Probe, beispielsweise von Molekülen, erlaubt. Idealerweise liefert es eine Methode, den Einfluss von Bewegung und Reaktionsdynamik auf die Korrelationskurve leicht trennen zu können.
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Die Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder die Detektionsempfindlichkeit innerhalb des Messvolumens zeitlich moduliert ist und das Messvolumen auf einen Rasterpunkt eingeschränkt werden kann.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass die Modulation der Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder der Detektionsempfindlichkeit zeitlich veränderbar ist. Hierbei können bei unterschiedlichen Modulationen aufgenommene Fluoreszenz-Korrelations-Spektren desselben Messvolumens durch gegenseitigen Vergleich ausgewertet werden. Durch gleichzeitige Modulation der Intensität und Detektionsempfindlichkeit (Lock-In Methode) können „effektive” räumliche Modulationen des Messvolumens erzeugt werden.
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Des weiteren ist das Messvolumen durch zumindest einen Rasterpunkt definiert, wobei der Fachmann unter Messvolumen eine geeignete normierbare räumliche Verteilung der kombinierten Wahrscheinlichkeit, ein vorhandenes Fluoreszenzmolekül zum Fluoreszieren zu bringen und diese Fluoreszenz zu detektieren versteht. Insoweit bezeichnet der Begriff Rasterpunkt keinen Punkt ohne Ausdehnung im mathematischen Sinn.
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Das Messvolumen kann auch mehrere Rasterpunkte umfassen, wobei das von den Rasterpunkten ausgehende Detektionslicht gleichzeitig – parallel – mit vorzugsweise mehreren Detektoren detektierbar ist.
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Vorzugsweise sind bei geeigneter räumlicher Modulation Bewegungen in unterschiedlichen Richtungen voneinander unterschieden werden können und durch geeignete Kombination solcher Messungen von Effekten durch andere Dynamiken getrennt werden können. Dabei können nicht nur Bewegungen entlang der Raumachsen x, y und z, sondern in alle beliebigen Richtungen analysiert werden und Diffusion von z. B. gerichtetem Transport unterschieden werden.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder die Detektionsempfindlichkeit räumlich periodisch moduliert.
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Vorzugsweise ist die Modulation der Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder der Detektionsempfindlichkeit ein- und ausschaltbar oder in ihrer räumlichen Form veränderbar. Dies hat den Vorteil, dass bei unterschiedlicher Modulation aufgenommene Fluoreszenz-Korrelations-Spektren desselben Messvolumens durch gegenseitigen Vergleich auswertbar sind. Vorzugsweise werden die bei eingeschalteter und bei ausgeschalteter Modulation aufgenommene Fluoreszenz-Korrelations-Spektren desselben Messvolumens, evtl. nach Korrekturen (z. B. Hintergrund), durcheinander dividiert.
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Vorzugsweise ist die Modulation der Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder der Detektionsempfindlichkeit durch Interferenz erzeugbar. In einer bevorzugten Ausgestaltung weisen die zur Interferenz beitragenden Lichtwellen zueinander eine einstellbare Phasenbeziehung auf, so dass durch Variation der Phasenbeziehung die räumliche Modulation veränderbar ist.
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In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die Modulation der Intensität des Beleuchtungslichtes durch Interferenz zweier Beleuchtungslichtstrahlen mit entgegengesetzter Ausbreitungsrichtung erzeugbar. Analog ist die Modulation der Detektionsempfindlichkeit durch Interferenz zweier Detektionslichtstrahlen mit entgegengesetzter Ausbreitungsrichtung erzeugbar. Vorzugsweise weist das Rastermikroskop hierzu eine 4Pi-Anordnung mit zwei einander gegenüberliegenden Objektiven, zwischen denen sich die Probe befindet, auf. Das Beleuchtungslicht wird vorzugsweise mit einem Strahlteiler in zwei Teilbeleuchtungsstrahlenbündel aufgespalten die je einen Interferometerarm durchlaufen und durch je eines der Objektive zur Probe gelangen. Entsprechend gelangt das von der Probe ausgehende Detektionslicht durch die Objektive hindurch in zunächst zwei Detektionslichtstrahlenbündeln zu einem Strahlvereiniger und werden dann gemeinsam einem Detektor zugeführt. Vorzugsweise wirkt der Strahlteiler für die Detektionslichtstrahlenbündel als Strahlvereiniger.
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Diese Ausgestaltungsform ist insbesondere dazu geeignet Fließgeschwindigkeiten in axialer Richtung zu messen, indem die Phasenbeziehung des die Interferometerarme durchlaufenden Lichtes zeitlich kontinuierlich verändert wird. Die Geschwindigkeit der zeitlichen Änderung wird z. B. so lange variiert, bis sie der Fließgeschwindigkeit angepasst ist.
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In einer bevorzugten Variante ist ein Amplitudenfilter vorgesehen, der die Modulation der Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder der Detektionsempfindlichkeit erzeugt. Vorzugsweise werden hierdurch innerhalb des Messvolumens mehrere Seitenmaxima (Sidelobes) erzeugt, wobei diese derart ausgebildet sind, dass die einander ähnlich sind.
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Ebenso kann in einer anderen Variante ein Phasenfilter oder eine Kombination aus Phasen- und Amplitudenfiltern vorgesehen sein, der die Modulation der Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder der Detektionsempfindlichkeit erzeugt.
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In einer weiteren Variante ist ein Linsenarray (z. B. ein Mikrolinsenarray) oder die Kombination mehrerer Strahlteiler vorgesehen, das die Modulation der Intensität des Beleuchtungslichtes und/oder der Detektionsempfindlichkeit erzeugt.
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Das Rastermikroskop ist vorzugsweise als konfokales Rastermikroskop ausgebildet.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind.
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1 zeigt eine Rastermikroskop, das insbesondere zur Messung gerichteter Korrelationsfunktionen geeignet ist. Der einfallende Laserstrahl wird durch einen Strahlteiler in zwei Strahlen geteilt (nicht dargestellt). Einer der Teilstrahlen wird direkt in den 4Pi Resonator geführt, wo ein weiterer Strahlteiler (BS) zwei Strahlen erzeugt, die durch die beiden Objektive (OL) in den selben Punkt in der Probe fokussiert werden und dort durch Interferenz ein axiales Muster erzeugen.
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Alternativ kann der andere Teilstrahl verwendet werden, der durch Mikrolinsenraster (LA) in mehrere benachbarte Strahlen aufgeteilt wird. Die Position der Strahlen kann innerhalb des Strahlprofils verändert werden. Dadurch wird ein zusätzliches, bewegliches laterales Muster in der Probe erzeugt.
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Durch Abschalten einer der beiden Seiten des 4Pi-Resonators kann ein rein laterales Muster erzeugt werden.
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Als eine von vielen Möglichkeiten, das Muster um die optische Achse zu drehen, ist hier ein Dove-Prisma (DP) gezeigt.
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2a) zeigt die Point-Spread-Function (PSF) eines 1-Photonen 4π konfokalen Mikroskops, berechnet für 488 nm Anregungslicht, eine numerische Apertur von 1,2, Wasserimmersion und eine Defektions-Lochblende von der Größe einer Airy-Scheibe. Die kleinen Abbildungen zeigen die Veränderung des Musters, wenn sich die relative Phase der interfererierenden Strahlen ändert.
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2b) zeigt die zeitlich gemittelte Intensitätsverteilung des sich bewegenden Musters. Sie entspricht der konfokalen PSF.
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3a) zeigt eine lateral modulierte PSF, resultierend aus der kohärenten Überlagerung mehrerer Anregungsfokusse, die im Abstand von 200 nm auf der x-Achse angeordnet sind. Die Phasen benachbarter Fokusse sind um π gegeneinander verschoben. Ihre Amplitude hängt vom Abstand zum Zentrum der gaussförmigen Einhüllenden ab und fällt nach 400 nm auf das 1/e2-fache ab. Die PSF ist in der Fokalebene (xy) und in xz-Richtung dargestellt. Die kleinen Abbildungen unten zeigen die Veränderung des Musters, wenn die Fokusse innerhalb der Einhüllenden bewegt werden.
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3b) zeigt jeweils das zeitliche Mittel eines bewegten Musters.
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4a) und b) zeigen die effektiven, mit der lock-in Detektionsmethode erzeugten PSFs aus der Kombination der Muster aus 2a) und 3b), dargestellt für zwei verschiedene Phasenverschiebungen φ zwischen Anregungs- und Detektionsmodulation.
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5a) zeigt die entstehende PSF aus der Kombination lateraler und axialer Muster. Die axialen und lateralen Muster werden in diesem Beispiel mit den Frequenzen ω2 = 9ω1/10 variiert, was in den kleinen Abbildungen illustriert ist. Eine volle Periode ist bei φ = 2π abgeschlossen. Die durch zeitliche Mittelung entstandene Einhüllende ist in (b) gezeigt.
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6 zeigt die effektive, durch Kombination der in 5 gezeigten Muster mit der lock-in Detektionsmethode bei der Differenzfrequenz ω1 – ω2 entstehende PSF. Die diagonale Struktur kann dazu benutzt werden, Bewegung entlang der Winkelhalbierenden des Koordinatensystems zu erkennen, um zum Beispiel den Diffusionstensor vollständig zu bestimmen.
