WO2020088997A2 - Mikroskop und verfahren zur mikroskopie - Google Patents

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    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the present invention relates to a microscope according to the preamble of claim 1.
  • the invention relates to a method for microscopy according to the preamble of claim 28.
  • a generic microscope has the following components: a light source for providing illuminating light, a controllable manipulation device for variably generating an illuminating pattern of the illuminating light to be selected, an illuminating beam path with a microscope objective for guiding the illuminating pattern onto a sample to be examined, a detector with one A large number of pixels for detecting fluorescent light emitted by the sample, a detection beam path for directing the fluorescent light emitted from the sample onto the detector, a main beam splitter for separating illuminating light and fluorescent light and a control and evaluation unit for controlling the manipulation device and for Evaluation of the data measured by the detector.
  • Illumination light is provided by a light source, with a controllable manipulation device for the variable generation of an illumination pattern to be selected for the illumination light, an illumination pattern is generated, the illumination pattern is also carried out via an illumination beam path directed onto a sample to be examined by a microscope objective, the fluorescent light emitted by the sample becomes via a detection beam path to a detector with a plurality of pixels, the illuminating light and fluorescent light being separated with a main beam splitter, and the fluorescent light is finally detected with the detector.
  • Living cell imaging is in the growing interest of biomedical research. This places high demands on the imaging systems used and in particular on the microscopes. On the one hand, high refresh rates are required to follow the dynamic processes in the sample. On the other hand, the observation should have as little influence as possible on the development and behavior of the sample. It is therefore important to keep the irradiated light dose and the radiated energy densities, that is, the laser power used for a given focus size, as small as possible, since light has a toxic effect on cells and thus shortens their lifespan. In principle, both conditions are very well met by wide-field microscopes. The problem, however, is that living cells are increasingly to be understood as an ensemble and their interaction with one another is therefore being investigated.
  • the samples are therefore no longer two-dimensional, but have a finite thickness. When observing with a wide-field microscope, this leads to a superimposition of the desired signal with extra-focal light, which is imaged onto the sensor out of focus. The information sought is therefore sometimes not detectable or can only be detected with poor contrast. As a result, a technology that allows optical sectioning (measuring individual sample levels while suppressing or discriminating the signals of all other levels) without destroying the sample is essential.
  • the confocal laser scanning microscope has established itself as the standard for detecting optical sections. It very effectively blocks extra-focal light at the confocal pinhole and discriminates before detection.
  • the LSM is very slow due to the sequential image structure of the raster.
  • relatively large light intensities i.e. amounts of energy, are entered into the sample in order to achieve an acceptable signal-to-noise ratio with the inherently short pixel times. Accordingly, the LSM is Imaging in living cells is not ideal.
  • DLP Digital Light Processing
  • PAM programmable array microscopes
  • the PAM has the disadvantage of detection efficiency, since the emission must be conducted via the DMD array, which generally consists of silicon mirrors coated with aluminum. Aluminum already causes almost 20% losses to the signal.
  • a mirror matrix is a regular two-dimensional grating, on the substructure of which the emission light is diffracted, as a result of which additional signal losses are caused by diffraction in higher orders.
  • the use of a DMD matrix in the intermediate image of the microscope means that the DMD Structure is imaged directly on the camera, so that pattern artifacts arise.
  • the geometrical dimensioning can be problematic.
  • Commercially available mirror matrices currently have a maximum of 1080 lines of micromirrors.
  • a device that is frequently used for living cell imaging is the spinning diso microscope (SDM).
  • SDM spinning diso microscope
  • two disks that are fixed to each other are rotated at high speed.
  • a matrix of microlenses is arranged on the disk facing the laser.
  • Each microlens is assigned a pinhole on the following disk.
  • the microlens disk is illuminated over a large area with the excitation laser, which is then focused through the pinholes.
  • a dichroic beam splitter is arranged between the two panes, which transmits the laser light and reflects fluorescent light.
  • the pinhole disk is imaged in the sample using the following optics. Due to the rotation of the disk, the sample is rasterized with a high degree of parallelism (approx. 1000x) using an array of excitation spots.
  • the fluorescence generated in the excitation spots is imaged on the pinhole disk and filtered there with a confocal filter.
  • the fluorescence is deflected towards the camera at the subsequent beam splitter.
  • the great advantage of the SDM is the highly parallelized and thus relatively sample-saving confocal detection.
  • the SDM is a pure observation device with confocal image quality.
  • the confocal resolution limit cannot be easily reached because the pinholes have to be finite in size.
  • the pinhole size only ever fits approximately for a particular lens.
  • the microscope of the type specified above is further developed according to the invention in that the manipulation device is arranged in the illumination beam path upstream of the main beam splitter in the vicinity of a plane optically conjugated to a sample plane, in that the pixels of the detector are selected individually and in the control and evaluation unit Readout patterns can be activated and that the control and readout Value unit is set up to activate pixels of the detector individually or in a selected readout pattern depending on a selected lighting pattern.
  • the method of the type specified above is further developed according to the invention in that the manipulation device is arranged upstream of the main beam splitter in the vicinity of a plane optically conjugated to a sample plane and in that the pixels of the detector are activated individually or in a selected readout pattern depending on a selected illumination pattern.
  • the manipulation device is particularly preferably arranged in a plane which is optically conjugated to a sample plane. It goes without saying that this information is not to be understood in a mathematical sense, but in the context of typical inaccuracies in the positioning.
  • a basic idea of the present invention can be considered not to pass the detection light again, deviating from previous solutions, via the manipulation device with which the illumination pattern is formed.
  • the invention provides a particularly versatile microscope and a particularly versatile method for microscopy.
  • An illumination pattern is understood to mean the actual pattern of the illumination on the illuminated surface of the sample, for example a dot pattern, a line pattern, a lattice-like illumination or an illumination that is specifically tailored for a biological sample.
  • a certain lighting pattern corresponds to a certain combination of activated pixels of the manipulation device.
  • the term “readout pattern” means in principle any combination of pixels of the detector to be activated.
  • Lasers are expediently used as light sources. However, other intensive light sources, such as LEDs, are used.
  • Computing devices in particular PCs, which are known per se, are used as the control and evaluation unit.
  • the device according to the invention is particularly suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the manipulation device for generating an illumination pattern to be selected has a multiplicity of pixels and in particular a spatial light modulator (SLM), such as, for example, a digital micromirror array (DMD).
  • SLM spatial light modulator
  • DMD digital micromirror array
  • Such components are available with resolutions of, for example, 4096 c 2160 pixels.
  • the main advantage of such pixelated manipulation devices can be seen in the fact that, owing to the fact that they can be controlled freely, the possibilities of the lighting pattern are in principle only limited by the spatial resolution and the speed of the component used.
  • the manipulation device for variable generation of an illumination pattern has a movable, in particular rotatable, diaphragm disk.
  • the sample is illuminated with variable illumination patterns by movement, in particular by rotation, of this diaphragm disk.
  • the diaphragm openings of the diaphragm disk must have the confocal dimension in at least one spatial dimension Aperture be limited.
  • the diaphragm disk can have a multiplicity of perforated diaphragms arranged in a spiral, in particular in the form of Archimedes spirals, and in particular be a Nipkov disk. Orifice plates with a large number of slots are also possible.
  • a microlens array can advantageously be present upstream of the rotatable diaphragm disk, which focuses illuminating light on the diaphragm openings of the diaphragm disk and which in operation with the same Ge - Speed as the aperture disc rotates.
  • the microlenses are expediently dimensioned such that they focus the illuminating light on the diaphragm openings.
  • the control and evaluation unit is expediently set up to synchronize a readout pattern of the detector with an illumination pattern generated by the moving, in particular rotating, diaphragm plate.
  • a further advantageous embodiment of the microscope according to the invention is that, in order to synchronize a control of the detector with a movement of the rotatable diaphragm disk, a photodiode for measuring an intermittent light transmission through the rotating diaphragm disk or for measuring intermittent light reflection from the rotatable lens is present. The transmission or reflection signal provides a reliable trigger signal for triggering the detector.
  • any type of pixelated detector can be used for the microscope according to the invention, which detects the light to be detected with sufficient sensitivity and can be read out with sufficient speed.
  • the detector has one SPAD array or one SPAD camera on. With these sensors, which can be manufactured in CMOS processes, a highly sensitive photon counting measurement is possible.
  • a microlens array can advantageously be provided upstream of the detector. This measure is particularly useful if the pixel grid of the manipulation device and the detector do not match.
  • the light reflected back from a sample contains, in a manner known per se, reflected and backscattered spectral components of the illuminating light, which can also be referred to as excitation light, and, in comparison, red-shifted fluorescent components.
  • the main color splitter is used to separate the spectral components of the illuminating light from the fluorescent components.
  • a further elimination of undesired spectral components in the detection beam path can be accomplished if at least one emission filter, in particular an exchange device with several emission filters, is present in the detection beam path downstream of the main color splitter.
  • the changing device can be a filter wheel, for example.
  • Preferred variants of the microscope according to the invention relate to the assignment of pixels of the manipulation device to pixels of the detector. Strictly speaking, the manipulation device as such is not optically imaged on the detector because the illuminating light is separated from the sample on the main color splitter on the way back.
  • the pixel numbers of the manipulation device, in particular the DMD, and the detector, in particular the SPAD array, are generally not identical.
  • a certain group of pixels of the manipulation device can be mapped to a defined group of pixels of the detector.
  • each pixel of the manipulation device is mapped to a defined group of pixels of the detector. Likewise, a certain group of pixels of the manipulation device can be mapped to a certain pixel of the detector.
  • the pixels can be assigned in specific numerical ratios.
  • a pixel of the detector can be assigned a group of 2x2 or 4x4 pixels of the DMD.
  • each pixel of the manipulation device is mapped onto exactly one pixel of the detector.
  • This situation is also referred to as pixel-precise mapping. This means that a sample area illuminated by a certain pixel of the manipulation device is imaged on exactly one pixel of the detector.
  • the signals of the individual pixels can also be assigned after the measurement has been taken, if the entire SPAD matrix is read out. If necessary, a microlens array in front of the SPAD camera optimizes the fill factor. If necessary, an optical zoom between the main color splitter and detector or between the manipulation device and main color splitter can also ensure the corresponding assignment or adapt the arrangement to the measurement task.
  • control and evaluation unit is set up to control the detector with a readout pattern corresponding to the selected illumination pattern.
  • the detector can advantageously be controlled with a readout pattern which corresponds to the illumination pattern generated by the manipulation device.
  • a readout pattern there is a certain combination of activated pixels understood the detector.
  • the control of the detector with a readout pattern corresponding to the selected illumination pattern means that the illumination pattern and the readout pattern are similar insofar as they can be converted into one another by scaling, ie linear transformation.
  • control and evaluation unit is expediently set up to control the detector synchronously with the readout pattern which corresponds to the illumination pattern.
  • synchronous means in particular that the respective pixels of the detector are activated within the fluorescence lifetime of the dyes.
  • control and evaluation unit it is also possible for the control and evaluation unit to be set up to control the detector with a readout pattern, in particular with a variable time delay, to an illumination pattern radiated onto the sample.
  • the detector is triggered with a readout pattern at an offset to an illumination pattern radiated onto the sample. This can be advantageous, for example, for examining phosphorescence processes or other processes, in particular in biological samples, which run much more slowly than the fluorescence lifetime of the dyes.
  • control and evaluation unit is set up to control the manipulation device for scanning illumination patterns, in particular dot patterns, line patterns or grid-like patterns, via the sample.
  • the dimensioning of the detection beam path determines whether confocal microscopy is possible with a suitable control of the detector.
  • the detection beam path can be dimensioned such that a detection point distribution function on the detector illuminates more than one pixel, in particular more than 5 pixels. With such an arrangement, confocal measurements and oversampling of the point distribution function are accordingly possible.
  • zoom optics are present between the main beam splitter and the microscope objective in order to vary the size of the illumination field on the sample.
  • a zoom scale with which the manipulation means is imaged on the sample can be varied with the zoom optics.
  • zoom optics can be present between the manipulation device and the main beam splitter and / or between the main beam splitter and the detector. An assignment of the pixels of the manipulation device to the pixels of the detector can thereby be varied as required.
  • a setting of the zoom optics can be selected in which the manipulation device, in particular a DMD matrix, is imaged on a full field of view.
  • AU Airy Unit
  • the imaging on the detector matrix is then not limited by diffraction and is more suitable for quickly taking overview images.
  • the invention also enables advantageous variants in which a setting of the zoom optics is selected in which the manipulation device, in particular a DMD matrix, is only imaged on part of a field of view. With these variants, confocal detection or oversampling of the point distribution function can be achieved.
  • a scanning unit in particular with galvanometric scanner mirrors, is provided for laterally displacing the illumination field.
  • a scanning unit is expediently positioned in a generally known manner in a plane optically conjugated to the rear pupil of the microscope objective.
  • the illumination field can advantageously be shifted laterally with a scanning unit, for example in the x and y directions.
  • scans can be carried out with point, line or grid illumination.
  • the scanning unit can be used to shift the illumination field in a raster of partial images by at least one raster position in it, and a scan can then be carried out again by appropriately controlling the manipulation device.
  • a polarizing beam splitter (PBS) and a quarter-wave plate can expediently be present for conditioning the illuminating light in the illuminating beam path upstream of the main beam splitter.
  • a TIR prism can also be used in the illumination beam path.
  • a TIR prism has the advantage that suppressed light can be geometrically separated from the useful light.
  • the spectral composition of the illuminating light it can be advantageous if at least one excitation filter, in particular an exchange device with different excitation filters, is present in the illuminating beam path upstream from the main color splitter.
  • the changing device can be a filter wheel or a linearly displaceable changing device in a generally known manner.
  • a diffractive optical element is present in the illuminating beam path, in particular immediately downstream of the light source. For example, an initially essentially Gaussian-like spatial intensity profile can be converted into a spatial intensity profile which essentially has a rectangular shape.
  • a further light-shaping unit in particular a spatial light modulator (SLM)
  • SLM spatial light modulator
  • a further light-shaping unit can be used to concentrate certain spectral components of the excitation light on certain regions of the manipulation device.
  • at least one color splitter can also be present upstream of the further light-shaping unit for guiding selected wavelengths to the further light-shaping unit.
  • At least one separate light source in particular another laser, can also advantageously be present for the optical manipulation of the sample.
  • a further laser preferably provides light of special wavelengths which are suitable for the optical manipulation of a sample.
  • the sample is therefore illuminated polychromatically.
  • the laser or lasers is or are preferably operated in a pulsed manner, in particular for time-resolving measurements, in particular with pulse durations in the range of picoseconds.
  • a means for wavefront modulation in particular a spatial light modulator (SLM) may be present.
  • SLM spatial light modulator
  • relay optics can be present in the illumination beam path in order to provide an additional pupil plane. This provides an adaptive correction of the illumination field in order to guarantee the best possible excitation point image function for thicker samples.
  • the detector has a photon-counting sensor, in particular a SPAD camera, whose or whose pixels are operated in Geiger mode, and the detector reads digital count values that correspond to photon detection events . Individual pixels are therefore counted with the pixels of the detector.
  • a photon-counting sensor in particular a SPAD camera, whose or whose pixels are operated in Geiger mode, and the detector reads digital count values that correspond to photon detection events .
  • Individual pixels are therefore counted with the pixels of the detector.
  • fluorescence measurements can be carried out with very low intensities of the excitation light and damage to a specimen, especially a living biological specimen, can be avoided as best as possible.
  • the FLIM signal of the dyes can be detected when using a laser pulsed in the picosecond range.
  • the movement of the pixels of a DMD or the switching between different lighting patterns is much slower, ie a quasi-static process.
  • exposure times are set specifically for individual pixels of the detector.
  • the exposure times for individual pixels of the detector can be set specifically, ie separately and individually for each pixel, depending on the measurement data obtained from the sample.
  • This also makes possible particularly gentle variants of the method according to the invention, in which at least one area of a sample is no longer exposed to illumination light as soon as a certain value for a signal-to-noise ratio has been reached in these areas in a recorded image.
  • the limit or threshold value for the signal-to-noise ratio can advantageously be set by a user as required, in principle also differently for different areas.
  • time-resolved measurements are carried out following optical excitation and / or manipulation of the sample.
  • FLIM Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy
  • fluorescence lifetimes of the emitting dyes can be determined by evaluating detection times of individual photons.
  • a further advantageous variant of the method according to the invention is that a movement which performs a component of a, in particular biological, sample is extrapolated.
  • methods of artificial intelligence, pattern recognition and machine learning can be used in the control and evaluation unit.
  • the structuring of a pixelated manipulation device can cause artifacts in the image measured by the camera. These artifacts can be reduced if the scanning unit is actuated slightly during an integration time of the detector.
  • the artifacts caused by the structure of the DMD are smeared on the detector.
  • the illumination field between individual images to be summed up can be moved with the scanning unit by a fraction of an Airy disc, are moved laterally in particular by 1% to 50%, preferably 3% to 30% and particularly preferably 5% to 15% of an Airy disc.
  • the artifacts caused by the structure of a DMD are reduced particularly effectively if the illumination field between individual images to be summed up is moved in two independent coordinate directions (x, y).
  • integration time can be used to denote in particular the time over which the signals of the pixels or pixel groups or all pixels of the sensor are integrated, that is to say digitally added up.
  • SPAD cameras With SPAD cameras, a photon stream can basically be continuous, i.e. not clocked, measured. On the other hand, clocked or synchronized operation, as with a conventional camera, is also possible with a SPAD camera.
  • a particular advantage of SPAD cameras is that different integration times can be used in different areas of the image. In principle, it is possible to add up the incoming pulses locally, ie to integrate them “digitally” for different lengths. That is one of the great advantages of SPAD technology.
  • the manipulation device and the SPAD camera can be integrated in different image areas for different lengths of time, which reduces the light input to a minimum and measures optimally depending on the sample.
  • the device according to the invention basically enables a particularly large number of method variants. For example, basically known methods of SIM illumination of the sample can be carried out. PALM, d-STORM, SOFI and FRAP processes are also possible. Further advantages and features of the microscope according to the invention and of the method according to the invention are explained below in connection with the figures. Show it:
  • Figure 1 a first embodiment of a microscope according to the invention
  • Figure 2 a second embodiment of a microscope according to the invention
  • Figure 3 a third embodiment of a microscope according to the invention.
  • Figure 4 schematic views of the detector surface to explain a variant of the method according to the invention.
  • Figure 5 schematic views of the detector surface to explain another
  • the first exemplary embodiment of a microscope 100 according to the invention shown in FIG. 1 initially has, as essential components, a light source L for providing illuminating light 12, a controllable manipulation device 16 for variably generating an illuminating pattern 18 of illuminating light 12 to be selected, an illuminating beam path 10 with a microscope objective 25 for guiding the illumination pattern 18 onto a sample S to be examined, a detector D with a plurality of pixels 36 for detecting fluorescent light 32 emitted by the sample S, a detection beam path 30 for guiding the sample S emitted - fluorescent light 32 radiated onto detector D, a main beam splitter 19 for separation illumination light 12 and fluorescent light 32 and a control and evaluation unit 40 for controlling the manipulation device 16 and for evaluating the data measured by the detector D.
  • a light source L for providing illuminating light 12
  • a controllable manipulation device 16 for variably generating an illuminating pattern 18 of illuminating light 12 to be selected
  • an illuminating beam path 10 with
  • the light source L is a laser, which can also be referred to as an excitation laser.
  • a manipulation device 16 is a digital micromirror array, hereinafter referred to as a DMD matrix or only as a DMD (Digital Micromirror Device).
  • the control and evaluation unit 40 can be a computing device of known nature. A PC is typically used.
  • the detector D is a SPAD camera
  • the DMD is arranged in the illuminating beam path 10 upstream from the main beam splitter 19, that is to say in that part of the illuminating beam path 10 which is exclusively the illuminating beam path and not the detection beam path, specifically in a plane 15 which is optically conjugated to a sample plane 26.
  • the illumination beam path 10 images the surface of the DMD matrix 16 on the sample.
  • the PC 40 is set up to activate the pixels 36 of the detector D individually and in selected readout patterns depending on a selected illumination pattern 18.
  • the DMD matrix 16 in the illumination beam path 10 is illuminated with the excitation laser L.
  • the wavelength of the laser L can be adjustable or can be selected from a large number of wavelengths.
  • the intensity of the laser L can be adjustable, for example, with an acousto-optical element (AOM, AOTF) not shown in FIG. 1.
  • Illumination light 12 reflected on the DMD matrix 16 undergoes a polarization rotation of 90 ° due to the double passage through the lambda quarter plate 14 and is reflected on the polarizing beam splitter 13 and reaches the main beam splitter 19 via a lens 17.
  • the illumination light 12 is downstream of the DMD matrix 16 has the respectively selected illumination pattern 18.
  • PBS polarizing beam splitter
  • lambda quarter plate 14 a TIR prism
  • the illuminating light 12 in the exemplary embodiment shown in FIG. 1 passes through zoom optics 20 and, after reflection on a deflecting mirror 21, reaches the microscope objective 25 via a lens 22 and a tube lens 24 and is applied by the latter to the sample S in the sample plane 26 focuses.
  • an intermediate image plane 29 that is to say a plane optically conjugated to the sample plane 26.
  • the zoom optics 20 enable the imaging scale to be scaled from the DMD matrix 16 into an intermediate image into the intermediate image plane 29 of the illuminating beam path 10.
  • the illuminating beam path 10 overall forms the illuminating pattern 18 from the DMD matrix 16 into the focal plane 26 of the microscope objective 25.
  • Fluorescent light 32 emitted by the sample S is recorded with the microscope objective 25 and returns via the same beam path, which is referred to in this direction as the detection beam path 30, to the main beam splitter 19.
  • the fluorescent light 32 is transmitted at the main beam splitter 19 and is transmitted by the lens 34 is imaged on the pixels 36 of the SPAD camera D.
  • the DMD matrix 16 can advantageously be mapped onto the SPAD camera approximately with pixel accuracy or pixel accuracy. However, this is not a strict requirement because of the number of pixels the DMD matrix 16 and the SPAD camera D may differ from one another. It is also possible to assign the measurement signals of the individual pixels 36 to the SPAD camera D only after the measurement has been taken, if all pixels 36 of the SPAD camera D are read out.
  • a microlens array for optimizing the fill factor can advantageously be present in front of the SPAD camera D.
  • the activation patterns of the DMD matrix 16, that is to say the illumination pattern 18, and the SPAD camera D, that is to say the readout pattern, are matched to one another and can preferably be switched synchronously.
  • the synchronization and control unit 40 can accomplish this.
  • the DMD matrix 16 is optically conjugated to the sample plane 26 on the one hand and to the detection plane of the SPAD camera D on the other hand, but is arranged in the pure illumination beam path 10, which can also be referred to as the excitation beam path.
  • the image is therefore not diffraction-limited and is more suitable for taking quick overview images.
  • the zoom optics are set such that only a part, for example half of the full field of view, is illuminated with the DMD matrix 16, confocal detection or oversampling of the detection point distribution function are possible.
  • a size of a detection point distribution function can correspond to a diameter of 3 pixels and can thus be scanned at 7 locations.
  • SDM Spinning Diso Microscopy
  • FIG. 1 The arrangement from FIG. 1 is very flexible with regard to the switchable lighting pattern 18. This gives rise to many other possible uses.
  • regular lighting patterns 18 randomly selected patterns can also be applied, for example.
  • Line profiles can be defined and scanned over the sample S by sequential switching of the illumination patterns 18.
  • lattice-like illumination patterns 18 are possible, which supply confocal image data with appropriate accounting.
  • the system can in principle learn from the measured data where a sample S emits intensely, weakly or not at all and accordingly adjust the exposure time in these areas, that is to say in principle individually for each pixel 36 of the SPAD camera.
  • fluorescent light from several planes of the sample S can also be measured at the same time, either by using the wavefront coding method for a so-called "extended depth of field" mapping.
  • a cubic phase mask for example an SLM, can be positioned in the illumination beam path 10 and / or in the detection beam path 30. In principle, however, you only get a projection over a certain z range of a sample S.
  • a real coding of different sample planes that is to say planes of sample S with different z coordinates, in such a way that they can be separated.
  • a helical point distribution function or in principle also another suitable point distribution function can be generated in the illumination beam path 10 and / or in the detection beam path 30, and that Signal can be evaluated accordingly.
  • the exemplary embodiment of a microscope 200 according to the invention shown in FIG. 2 differs from the microscope 100 from FIG. 1 only in the region of the pure illuminating beam path 10, that is to say in the region of the illuminating beam path 10 upstream of the main beam splitter 19.
  • the polarizing beam splitter 13 with the lambda Quarter plate 14 and the DMD array 16 are replaced in the microscope in FIG. 200 by two disks 42, 43 rotating in microscope mode.
  • the disk 42 facing the laser L in the illuminating beam path 10 carries a matrix of microlenses which focuses the laser light through the pinholes assigned to the respective microlenses on the rotatable diaphragm disk 43 following in the illuminating beam path 10.
  • the rotatable diaphragm disk 43 which can also be referred to as a pinhole disk, is located in a plane 15 which is optically conjugated to the sample plane 26 and is moved into the sample plane 26, that is to say the focal plane, via subsequent optics which essentially correspond to the arrangement from FIG of the microscope objective 25.
  • the disk 42 with the microlens arrangement and the aperture disk 43 rotate at high speed, fixed frequency and phase relationship to one another and thus rasterize a pattern of excitation points over the sample S.
  • the fluorescence light 32 generated and emitted by the sample S in the excitation points illuminated in this way is, again as in the exemplary embodiment in FIG. 1, imaged back onto the SPAD camera D via the detection beam path 30.
  • the pattern of the emission points or emission spots accordingly moves synchronously with the rotation of the disks 42, 43 via the SPAD camera D.
  • the readout pattern with which the SPAD camera D is to be controlled according to the invention is moved with the movement of the Illumination pattern synchronized.
  • the synchronization takes place with the PC 40, which from a known current position of the disks 42, 43 in the SPAD camera D readout pattern to be programmed, which can also be referred to as an activation pattern or activation pattern.
  • a trigger signal is provided to the PC 40 via a fast photodiode 47, which measures the transmission through an aperture of the rotating aperture disc 43 or a plurality of aperture openings that are at the same distance from the axis of rotation.
  • part of the illuminating light 12 is coupled out via a partially transparent mirror 44 and directed onto the rotating diaphragm disk 43 via a diaphragm 46 and via the disk 42 with the arrangement of microlenses.
  • the rotating diaphragm disk 43 by means of which the manipulation device 16 is implemented in the exemplary embodiment in FIG. 2, lies, like the DMD matrix 16 in the exemplary embodiment in FIG. 1, in a plane 15 which extends both to the sample plane 26 and to the plane the SPAD camera D is optically conjugated. It is essential for the invention that the manipulation device 16, ie the rotating diaphragm disk 43, is also arranged in the pure illumination beam path or excitation beam path of the microscope 200, ie in the illumination beam path 10 upstream of the main beam splitter 19. As in the example in FIG. 1, the SPAD camera D serves both as a sensor and as a switchable pinhole matrix, so that confocality or oversampling of the detection point distribution functions can be achieved by specifically activating the pixels 36 and with suitable dimensioning of the image, as described above.
  • FIGS. 1 and 2 have in common that the fluorescent light 32 reflected back from the sample S does not have a physical one as in the prior art Pinhole or a pinhole, such as a micromirror of the DMD matrix 16 or a real pinhole on the rotating disk, must be focused back on the detector D.
  • the fluorescent light 32 reflected back from the sample S is imaged directly onto the SPAD camera D and, in a defined temporal connection with the illumination pattern 18, readout patterns of the SPAD camera D corresponding to the respective current illumination pattern 18 are activated.
  • an electronically programmable, dynamic pinhole matrix is obtained, which in principle enables the data acquisition to be confocal if the imaging scale is suitably dimensioned for the SPAD camera D or a zoom setting is selected.
  • the imaging scale on the SPAD camera D is selected such that a detection point imaging function covers several pixels 36 of the SPAD camera, an oversampling evaluation of the signal data is possible, so that confocal limit resolution is achieved in spite of finally extended pinholes.
  • the measurement data of the SPAD camera can be calculated according to the so-called image scanning.
  • the lighting does not have to be operated stroboscopically, but the frame rate itself can be increased. This initially leads to very small numbers of photons per pixel in the individual image.
  • the individual images can then be integrated, taking into account the respective phase of rotation of the rotating diaphragm disk 43. It is essential for the present invention that the integration of the signal data does not take place on the sensor chip as in the case of CCD and CMOS arrays, but rather in a buffer store arranged downstream of the SPAD camera D. As a rule, this is a digital integration of the measured photon count events.
  • the potentially very short dead times (10 ns -100 ns) of a SPAD camera enable ultra-short integration times.
  • the SPAD pixels 36 can thus be operated in the violin mode in which individual photons are counted.
  • the movement of the panes in Figure 2 or the switching between different lighting patterns 18 in the arrangement according to Figure 1 is a quasi-static process. Accordingly, the FLIM signal of the dyes can be detected using a laser pulsed in the picosecond range.
  • Slower processes can also be measured with microscopes 100 and 200 from FIGS. 1 and 2. If such processes occur, for example, on a time scale comparable to the exposure time of individual areas, that is to say more in the millisecond range, such as phosphorescence processes, the readout pattern on the detector D can also be activated with a time delay compared to the illumination pattern and the detector D can be read out accordingly with a time delay. In this case, the afterglow of sample S is measured, so to speak, and information can be obtained from the measured delays regarding the time course of the relevant processes.
  • FIG. 3 A third exemplary embodiment of a microscope according to the invention is explained with reference to FIG. 3.
  • the microscope 300 according to the invention shown there has great similarities to the microscope 100 from FIG. 1.
  • the structure of the microscope 300 in the region of the illuminating beam path 10 upstream from the main beam splitter 19 is the same as in the microscope 100 from FIG. H.
  • FIG. 3 also uses a DMD matrix 16 which is arranged in a plane 15 which is optically conjugate to the intermediate image plane 29 and to the sample plane 26.
  • the essential difference between the microscope 300 from FIG. 3 and the microscope 100 from FIG. 1 is that at the position of the deflection mirror 21 in FIG. 1 in FIG 3, a scanning unit 50 is now arranged and that the zoom optics 20 shown in FIG. 1 is replaced by a relay system with a lens 27 and a lens 28.
  • the scanning unit 50 can in particular have scanning mirrors, for example galvanometric scanning mirrors.
  • the illumination pattern 18 thus reaches the sample S via the main beam splitter 19, the lenses 27, 28, the scanning unit 50, the lenses 22, 24 and the microscope objective 25.
  • fluorescent light 32 emitted by the sample S is collected and collimated with the microscope objective 25.
  • the fluorescent light 32 is then deflected by the scanning unit 50 onto the descanned beam path, transmitted on the main beam splitter 19 and imaged on the SPAD camera D.
  • the scanning unit 50 which is also controlled by the control and evaluation unit 40, is used to position the image of the DMD matrix 16 in the sample plane 26. This shifting of the illumination field is also referred to as panning. So that the entire optics of the microscope 300 are not too complex and tense, the field size that can be transmitted in the scanned beam path is limited, for example to a field diagonal of 2 mm.
  • the scanned beam path is that part of the detection beam path 30 downstream of the scanning unit 50.
  • pinhole sizes of 0.2 AU corresponding to five times oversampling of the Airy disk, can be achieved with full illumination of the DMD matrix 16.
  • artifacts caused by the structuring of the DMD matrix 16 which are also referred to as pattern artifacts, are already significantly reduced. Such artifacts can be reduced even more, namely smeared, if the scanning unit is actuated slightly. This is explained in more detail below in connection with FIG. 4 explained.
  • the illumination pattern 18 of the DMD matrix 16 and the readout pattern of the SPAD camera D are coordinated with one another and are in particular switched synchronously.
  • the synchronization is again carried out by the control and evaluation unit 40.
  • the fluorescent light 32 is detected by the SPAD camera D, which is arranged in a dedicated detection path.
  • the SPAD camera D is characterized by high refresh rates, so that it can be operated in Geiger mode for counting individual photons.
  • the pixels 36 of the SPAD camera D are preferably activated according to the lighting pattern 18 generated by the DMD matrix 16. Light that strikes the SPAD camera D outside the actively switched pixels 36 is therefore not registered.
  • the SPAD camera D therefore acts like a combination of sensor and switchable pinhole matrix.
  • An essential advantage of the invention is that the fluorescent light 32 is not passed over the manipulation device, ie not over the DMD matrix 16, on the way to the SPAD camera D. Loss of intensity when reflecting on the DMD matrix 16 is therefore avoided.
  • the PAM subfield is suitably shifted and positioned with the scanning unit 50.
  • the entire addressable field of view also referred to as a full field, can typically be a diagonal in the intermediate image plane 29 between the scanning unit 50 and the microscope objective 25 The order of magnitude is 20mm.
  • a pixel dwell time of 25 ps is still achieved. If, for comparison with a laser scanning microscope, a field of view of the same size were conventionally scanned with a double line rate of 1 kHz, the pixel dwell time of only 0.65 ps would result at a frame rate of only 3 fps. Because of the large degree of parallelization which can be set as desired, a microscope according to the invention, which can also be referred to as a hybrid microscope, can be very gentle on the specimen and nevertheless be repeated significantly faster than a conventional laser scanning microscope.
  • a measurement adapted to the sample can be carried out in such a way that areas whose SNR is already sufficiently high are no longer measured and are exposed to light.
  • user specifications and suitable algorithms can be used for this.
  • the pattern artifacts typical of a PAM microscope which result from the imaging of the DMD matrix into the sample plane and the plane of the detector, can advantageously be almost eliminated in the microscope according to the invention.
  • these pattern artifacts are not as pronounced in the microscope according to the invention as in PAM microscopes from the prior art, in which the DMD matrix is dimensioned over the entire field of view, because the mirror substructure of the DMD matrix 16 in the microscope according to the invention, i.e. the individual micromirrors, preferably smaller or are smaller than the diameter of a diffraction disk in the optical plane of the DMD matrix 16.
  • the dashed grating 60 in FIG. 4 corresponds to the DMD matrix 16, the narrow strips 66 representing the spaces between the individual mirrors of the DMD matrix 16. These gaps are the real cause of the pattern artifacts.
  • the square 61 marks active partial mirrors and has an edge length which corresponds approximately to the diameter of a diffraction disk. In the partial images b) to d), the image of the DMD array 16 in the sample plane 26 with the scanning unit 50 was in each case 1/10 of the diameter of the Airy disk in the x direction (FIG.
  • the individual pixels 36 of the SPAD camera D can also be activated.
  • the signal of the relevant excitation spot integrated via the activated pixels 36 then corresponds to the intensity value in a confocal detection mode.
  • the activated pixels 36 about which in this context, the signal is integrated, also referred to as an electronic pinhole.
  • FIG. 5 shows various sizes of an electronic pinhole in relation to the size of the detection point distribution function in the plane of the SPAD camera D.
  • the detection point distribution function is illustrated by a circular disk 74.
  • 5a the pixels 36 enclosed by the square 71 are activated. This means that in this case the diameter of the pinhole corresponds to 1 AU, ie it is the same size as the extent of the detection point distribution function 74.
  • the linear extent of the electronic pinhole defined by the square 72 is approximately twice as large as large as the detection point distribution function 74.
  • the electronic pinhole 72 is therefore larger than 1 AU. This means that confocal resolution is no longer achieved in this situation. However, the background light from levels other than the focal level can still be effectively suppressed.
  • the electronic pinhole defined by the square 73 is smaller than 1 AU.
  • the PAM-LSM it is also possible to set completely different structuring of the lighting than the point excitations typical for the LSM. To do this, the desired patterns are programmed on the DMD matrix.
  • the activation of the SPAD pixels then follows analogously. For example, the PAM subfield can be scanned with line lighting without complex anamorphic optics having to be installed and adjusted. This enables very high degrees of parallelization to be achieved. Structured lattice lighting is also possible, which enables quasi-confocal detection modes. Furthermore, direct SIM lighting is even possible, since the pixel grid of the DMD matrix is smaller than a diffraction disk.
  • the structures of the illumination patterns can then also be selected at random, as long as the DMD matrix and the detector D are coupled - for example via a control unit.
  • An essential application of the invention will be live cell microscopy, in which so-called time-lapse recordings, ie time series recordings, are very often made. Phototoxic effects are particularly problematic there.
  • the arrangement described here is particularly well suited to optimizing the exposure of later shots in a time series in such a way that areas which do not contain any luminous structures are no longer illuminated in subsequent shots.
  • the control and evaluation unit can automatically identify areas by means of suitable algorithms which contain no information but only dark noise. In subsequent recordings, only the areas are illuminated with image information, or, if appropriate, a small area around them.
  • the system can also make estimates of the areas in which future information can be expected. For example, a movement that performs a sample or part of a sample can be extrapolated.
  • One application could be the movement of vesicles, for example.
  • the switching pattern on the DMD and the SPAD array as well as the scanner speed and possibly the laser power must then be adjusted.
  • the SPAD camera can be designed in such a way that a time resolution in the range of picoseconds can be achieved. This enables a time-resolved recording with which the pictorial representation of the fluorescence decay behavior or the so-called fluorescence lifetimes is possible. This option is available for all of the image acquisition variants described above.
  • SPAD cameras Due to the very high exposure rates and very short exposure times, SPAD cameras also allow various methods of high-resolution microscopy to be used. For example, known that methods such as PALM and d-STORM as well as SOFI based on the flashing behavior of standard fluorophores are possible with sensors of this type. An arrangement such as the arrangement described above now allows these methods to be implemented in a way that is particularly gentle on the sample, since locally adapted lighting is particularly advantageous here.
  • the microscope according to the invention can, however, also be used advantageously for methods in which imaging is combined with optical manipulation of the sample, such as are increasingly used, for example, in optogenetics.
  • the microscope according to the invention allows the free switching of an illumination pattern and a readout pattern.
  • the illumination pattern 18 and the readout pattern can in principle be switched synchronously with one another, so that locations on a sample S which are illuminated by the illumination pattern 18 can also be read out simultaneously.
  • sample S is to be manipulated optically, one would like the areas which are present during a manipulation process, for example a channel opening Channelrhodopsin with a certain wavelength in certain areas of the sample, did not detect in these areas at that time. However, one wants to observe the reaction of the sample to this manipulation with a time delay that should not exceed a millisecond if possible. DMDs allow switching speeds up to the kHz range. SPAD cameras can be switched even faster. Because SPAD cameras are robust when operated in saturation, instead of switching off pixels 36, those signals that do not serve for imaging but instead result from manipulation radiation can also be removed afterwards. In addition to optogenetic manipulation, other manipulation methods such as FRAP can of course also be implemented.
  • DMDs allow switching speeds up to the kHz range. SPAD cameras can be switched even faster. Because SPAD cameras are robust when operated in saturation, instead of switching off pixels 36, those signals that do not serve for imaging but instead result from manipulation radiation can also be removed afterwards.
  • other manipulation methods such as FRAP can of course also be implemented
  • the invention provides a device which is particularly suitable for the application of optical manipulation / imaging of a sample.
  • polychromatic illumination of a sample S in which, for example, an activation laser, typically very short-wave with wavelengths below 450 nm, is condensed to a few points in the image field by means of the upstream beam shaping unit, while an excitation
  • the manipulation device 16, in particular the DMD matrix 16, is illuminated over a large area.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer Lichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht, mit einer ansteuerbaren Manipulationseinrichtung zum variablen Erzeugen eines auszuwählenden Beleuchtungsmusters des Beleuchtungslichts, mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv zum Leiten des Beleuchtungsmusters auf eine zu untersuchende Probe, mit einem Detektor mit einer Vielzahl von Pixeln zum Nachweisen von von der Probe abgestrahltem Fluoreszenzlicht, mit einem Detektionsstrahlengang zum Leiten des von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzlichts auf den Detektor, mit einem Hauptstrahlteiler zum Trennen von Beleuchtungslicht und Fluoreszenzlicht, mit einer Steuer- und Auswerteeinheit zum Ansteuern der Manipulationseinrichtung und zum Auswerten der von dem Detektor gemessenen Daten. Das erfindungsgemäße Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass die Manipulationseinrichtung im Beleuchtungsstrahlengang strahlaufwärts von dem Hauptstrahlteiler in der Nähe einer zu einer Probenebene optisch konjugierten Ebene angeordnet ist, dass die Pixel des Detektors mit der Steuer- und Auswerteeinheit einzeln und in auszuwählenden Auslesemustern aktivierbar sind und dass die Steuer- und Auswerteeinheit eingerichtet ist zum Aktivieren von Pixeln des Detektors einzeln oder in einem ausgewählten Auslesemuster abhängig von einem ausgewählten Beleuchtungsmuster. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Mikroskopie.

Description

- l -
Mikroskop und Verfahren zur Mikroskopie
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt ein Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. In einem zweiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Mikroskopie nach dem Oberbegriff des Anspruchs 28.
Ein gattungsgemäßes Mikroskop weist folgende Komponenten auf: eine Lichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht, eine ansteuerbare Manipulationseinrichtung zum va- riablen Erzeugen eines auszuwählenden Beleuchtungsmusters des Beleuchtungslichts, einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv zum Leiten des Beleuch- tungsmusters auf eine zu untersuchende Probe, einen Detektor mit einer Vielzahl von Pixeln zum Nachweisen von von der Probe abgestrahltem Fluoreszenzlicht, einen Detek- tionsstrahlengang zum Leiten des von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzlichts auf den Detektor, einen Hauptstrahlteiler zum Trennen von Beleuchtungslicht und Fluoreszenz- licht und eine Steuer- und Auswerteeinheit zum Ansteuern der Manipulationseinrichtung und zum Auswerten der von dem Detektor gemessenen Daten.
Bei einem gattungsgemäßen Verfahren zur Mikroskopie werden folgende Schritte durch- geführt: Beleuchtungslicht wird von einer Lichtquelle bereitgestellt, mit einer ansteuerba- ren Manipulationseinrichtung zum variablen Erzeugen eines auszuwählenden Beleuch- tungsmusters des Beleuchtungslichts wird ein Beleuchtungsmuster erzeugt, das Beleuch- tungsmuster wird über einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv auf eine zu untersuchende Probe geleitet, von der Probe abgestrahltes Fluoreszenzlicht wird über einen Detektionsstrahlengang auf einen Detektor mit einer Vielzahl von Pixeln gelei tet, wobei Beleuchtungslicht und Fluoreszenzlicht mit einem Hauptstrahlteiler getrennt werden, und das Fluoreszenzlicht wird schließlich mit dem Detektor nachgewiesen.
Lebendzellbildgebung steht im stetig wachsenden Interesse der biomedizinischen For- schung. Daraus ergeben sich hohe Anforderungen an die verwendeten Bildgebungssy- steme und insbesondere an die Mikroskope. Zum einen sind hohe Bildwiederholraten ge- fordert, um den dynamischen Prozessen in der Probe zu folgen. Zum anderen sollte die Beobachtung einen möglichst kleinen Einfluss auf die Entwicklung und das Verhalten der Probe haben. Es gilt somit, die eingestrahlte Lichtdosis und die eingestrahlten Energie- dichten, das heißt, bei gegebener Fokusgröße die genutzte Laserleistung, so klein wie möglich zu halten, da Licht auf Zellen toxisch wirkt und damit deren Lebensdauer verkürzt. Im Grundsatz werden beide Bedingungen sehr gut durch Weitfeldmikroskope erfüllt. Pro- blematisch ist dabei jedoch, dass zunehmend die lebenden Zellen als Ensemble zu ver- stehen sind und daher deren Wechselwirkung untereinander untersucht werden. Die Pro- ben sind somit nicht mehr zweidimensional, sondern weisen eine endliche Dicke auf. Bei einer Beobachtung mit einem Weitfeldmikroskop führt das zu einer Überlagerung des ge- wünschten Signals mit außerfokalem Licht, das unscharf auf den Sensor abgebildet wird. Die gesuchte Information ist demnach mitunter nicht oder nur mit schlechtem Kontrast detektierbar. Demzufolge ist eine Technologie, die optisches Sectioning (optisches Schneiden) - also das Messen einzelner Probenebenen bei Unterdrückung oder Diskri- minierung der Signale aller anderen Ebenen - erlaubt, ohne die Probe zu zerstören, un- abdingbar.
Als Standard zum Detektieren optischer Schnitte hat sich das konfokale Laserscanmikro- skop (LSM) etabliert, das sehr effektiv außerfokales Licht am konfokalen Pinhole blockiert und vor der Detektion diskriminiert. Das LSM ist jedoch bedingt durch den sequentiellen Bildaufbau des Rasterns sehr langsam. Außerdem werden relativ große Lichtintensitäten, also Energiemengen, in die Probe eingetragen, um bei den inhärenten kurzen Pixelzeiten noch ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Demnach ist das LSM zur Bildgebung bei lebenden Zellen nicht ideal geeignet.
Mit der Entwicklung der DLP-Technologie (DLP = Digital Light Processing) wurden in der Literatur sogenannte Programmable-Array-Mikroskope (PAM) diskutiert. Dabei wird ein DMD-Array in einer Zwischenbildebene des Mikroskops positioniert und mit dem Anre- gungslicht beleuchtet. Es werden dann mit dem DMD Beleuchtungsmuster aktiv geschal- tet, um die Probe an mehreren Positionen gleichzeitig zu beleuchten. Die in der Probe angeregte Fluoreszenz wird sodann wieder über dasselbe DMD-Array geleitet und der Detektion auf einem Matrixsensor, in der Regel einer sCMOS, zugeführt. Das DMD-Array dient damit gleichzeitig sowohl als Anregungs- als auch als Detektionspinholematrix. Die Anregungsmuster des DMD-Arrays werden dann systematisch durchgeschaltet bis eine vollständige Abtastung der Probenebene erreicht worden ist.
Aufgrund der nahezu beliebig großen Parallelisierung, die mit dem PAM erreichbar ist, sind Bildraten möglich, die nur noch durch die Bildaufnahmerate der Kamera limitiert sind. Trotzdem wird die Pixelverweilzeit im Vergleich zum LSM erhöht, so dass die mittlere Laserleistung pro Probenposition deutlich reduziert werden kann. Es ist dann immer noch möglich, in Abhängigkeit von der Probendicke den Parallelisierungsgrad zu variieren, um den Kontrast zu außerfokalem Licht zu erhöhen. Dies erfolgt zu Lasten von Bildrate oder Pixelverweilzeit.
Nachteilig beim PAM ist jedoch zum einen die Detektionseffizienz, da die Emission zwin- gend über das DMD-Array geführt werden muss, das in der Regel aus mit Aluminium beschichteten Siliziumspiegeln besteht. Aluminium führt dem Signal schon nahezu 20% Verluste zu. Zudem ist eine solche Spiegelmatrix ein regelmäßiges zweidimensionales Gitter, an dessen Substruktur das Emissionslicht gebeugt wird, wodurch zusätzliche Signalverluste durch Beugung in höhere Ordnungen verursacht werden. Darüber hinaus folgt aus dem Einsatz einer DMD-Matrix im Zwischenbild des Mikroskops, dass die DMD- Struktur direkt auf die Kamera abgebildet wird, so dass Patternartefakte entstehen. Zu- dem kann die geometrische Dimensionierung problematisch sein. Kommerziell verfüg- bare Spiegelmatrizen verfügen derzeit über eine maximale Anzahl von 1080 Zeilen aus Mikrospiegeln. Das begrenzt die Anwendbarkeit des PAM zum optischen Schneiden im Hinblick auf die Bildfeldgröße und die Objektivauswahl. Bei sehr großen Bildfeldern kön- nen viele Objektive nicht unterstützt werden, um konfokal abzutasten. Aus diesen Grün- den hat sich das PAM kommerziell bislang nicht durchsetzen können.
Ein für die Lebenzellbildgebung häufig eingesetztes Gerät ist das Spinning Diso Mikro- skop (SDM). Hier werden zwei fest zueinander positionierte Scheiben mit einer hohen Drehzahl rotiert. Auf der dem Laser zugewandten Scheibe ist eine Matrix aus Mikrolinsen angeordnet. Jeder Mikrolinse ist ein Pinhole auf der nachfolgenden Scheibe zugeordnet. Die Mikrolinsenscheibe wird großflächig mit dem Anregungslaser beleuchtet, der darauf- hin durch die Pinholes fokussiert wird. Zwischen den beiden Scheiben ist ein dichroiti scher Strahlteiler angeordnet, der das Laserlicht transmittiert und Fluoreszenzlicht reflek- tiert. Die Pinholescheibe wird mittels nachfolgender Optik in die Probe abgebildet. Auf- grund der Rotation der Scheibe wird die Probe mit einem Array aus Anregungsspots hoch- gradig parallelisiert (ca. 1000x) gerastert. Die in den Anregungsspots erzeugte Fluores- zenz wird auf die Pinholescheibe abgebildet und dort konfokal gefiltert. Am nachfolgenden Strahlteiler wird die Fluoreszenz zur Kamera abgelenkt. Der große Vorteil des SDM ist die hochgradig parallelisierte und damit relativ probenscho- nende konfokale Detektion. Weil Kameras als Sensoren genutzt werden müssen, ist das SDM jedoch ein reines Beobachtungsgerät mit konfokaler Bildqualität. Die konfokale Auf- lösungsgrenze kann nicht ohne weiteres erreicht werden, weil die Pinholes eine endliche Größe aufweisen müssen. Zudem passt die Pinhole-Größe immer nur näherungsweise für ein bestimmtes Objektiv. Andere Objektive können somit von vornherein nicht optimal genutzt werden, weil sie entweder eine kleinere Punktverteilungsfunktion am Pinhole er- zeugen, was zu einer verlängerten Detektionspunktverteilungsfunktion führt, oder aber das Pinhole überstrahlen, was zu starken Effizienzverlusten führen kann. Für eine Auflö- sungsverbesserung über die Möglichkeiten eines SDM hinaus ist eine stroboskopische Beleuchtung notwendig, die gegenüber der Rotation der Scheiben phasenverschoben ist. Zudem kann pro Beleuchtungsschuss nur ein einziges Bild aufgenommen werden, so dass die Bildrate für Hochauflösungsbildgebung extrem gering und somit für Lebendzell- bildgebung uninteressant ist. Experimente abseits der Bildakquise lassen sich nicht auf- setzen, da nur Vollframes ausgelesen werden können. Weiterhin sind diese Systeme we- nig flexibel hinsichtlich der Einstellung des beobachteten Bereichs, was dazu führt, dass bei Beobachtung einer kleinen Struktur deutlich größere Bereiche mitbelichtet werden müssen.
Als eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, ein Mikroskop und ein Verfahren zur Mikroskopie anzugeben, bei denen ein hochgradig parallelisiertes Ab- rastern einer lebenden Probe bei konfokaler Grenzauflösung und darüber hinaus abseits der reinen Bildgebung weitere Experimentiertechniken an der lebenden Probe möglich sind.
Diese Aufgabe wird durch das Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren zur Mikroskopie mit den Merkmalen des Anspruchs 28 gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Mikroskops und vorteilhafte Varianten des er- findungsgemäßen Verfahrens werden im Folgenden, insbesondere im Zusammenhang mit den abhängigen Ansprüchen und den Figuren, beschrieben.
Das Mikroskop der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass die Manipulationseinrichtung im Beleuchtungsstrahlengang strahlaufwärts von dem Hauptstrahlteiler in der Nähe einer zu einer Probenebene optisch konjugierten Ebene an- geordnet ist, dass die Pixel des Detektors mit der Steuer- und Auswerteeinheit einzeln und in auszuwählenden Auslesemustern aktivierbar sind und dass die Steuer- und Aus- Werteeinheit eingerichtet ist zum Aktivieren von Pixeln des Detektors einzeln oder in ei- nem ausgewählten Auslesemuster abhängig von einem ausgewählten Beleuchtungsmu- ster.
Das Verfahren der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass die Manipulationseinrichtung strahlaufwärts von dem Hauptstrahlteiler in der Nähe einer zu einer Probenebene optisch konjugierten Ebene angeordnet ist und dass die Pixel des Detektors abhängig von einem ausgewählten Beleuchtungsmuster einzeln oder in einem ausgewählten Auslesemuster aktiviert werden.
Besonders bevorzugt ist die Manipulationseinrichtung in einer zu einer Probenebene op- tisch konjugierten Ebene angeordnet. Es versteht sich, dass diese Angabe nicht in einem mathematischen Sinn, sondern im Rahmen von typischen Ungenauigkeiten der Positio- nierung zu verstehen ist.
Als ein Grundgedanke der vorliegenden Erfindung kann erachtet werden, das Detektions- licht abweichend von bisherigen Lösungen nicht wieder über die Manipulationseinrichtung zu führen, mit welcher das Beleuchtungsmuster gebildet wird.
Mit der Erfindung werden ein besonders vielseitiges Mikroskop und ein besonders viel- seitiges Verfahren zur Mikroskopie bereitgestellt.
Unter einem Beleuchtungsmuster wird das tatsächliche Muster der Beleuchtung auf der beleuchteten Fläche der Probe, beispielsweise ein Punktmuster, ein Strichmuster, eine gitterartige Beleuchtung oder eine für eine biologische Probe spezifisch maßgeschnei- derte Beleuchtung, verstanden. Naturgemäß korrespondiert bei Verwendung einer pi- xelierten Manipulationseinrichtung dabei ein bestimmtes Beleuchtungsmuster mit einer bestimmten Kombination von aktivierten Pixeln der Manipulationseinrichtung. Mit dem Begriff eines Auslesemusters wird eine prinzipiell beliebige Kombination von zu aktivierenden Pixeln des Detektors verstanden.
Als Lichtquellen werden zweckmäßig Laser verwendet. Es können aber auch weitere in- tensive Lichtquellen, wie z.B. LEDs, zum Einsatz kommen. Als Steuer- und Auswerteein- heit kommen in an sich bekannter weise Recheneinrichtungen, insbesondere PCs, zum Einsatz.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich insbesondere zur Durchführung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikroskops weist die Manipulationseinrichtung zum Erzeugen eines auszuwählenden Beleuchtungs- musters eine Vielzahl von Pixeln und insbesondere einen räumlichen Lichtmodulator (SLM), wie beispielsweise ein digitales Mikrospiegelarray (DMD), auf. Solche Komponen- ten sind mit Auflösungen von beispielsweise 4096 c 2160 Pixel erhältlich. Der wesentliche Vorteil von solchen pixelierten Manipulationseinrichtungen kann darin gesehen werden, dass wegen der freien Ansteuerbarkeit die Möglichkeiten der Beleuchtungsmuster im Grundsatz nur durch die räumliche Auflösung und die Schnelligkeit der verwendeten Kom- ponente beschränkt sind.
Bei einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops weist die Manipu- lationseinrichtung zum variablen Erzeugen eines Beleuchtungsmusters eine bewegliche, insbesondere drehbare, Blendenscheibe auf. Durch Bewegung, insbesondere durch Dre- hung, dieser Blendenscheibe wird die Probe mit variablen Beleuchtungsmustern beleuch- tet.
Um mindestens teilweise Konfokalität zu erreichen, müssen die Blendenöffnungen der Blendenscheibe mindestens in einer Raumdimension auf die Dimension einer konfokalen Blende beschränkt sein. Beispielsweise kann die Blendenscheibe in grundsätzlich be- kannter Weise eine Vielzahl von spiralförmig, insbesondere in Form von Archimedes-Spi- ralen, angeordneten Lochblenden aufweisen und insbesondere eine Nipkov-Scheibe sein. Ebenfalls möglich sind Blendenscheiben mit einer Vielzahl von Schlitzen. Um dem Problem des großen Verlusts an Beleuchtungslicht an der Blendenscheibe we- nigstens teilweise abzuhelfen, kann vorteilhaft strahlaufwärts von der drehbaren Blenden- scheibe ein Mikrolinsen-Array vorhanden sein, welches Beleuchtungslicht auf die Blen- denöffnungen der Blendenscheibe fokussiert und welches im Betrieb mit gleicher Ge- schwindigkeit wie die Blendenscheibe rotiert. Die Mikrolinsen sind zweckmäßig so dimen- sioniert, dass sie das Beleuchtungslicht auf die Blendenöffnungen fokussieren.
Die Steuer- und Auswerteeinheit ist bei den Ausgestaltungen mit einer beweglichen Blen- denscheibe zweckmäßig dazu eingerichtet, ein Auslesemuster des Detektors mit einem durch die sich bewegende, insbesondere sich drehende, Blendenscheibe erzeugten Be- leuchtungsmuster zu synchronisieren. Bei Varianten mit drehender Blendenscheibe besteht eine weitere vorteilhafte Ausgestal- tung des erfindungsgemäßen Mikroskops darin, dass zum Synchronisieren einer An- steuerung des Detektors mit einer Bewegung der drehbaren Blendenscheibe eine Fotodi- ode zum Messen einer intermittierenden Lichttransmission durch die drehbare Blenden- scheibe oder zum Messen einer intermittierenden Lichtreflexion von der drehbaren Blen- denscheibe vorhanden ist. Durch das Transmissions- oder Reflexionssignal wird ein zu- verlässiges Triggersignal für die Ansteuerung des Detektors bereitgestellt.
Prinzipiell kann für das erfindungsgemäße Mikroskop jede Art von pixeliertem Detektor zum Einsatz kommen, welcher das nachzuweisende Licht hinreichend empfindlich nach- weist und hinreichend schnell ausgelesen werden kann. Bei besonders bevorzugten Va- rianten des erfindungsgemäßen Mikroskops weist der Detektor ein SPAD-Array oder eine SPAD-Kamera auf. Mit diesen in CMOS-Prozessen fertigbaren Sensoren ist eine hoch- sensitive photonenzählende Messung möglich.
Zur Steigerung des Füllfaktors, also des Verhältnisses der lichtempfindlichen Fläche zur gesamten Pixelfläche, kann vorteilhaft strahlaufwärts vor dem Detektor ein Mikrolin- senarray vorhanden sein. Diese Maßnahme ist insbesondere sinnvoll, wenn die Pixelra- ster der Manipulationseinrichtung und des Detektors nicht übereinstimmen.
Das von einer Probe zurückgestrahlte Licht enthält in an sich bekannter weise reflektierte und zurückgestreute spektrale Komponenten des Beleuchtungslichts, das auch als Anre- gungslicht bezeichnet werden kann, und im Vergleich dazu rotverschobene Fluoreszenz- komponenten. Der Hauptfarbteiler dient dazu, die spektralen Komponenten des Beleuch- tungslichts von den Fluoreszenzkomponenten zu trennen. Eine weitere Aussonderung von unerwünschten spektralen Komponenten im Detektionsstrahlengang kann bewerk- stelligt werden, wenn im Detektionsstrahlengang strahlabwärts von dem Hauptfarbteiler mindestens ein Emissionsfilter, insbesondere eine Wechseleinrichtung mit mehreren Emissionsfiltern, vorhanden ist. Die Wechseleinrichtung kann beispielsweise ein Filterrad sein.
Bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Mikroskops betreffen die Zuordnung von Pixeln der Manipulationseinrichtung zu Pixeln des Detektors. Die Manipulationseinrich- tung als solche wird streng genommen nicht auf den Detektor optisch abgebildet, weil das Beleuchtungslicht auf dem Rückweg von der Probe am Hauptfarbteiler abgetrennt wird. Die Pixelzahlen der Manipulationseinrichtung, insbesondere also des DMDs, und des De- tektors, insbesondere also des SPAD-Arrays, sind im Allgemeinen nicht identisch.
Beispielsweise kann eine bestimmte Gruppe von Pixeln der Manipulationseinrichtung auf eine festgelegte Gruppe von Pixeln des Detektors abgebildet werden. Insbesondere kann - io -
jedes Pixel der Manipulationseinrichtung auf eine festgelegte Gruppe von Pixeln des De- tektors abgebildet werden. Ebenso kann eine bestimmte Gruppe von Pixeln der Manipu- lationseinrichtung auf ein bestimmtes Pixel des Detektors abgebildet werden.
Beispielsweise kann eine Zuordnung der Pixeln in bestimmten Zahlenverhältnissen erfol- gen. So kann einem Pixel des Detektors zum Beispiel eine Gruppe von 2x2 oder 4x4 Pixeln des DMD zugeordnet sein.
In einem Spezialfall wird jedes Pixel der Manipulationseinrichtung auf genau ein Pixel des Detektors abgebildet. Diese Situation wird auch als pixelgenaue Abbildung bezeichnet. Damit ist gemeint, dass ein von einem bestimmten Pixel der Manipulationseinrichtung beleuchteter Probenbereich auf jeweils genau ein Pixel des Detektors abgebildet wird.
Die Signale der einzelnen Pixel können auch nach der Messaufnahme zugeordnet wer- den, wenn die gesamte SPAD-Matrix ausgelesen wird. Im Bedarfsfall sorgt ein Mikrolin- senarray vor der SPAD-Kamera für eine Optimierung des Füllfaktors. Weiterhin kann im Bedarfsfall ein optischer Zoom zwischen Hauptfarbteiler und Detektor oder zwischen der Manipulationseinrichtung und Hauptfarbteiler die entsprechende Zuordnung sicherstellen oder die Anordnung an die Messaufgabe anpassen.
Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops ist die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet, den Detektor mit einem dem ausge- wählten Beleuchtungsmuster entsprechenden Auslesemuster anzusteuern. In verfah- rensmäßiger Hinsicht kann vorteilhaft der Detektor mit einem Auslesemuster angesteuert werden, welches dem von der Manipulationseinrichtung erzeugten Beleuchtungsmuster entspricht.
Unter einem Auslesemuster wird dabei eine bestimmte Kombination von aktivierten Pixeln des Detektors verstanden. Bei einer pixelgenauen Abbildung bedeutet das, dass ein be- stimmtes Pixel des Detektors genau dann aktiviert wird, wenn von dem über die pixelge- naue Abbildung zugehörigen Pixel der Manipulationseinrichtung Beleuchtungslicht auf die Probe gestrahlt wird. Wenn keine pixelgenaue Abbildung vorliegt, bedeutet die Ansteue- rung des Detektors mit einem dem ausgewählten Beleuchtungsmuster entsprechenden Auslesemuster, dass das Beleuchtungsmuster und das Auslesemuster insoweit ähnlich sind, als sie durch Skalierung, also lineare Transformation, ineinander überführbar sind.
Bei reiner Fluoreszenzmikroskopie ist die Steuer- und Auswerteeinheit zweckmäßig dazu eingerichtet, den Detektor synchron mit dem Auslesemuster, welches dem Beleuchtungs- muster entspricht, anzusteuern. Synchron bedeutet dabei insbesondere, dass die jeweili gen Pixel des Detektors innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer der Farbstoffe aktiviert sind. Es ist aber auch möglich, dass die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet ist, den Detektor zeitversetzt, insbesondere variabel zeitversetzt, zu einem auf die Probe gestrahlten Beleuchtungsmuster mit einem Auslesemuster anzusteuern. Bei einer korres- pondierenden vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Detek- tor zeitversetzt zu einem auf die Probe gestrahlten Beleuchtungsmuster mit einem Ausle- semuster angesteuert. Dies kann beispielsweise zur Untersuchung von Phosphoreszenz- vorgängen oder sonstigen Vorgängen, insbesondere in biologischen Proben, die im Ver- gleich zur Fluoreszenzlebensdauer der Farbstoffe viel langsamer ablaufen, von Vorteil sein.
Bei der konkreten Gestaltung der Beleuchtungsmuster besteht im Prinzip große Freiheit. Bei vorteilhaften Varianten des erfindungsgemäßen Mikroskops ist die Steuer- und Aus- werteeinheit dazu eingerichtet, die Manipulationseinrichtung zum Scannen von Beleuch- tungsmustern, insbesondere Punktmustern, Linienmustern oder gitterartigen Mustern, über die Probe anzusteuern.
Grundsätzlich wird durch die Dimensionierung des Detektionsstrahlengangs festgelegt, ob bei geeigneter Ansteuerung des Detektors konfokale Mikroskopie ermöglicht wird. Bei- spielsweise kann der Detektionsstrahlengang so dimensioniert sein, dass eine Detekti- onspunktverteilungsfunktion auf dem Detektor mehr als ein Pixel, insbesondere mehr als 5 Pixel, beleuchtet. Bei solch einer Anordnung sind demgemäß konfokale Messungen und eine Überabtastung der Punktverteilungsfunktion möglich.
Größere Freiheit erhält man in diesem Zusammenhang, wenn zur Variation der Größe des Beleuchtungsfelds auf der Probe zwischen dem Hauptstrahlteiler und dem Mikro- skopobjektiv eine Zoomoptik vorhanden ist. Mit der Zoomoptik kann ein Abbildungsmaß- stab, mit welchem das Manipulationsmittel auf die Probe abgebildet wird variiert werden. Außerdem kann zwischen der Manipulationseinrichtung und dem Hauptstrahlteiler und/oder zwischen dem Hauptstrahlteiler und dem Detektor eine Zoomoptik vorhanden sein. Dadurch kann eine Zuordnung der Pixel der Manipulationseinrichtung zu den Pixeln des Detektors bedarfsgerecht variiert werden.
Beispielsweise kann eine Einstellung der Zoomoptik gewählt werden, bei der die Manipu- lationseinrichtung, insbesondere eine DMD-Matrix, auf ein volles Sehfeld abgebildet wird. Zum Beispiel kann die Optik so dimensioniert sein, dass ein Teilspiegel, also ein Pixel der Manipulationseinrichtung, dann einem Beleuchtungsspot mit einem Durchmesser von 1 bis 2 AU (AU=Airy-Unit) entspricht. Die Abbildung auf die Detektormatrix ist dann nicht beugungsbegrenzt und eher geeignet, um schnell Übersichtsbilder aufzunehmen. Die Erfindung ermöglicht aber auch vorteilhafte Varianten, bei denen eine Einstellung der Zoomoptik gewählt wird, bei der die Manipulationseinrichtung, insbesondere eine DMD- Matrix, nur auf einen Teil eines Sehfelds abgebildet wird. Bei diesen Varianten kann eine konfokale Detektion oder Überabtastung der Punktverteilungsfunktion erreicht werden. Die Möglichkeiten der räumlichen Manipulation des Beleuchtungsfelds können noch er- weitert werden, wenn alternativ oder ergänzend zur Zoomoptik zum lateralen Verschieben des Beleuchtungsfelds eine Scaneinheit, insbesondere mit galvanometrischen Scanner- spiegeln, vorhanden ist. Zweckmäßig ist eine solche Scaneinheit in grundsätzlich bekann- ter Weise in einer zur hinteren Pupille des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene positioniert. Das Beleuchtungsfeld kann vorteilhaft mit einer Scaneinheit lateral, beispiels- weise in x- und y-Richtung, verschoben werden.
Prinzipiell können bei geeigneter Ansteuerung der Manipulationseinrichtung mit der Scaneinheit Scans mit einer Punkt-, Linien- oder Gitterbeleuchtung durchgeführt werden. Es ist aber auch möglich, solche Scans mit der Manipulationseinrichtung selbst durchzu- führen. Wenn eine Scaneinheit vorhanden ist, kann mit der Scaneinheit das Beleuch- tungsfeld in einem Raster von Teilbildern um mindestens eine Rasterposition in diesem verschoben werden und es kann sodann erneut ein Scan durch geeignete Ansteuerung der Manipulationseinrichtung durchgeführt werden. Zweckmäßig kann zur Konditionierung des Beleuchtungslichts im Beleuchtungsstrahlen- gang strahlaufwärts von dem Hauptstrahlteiler ein polarisierender Strahlteiler (PBS) und ein Lambda-Viertel-Plättchen vorhanden sein. Anstelle der Kombination aus PBS und Lambda-Viertel-Plättchen kann, wie in Projektionsanwendungen üblich, im Beleuchtungs- Strahlengang auch ein TIR-Prisma eingesetzt werden. Ein TIR-Prisma hat den Vorteil, dass unterdrücktes Licht geometrisch vom Nutzlicht abgetrennt werden kann.
Zum geeigneten Konditionieren der spektralen Zusammensetzung des Beleuchtungs- lichts kann es vorteilhaft sein, wenn im Beleuchtungsstrahlengang strahlaufwärts von dem Hauptfarbteiler mindestens ein Anregungsfilter, insbesondere eine Wechseleinrichtung mit verschiedenen Anregungsfiltern, vorhanden ist. Die Wechseleinrichtung kann in grundsätzlich bekannter Weise insbesondere ein Filterrad oder eine linear verschiebbare Wechseleinrichtung sein. Zum geeigneten Konditionieren, beispielsweise zum Homogenisieren, des räumlichen In- tensitätsprofils des Beleuchtungslichts kann es vorteilhaft sein, wenn im Beleuchtungs- Strahlengang, insbesondere unmittelbar strahlabwärts von der Lichtquelle ein beugendes optisches Element vorhanden ist. Beispielsweise kann so ein zunächst im Wesentlichen Gauß-artiges räumliches Intensitätsprofil in ein räumliches Intensitätsprofil umgewandelt werden, welches im Wesentlichen eine Rechteckform aufweist.
Noch mehr Manipulationsmöglichkeiten im Hinblick auf die spektrale Zusammensetzung und die spektrale räumliche Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts kann man errei- chen, wenn strahlaufwärts vor der Manipulationseinrichtung eine weitere lichtformende Einheit, insbesondere ein räumlicher Lichtmodulator (SLM), vorhanden ist. Beispielsweise kann solch eine weitere lichtformenden Einheit dazu dienen, bestimmte spektrale Kom- ponenten des Anregungslichts auf bestimmte Regionen der Manipulationseinrichtung zu konzentrieren. Ergänzend oder alternativ kann für solche Zwecke auch strahlaufwärts von der weiteren lichtformenden Einheit mindestens ein Farbteiler vorhanden sein zum Leiten von ausgewählten Wellenlängen zu der weiteren lichtformenden Einheit.
In diesem Zusammenhang kann außerdem vorteilhaft zum optischen Manipulieren der Probe mindestens eine separate Lichtquelle, insbesondere ein weiterer Laser, vorhanden sein. Mit solch einem weiteren Laser wird bevorzugt Licht besonderer Wellenlängen, die für die optische Manipulation einer Probe geeignet sind, bereitgestellt. Die Probe wird bei solchen Verfahrensvarianten also polychromatisch beleuchtet.
Der oder die Laser wird beziehungsweise werden, insbesondere für zeitauflösende Mes- sungen, bevorzugt gepulst betrieben, insbesondere mit Pulsdauern im Bereich von Piko- sekunden.
In an sich bekannter Weise kann darüber hinaus im Beleuchtungsstrahlengang, insbe- sondere in einer zur hinteren Pupille des Mikroskopobjektivs optisch konjugierten Ebene, ein Mittel zur Wellenfrontmodulation, insbesondere ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) vorhanden sein. Hierzu kann, falls erforderlich, im Beleuchtungsstrahlengang eine Relais- Optik vorhanden sein, um eine zusätzliche Pupillenebene bereitzustellen. Hiermit wird eine adaptive Korrektur des Beleuchtungsfeldes bereitgestellt, um eine möglichst gute Anregungspunktbildfunktion bei dickeren Proben zu garantieren.
Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens weist der Detektor einen photonenzählenden Sensor, insbesondere eine SPAD-Kamera, auf, dessen bezie- hungsweise deren Pixel im Geiger-Modus betrieben werden, und von dem Detektor wer- den digitale Zählwerte, die Photonendetektionsereignissen entsprechen, ausgelesen. Mit den Pixeln des Detektors werden also jeweils einzelne Photonen gezählt. Das bedeutet, dass Fluoreszenzmessungen mit sehr geringen Intensitäten des Anregungslichts durch- geführt werden können und somit Schädigungen einer, insbesondere lebenden biologi schen, Probe bestmöglich vermieden werden können. Beispielsweise kann bei Verwen- dung eines im Pikosekundenbereich gepulsten Lasers das FLIM-Signal der Farbstoffe erfasst werden. Im Vergleich zur sehr geringen Integrations- oder Auslesezeit der SPAD- Kamera ist die Bewegung der Pixel eines DMDs beziehungsweise das Umschalten zwi- schen verschiedenen Beleuchtungsmustern viel langsamer, also ein quasi-statischer Vor- gang.
Bei besonders vorteilhaften Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Be- lichtungszeiten für einzelne Pixel des Detektors spezifisch eingestellt. Beispielsweise kön- nen die Belichtungszeiten für einzelne Pixel des Detektors in Abhängigkeit von von der Probe gewonnenen Messdaten spezifisch, also separat und individuell für jedes Pixel, eingestellt werden. Dadurch kann beispielsweise für Bereiche der Probe, die vergleichs- weise schwach emittieren mit einer größeren Belichtungszeit und für andere Bereiche der Probe, die relativ intensiv emittieren, mit einer kleineren Belichtungszeit gearbeitet wer- den. Hierdurch werden auch besonders probenschonende Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, bei denen mindestens ein Bereich einer Probe nicht mehr mit Be- leuchtungslicht beaufschlagt wird, sobald in diesen Bereichen in einem aufgenommenen Bild ein bestimmter Wert für ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis erreicht ist. Der Grenz- oder Schwellwert für das Signal-zu-Rausch-Verhältnis kann vorteilhaft von einem Nutzer be- darfsweise, prinzipiell auch für verschiedene Bereiche unterschiedlich, eingestellt werden.
Bei bevorzugten Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im An- schluss an eine optische Anregung und/oder Manipulation der Probe zeitaufgelöste Mes- sungen durchgeführt. Beispielsweise können bei FLIM (FLIM = Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy) durch Auswertung von Detektionszeiten einzelner Photonen Fluoreszenzlebensdauern der emittierenden Farbstoffe bestimmt werden.
Im Hinblick auf das Ansteuermuster, mit welchem der Detektor angesteuert wird, besteht eine weitere vorteilhafte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, dass eine Bewegung, die eine Komponente einer, insbesondere biologischen, Probe durchführt, ex- trapoliert wird. Hierzu können bei der Steuer- und Auswerteeinheit Methoden der künstli- chen Intelligenz, der Mustererkennung und des Maschinenlernens zum Einsatz kommen.
Die Strukturierung einer pixelierten Manipulationseinrichtung, insbesondere eines DMD, kann Artefakte in dem von der Kamera gemessenen Bild bewirken. Diese Artefakte kön- nen reduziert werden, wenn die Scaneinheit während einer Integrationszeit des Detektors geringfügig betätigt wird.
Das bedeutet, dass die durch die Struktur des DMD bewirkten Artefakte auf dem Detektor verschmiert werden. Beispielsweise kann das Beleuchtungsfeld zwischen einzelnen auf- zusummierenden Bildern mit der Scaneinheit um einen Bruchteil eines Airy-Scheibchens, insbesondere um 1 % bis 50 %, bevorzugt 3 % bis 30 % und besonders bevorzugt 5 % bis 15 % eines Airy-Scheibchens, lateral bewegt werden. Besonders effektiv werden die durch die Struktur eines DMD bewirkten Artefakte reduziert, wenn das Beleuchtungsfeld zwischen einzelnen aufzusummierenden Bildern in zwei unabhängigen Koordinatenrich- tungen (x, y) bewegt wird.
Mit dem Begriff der Integrationszeit kann insbesondere diejenige Zeit bezeichnet werden, über welche die Signale der Pixel oder Pixelgruppen oder aller Pixel des Sensors inte- griert, also digital aufsummiert, werden.
Mit SPAD-Kameras kann ein Photonenstrom grundsätzlich kontinuierlich, d.h. nicht ge- taktet, gemessen werden. Andererseits ist ein getakteter oder synchronisierter Betrieb, wie bei einer herkömmlichen Kamera, bei einer SPAD-Kamera ebenso möglich. Ein be- sonderer Vorteil von SPAD-Kameras ist aber, dass man in verschiedenen Bereichen des Bilds verschiedene Integrationszeiten anwenden kann. Prinzipiell ist es möglich, jeweils lokal die einkommenden Pulse aufzusummieren, also unterschiedlich lang„digital“ zu in- tegrieren. Das ist einer der ganz großen Vorteile der SPAD-Technologie.
Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird mit der Manipu- lationseinrichtung und der SPAD-Kamera zusammen in verschiedenen Bildbereichen ver- schieden lange zu integrieren, was den Lichteintrag auf ein Minimum reduziert und dabei probenabhängig optimal misst. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht grundsätzlich eine besonders große Zahl von Verfahrensvarianten. Beispielsweise können grundsätzlich bekannte Verfahren der SIM-Beleuchtung der Probe durchgeführt werden. Möglich sind außerdem PALM-, d- STORM-, SOFI- und FRAP-Verfahren. Weitere Vorteile und Merkmale des erfindungsgemäßen Mikroskops und des erfindungs- gemäßen Verfahrens werden im Folgenden im Zusammenhang mit den Figuren erläutert. Es zeigen:
Figur 1 : ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops; Figur 2: ein zweites Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
Figur 3: ein drittes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
Figur 4: schematische Ansichten der Detektorfläche zur Erläuterung einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens und
Figur 5: schematische Ansichten der Detektorfläche zur Erläuterung einer weiteren
Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Gleiche und gleichwirkende Komponenten sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
Das in Figur 1 gezeigte erste Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikro- skops 100 weist als wesentliche Komponenten zunächst eine Lichtquelle L zum Bereit- stellen von Beleuchtungslicht 12, eine ansteuerbare Manipulationseinrichtung 16 zum va- riablen Erzeugen eines auszuwählenden Beleuchtungsmusters 18 des Beleuchtungs- lichts 12, einen Beleuchtungsstrahlengang 10 mit einem Mikroskopobjektiv 25 zum Leiten des Beleuchtungsmusters 18 auf eine zu untersuchende Probe S, einen Detektor D mit einer Vielzahl von Pixeln 36 zum Nachweisen von von der Probe S abgestrahltem Fluo- reszenzlicht 32, einen Detektionsstrahlengang 30 zum Leiten des von der Probe S abge- strahlten Fluoreszenzlichts 32 auf den Detektor D, einen Hauptstrahlteiler 19 zum Tren- nen von Beleuchtungslicht 12 und Fluoreszenzlicht 32 und eine Steuer- und Auswerteein- heit 40 zum Ansteuern der Manipulationseinrichtung 16 und zum Auswerten der von dem Detektor D gemessenen Daten auf.
Im gezeigten Ausführungsbeispiel handelt es sich bei der Lichtquelle L um einen Laser, der auch als Anregungslaser bezeichnet werden kann. Als Manipulationseinrichtung 16 kommt im Beispiel der Figur 1 ein digitales Mikrospiegelarray, im Folgenden als DMD- Matrix oder nur als DMD (Digital Micromirror Device) bezeichnet, zum Einsatz. Bei der Steuer- und Auswerteeinheit 40 kann es sich um eine Recheneinrichtung prinzipiell be- kannter Natur handeln. Typischerweise wird ein PC verwendet. Der Detektor D ist im ge- zeigten Ausführungsbeispiel eine SPAD-Kamera
Erfindungsgemäß ist der DMD im Beleuchtungsstrahlengang 10 strahlaufwärts von dem Hauptstrahlteiler 19, also in demjenigen Teil des Beleuchtungsstrahlengangs 10 der aus- schließlich Beleuchtungsstrahlengang und nicht Detektionsstrahlengang ist, angeordnet und zwar in einer Ebene 15, die zu einer Probenebene 26 optisch konjugiert ist. Das be- deutet, dass der Beleuchtungsstrahlengang 10 die Oberfläche der DMD-Matrix 16 auf die Probe abbildet. Der PC 40 ist erfindungsgemäß dazu eingerichtet, die Pixel 36 des De- tektors D einzeln und in auszuwählenden Auslesemustern abhängig von einem ausge- wählten Beleuchtungsmuster 18 zu aktivieren.
Die DMD-Matrix 16 im Beleuchtungsstrahlengang 10 wird mit dem Anregungslaser L aus- geleuchtet. Die Wellenlänge des Lasers L kann einstellbar oder aus einer Vielzahl von Wellenlängen auswählbar sein. Die Intensität des Lasers L kann beispielsweise mit einem in Figur 1 nicht dargestellten akustooptischen Element (AOM, AOTF) einstellbar sein. Bei dem in Figur 1 gezeigten Ausführungsbeispiel ist unmittelbar strahlabwärts von dem La- ser L ein beugendes optisches Element (DOE=Diffraktives Optisches Element) 1 1 ange- ordnet, welches für eine gleichmäßige Lichtverteilung, also für ein räumliches Intensitäts- profil sorgt, welches im Wesentlichen eine Rechteckform aufweist. Vor der DMD-Matrix 16 sind ein polarisierender Strahlteiler (PBS= Polarizing Beam Splitter) 13 und ein Lambda- Viertel-Plättchen 14 angeordnet, so dass vom Laser L einlaufendes, linear polarisiertes Licht zu der DMD-Matrix 16 propagieren kann. An der DMD-Matrix 16 reflektiertes Beleuchtungslicht 12 erfährt wegen des zweimaligen Durchgangs durch das Lambda- Viertel-Plättchen 14 eine Polarisationsdrehung um 90° und wird an dem polarisierender Strahlteiler 13 reflektiert und gelangt über eine Linse 17 auf den Hauptstrahlteiler 19. Das Beleuchtungslicht 12 strahlabwärts von der DMD-Matrix 16 weist das jeweils ausgewählte Beleuchtungsmuster 18 auf.
Anstelle der Kombination aus polarisierendem Strahlteiler (PBS= Polarizing Beam Split- ter) 13 und Lambda-Viertel-Plättchen 14 kann, wie in Projektionsanwendungen üblich, auch ein TIR-Prisma eingesetzt werden. Letztere Lösung hat den Vorteil, dass unter- drücktes Licht geometrisch vom Nutzlicht abgetrennt werden kann.
Strahlabwärts vom Hauptstrahlteiler 19 durchläuft das Beleuchtungslicht 12 in dem in Fi- gur 1 gezeigten Ausführungsbeispiel eine Zoomoptik 20 und gelangt nach Reflexion an einem Umlenkspiegel 21 über eine Linse 22 und eine Tubuslinse 24 zum Mikroskopob- jektiv 25 und wird von diesem auf die Probe S in die Probenebene 26 fokussiert. Zwischen der Linse 22 und der Tubuslinse 24 befindet sich eine Zwischenbildebene 29, also eine zur Probenebene 26 optisch konjugierte Ebene. Die Zoomoptik 20 ermöglicht eine Ska- lierung des Abbildungsmaßstabs von der DMD-Matrix 16 in ein Zwischenbild in die Zwi- schenbildebene 29 des Beleuchtungsstrahlengangs 10. Der Beleuchtungsstrahlen- gang 10 bildet insgesamt das Beleuchtungsmuster 18 von der DMD-Matrix 16 in die Fo- kusebene 26 des Mikroskopobjektivs 25 ab. Von der Probe S emittiertes Fluoreszenz- lichts 32 wird mit dem Mikroskopobjektiv 25 aufgenommen und gelangt über denselben Strahlengang, der in dieser Richtung als Detektionsstrahlengang 30 bezeichnet wird, zu- rück bis zum Hauptstrahlteiler 19. Am Hauptstrahlteiler 19 wird das Fluoreszenzlichts 32 transmittiert und wird von der Linse 34 auf die Pixel 36 der SPAD-Kamera D abgebildet. Die DMD-Matrix 16 kann vorteilhaft in etwa pixelgenau oder pixeltreu auf die SPAD-Ka- mera abgebildet werden. Allerdings ist das keine strenge Forderung, weil die Pixelzahlen der DMD-Matrix 16 und der SPAD-Kamera D voneinander abweichen können. Es ist auch möglich, die Messsignale der einzelnen Pixel 36 der SPAD-Kamera D erst nach der Mess- aufnahme zuzuordnen, wenn man alle Pixel 36 der SPAD-Kamera D ausliest. Vorteilhaft kann vor der SPAD-Kamera D ein Mikrolinsen-Array zum Optimieren des Füllfaktors vor- handen sein. Die Aktivierungsmuster der DMD-Matrix 16, also das Beleuchtungsmu- ster 18, und der SPAD-Kamera D, also das Auslesemuster, sind aufeinander abgestimmt und können bevorzugt synchron umgeschaltet werden. Die Synchronisierung kann dabei von der Steuer- und Auswerteeinheit 40 bewerkstelligt werden.
Die DMD-Matrix 16 liegt optisch konjugiert zu Probenebene 26 einerseits und zur Detek- tionsebene der SPAD-Kamera D andererseits, ist aber im reinen Beleuchtungsstrahlen- gang 10, der auch als Anregungsstrahlengang bezeichnet werden kann, angeordnet. Die SPAD-Kamera D dient sowohl als Sensor als auch als schaltbare Pinholematrix, so dass durch gezielte Aktivierung der Sensorpixel 36 und bei entsprechender Dimensionierung der Abbildung Konfokalität erreicht werden kann. Wird die Zoomoptik 20 so eingestellt, dass das volle Sehfeld mit der DMD-Matrix 16 adres- siert werden kann, entspricht ein Teilspiegel der DMD-Matrix 16 je nach verwendetem Objektiv einem Beleuchtungsspot mit einem Durchmesser von 1 bis 2 AU (1 AU = 1 Airy- Unit). Die Abbildung ist in dieser Situation also nicht beugungsbegrenzt und eher geeig- net, um schnelle Übersichtsbilder aufzunehmen. Wird die Zoomoptik so eingestellt, dass mit der DMD-Matrix 16 nur ein Teil, beispielsweise die Hälfte des vollen Sehfelds, ausgeleuchtet wird, werden konfokale Detektion oder Überabtastung der Detektionspunktverteilungsfunktion möglich. Hierzu kann beispiels- weise eine Detektionspunktverteilungsfunktion in der Größe einem Durchmesser von 3 Pixeln entsprechen und somit an 7 Stellen abgetastet werden. Nimmt man Verhältnisse an, wie sie beispielsweise bei SDM (SDM = Spinning Diso Microscopy) üblich sind, liegen zwischen den Maxima der einzelnen Detektionspunktverteilungsfunktionen etwa 5 AU und somit etwa 15 Pixel. Mit einer Sensormatrix mit 512x512 Pixeln könnte man so ca. 900 Detektionspunktverteilungsfunktionen gleichzeitig und jeweils überabgetastet auf- nehmen. Dieses Beispiel dient nur der Illustration der Möglichkeiten. Andere Parameter- kombinationen sind natürlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich. Die Anordnung aus Figur 1 ist im Hinblick auf die schaltbaren Beleuchtungsmuster 18 sehr flexibel. Daraus ergeben sich viele weitere Anwendungsmöglichkeiten. Neben den klassischen, regulären Beleuchtungsmustern 18 können beispielsweise auch zufällig ge- wählte Muster aufgeschaltet werden. Es können Linienprofile definiert und durch sequen- tielle Schaltung der Beleuchtungsmuster 18 über die Probe S gescannt werden. Außer- dem sind gitterartige Beleuchtungsmuster 18 möglich, die mit entsprechender Verrech- nung konfokale Bilddaten liefern. Zudem kann das System aus den gemessenen Daten prinzipiell lernen, wo eine Probe S intensiv, schwach oder gar nicht emittiert und entspre- chend die Belichtungsdauer in diesen Bereichen, also prinzipiell individuell für jedes Pixel 36 der SPAD-Kamera, anpassen. Weil eine Überabtastung der Detektionspunktverteilungsfunktion mit der SPAD-Kamera D grundsätzlich möglich ist, kann auch Fluoreszenzlicht aus mehreren Ebenen der Probe S gleichzeitig gemessen werden, indem man entweder das Verfahren der Wellenfrontko- dierung für eine sogenannte "extended depth of field"-Abbildung verwendet. Beispiels- weise kann hierzu eine kubische Phasenmaske, etwa ein SLM, im Beleuchtungsstrahlen- gang 10 und/oder im Detektionsstrahlengang 30 positioniert werden. Dabei erhält man allerdings prinzipiell nur eine Projektion über einen bestimmten z-Bereich einer Probe S.
Darüber hinaus ist es auch möglich, eine echte Kodierung von verschiedenen Proben- ebenen, also Ebenen der Probe S mit unterschiedlicher z-Koordinate, derart vorzuneh- men, dass diese trennbar sind. Hierzu kann beispielsweise im Beleuchtungsstrahlen- gang 10 und/oder im Detektionsstrahlengang 30 eine helikale Punktverteilungsfunktion oder grundsätzlich auch eine andere geeignete Punktverteilungsfunktion erzeugt und das Signal entsprechend ausgewertet werden.
Das in Figur 2 dargestellte Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikro- skops 200 unterscheidet sich von dem Mikroskop 100 aus Figur 1 nur im Bereich des reinen Beleuchtungsstrahlengangs 10, also im Bereich des Beleuchtungsstrahlen- gangs 10 strahlaufwärts von dem Hauptstrahlteiler 19. Der polarisierende Strahlteiler 13 mit dem Lambda-Viertel-Plättchen 14 und das DMD-Array 16 sind bei dem Mikroskop in Figur 200 durch zwei im Mikroskopbetrieb drehende Scheiben 42, 43 ersetzt. Die dem Laser L im Beleuchtungsstrahlengang 10 zugewandte Scheibe 42 trägt eine Matrix aus Mikrolinsen, die das Laserlicht durch den jeweiligen Mikrolinsen zugeordnete Pinholes auf der im Beleuchtungsstrahlengang 10 strahlabwärts folgenden drehbaren Blenden- scheibe 43 fokussiert. Die drehbare Blendenscheibe 43, die auch als Pinholescheibe be- zeichnet werden kann, befindet sich in einer zur Probenebene 26 optisch konjugierten Ebene 15 und wird über nachfolgende Optiken, die im Wesentlichen der Anordnung aus Figur 1 entsprechen, in die Probenebene 26, also die Fokusebene des Mikroskopobjek- tivs 25, abgebildet.
Die Scheibe 42 mit der Mikrolinsenanordnung und die Blendenscheibe 43 rotieren mit hoher Drehzahl, fester Frequenz und Phasenbeziehung zueinander und rastern somit ein Muster aus Anregungspunkten über die Probe S.
Das in den auf diese Weise beleuchteten Anregungspunkten von der Probe S erzeugte und abgestrahlte Fluoreszenzlicht 32 wird, wiederum wie bei dem Ausführungsbeispiel der Figur 1 , über den Detektionsstrahlengang 30 zurück auf die SPAD-Kamera D abge- bildet. Das Muster der Emissionspunkte oder Emissionsspots bewegt sich demnach syn- chron mit der Drehung der Scheiben 42, 43 über die SPAD-Kamera D. Das Auslesemu- ster, mit dem erfindungsgemäß die SPAD-Kamera D anzusteuern ist, wird mit der Bewe- gung des Beleuchtungsmusters synchronisiert. Die Synchronisierung erfolgt mit dem PC 40, der aus einer bekannten momentanen Position der Scheiben 42, 43 das in die SPAD-Kamera D zu programmierende Auslesemuster, das auch als Aktivierungsmuster oder Aktivierungspattern bezeichnet werden kann, bestimmt. Ein Triggersignal wird dem PC 40 dabei über eine schnelle Photodiode 47 bereitgestellt, welche die Transmission durch eine Blendenöffnung der drehenden Blendenscheibe 43 oder mehrere Blendenöff- nungen, die sich in demselben Abstand von der Drehachse befinden, misst. Hierzu wird ein Teil des Beleuchtungslichts 12 über einen teildurchlässigen Spiegel 44 ausgekoppelt und über eine Blende 46 und über die Scheibe 42 mit der Anordnung von Mikrolinsen auf die drehende Blendenscheibe 43 geleitet. Es ist desweiteren auch möglich, das Licht ei- ner weiteren Laserdiode unabhängig vom übrigen Strahlengang auf die Pinholescheibe zu koppeln.
Die drehende Blendenscheibe 43, durch die in dem Ausführungsbeispiel der Figur 2 die Manipulationseinrichtung 16 verwirklicht ist, liegt, wie die DMD-Matrix 16 bei dem Ausfüh- rungsbeispiel der Figur 1 , in einer Ebene 15, die sowohl zur Probenebene 26 als auch zur Ebene der SPAD-Kamera D optisch konjugiert ist. Wesentlich für die Erfindung ist, dass auch hier die Manipulationseinrichtung 16, also die drehende Blendenscheibe 43, im rei- nen Beleuchtungsstrahlengang oder Anregungsstrahlengang des Mikroskops 200, also im Beleuchtungsstrahlengang 10 strahlaufwärts von dem Hauptstrahlteiler 19, angeord- net ist. Wie bei dem Beispiel der Figur 1 dient die SPAD-Kamera D sowohl als Sensor als auch als schaltbare Pinholematrix, so dass durch gezielte Aktivierung der Pixel 36 und bei geeigneter Dimensionierung der Abbildung, wie oben beschrieben, Konfokalität oder Überabtastung der Detektionspunktverteilungsfunktionen erreicht werden kann.
Anstelle der drehenden Blendenscheibe 43, die mit einer Anordnung von Lochblenden versehen ist, können auch andere Blendengeometrien, wie beispielsweise Schlitze, in ei- ner rotierenden Scheibe genutzt werden. Den Anordnungen der Figuren 1 und 2 ist gemeinsam, dass das von der Probe S zurück- gestrahlte Fluoreszenzlicht 32 nicht wie im Stand der Technik über eine physikalische Lochblende oder ein Pinhole, wie beispielsweise ein Mikrospiegel der DMD-Matrix 16 oder ein reales Pinhole auf der rotierenden Scheibe, zurück auf den Detektor D fokussiert werden muss. Stattdessen wird erfindungsgemäß das von der Probe S zurückgestrahlte Fluoreszenzlicht 32 direkt auf die SPAD-Kamera D abgebildet und es werden in definier- tem zeitlichem Zusammenhang mit dem Beleuchtungsmuster 18 Auslesemuster der SPAD-Kamera D entsprechend dem jeweiligen momentanen Beleuchtungsmuster 18 ak- tiviert. Prinzipiell erhält man so eine elektronisch programmierbare, dynamische Pinhole- matrix, durch die prinzipiell, wenn der Abbildungsmaßstab auf die SPAD-Kamera D ge- eignet dimensioniert oder eine Zoom-Einstellung geeignet gewählt ist, Konfokalität der Datenakquise ermöglicht wird.
Wenn der Abbildungsmaßstab auf die SPAD-Kamera D so gewählt wird, dass eine De- tektionspunktabbildungsfunktion mehrere Pixel 36 der SPAD-Kamera überdeckt, ist eine überabtastende Auswertung der Signaldaten möglich, so dass konfokale Grenzauflösung trotz endlich ausgedehnter Pinholes erreicht wird. In diesem Fall können die Messdaten der SPAD-Kamera entsprechend dem sogenannten Image scanning verrechnet werden.
Wegen der intrinsisch großen Repetitionsrate der SPAD-Kamera D ist hier im Vergleich zum Stand der Technik eine deutliche Steigerung der Bildrate für diese Funktionalität möglich. Weiterhin muss, ebenfalls im Unterschied zum Stand der Technik, die Beleuch- tung nicht stroboskopisch betrieben werden, sondern die Bildrate an sich kann erhöht werden. Das führt zwar zunächst zu sehr kleinen Photonenzahlen pro Pixel im Einzelbild. Die Einzelbilder können dann aber unter Berücksichtigung der jeweiligen Rotationsphase der drehenden Blendenscheibe 43 aufintegriert werden. Wesentlich für die vorliegende Erfindung ist dabei, dass die Integration der Signaldaten nicht auf dem Sensorchip wie bei CCD- und CMOS-Arrays erfolgt, sondern in einem der SPAD-Kamera D nachgeord- neten Zwischenspeicher. In der Regel ist dies eine digitale Integration der gemessenen Photonen-Zählereignisse. Die potentiell sehr kurzen Totzeiten (10 ns -100 ns) einer SPAD-Kamera ermöglichen ultrakurze Integrationszeiten. Die SPAD-Pixel 36 können somit im Geigermodus betrieben werden, in dem einzelne Photonen gezählt werden.
Im Vergleich zur sehr kurzen Auslesezeit der SPAD-Kamera D ist die Bewegung der Scheiben in Abbildung 2 beziehungsweise das Umschalten zwischen verschiedenen Be- leuchtungsmustern 18 in der Anordnung nach Abbildung 1 ein quasi-statischer Vorgang. Demzufolge kann mit Verwendung eines im Pikosekundenbereich gepulsten Lasers das FLIM-Signal der Farbstoffe erfasst werden.
Langsamere Prozesse lassen sich ebenfalls mit Mikroskopen 100 und 200 der Figuren 1 und 2 messen. Laufen solche Vorgänge beispielsweise auf einer mit der Belichtungszeit einzelner Bereiche vergleichbaren Zeitskala ab, also eher im Millisekundenbereich, wie beispielsweise Phosphoreszenz-Prozesse, kann das Auslesemuster auf dem Detektor D auch zeitverzögert gegenüber dem Beleuchtungsmuster aktiviert und der Detektor D ent- sprechend zeitverzögert ausgelesen werden. Man misst in diesem Fall sozusagen das Nachleuchten der Probe S und kann aus den gemessenen Verzögerungen auch Aussa- gen zum Zeitverlauf der betreffenden Vorgänge gewinnen.
Ein drittes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops wird mit Bezug auf Figur 3 erläutert. Das dort gezeigte erfindungsgemäße Mikroskop 300 weist große Ähn- lichkeiten mit dem Mikroskop 100 aus Figur 1 auf. Insbesondere ist der Aufbau des Mikro- skops 300 im Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs 10 strahlaufwärts von dem Haupt- strahlteiler 19 gleich wie bei dem Mikroskop 100 aus Figur 1 , d. h. auch in Figur 3 kommt eine DMD-Matrix 16 zum Einsatz, die in einer zur Zwischenbildebene 29 und zur Proben- ebene 26 optisch konjugierten Ebene 15 angeordnet ist.
Der wesentliche Unterschied des Mikroskops 300 aus Figur 3 im Vergleich zum Mikro- skop 100 aus Figur 1 ist, dass an der Position des Umlenkspiegels 21 in Figur 1 in Figur 3 nunmehr eine Scaneinheit 50 angeordnet ist und dass die in Figur 1 vorhandene Zoom- optik 20 ersetzt ist durch ein Relais-System mit einer Linse 27 und einer Linse 28. Die Scaneinheit 50 kann insbesondere Scanspiegel, beispielsweise galvanometrische Scan- spiegel, aufweisen. Das Beleuchtungsmuster 18 gelangt somit bei dem Ausführungsbei- spiel aus Figur 3 über den Hauptstrahlteiler 19, die Linsen 27, 28, die Scaneinheit 50, die Linsen 22, 24 und das Mikroskopobjektiv 25 auf die Probe S.
Von der Probe S emittiertes Fluoreszenzlicht 32 wird, wie bei den Figuren 1 und 2, mit dem Mikroskopobjektiv 25 eingesammelt und kollimiert. Anschließend wird das Fluores- zenzlicht 32 mit der Scaneinheit 50 auf den descannten Strahlengang abgelenkt, am Hauptstrahlteiler 19 transmittiert und auf die SPAD-Kamera D abgebildet.
Die Scaneinheit 50, die ebenfalls von der Steuer- und Auswerteeinheit 40 angesteuert wird, wird zur Positionierung des Abbilds der DMD-Matrix 16 in der Probenebene 26 ge- nutzt. Dieses Verschieben des Beleuchtungsfelds wird auch als Panning bezeichnet. Da- mit die gesamte Optik des Mikroskops 300 nicht zu komplex und angespannt wird, wird die im descannten Strahlengang übertragbare Feldgröße begrenzt, beispielsweise auf eine Felddiagonale von 2 mm. Der descannte Strahlengang ist derjenige Teil des Detek- tionsstrahlengangs 30 strahlabwärts von der Scaneinheit 50.
Mit solchen Dimensionierungen können Pinholegrößen von 0.2 AU, entsprechend einer fünffachen Überabtastung des Airyscheibchens, bei voller Ausleuchtung der DMD-Ma- trix 16 erreicht werden.
Weil die Größe der einzelnen Mikrospiegel der DMD-Matrix 16 unterhalb der optischen Auflösungsgrenze liegt, sind durch die Strukturierung der DMD-Matrix 16 bewirkte Arte- fakte, die auch als Patternartefakte bezeichnet werden, schon deutlich reduziert. Solche Artefakte können noch weiter reduziert, nämlich verschmiert, werden, wenn die Scanein- heit geringfügig betätigt wird. Dieses wird unten im Zusammenhang mit Figur 4 näher erläutert.
Das Beleuchtungsmuster 18 der DMD-Matrix 16 und das Auslesemuster der SPAD-Ka- mera D sind, wie bei Figur 1 , erfindungsgemäß aufeinander abgestimmt und werden ins- besondere synchron umgeschaltet. Die Synchronisierung erfolgt wiederum durch die Steuer- und Auswerteeinheit 40.
Wie beim Ausführungsbeispiel aus Figur 1 erfolgt die Detektion des Fluoreszenzlichts 32 durch die SPAD-Kamera D, die in einem dedizierten Detektionspfad angeordnet ist. Die SPAD-Kamera D zeichnet sich durch hohe Bildwiederholraten aus, sodass sie im Geiger- Modus zum Zählen einzelner Photonen betrieben werden kann. Bevorzugt werden nur die zur Detektion notwendigen Pixel 36 der SPAD-Kamera D aktiv geschaltet, also vorge- spannt. Dadurch kann das Datenvolumen minimiert und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) verbessert werden. Die Pixel 36 der SPAD-Kamera D sind bevorzugt entsprechend dem durch die DMD-Matrix 16 erzeugten Beleuchtungsmuster 18 aktiv geschaltet. Licht, das außerhalb der aktiv geschalteten Pixel 36 auf die SPAD-Kamera D trifft, wird somit nicht registriert. Die SPAD-Kamera D wirkt deshalb wie eine Kombination aus Sensor- und schaltbarer Pinholematrix. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist, dass das Fluo- reszenzlicht 32 somit auf dem Weg zur SPAD-Kamera D nicht über die Manipulationsein- richtung, also nicht über die DMD-Matrix 16, geleitet wird. Intensitätsverluste bei einer Reflexion an der DMD-Matrix 16 werden deshalb vermieden. Ein Beleuchtungsfeld, das auch als PAM-Subfeld bezeichnet wird (PAM = Programmable Array Mikroscope) kann im Verhältnis zum gesamten adressierbaren Sehfeld des erfin- dungsgemäßen Mikroskops beispielsweise so dimensioniert sein, dass das gesamte adressierbare Sehfeld aus 100 PAM-Subfeldern zusammengesetzt wird. Mit der Scanein- heit 50 wird das PAM-Subfeld geeignet verschoben und positioniert. Das gesamte adres- sierbare Sehfeld, auch als Vollfeld bezeichnet, kann in der Zwischenbildebene 29 zwi- schen Scaneinheit 50 und Mikroskopobjektivs 25 typischerweise eine Diagonale in der Größenordnung von 20mm aufweisen.
Wenn die DMD-Matrix 16 so in das Zwischenbild in der Zwischenbildebene 29 abgebildet wird, dass sie ein Teilfeld mit einer Diagonale von beispielsweise 2 mm adressieren kann, welches dann mit der Scaneinheit 50 an eine gewünschte Position im gesamten adres- sierbaren Sehfeld gesetzt wird, wären zum Abscannen des gesamten adressierbaren Sehfelds 100 Teilbilder notwendig. Wenn das gesamte adressierbare Sehfeld beispiels- weise mit 10 fps (fps = frames per second = Bilder pro Sekunde) gescannt werden soll, bleibt für jedes Teilbild eine Akquisitionsdauer von 1 ms. Wenn jedes Teilfeld beispiels- weise zu 10% mit aktivierten Pixeln gefüllt ist, können die 10 fps ohne Überabtastung immerhin noch mit einer Pixelverweildauer von 100 ps erreicht werden. Bei einer zweifachen Überabtastung, also bei 4 Pixeln pro Detektionspunktverteilungsfunktion erreicht man immerhin noch eine Pixelverweildauer von 25 ps. Würde zum Vergleich mit einem Laser-Scanning-Mikroskop herkömmlich ein Sehfeld gleicher Größe mit einer Dop- pelzeilenrate von 1 kHz gerastert werden, ergäbe sich bei einer Bildrate von nur 3 fps eine Pixelverweildauer von nur 0,65 ps. Wegen des großen und beliebig einstellbaren Paralle- lisierungsgrads kann ein erfindungsgemäßes Mikroskop, das auch als Hybridmikroskop bezeichnet werden kann, sehr probenschonend und dennoch deutlich schneller repetie- rend sein als ein konventionelles Laser-Scannen-Mikroskop.
Zudem kann eine an die Probe angepasste Messung derart erfolgen, dass Bereiche, de- ren SNR bereits hinreichend hoch ist, nicht weiter vermessen und mit Licht belastet wer- den. Hierfür können einerseits Vorgaben des Anwenders als auch geeignete Algorithmen zum Einsatz kommen.
Vorteilhafterweise lassen sich die für ein PAM-Mikroskop typischen Patternartefakte, die aus der Abbildung der DMD-Matrix in die Probenebene und die Ebene des Detektors her- rühren, im erfindungsgemäßen Mikroskop nahezu eliminieren. Zunächst sind diese Patternartefakte bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop nicht so stark ausgeprägt wie bei PAM-Mikroskopen aus dem Stand der Technik, bei denen die DMD-Matrix auf das gesamte Sehfeld dimensioniert ist, weil die Spiegelsubstruktur der DMD-Matrix 16 beim erfindungsgemäßen Mikroskop, also die einzelnen Mikrospiegel, be- vorzugt kleiner ist beziehungsweise sind als der Durchmesser eines Beugungsscheib- chens in der optischen Ebene der DMD-Matrix 16.
Sollten die Patternartefakte dennoch deutlich sichtbar sein, lassen sie sich durch Betäti- gung der Scaneinheit 50, insbesondere also durch Bewegungen der Scanspiegel, wäh- rend der Integrationszeit des Detektors D nahezu komplett eliminieren. Das wird im Zu- sammenhang mit Figur 4 näher erläutert. Das Strichgitter 60 in Figur 4 entspricht dabei der DMD-Matrix 16, wobei die schmalen Streifen 66 die Zwischenräume zwischen den einzelnen Spiegeln der DMD-Matrix 16 darstellen. Diese Zwischenräume sind die eigent- liche Ursache der Patternartefakte. Das Quadrat 61 markiert aktiv geschaltete Teilspiegel und hat eine Kantenlänge, die etwa dem Durchmesser eines Beugungsscheibchens ent- spricht. In den Teilabbildungen b) bis d) wurde die Abbildung des DMD-Arrays 16 in die Probenebene 26 mit der Scaneinheit 50 um jeweils 1/10 des Durchmessers des Airy- scheibchens in x Richtung (Figur 4b) und/oder y-Richtung (Figuren 4c, 4d) verschoben. Über die mit gegeneinander verschobenen Spotpattern aufgenommenen Bilder wird so- dann gemittelt. In der Folge ist die Anregungspunktverteilungsfunktion nur unwesentlich verbreitert und die Substruktur, welche zu den Patternartefakten führt, ist über den Groß- teil der Fläche des Beugungsscheibchens deutlich reduziert.
Genauso wie die einzelnen Mikrospiegel der DMD-Matrix 16 gezielt aktiviert werden kön- nen, können auch die einzelnen Pixel 36 der SPAD-Kamera D aktiviert werden. Dabei ist zum einen möglich, durch die Wahl einer Anzahl zusammenhängender Pixel 36 der SPAD-Kamera D die Größe eines konfokalen Pinholes festzulegen. Das über die aktivier- ten Pixel 36 integrierte Signal des betreffenden Anregungsspots entspricht dann dem In- tensitätswert in einem konfokalen Detektionsmodus. Die aktivierten Pixel 36, über welche das Signal integriert wird, werden in diesem Zusammenhang auch als elektronisches Pin- hole bezeichnet.
Figur 5 zeigt verschiedene Größen eines elektronischen Pinholes im Verhältnis zur Größe der Detektionspunktverteilungsfunktion in der Ebene der SPAD-Kamera D. In allen 3 Teil- abbildungen der Figur 5 ist die Detektionspunktverteilungsfunktion durch eine Kreis- scheibe 74 veranschaulicht. In Figur 5a sind die von dem Quadrat 71 umschlossenen Pixel 36 aktiviert. Das bedeutet, dass in diesem Fall der Durchmesser des Pinholes 1 AU entspricht, also gleich groß ist wie die Ausdehnung der Detektionspunktverteilungsfunk- tion 74. Bei der Situation in Figur 5b ist das durch das Quadrat 72 definierte elektronische Pinhole in seiner linearen Ausdehnung etwa doppelt so groß wie die Detektionspunktver- teilungsfunktion 74. Das elektronische Pinhole 72 ist also größer als 1 AU. Das bedeutet, dass in dieser Situation keine konfokale Auflösung mehr erreicht wird. Allerdings kann trotzdem das Hintergrundlicht aus anderen Ebenen als der Fokalebene effektiv unter- drückt werden. In Figur 5c schließlich ist das durch das Quadrat 73 definierte elektroni- sehe Pinhole kleiner als 1 AU.
Aufgrund der Pixellierung und der großen Bildrate der SPAD-Kamera D ist es auch mög- lich, Substrukturen der Detektionspunktverteilungsfunktionen auszuwerten und durch Entfalten oder Zurückschieben des Signals auf die Zentrumsposition der Punktvertei- lungsfunktion die konfokale Grenzauflösung zu erreichen und die Sensitivität zu erhöhen. Es ist mit dem PAM-LSM zudem möglich, gänzlich andere Strukturierungen des Beleuch- tungslichts einzustellen, als die für das LSM typischen Punktanregungen. Dazu werden die gewünschten Muster auf die DMD-Matrix programmiert. Die Aktivierung der SPAD- Pixel folgt dann analog. Beispielsweise kann das PAM-Subfeld mit einer Linienbeleuch- tung gescannt werden, ohne dass komplexe anamorphotische Optiken verbaut und ju- stiert werden müssen. Damit können sehr hohe Parallelisierungsgrade erreicht werden. Außerdem sind auch strukturierte Gitterbeleuchtungen möglich, die quasikonfokale De- tektionsmodi ermöglichen. Weiterhin ist sogar eine direkte SIM-Beleuchtung möglich, da das Pixelraster der DMD-Matrix kleiner ist als ein Beugungsscheibchen.
Sodann können die Strukturen der Beleuchtungsmuster auch zufällig ausgewählt sein, solange eine Kopplung der DMD-Matrix und des Detektors D stattfindet - beispielsweise über eine Steuereinheit.
Eine wesentliche Anwendung der Erfindung wird die Lebendzellmikroskopie sein, bei wel- cher sehr häufig sogenannte time-lapse-Aufnahmen, also Zeitserienaufnahmen, gemacht werden. Insbesondere dort sind phototoxische Effekte problematisch. Die hier beschrie- bene Anordnung ist aber insbesondere sehr gut geeignet, die Belichtung späterer Auf- nahmen in einer Zeitserie derart zu optimieren, dass Bereiche, die keine leuchtenden Strukturen enthalten, in nachfolgenden Aufnahmen nicht mehr beleuchtet werden. Hierzu kann die Steuer- und Auswerteeinheit durch geeignete Algorithmen automatisch Bereiche erkennen, welche keine Information, sondern nur Dunkelrauschen enthalten. In nachfol- genden Aufnahmen werden nur die Bereiche mit Bildinformation beleuchtet, oder gege- benenfalls noch ein kleiner Bereich um diese herum. Zudem kann das System auch Ab- schätzungen darüber treffen, in welchen Bereichen zukünftiger Bilder eine Information zu erwarten ist. Hierzu kann zum Beispiel eine Bewegung, die eine Probe oder ein Teil einer Probe ausführt, extrapoliert werden. Eine Anwendung könnte hierbei zum Beispiel die Bewegung von Vesikeln darstellen. Hierbei muss dann sowohl das Schaltmuster auf dem DMD und dem SPAD-array wie auch die Scannergeschwindigkeit und gegebenenfalls die Laserleistung angepasst werden.
Für diese Berechnungen können klassische Verfahren oder aber auch Algorithmen aus dem Bereich des Machine learning Anwendung finden. Hierbei ist auch vorstellbar, dass der Nutzer dem System am Anfang einer solchen Zeitreihe hilft, zu lernen (durch eine sogenannte Annotation). Im Ergebnis hat man also hier nicht nur ein steuerndes System, sondern ein geregeltes System mit einer selbstlernenden Rückkopplung.
Die SPAD-Kamera kann derart gestaltet sein, dass eine Zeitauflösung im Bereich von Pikosekunden erreicht werden kann. Dies ermöglicht eine zeitaufgelöste Aufnahme, mit welcher die bildhafte Darstellung des Fluoreszenzabklingverhaltens oder der sogenann- ten Fluoreszenzlebensdauern möglich ist. Diese Option hat man bei allen oben beschrie- benen Varianten der Bildaufnahme.
SPAD-Kameras erlauben durch die sehr hohen Aufnahmeraten bei sehr kurzen Belich- tungszeiten auch, verschiedene Verfahren der hochauflösenden Mikroskopie zu nutzen. So ist z.B. bekannt, dass Verfahren wie PALM und d-STORM sowie auch SOFI basierend auf dem Blinkverhalten von Standardfluorophoren mit Sensoren dieser Art möglich wird. Gerade eine Anordnung wie die oben beschriebene Anordnung erlaubt jetzt, diese Ver- fahren besonders probenschonend zu implementieren, da gerade hier eine lokal ange- passte Beleuchtung von Vorteil ist.
Neben der reinen Bildgebung kann das erfindungsgemäße Mikroskop aber auch vorteil- haft verwendet werden für Verfahren, bei denen eine Bildgebung mit einer optischen Ma- nipulation der Probe kombiniert wird, wie sie zum Beispiel in der Optogenetik immer häu- figer zum Einsatz kommen. Das erfindungsgemäße Mikroskop erlaubt das freie Schalten eines Beleuchtungsmusters und eines Auslesemusters.
Das Beleuchtungsmuster 18 und das Auslesemuster können, wie oben beschrieben, prin- zipiell synchron zueinander geschaltet werden, sodass Orte auf einer Probe S, welche durch das Beleuchtungsmuster 18 beleuchtet werden, auch gleichzeitig ausgelesen wer- den.
Wenn die Probe S optisch manipuliert werden soll, so möchte man die Bereiche, welche während eines Manipulationsvorgangs, beispielsweise einem Aufschalten von Kanälen in Channelrhodopsin mit einer bestimmten Wellenlänge in bestimmten Bereichen der Probe, in diesen Bereichen zu dieser Zeit nicht detektieren. Allerdings will man mit einem Zeit versatz, der möglichst eine Millisekunde nicht deutlich überschreiten sollte, die Reaktion der Probe auf diese Manipulation beobachten. DMDs erlauben Schaltgeschwindigkeiten bis in den kHz-Bereich. SPAD-Kameras können sogar noch schneller geschaltet werden. Weil SPAD-Kameras robust sind bei Betrieb in Sättigung kann man anstelle eines Ab- schaltens von Pixeln 36 auch im Nachgang noch diejenigen Signale entfernen, die nicht der Bildgebung dienen, sondern aus der Manipulationsstrahlung resultieren. Neben der optogenetischen Manipulation können natürlich auch weitere Manipulationsverfahren, wie FRAP, realisiert werden.
Für den beschriebenen Anwendungsfall einer kombinierten Manipulation/Bildgebung kann es von Vorteil sein, die Manipulationseinrichtung 16, insbesondere die DMD-Matrix, nicht mit einem homogenen Laserlichtfeld zu beleuchten, sondern eine weitere lichtfor mende Einheit vorzuschalten, die das Licht auf der Manipulationseinrichtung 16 so vor- formt, dass Bereiche der Manipulationseinrichtung 16, welche zur Manipulation genutzt werden sollen, intensiver beleuchtet werden als Bereiche, die nur zur Beobachtung ge- nutzt werden. Durch die Erfindung wird also eine für die Anwendung der optischen Mani- pulation/Bildgebung einer Probe besonders gut geeignete Vorrichtung zur Verfügung ge- stellt. Zudem kann es vorteilhaft sein, wenn eine polychromatische Beleuchtung einer Probe S vorgenommen wird, bei der beispielsweise ein Aktivierungslaser, typischerweise sehr kurzwellig mit Wellenlängen unterhalb von 450 nm, mittels der vorgeschalteten Strahlfor- mungseinheit auf wenige Punkte im Bildfeld kondensiert wird, während ein Anregungsla- ser die Manipulationseinrichtung 16, insbesondere die DMD-Matrix 16, großflächig aus- leuchtet. Bezugszeichenliste
10 Beleuchtungsstrahlengang
1 1 beugendes optisches Element
12 Beleuchtungslicht
13 polarisierender Strahlteiler
14 Lambda-Viertel-Plättchen
15 zur Probenebene optisch konjugierte Ebene
16 ansteuerbaren Manipulationseinrichtung
17 Kollimationslinse
18 Beleuchtungsmusters
19 Hauptstrahlteiler
20 Zoomoptik
21 Umlenkspiegel
22 Linse
24 Tubuslinse
25 Mikroskopobjektiv
26 Probenebene
27 Relaislinse
28 Relaislinse
29 Zwischenbildebene
30 Detektionsstrahlengang
32 von Probe S abgestrahltes Fluoreszenzlicht 34 Linse
36 Pixel des Detektors
40 Steuer- und Auswerteeinheit
42 drehbares Mikrolinsen-Array
43 drehbare Blendenscheibe
44 Auskoppelspiegel
45 Umlenkspiegel 46 Blende
47 Fotodiode
50 Scaneinheit
60 Strichgitter
61 aktive geschaltete Teilspiegel
66 Streifen entsprechend Zwischenräumen zwischen Mikrospiegeln
71 Detektionspinhole = 1 AU
72 Detektionspinhole größer als 1 AU
73 Detektionspinhole kleiner als 1 AU
100 erfindungsgemäßes Mikroskop
200 erfindungsgemäßes Mikroskop
300 erfindungsgemäßes Mikroskop
D Detektor
L Lichtquelle
S Probe
x, y Koordinatenrichtungen

Claims

Patentansprüche
1. Mikroskop
mit einer Lichtquelle (L) zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht (12), mit einer ansteuerbaren Manipulationseinrichtung (16) zum variablen Erzeugen eines auszuwählenden Beleuchtungsmusters (18) des Beleuchtungslichts (12), mit einem Beleuchtungsstrahlengang (10) mit einem Mikroskopobjektiv (25) zum Leiten des Beleuchtungsmusters (18) auf eine zu untersuchende Probe (S), mit einem Detektor (D) mit einer Vielzahl von Pixeln (36) zum Nachweisen von von der Probe (S) abgestrahltem Fluoreszenzlicht (32),
mit einem Detektionsstrahlengang (30) zum Leiten des von der Probe (S) abge- strahlten Fluoreszenzlichts (32) auf den Detektor (D),
mit einem Hauptstrahlteiler (19) zum Trennen von Beleuchtungslicht (12) und Fluoreszenzlicht (32),
mit einer Steuer- und Auswerteeinheit (40) zum Ansteuern der Manipulationsein- richtung (16) und zum Auswerten der von dem Detektor (D) gemessenen Daten, dadurch gekennzeichnet,
dass die Manipulationseinrichtung (16) im Beleuchtungsstrahlengang (10) strahl- aufwärts von dem Hauptstrahlteiler (19) in der Nähe einer zu einer Proben- ebene (26) optisch konjugierten Ebene (15) angeordnet ist,
dass die Pixel (36) des Detektors (D) mit der Steuer- und Auswerteeinheit (40) einzeln und in auszuwählenden Auslesemustern aktivierbar sind und
dass die Steuer- und Auswerteeinheit (40) eingerichtet ist zum Aktivieren von Pi- xeln (36) des Detektors (D) einzeln oder in einem ausgewählten Auslesemuster abhängig von einem ausgewählten Beleuchtungsmuster (18).
2. Mikroskop nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Manipulationseinrichtung (16) zum Erzeugen eines auszuwählenden Be- leuchtungsmusters (18) eine Vielzahl von Pixeln aufweist.
3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Manipulationseinrichtung (16) ein digitales Mikrospiegelarray (DMD) auf- weist.
4. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Manipulationseinrichtung (16) einen räumlichen Lichtmodulator (SLM) aufweist.
5. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Manipulationseinrichtung (16) zum variablen Erzeugen eines Beleuch- tungsmusters (18) eine drehbare Blendenscheibe (43) aufweist.
6. Mikroskop nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die drehbare Blendenscheibe (43) eine Vielzahl von spiralförmig, insbeson- dere in Form von Archimedes-Spiralen, angeordneten Lochblenden aufweist und insbesondere eine Nipkow-Scheibe ist.
7. Mikroskop nach Anspruch 5 oder 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass die drehbare Blendenscheibe (43) eine Vielzahl von Schlitzen aufweist.
8. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass strahlaufwärts von der drehbaren Blendenscheibe (43) ein Mikrolinsen-Ar- ray (42) vorhanden ist, welches Beleuchtungslicht (12) auf die Blendenöffnungen der Blendenscheibe (43) fokussiert und welches im Betrieb mit gleicher Ge- schwindigkeit wie die Blendenscheibe (43) rotiert.
9. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Steuer- und Auswerteeinheit dazu eingerichtet ist, ein Auslesemuster des Detektors (D) mit einem durch die sich drehende Blendenscheibe (43) er- zeugten Beleuchtungsmuster (18) zu synchronisieren.
10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass zum Synchronisieren einer Ansteuerung des Detektors (D) mit einer Bewe- gung der drehbaren Blendenscheibe (43) eine Fotodiode zum Messen einer inter- mittierenden Lichttransmission durch oder einer intermittierenden Lichtreflexion von der drehbaren Blendenscheibe (43) vorhanden ist.
1 1. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Detektor (D) ein SPAD-Array oder eine SPAD-Kamera aufweist.
12. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass strahlaufwärts vor dem Detektor (D) ein Mikrolinsenarray vorhanden ist.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Detektionsstrahlengang (30) strahlabwärts von dem Hauptfarbteiler (19) mindestens ein Emissionsfilter, insbesondere eine Wechseleinrichtung mit meh- reren Emissionsfiltern, vorhanden ist.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine bestimmte Gruppe von Pixeln der Manipulationseinrichtung (16) auf eine festgelegte Gruppe von Pixeln des Detektors (D) abgebildet wird oder dass jedes Pixel der Manipulationseinrichtung (16) auf eine festgelegte Gruppe von Pixeln des Detektors (D) abgebildet wird oder
dass eine bestimmte Gruppe von Pixeln der Manipulationseinrichtung (16) auf ein bestimmtes Pixel des Detektors (D) abgebildet wird oder
dass jedes Pixel der Manipulationseinrichtung (16) auf genau ein Pixel (36) des
Detektors (D) abgebildet wird.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Steuer- und Auswerteeinheit (40) dazu eingerichtet ist, den Detektor (D), insbesondere synchron, mit einem dem ausgewählten Beleuchtungsmuster (18) entsprechenden Auslesemuster anzusteuern.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Steuer- und Auswerteeinheit (40) dazu eingerichtet ist, den Detektor (D) zeitversetzt zu einem auf die Probe (S) gestrahlten Beleuchtungsmuster (18) mit einem Auslesemuster anzusteuern.
17. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Steuer- und Auswerteeinheit (40) dazu eingerichtet ist, die Manipulati- onseinrichtung (16) zum Scannen von Beleuchtungsmustern (18), insbesondere Punktmustern, Linienmustern oder gitterartigen Mustern, über die Probe (S) an- zusteuern.
18. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass zwischen dem Hauptstrahlteiler (19) und dem Mikroskopobjektiv (25) und/oder zwischen der Manipulationseinrichtung (16) und dem Hauptstrahltei- ler (19) und/oder zwischen dem Hauptstrahlteiler (19) und dem Detektor (D) eine Zoomoptik (20) vorhanden ist.
19. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
dass zum lateralen Verschieben des Beleuchtungsfelds eine Scaneinheit (50), insbesondere mit galvanometrischen Scannerspiegeln, vorhanden ist.
20. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Beleuchtungsstrahlengang (10) strahlaufwärts von dem Hauptstrahltei- ler (19) ein polarisierender Strahlteiler (13) und ein Lambda-Viertel-Plättchen (14) vorhanden sind.
21. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 20,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Beleuchtungsstrahlengang (10) ein TIR-Prisma vorhanden ist.
22. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 21 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Beleuchtungsstrahlengang (10) strahlaufwärts von dem Hauptfarbtei- ler (19) mindestens ein Anregungsfilter, insbesondere eine Wechseleinrichtung mit verschiedenen Anregungsfilter, vorhanden ist.
23. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 22,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Beleuchtungsstrahlengang zum Homogenisieren eines Profils des Be- leuchtungslichts, insbesondere unmittelbar strahlabwärts von der Lichtquelle ein beugendes optisches Element (21 ) vorhanden ist.
24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass strahlaufwärts vor der Manipulationseinrichtung (16) eine weitere lichtfor mende Einheit, insbesondere ein räumlicher Lichtmodulator (SLM), vorhanden ist.
25. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 24,
dadurch gekennzeichnet,
dass strahlaufwärts von der weiteren lichtformenden Einheit mindestens ein Farb- teiler vorhanden ist zum Leiten von ausgewählten Wellenlängen zu der weiteren lichtformenden Einheit.
26. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 25,
dadurch gekennzeichnet,
dass zum optischen Manipulieren der Probe (S) mindestens eine separate Licht- quelle vorhanden ist.
27. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 26,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Beleuchtungsstrahlengang (10), insbesondere in einer zur hinteren Pu- pille des Mikroskopobjektivs (25) optisch konjugierten Ebene, ein Mittel zur Wel- lenfrontmodulation, insbesondere ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) vorhanden ist.
28. Verfahren zur Mikroskopie, bei dem
Beleuchtungslicht (12) von einer Lichtquelle (L) bereitgestellt wird,
mit einer ansteuerbaren Manipulationseinrichtung (16) zum variablen Erzeugen eines auszuwählenden Beleuchtungsmusters (18) des Beleuchtungslichts (12) ein Beleuchtungsmuster (18) erzeugt wird,
das Beleuchtungsmuster (18) über einen Beleuchtungsstrahlengang (10) mit ei- nem Mikroskopobjektiv (25) auf eine zu untersuchende Probe (S) geleitet wird, von der Probe (S) abgestrahltes Fluoreszenzlicht (32) über einen Detektions- strahlengang (30) auf einen Detektor (D) mit einer Vielzahl von Pixeln (36) gelei- tet und mit dem Detektor (D) nachgewiesen wird,
Beleuchtungslicht (12) und Fluoreszenzlicht (32) mit einem Hauptstrahlteiler (19) getrennt werden,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Manipulationseinrichtung (16) strahlaufwärts von dem Hauptstrahltei- ler (19) in der Nähe einer zu einer Probenebene (26) optisch konjugierten
Ebene (15) angeordnet ist und
dass die Pixel (36) des Detektors (D) abhängig von einem ausgewählten Be- leuchtungsmuster (18) einzeln oder in einem ausgewählten Auslesemuster akti- viert werden.
29. Verfahren nach Anspruch 28,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Detektor (D), insbesondere synchron, mit einem Auslesemuster ange- steuert wird, welches dem von der Manipulationseinrichtung (16) erzeugten Be- leuchtungsmuster (18) entspricht.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Detektor (D) zeitversetzt zu einem auf die Probe (S) gestrahlten Be- leuchtungsmuster (18) mit einem Auslesemuster angesteuert wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Detektor (D) einen photonenzählenden Sensor, insbesondere eine SPAD-Kamera, aufweist, dessen beziehungsweise deren Pixel im Geiger-Modus betrieben werden, und
dass von dem Detektor digitale Zählwerte, die Photonendetektionsereignissen entsprechen, ausgelesen werden.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass Belichtungszeiten für einzelne Pixel (36) des Detektors (D) spezifisch einge- stellt werden.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Belichtungszeiten für einzelne Pixel (36) des Detektors (D) in Abhängig- keit von von der Probe (S) gewonnenen Messdaten eingestellt werden.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 33,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Detektionspunktverteilungsfunktion auf dem Detektor (D) mehr als ein Pixel, insbesondere mehr als 5 Pixel, beleuchtet.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 34,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Einstellung der Zoomoptik (20) gewählt wird, bei der die Manipulations- einrichtung (16), insbesondere eine DMD-Matrix, auf ein volles Sehfeld abgebil- det wird.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 35,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Einstellung der Zoomoptik (20) gewählt wird, bei der die Manipulations- einrichtung (16), insbesondere eine DMD-Matrix, auf einen Teil eines Sehfelds abgebildet wird.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 36,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Beleuchtungsfeld mit einer Scaneinheit (50) lateral verschoben wird.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 37,
dadurch gekennzeichnet,
dass mit der Manipulationseinrichtung (16) Scans mit einer Punkt-, Linien- oder Gitterbeleuchtung durchgeführt werden.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 38,
dadurch gekennzeichnet, dass die Scaneinheit (50) während einer Integrations- zeit des Detektors (D) geringfügig betätigt wird.
40. Verfahren nach einem der Anspruch 39,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Beleuchtungsfeld zwischen einzelnen aufzusummierenden Bildern mit der Scaneinheit (50) um einen Bruchteil eines Airy-Scheibchens, insbesondere um 1 % bis 50 %, bevorzugt 3 % bis 30 % und besonders bevorzugt 5 % bis
15 % eines Airy-Scheibchens, lateral bewegt wird.
41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Beleuchtungsfeld zwischen einzelnen aufzusummierenden Bildern in zwei unabhängigen Koordinatenrichtungen (x, y) bewegt wird.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 41 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass im Anschluss an eine optische Anregung und/oder Manipulation der
Probe (S) zeitaufgelöste Messungen durchgeführt werden.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 42,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Laser (L) gepulst betrieben wird.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 43,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Bewegung, die eine Komponente einer, insbesondere biologischen, Probe (S) durchführt, extrapoliert wird.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 44,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine SIM-Beleuchtung der Probe (S) durchgeführt wird.
46. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 45,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Probe (S) polychromatisch beleuchtet wird.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 46,
dadurch gekennzeichnet,
dass PALM-, d-STORM-, SOFI- oder FRAP-Verfahren durchgeführt werden.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 47,
dadurch gekennzeichnet,
dass Bereiche einer Probe (S) nicht mehr mit Beleuchtungslicht beaufschlagt werden, sobald in diesen Bereichen in einem aufgenommenen Bild ein bestimm- ter Wert für ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis erreicht ist.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 42 bis 48,
dadurch gekennzeichnet,
dass durch Auswertung von Detektionszeiten einzelner Photonen Fluoreszenzle- bensdauern der emittierenden Farbstoffe bestimmt werden.
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