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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Multispot-Laser-Scanning Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
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Ein solches Mikroskop ist beispielsweise in
DE 10 2004 034 991 A1 beschrieben und weist folgende Komponenten auf: Eine Lichtquelle zum Aussenden von Anregungslicht, Optikmittel zum Leiten des Anregungslichts in einem Anregungsstrahlengang zu einer Probe und zum Leiten von von der Probe kommendem Detektionslicht in einem Strahlengang zu einer Detektionseinheit. Die Optikmittel weisen dabei mindestens folgende Komponenten auf: Auftrennmittel zum Auftrennen des Anregungslichts in mehrere Beleuchtungsstrahlenbündel, einen Hauptfarbteiler zum Auftrennen von Anregungslicht und von der Probe kommendem Detektionslicht, einen Scanner zum Abrastern der Probe mit den Beleuchtungsstrahlenbündeln, ein Mikroskopobjektiv zum gleichzeitigen Leiten der verschiedenen Beleuchtungsstrahlenbündel auf jeweils verschiedene Probenbereiche der Probe und zum Zurückstrahlen des von den verschiedenen Probenbereichen zurückgestrahltem Detektionslichts zu der Detektoreinheit und eine Teleskop zum Ausgleichen von Ungenauigkeiten der Strahlformung der Detektoroptik, welches in dem Anregungsstrahlengang vor dem Hauptstrahlteiler dergestalt angeordnet ist, dass das Anregungslicht zuerst eine erste Teleskoplinse und danach eine zweite Teleskoplinse durchläuft. Schließlich weist ein gattungsgemäßes Multispot-Scanning-Mikroskop die vorhin erwähnte Detektoreinheit auf, die zum getrennten Nachweisen von Detektionslicht, das von verschiedenen Probenbereichen zurückgestrahlt wird, mindestens eine der Anzahl der Beleuchtungslichtbündel entsprechende Anzahl von Detektoren aufweist, vor denen die Detektoroptik angeordnet ist.
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Weitere Anordnungen, bei denen Teleskope im Strahlengang eines Mikroskops verwendet werden sind in
DE 10 2009 004 741 A1 ,
EP 0 723 834 B1 und
DE 26 03 455 A1 beschrieben. Bei den in
DE 10 2004 034 991 A1 und
DE 10 2009 004 741 A1 beschriebenen Teleskopen werden zur Einstellung der Vergrößerung und zum Konstanthalten der Fokus- und Pupillenlage drei Linsengruppen bewegt. Nachteilig ist dabei der vergleichsweise komplizierte Aufbau, der mechanisch die Bewegungen von drei Komponenten erfordert. Bei dem in
EP 0 723 834 B1 beschriebenen Aufbau muss zwar nur eine einzige optische Komponente bewegt werden. Die Lage des Brennpunkts bleibt auch dort durch geeigneten optischen Ausgleich nahezu konstant. Nachteilig ist aber, dass die Pupillenlage nicht konstant ist.
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Dies trifft auch auf die in
DE 26 03 455 A1 offenbarte Vorrichtung zu, wobei dort aber eine konstante Pupillenlage nicht gefordert ist.
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US 6 028 306 A offenbart im Zusammenhang mit
12 ein Scanning-Mikroskop, bei dem im Strahlengang eine Zoom-Einheit vorhanden ist.
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EP 1 975 672 A1 betrifft ebenfalls ein Scanning-Mikroskop. In
3 ist dort ein Strahlengang mit einer Zoom-Einheit 32 gezeigt.
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WO 2008 / 032 055 A1 offenbart im Zusammenhang mit den
6 und
7 bezieht sich auf Relay-Anordnungen mit optischen Zusatzkomponenten insbesondere zur Korrektur von Farbfehlern.
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Zur Beschleunigung der Bildaufnahme kann bei einem Multispot-Scanning-Mikroskop eine Probe zeitgleich mit einer Mehrzahl, beispielsweise vier, Beleuchtungsspots abgerastert werden. Diese Mehrzahl von Beleuchtungsspots kann erzeugt werden, indem der einkommende Beleuchtungsstrahl mit Hilfe von Strahlteilern auf vier Bündel aufgeteilt wird. Diese können dann mit einem Teleskop auf die Scanner des Scanning-Mikroskops abgebildet werden. Das Teleskop hat dabei die Aufgabe, den Querschnitt der Lichtbündel an die Erfordernisse des Scanning-Mikroskops anzupassen, wobei gleichzeitig damit auch ein Abstand der verschiedenen Beleuchtungsspots in einer Feldebene festgelegt wird. Aufgrund von Ungenauigkeiten der Abbildungsoptiken, die nicht sowohl vom Anregungs- als auch vom Detektionslicht durchlaufen werden, beispielsweise eine Optik vor den Detektor-Pinholes und einiger Umlenkspiegel, kann es zu Abweichungen des Abstands der Beleuchtungsspots in einer Ebene der Pinholes kommen. Um beispielsweise vier Pinholes mit einer lateralen Genauigkeit von etwa 10% des Durchmessers eines Beugungsscheibchens zu treffen, dürfte die Brennweite der Pinholeoptik nur eine Ungenauigkeit von etwa 0,3 % aufweisen. Auch die Umlenkspiegel dürften keinerlei Krümmung aufweisen.
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Als eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, ein Multispot-Scanning-Mikroskop bereitzustellen, bei dem mit möglichst einfachen Mitteln ein Abstand der Beleuchtungsspots justiert werden kann.
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Diese Aufgabe wird durch das Multispot-Scanning-Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
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Das Multispot-Scanning-Mikroskop der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass das Teleskop eine optische Baugruppe aufweist, die in einer Zwischenbildebene der ersten Teleskoplinse und der zweiten Teleskoplinse positioniert ist, dass eine Brechkraft φ der optischen Baugruppe folgender Bedingung genügt:
wobei φ
2 eine Brechkraft der zweiten Teleskoplinse und g der Abstand der zweiten Teleskoplinse zu einer Pupille des Anregungsstrahlengangs ist.
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Für den Abstand der Pupille von dem Teleskop ist die Pupillenlage, also die Position der Pupille auf dem Strahlengang, wichtig. Die Größe der Pupille spielt dabei keine Rolle.
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Eine Pupille soll für die vorliegende Anmeldung wie in der Optik üblich definiert sein. Demnach ist eine Pupille ein Ort auf der optischen Achse, in dem sich alle Teilstrahlbündel schneiden. Nach einer äquivalenten Definition ist jede Abbildung einer Blende eine Pupille. Die Lage eines solchen Bilds einer Blende im Strahlengang ist dann entsprechend die Pupillenlage.
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Als ein Grundgedanke der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, anstelle eines festen Teleskops im Anregungsstrahlengang des Multispot-Scanning-Mikroskops ein Zoom-Teleskop zu verwenden. Damit kann mit einfachen Mitteln der Abstand der Beleuchtungsspots eingestellt werden ohne dass hierzu eine komplizierte Strahlteilerbaugruppe notwendig ist. Insbesondere besteht für die Justage nur ein einziger Freiheitsgrad, nämlich die Einstellung des Zoom-Teleskops, so dass auch das Justieren als solches einfach ist.
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Als weiterer wesentlicher Vorteil wird durch das erfindungsgemäße Multispot-Scanning-Mikroskop erreicht, dass sowohl die Fokus- als auch die Pupillenlage über den Zoombereich sehr gut konstant bleiben.
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Bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Multispot-Scanning-Mikroskops werden im Folgenden, insbesondere mit Bezug auf die abhängigen Ansprüche sowie die beigefügten Figuren beschrieben.
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Die Pupille des Strahlengangs, zu welcher der Abstand g der zweiten Teleskoplinse gemessen wird, ist bevorzugt die dem Teleskop nächstgelegene Pupille zwischen Teleskop und Mikroskopobjektiv. Diese Pupille kann beispielsweise eine Austrittspupille des Teleskops oder eine Eintrittspupille von optischen Komponenten sein, die dem Teleskop im Strahlengang nachgeordnet sind. Insbesondere kann das Teleskop so positioniert werden, dass die Austrittspupille des Teleskops mit der Eintrittspupille der nachfolgenden Komponenten zusammenfällt.
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Die erfindungsgemäß vorhandene optische Baugruppe kann beispielsweise eine Einzellinse sein. Diese Ausführungsform ist wegen ihrer Einfachheit bevorzugt.
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Sodann kann die optische Baugruppe mindestens zwei Linsen aufweisen, wobei es sich insbesondere um genau zwei insbesondere identische Linsen handeln kann.
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Vorteilhaft ist hierbei, dass die Positionierung einer optischen Komponente in einer Zwischenbildebene vermieden werden kann.
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Die Linsen der optischen Baugruppe können starr aneinander gekoppelt sein.
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Bei einer weiteren bevorzugten Variante kann die optische Baugruppe zusätzlich einen Achromat zur Korrektur von Farbfehlern aufweisen. Darüber hinaus können zur Korrektur von Öffnungsfehlern und/oder Feldfehlern weitere Linsen vorhanden sein.
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Besonders zweckmäßig sind vor den Detektoren konfokale Blenden angeordnet, so dass das Multispot-Scanning-Mikroskop ein konfokales Mikroskop ist, mit allen, prinzipiell bekannten Vorteilen und Eigenschaften.
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Anregungslicht im Sinn der hier beschriebenen Erfindung ist elektromagnetische Strahlung, wobei insbesondere die infraroten, sichtbaren und ultravioletten Teile des Spektrums gemeint sind. Als Lichtquellen können prinzipiell alle Strahlungsquellen verwendet werden, die die erforderliche elektromagnetische Strahlung mit der gewünschten Intensität bereitstellen. Besonders bevorzugt werden Laser verwendet. Prinzipiell können aber auch Leuchtdioden oder andere Leuchtmittel verwendet werden.
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Als konfokal wird eine Blende bezeichnet, wenn sie in oder in der Nähe einer konfokalen Ebene positioniert ist. Unter einer konfokalen Ebene wird eine zu einer probenseitigen Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierte Ebene des Detektionsstrahlengangs bezeichnet. Eine konfokale Blende vor einem Detektor beschränkt die Lichtaufnahme dieses Detektors auf ein kleines Zielvolumen am Probenort.
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Als Detektoren können prinzipiell alle Detektoren verwendet werden, welche für die nachzuweisende elektromagnetische Strahlung hinreichend empfindlich sind und ein ausreichend gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufweisen. Grundsätzlich können Halbleiterdetektoren hierfür verwendet werden. Weil bei dem Haupteinsatzbereich der Fluoreszenzmikroskopie die Zählraten vergleichsweise klein sind, werden aber sehr häufig Photomultiplier verwendet.
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Das erfindungsgemäß vorhandene Teleskop kann insbesondere ein Kepler-Teleskop sein. Dadurch wird gewährleistet, dass sich die Beleuchtungsstrahlenbündel in der Pupille des Scanners schneiden und demgemäß eine gemeinsame Pupillenlage aufweisen.
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Besonders bevorzugt kann außerdem der Scanner mit dem Abstand g zu der zweiten Teleskoplinse positioniert sein.
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Die Vorteile der vorliegenden Erfindung, insbesondere die Konstanz der Fokus- und Pupillenlage können in besonderer Weise bei einer Ausgestaltung der Erfindung erreicht werden, bei der der Zoombereich des Teleskops sehr klein ist. Insbesondere kann durch die optische Baugruppe eine Vergrößerung des Teleskops um weniger als 15 %, bevorzugt weniger als 10 % und besonders bevorzugt weniger als 5 %, veränderbar sein.
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Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten Figuren erläutert. Hierin zeigt:
- 1: ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Multispot-Scanning-Mikroskops;
- 2: ein Detail des Mikroskops aus 1;
- 3: ein weiteres Detail aus 1; und
- 4: eine Variante der in 3 dargestellten Situation.
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Ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Multispot-Scanning-Mikroskops 100 wird mit Bezug auf 1 erläutert. Als wesentliche Komponenten weist das dort gezeigte Mikroskop 100 eine Lichtquelle 10, sowie Optikmittel 20, 30, 40, 48, 60 auf zum Leiten von Anregungslicht 12 in einem Anregungsstrahlengang A zu einer Probe 70 und zum Leiten von von der Probe 70 kommendem Detektionslicht 54, 56, 58 in einem Detektionsstrahlengang D zu einer Detektionseinheit 90.
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Die Optikmittel beinhalten im Einzelnen Auftrennmittel 20, die auch als Auftrenneinrichtung bezeichnet werden können, zum Auftrennen des Anregungslichts 12 in mehrere Beleuchtungsstrahlenbündel 14, 16, 18.
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Sodann ist ein Teleskop 30 vorhanden, welches zwischen der Auftrenneinrichtung 20 und einem Hauptfarbteiler 40 positioniert ist und als wesentliche Komponenten eine erste Teleskoplinse 32, eine zweite Teleskoplinse 36 und die erfindungsgemäß vorhandene optische Baugruppe 34 aufweist.
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Über das Teleskop 30 und den Hauptfarbteiler 40 gelangt das Anregungslicht 12 in mehreren Beleuchtungsstrahlenbündeln 14, 16, 18 auf einen Scanner 48, der in einer Pupille des Anregungsstrahlengangs positioniert ist. Diese Pupille hat im Anregungsstrahlengang A einen Abstand g von der zweiten Teleskoplinse 36. Zu beachten ist dabei, dass der Abstand g dabei als Wegstrecke im optischen Anregungsstrahlengang A zu verstehen ist, mit anderen Worten also an dem Hauptfarbteiler um 90° abgelenkt wird. Dieser Abstand oder Weg ist in 1 schematisch als Linie h zwischen der zweiten Teleskoplinse 36 und dem Scanner 48 eingetragen und liegt auf der Symmetrieachse des Anregungsstrahlengangs A. An dem Hauptfarbteiler 40 wird, wie aus 1 ersichtlich, dieser Weg h von der zweiten Teleskoplinse 36 kommend, um 90° in Richtung des Scanners 48 abgelenkt. Die Gesamtlänge g des Wegs h ergibt sich, wie in 1 ebenfalls schematisch dargestellt, als Summe der Teilstrecken g1 und g2, das heißt g = g1 + g2.
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Die Beleuchtungsstrahlenbündel 14, 16, 18 werden durch den Scanner 48 nochmals um einen Winkel von etwa 90° abgelenkt und gelangen über eine Mikroskopoptik, die mindestens ein Mikroskopobjektiv 60 aufweist, auf eine Probe 70 und werden dort als Beleuchtungsspots 24, 26, 28 auf Probenbereiche 74, 76, 78 fokussiert. Zwischen dem Scanner 48 und dem Mikroskopobjektiv 60 befinden sich noch weitere strahlformende optische Komponenten, die in 1 nicht dargestellt sind, insbesondere eine Scanoptik. Das ist in 2 im Detail dargestellt. Als Antwort oder Response auf diese Bestrahlung durch die Beleuchtungsstrahlenbündel 14, 16, 18 strahlen die Probenbereiche 74, 76, 78 Detektionslicht 54, 56, 58 ab, was in 2 ebenfalls schematisch dargestellt ist.
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Dieses Detektionslicht 54, 56, 58 gelangt von der Probe 70 über das Mikroskopobjektiv 60 auf einem Detektionsstrahlengang D über den Scanner 48, die weiteren optischen Komponenten 46, 44, 42 bis zum Hauptfarbteiler 40. Im gezeigten Beispiel soll es sich bei dem Detektionslicht 54, 56, 58 um Fluoreszenzlicht mit längerer Wellenlänge als das Anregungslicht 12 handeln. Dieses Licht wird vom Hauptfarbteiler 40 transmittiert und gelangt über eine Detektoroptik 80, die hier schematisch als Einzellinse dargestellt ist, über konfokale Blenden 84, 86, 88, die in einer einzigen Blendenscheibe 82 gebildet sind, auf Detektoren 94, 96, 98 der Detektoreinheit 90.
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Die Detektoroptik 80 kann statt wie im Beispiel aus 1 auch für jede Detektorstrecke mit einer konfokalen Blende und nachgeordnetem Detektor eine Einzellinse sein.
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Für die Erfindung wesentlich ist die optische Baugruppe 34 des Teleskops 30, die im gezeigten Beispiel durch eine Einzellinse 38 gebildet ist.
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Durch Verstellung der Linse 38 in Richtung der optischen Achse, können Ungenauigkeiten der Detektoroptik 80, die dazu führen, dass die Fokalpunkte des Detektionslichts 54, des Detektionslichts 56 und des Detektionslichts 58, die hierfür vorgesehenen konfokalen Blenden 84, 86, 88 nicht mehr genau treffen, ausgeglichen werden. Diese Bewegung entlang der optischen Achse ist in 1 schematisch durch den Doppelpfeil 37 dargestellt.
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In übersichtlicherer Anordnung ist das Teleskop 30 aus 1 noch einmal in 3 dargestellt. Die optische Baugruppe 34, die durch eine Einzellinse 38 gebildet ist, ist erfindungsgemäß in einer Zwischenbildebene der ersten Teleskoplinse 32 und der zweiten Teleskoplinse 36 positioniert.
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Eine alternative Ausgestaltung ist in 4 dargestellt. Dort wird die optische Baugruppe durch zwei identische Linsen 33, 35 gebildet, die in einem konstanten Abstand d, der durch eine geschweifte Klammer in 4 veranschaulicht ist, in den durch den Doppelpfeil 37 veranschaulichten Richtungen parallel zur optischen Achse bewegt werden. Durch das Bewegen der optischen Baugruppe 34 entlang der optischen Achse in den Ausführungsbeispielen aus 1, 3 und 4 können die relativen Abstände der Fokalpunkte des Detektionslichts 54, 56, 58 um einen Faktor vergrößert oder verkleinert werden, wobei dieser Faktor durch die Position der optischen Baugruppe 34 in Richtung der optischen Achse des Anregungsstrahlengangs A definiert ist. Als besonderer Vorteil wird demgemäß bei der Erfindung erreicht, dass nur ein einziger Parameter eingestellt werden muss, was für einen Benutzer besonders praktisch ist.
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Die Erfindung bezieht sich insgesamt auf einen Aufbau zur Variierung des Abbildungsmaßstabs eines Teleskops, insbesondere eines Kepler-Teleskops, mit einer einzigen Bewegung, wobei gleichzeitig Fokus und Pupillenlage möglichst konstant gehalten werden sollen. Dazu ist im Zwischenbild des Teleskops mit den Linsen 36 und 32 die optische Baugruppe 34 angeordnet. Durch axiale Bewegung dieser optischen Baugruppe 34, die im Beispiel aus
3 als Einzellinse 38 gebildet ist, um einen Weg Δ ändert sich der Abbildungsmaßstab Γ in paraxialer Näherung, das heißt für achsnahe Strahlen, gemäß
wobei φ
1 die Brechkraft der Linse 32, φ
2 die Brechkraft der Linse 36 und φ die Brechkraft der optischen optischen Baugruppe 34 bedeuten. Die Anordnung der Linsen gemäß
3 garantiert bei Bewegung der Linse 38 um eine Strecke Δ eine quadratische Abhängigkeit der Defokussierung von Δ gemäß
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Damit schwankt die Fokuslage über einen ausreichenden Bereich sehr wenig und zwar deutlich unterhalb der Schärfentiefe. Damit auch die Pupillenlage vergleichsweise konstant bleibt, muss die Brechkraft φ der Linse 38, also der optischen Baugruppe 34, folgender Bedingung genügen:
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Hier bedeutet g die Eintrittspupillenlage, das heißt den Abstand einer Pupille des Anregungsstrahlengangs vor der zweiten Teleskoplinse 36. Dann weist die Pupillenlage p, das heißt der Abstand der Pupille vor der ersten Teleskoplinse 32, ebenfalls eine quadratische Abhängigkeit von Δ auf, gemäß
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Weil es wegen der hohen Sauberkeitsanforderungen nicht ratsam ist, eine Linse im Zwischenbild des Teleskops 30 zu positionieren, besteht eine vorteilhafte Lösung darin, für die optische Baugruppe 34 statt einer Einzellinse 38 zwei starr gekoppelte Linsen zu verwenden, die gemeinsam als Linsengruppe zu verschieben sind. Dies ist in 4 dargestellt, wo die optische Baugruppe durch die Linsen 33 und 35 gebildet ist. Die oben genannten Zusammenhänge bleiben dabei dieselben. Die Linsen 35 und 33 können insbesondere identisch sein.
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Auch durch den in 4 gezeigten Aufbau wird das der Erfindung zugrunde liegende Problem gelöst, das mit einer mechanischen Bewegung, insbesondere einer einzigen mechanischen Bewegung, einer Linsengruppe der Abbildungsmaßstab variiert wird, während Fokus und Pupillenlage sehr gut konstant bleiben.
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Bezugszeichenliste
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- A
- Anregungsstrahlengang
- d
- konstanter Abstand
- D
- Detektionsstrahlengang
- D
- Defokussierung
- g
- Abstand der Eintrittspupille von der zweiten Teleskoplinse 36
- g1, g2
- Teilstrecken
- h
- Weg in Strahlengang
- p
- Pupillenlage
- φ
- Brechkraft der optischen Baugruppe 34
- φ1
- Brechkraft der ersten Teleskoplinse 32
- φ2
- Brechkraft der zweiten Teleskoplinse 36
- Δ
- Weg, Strecke
- Γ
- Abbildungsmaßstab
- Γ0
- Abbildungsmaßstab
- 10
- Lichtquelle
- 12
- Anregungslicht
- 14
- Beleuchtungsstrahlenbündel
- 16
- Beleuchtungsstrahlenbündel
- 18
- Beleuchtungsstrahlenbündel
- 20, 30, 40, 48, 60
- Optikmittel
- 20
- Auftrennmittel
- 30
- Teleskop
- 32
- erste Teleskoplinse
- 33
- Linse
- 34
- optische Baugruppe
- 35
- Linse
- 36
- zweite Teleskoplinse
- 37
- Doppelpfeil
- 38
- Einzellinse
- 40
- Hauptfarbteiler
- 48
- Scanner
- 54
- Detektionslicht
- 56
- Detektionslicht
- 58
- Detektionslicht
- 60
- Mikroskopobjektiv
- 70
- Probe
- 74
- Probenbereich
- 76
- Probenbereich
- 78
- Probenbereich
- 80
- Detektoroptik
- 84
- konfokale Blende
- 86
- konfokale Blende
- 88
- konfokale Blende
- 90
- Detektoreinheit
- 90
- Detektionseinheit
- 94
- Detektor
- 96
- Detektor
- 98
- Detektor
