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Die Erfindung betrifft eine optische Vorrichtung mit einer fokussierenden Optik, die zumindest einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert, und einem Phasenfilter zur Formung des Fokus des Lichtstrahls, wobei der Phasenfilter eine Phasenverschiebung des Lichtstrahls bewirkt.
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Die Erfindung betrifft außerdem ein Rastermikroskop mit einer fokussierenden Optik, die einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert, und mit einem Phasenfilter zur Formung des Fokus des Lichtbündels, wobei der Phasenfilter eine Phasenverschiebung des Lichtstrahls bewirkt.
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In der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um ein von der Probe ausgehendes Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung (Scaneinrichtung), im allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x- und der andere in y-Richtung ablenkt.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkungsvorrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusebene stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblenden nicht, so dass man eine Punktinformation von der Probe erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objektes zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatenaufnahme erzielt.
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Das Auflösungsvermögen eines konfokalen Rastermikroskops ist unter anderem durch die Intensitätsverteilung und die räumliche Ausdehnung des Fokus des Anregungslichtstrahles gegeben. Eine Möglichkeit der Auflösungssteigerung bietet die STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskopie, wie sie von Prof. Stefan Hell entwickelt worden ist. Dabei werden die lateralen Randbereiche des Fokusvolumens des Anregungslichtstrahles mit einem Lichtstrahl einer anderen Wellenlänge, dem sog. Stimulationslichtstrahl bzw. Abregungslichtstrahl, der vorzugsweise von einem zweiten Laser emittiert wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten Probenbereiche (d.h. die dortigen Fluoreszenzmoleküle) stimuliert in den Grundzustand zurückzubringen. Detektiert wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht vom zweiten Laser beleuchteten Bereichen, so dass insgesamt eine Auflösungsverbesserung erreicht wird.
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Es hat sich gezeigt, dass man gleichzeitig sowohl lateral als auch axial eine Auflösungsverbesserung erzielen kann, wenn es idealerweise gelingen würde, den Fokus des Stimulationslichtstrahles im Innern als Nullstelle auszubilden, und zwar in allen drei Raumrichtungen. Bildlich gesprochen heißt dies, dass im Inneren des Intensitätsprofils des Stimulationslichtstrahles eine Hohlkugel ausgebildet wird, in der die Intensität des Stimulationslichtstrahles null wird, d.h. keine Strahlung vorhanden ist. Die Form des Stimulationsfokus ergibt sich aus der Fouriertransformierten der Phasenfilterfunktion. Dabei sind verschiedene Phasenfilter bekannt: Beispielsweise gibt es sogenannte Vortex-Phasenfilter oder axiale Phasenfilter, wie sie z.B. in Appl. Phys. Lett., Vol. 82, No. 18, 5 May 2003, 3125 - 3127 beschrieben sind. Bei einem axialen Phasenfilter wird das Licht, das den zentralen Teil der Platte durchläuft, gegenüber dem Randbereich der Platte um eine halbe Wellenlänge verzögert. Dabei muss der Anteil des Lichtes, das den zentralen Bereich durchläuft, der gleiche sein wie der Anteil, der die Randbereich durchläuft. Hierdurch kommt es durch Interferenzeffekte zu einer Auslöschung im zentralen Bereich des Lichtstrahles. In der Praxis gelingt es häufig nicht, sowohl in lateraler als auch in axialer Richtung gleichermaßen eine sehr hohe Auflösungsverbesserung zu erzielen, da die geschilderte ideale Hohlkugel nur schwierig herzustellen ist. Daher entscheidet man sich daher häufig für eine Anordnung, mit der entweder eine hohe Auflösung in lateraler oder in axialer Richtung erzielt werden kann, wobei dies dann auch von der jeweiligen Anwendung abhängt.
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Daneben müssen für unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe auch unterschiedliche Wellenlängen des Anregungs- und Abregungslichtes verwendet werden. Die bekannten Phasenfilter besitzen allerdings den Nachteil, dass sie nur für eine bestimmte Lichtwellenlänge eine Phasenverschiebung, die zu der gewünschten Intensitätsverteilung im Fokus führt, exakt durchführen. Sie sind daher im allgemeinen nur in einem schmalen Wellenlängenband von ca. 60 nm um die zentrale Wellenlänge verwendbar. Dies ist jedoch ein großer Nachteil, da Fluoreszenzfarbstoffe in einem breiten Wellenlängenbereich vorkommen und für bestimmte biologische Fragestellungen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen. Dann ist aber aufgrund der nicht auf diese Fluoreszenzfarbstoffe abgestimmten Phasenfilter nur eine schlechtere Auflösung erzielbar.
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Aus der
DE 10 2004 032 953 A1 ist unter anderem ein Phasenfilter, der zwischen einem ersten Teil eines Lichtbündels und einem zweiten Teil eines Lichtbündels eine Phasenverschiebung bewirkt. Dieser Phasenfilter weist eine erste Grenzfläche und eine zweite Grenzfläche auf. Die erste Grenzfläche reflektiert den ersten Teil des Lichtbündels und die zweite Grenzfläche reflektiert den zweiten Teil des Lichtbündels.
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Aus der
US 6,323,995 B1 ist ein Revolverträger bekannt, wobei der Revolverträger in einem Mikroskop verwendet werden kann. Dieser Revolverträger ist mit unterschiedlichen optischen Elementen in Form eines Analysators und einer ¼-Wellenlängenplatte bestückt, um unterschiedliche Funktionen und Beeinflussungen hinsichtlich eines Lichtstrahls zu ermöglichen.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine optische Vorrichtung anzugeben, die eine weitgehende wellenlängenunabhängige Fokusformung eines Lichtstrahls ermöglicht und somit hochauflösende Mikroskopie, insbesondere STED-Mikroskopie in einem größeren Wellenlängenspektrum erlaubt.
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Die Aufgabe wird durch eine optische Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben. Zumindest zwei Phasenfilter sind auf einem Träger angeordnet und bei dem Träger handelt es sich um ein Filterrad, der in den Strahlengang eines Lichtstrahls einbringbar ist. Vorzugsweise handelt es sich dabei um den Strahlengang des Stimulationslichtstrahles in einem STED-Mikroskop. Vorzugsweise sind mehrere Phasenfilter matrixförmig auf dem Träger angeordnet. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Träger um ein Glassubstrat, auf das die jeweiligen Phasenfilter aufgedampft sind. Zweckmäßiger-weise befindet sich zu Justagezwecken auf dem Träger zusätzlich noch eine Position, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird, d.h. es handelt sich hierbei um eine Leerstelle, an der sich kein Phasenfilter befindet.
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Zur Justage des Strahlenganges des Lichtes wird zunächst die Leerstelle, d.h. die Stelle im Filterrad bzw. Filterschieber, an der sich kein Phasenfilter befindet, in den Strahlengang eingestellt, so dass der Strahlengang beginnend vom Laserausgang bzw. dem Anregungspinhole oder einem Ende einer Lichtleitfaser, in die der Laser eingekoppelt wurde, bis zum Fokus in der Probenebene ohne Beeinflussung durch einen Phasenfilter justiert werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn beispielsweise ein in der
DE10 2007 011 305 A1 beschriebenes Justageverfahren für die Justage von zwei Lichtstrahlen, wie dies in der STED-Mikroskopie erforderlich ist, zur Anwendung kommt.
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Vorteilhafterweise sollten sich die Phasenfilter in der Pupille des Mikroskopobjektivs oder einer dazu konjugierten Ebene befinden. Da die Phasenfilter in der Regel jedoch aus baulichen Gründen nicht direkt in die Objektivpupille eingebaut werden können, werden sie entweder möglichst nahe an der Objektivpupille platziert oder mittels einer Abbildungsoptik in die Objektivpupille abgebildet. Der Phasenfilter wird in Bezug auf die optische Achse des Mikroskops justiert, so dass er bzw. sein Abbild zentrisch in der Pupille des Objektivs angeordnet sind. Bei Verwendung eines Filterrades für die Phasenfilter ist es erforderlich, dass beim Drehen des Filterrades der Mittelpunkt der einzelnen Phasenfilter jeweils auf den Mittelpunkt der Pupille des Objektivs abbildbar ist. Daher ist es erforderlich, dass die Drehachse des Filterrades entsprechend justiert worden ist, so dass beim Drehen des Rades der Mittelpunkt der jeweiligen Phasenfilter auch mit dem Mittelpunkt der Pupille übereinstimmt. Besonders vorteilhaft ist es bei Verwendung eines Filterrades, für die Justage ein Polarkoordinatensystem zu verwenden und den Mittelpunkt des Filterrades durch einen Abstand und einen Winkel zu definieren. Das Filterrad kann angetrieben durch einen Motor gedreht werden. Die Platzierung der einzelnen Phasenfilter im Strahlengang kann elektronisch gesteuert durch einen Computer erfolgen. Es ist dabei ein exaktes Positionieren der einzelnen Phasenfilter nötig in Bezug auf den Mittelpunkt der Objektivpupille. Zur Vermessung der Phasenfilterposition wird ein hochgenaues Messsystem, beispielsweise ein magnetoresistives Messsystem verwendet, mit dem eine exakte Vermessung der Position des jeweiligen in den Strahlengang eingeschwenkten Phasenfilter möglich ist.
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Die Justage des Phasenfilters kann dann z.B. wie folgt erfolgen: Die Position der Drehachse des Filterrades wird entlang der optischen Achse des Lichtstrahls von Hand justiert, und die jeweiligen Phasenfilter werden dann durch Drehen des Filterrades justiert. Insbesondere ist die folgende Ausführungsvariante vorteilhaft: In r-Richtung wird mittels einer Feinstellschraube der Kreis der einzelnen Phasenfilterpositionen auf den Strahlengang ausgerichtet. In cp-Richtung wird durch Drehen des Rades über einen Schrittmotorantrieb die exakte φ-Position eingestellt. Durch Verwendung eines Abtasters, vorteilhafterweise ein magnetoresistiver Sensor in Verbindung mit einem magnetischen Polrad, welches direkt am Phasenfilterrad angebracht ist, kann die Drehposition exakt und reproduzierbar eingestellt werden. Es ist auch denkbar, dass die Einstellung in r-Richtung auch über einen Abtaster erfolgt. Hierdurch kann die Justage automatisch mittels eines in einem Computer implementieren Algorithmus gesteuert werden. Vorteilhafterweise werden die Messwerte der richtigen Radstellungen in einer Datentabelle elektronisch gespeichert. Bei der späteren Positionierung der Phasenfiltermatrix im Betrieb werden die Phasenfilter in einem iterativen Verfahren platziert, wobei das Filterrad gedreht und die aktuelle Position gemessen wird. Falls die Zielposition noch nicht erreicht worden ist, wird das Rad wieder bewegt, die aktuelle Position gemessen usw., bis endlich die Endposition erreicht worden ist. Eine andere Vorgehensweise zur korrekten Positionierung ist die Verwendung eines Positionsreglers. Durch eine Justage der Phasenfiltermatrix in Bezug auf die optische Achse kann die optimale Positionierung der Phasenfiltermatrix bzw. ihres Abbildes in der Pupille erreicht werden. Dies kann auch motorisiert durchgeführt werden, um z.B. für unterschiedliche Objektive mit jeweils verschiedener Pupillenlage automatisch die richtige Einstellung zu erhalten. Hierfür kann wieder eine Datentabelle verwendet werden. Die Auswahl des Objektivs erfolgt computergesteuert. Damit kann dann für jedes gewählte Objektiv der Phasenfilter entsprechend positioniert werden.
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Um in einem Mikroskop sowohl eine laterale als auch eine axiale Auflösungserhöhung zu realisieren, kann die Phasenfiltermatrix sowohl mit Phasenfiltern, die die laterale Auflösung erhöhen als auch mit Phasenfiltern, die die axiale Auflösung erhöhen, bestückt werden. Alternativ kann z.B. für die STED-Mikroskopie der Stimulationsstrahl mittels eines Strahlteilers in zwei Teilstrahlen geteilt werden. Hierzu kann z.B. ein Polarisationsteiler verwendet werden und das Verhältnis der Lichtleistung für die beiden Teilstrahlen mit einer λ/2-Piatte eingestellt werden. Jeder der beiden Teilstrahlen kann durch einen Phasenfilter hindurchgehen, wobei jeder der beiden Phasenfilter Teil des erfindungsgemäßen Phasenfilterträgers ist. Nach dem Durchgang der beiden Teilstrahlen durch die jeweiligen Phasenfilter werden die beiden Teilstrahlen wieder übereinander gelagert, so dass sich dann möglichst eine Art Hohlkugel im Fokus des Stimulationsstrahls ausbildet und somit eine hohe Auflösung des STED-Mikroskops in lateraler als auch in axialer Richtung ermöglicht wird. Bei dieser Ausführungsbeispiel wird ein Träger nur mit Phasenfiltern bestücken, die nur die laterale Auflösung erhöhen und der andere Träger nur mit Phasenfiltern, welche die axiale Auflösung erhöhen. Dadurch ist neben den beiden Extremstellungen - nur laterale Auflösungserhöhung und nur axiale Auflösungserhöhung - auch eine Kombination aus lateraler und axialer Auflösungserhöhung ermöglicht.
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Es ist auch denkbar, dass verschiedene Abregungslaser gleichzeitig verwendet werden, wobei jeweils ein Laser einem spezifischen Phasenfilter zugeordnet ist. Diese können sich auf verschiedenen Phasenfilterträgern befinden. Für die STED-Mikroskopie ist erforderlich, dass der Fokus des Anregungslichts und der Fokus des Stimulationslichts bzw. Abregungslichtes exakt übereinander liegen, d.h. die zulässige Abweichung liegt bei weniger als 100 nm. Um dies zu realisieren, ist es vorteilhaft, wenn die verwendeten Laser mittels einer Lichtleitfaser in das STED-Mikroskop eingekoppelt werden. Dann gehen alle Lichtstrahlen sozusagen von einer Punktlichtquelle aus, so dass bei einer Drift von Systemkomponenten des Mikroskops die Lage der Fokusse zueinander unverändert bleibt. In der praktischen Umsetzung ist es aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften von Anregungs- und Abregungslicht oftmals vorteilhaft, zwei unterschiedliche Fasern für Anregungs- und Abregungslicht zu verwenden. Eventuell bietet sich auch eine Verwendung von unterschiedlichen Fasern für unterschiedliche Abregungswellenlängen an, um z.B. das Licht jeweils im Monomode führen zu können. Die Verwendung einer Punktlichtquelle bzw. einer Lichtleitfaser, aus der Licht verschiedener Wellenlängen, tritt erfordert eine entsprechend gut korrigierte Optik. Insbesondere chromatische Aberrationen der beteiligten Wellenlängen müssen im Fokus bis auf 100 nm korrigiert sein. Dies ist insbesondere für Mehrfarbenaufnahmen notwendig, bei denen mehrere Fluoreszenzmarker verwendet werden und die mit unterschiedlichen Anregungslaser und/oder Abregungslaser an- bzw. abgeregt werden.
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Für maximale Flexibilität werden die Laser über einen akustooptischen Strahlteiler (AOBS) eingekoppelt. Hierfür kann ein AOBS für alle Wellenlängen verwendet werden oder mehrere AOBS, z.B. ein erster zur Einkopplung des Anregungslichts und ein zweiter zur Einkopplung des Abregungslichts.
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Die Auswahl des Phasenfilters bzw. der Phasenfilter erfolgt über die Benutzeroberfläche der Software. Diese steuert dann die Elektronik und die Mechanik zur Positionierung des Phasenfilters. Es bieten sich verschiedene Möglichkeiten, die Benutzereingabe zu gestalten. Eine erste Möglichkeit ist, dass der Benutzer den entsprechenden Phasenfilter bzw. die entsprechenden Phasenfilter direkt in der Benutzeroberfläche auswählt. Eine weitere Möglichkeit ist es, die Auswahl des Phasenfilters bzw. der Phasenfilter an die benutzten Abregungslaser bzw. Abregungswellenlängen zu knüpfen. So könnte z.B. bei der Auswahl eines Abregungslasers mit der Wellenlänge von 592 nm der Phasenfilter für 592 nm bzw. der Phasenfilter des entsprechenden Wellenlängenbandes eingefahren werden. Hierfür können Nachschlagetabellen erstellt und verwendet werden. Es ist auch denkbar, dass bei gleichzeitiger Benutzung von Phasenfiltern, die die laterale Auflösung erhöhen und von Phasenfiltern, die die axiale Auflösung erhöhen, der Benutzer in der Benutzeroberfläche die Werte für die gewünschte laterale und axiale Auflösung eingibt. Die Software steuert dann die Elektronik bzw. Mechanik entsprechend an, so dass die für diesen Laser benötigten Phasenfilter zur lateralen und axialen Auflösungserhöhung in den Strahlengang gefahren werden und die Lichtleistung zwischen den beiden Pfaden, z.B. durch Drehen einer λ/2- Platte, so aufgeteilt wird, dass das entsprechende Verhältnis dem Verhältnis der Auflösungserhöhungen in lateraler und axialer Richtung entspricht. Hierfür können ebenfalls Nachschlagetabellen verwendet werden. Durch Einstellen der Laserleistung des Abregungslasers wird dann die Auflösung im STED-Mikroskop eingestellt. Dies ist möglich, da die Auflösungserhöhung in einem STED-Mikroskop gegenüber einem üblichen Konfokalmikroskop proportional zur Quadratwurzel aus der Laserleistung des Abregungslasers ist. Auch hierfür können Nachschlagetabellen verwendet werden und/oder der einzustellende Wert kann berechnet werden.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
- 1 einen erfindungsgemäßen Träger mit mehreren Phasenfiltern,
- 2 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
- 3 ein erfindungsgemäßes zweites Rastermikroskop,
- 4 ein Ausführungsbeispiel eines Trägers nach 1 mit mehreren Phasenfiltern.
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1 zeigt einen erfindungsgemäßen Träger 1 mit zumindest zwei Phasenfiltern 2, 3. Der Träger 1 ist hier als Filterrad ausgebildet und auf dem Filterrad befinden sich neben den zwei Phasenfiltern 2, 3 noch weitere Phasenfilter 4, 5 und 6., die ringförmig auf dem Träger angeordnet sind. Bei dem Träger handelt es sich vorteilhafterweise um ein Glassubstrat, auf das die Phasenfilter aufgedampft sind. Zweckmäßigerweise befindet sich zu Justagezwecken auf dem Träger 1 zusätzlich noch eine Position 7, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird, d.h. es handelt sich hierbei um eine Leerstelle, an der sich kein Phasenfilter befindet.
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Die optische Achse 10 verläuft jeweils senkrecht durch die Mitte einer Position eines Phasenfilters auf dem Filterrad. Für Justagezwecke sind die beiden Richtungen 8 und 9 vorgesehen, wobei in einem Polarkoordinatensystem damit zum einen die die Länge des Radius r sowie der Winkel φ gemeint ist.
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In 2 ist ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop dargestellt, hier insbesondere für die STED-Mikroskopie. Es sind zwei Laser 11, 18 vorgesehen, wobei der Laser 18 Licht 21 zur Anregung der Probe aussendet, das über eine erste Optik 19, eine nicht näher bezeichnete Lichtleitfaser und ein zweite Optik 20 zu einem Beleuchtungspinhole 22 geführt wird. Dann trifft das Anregungslicht 21 auf einen ersten Strahlteiler 17 und einen zweiten Strahlteiler 29 und gelangt zum Scanmodul 23. Das Scanmodul 23 weist ein oder mehrere Scanspiegel auf. Alternativ sind auch akustooptische Elemente denkbar. Schließlich gelangt das Anregungslicht 21 über zwei weitere Optiken 25, 25 zum Objektiv 27 und trifft dann auf die Probe 28.
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Der Laser 11 emittiert Licht zur Abregung, welches durch eine erste Optik 12, eine Lichtleitfaser 13 und eine zweite Optik 14 auf die erfindungsgemäße Phasenfiltermatrix 15 trifft. Die Phasenfiltermatrix 15 besteht aus einem Träger 1, der mit zumindest zwei Phasenfiltern bestückt ist. Nach der Reflexion am Strahlteiler 17 nimmt das Licht denselben Weg zur Probe 28 wie auch das Anregungslicht 21.
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In der 3 ist ein zweites erfindungsgemäßes Rastermikroskop, insbesondere für die STED-Mikroskopie, wobei Elemente mit gleichen Funktionen wie in 2 mit den gleichen Bezugszeichen versehen sind. Zusätzlich zu der Darstellung in 2 ist hier eine λ/2 Platte 36 vorgesehen sowie ein Polarisationsstrahlteiler 37, der den Laserstrahl in zwei Teilstrahlen aufteilt. Der durchgehende Teil des Laserstrahls trifft auf eine erste Phasenfiltermatrix 34 und wird nach dem Durchlaufen eines Strahlteilers 40 wieder mit dem anderen Teilstrahl zusammengeführt. Der reflektierte Teil des Lichtstrahls trifft auf einen Spiegel 38 und dann auf eine zweite Phasenfiltermatrix 35. Nach der Umlenkung durch einen Spiegel 39 und den Strahlteiler 40 trifft er wieder mit dem anderen Teil des Laserstrahls zusammen. Dann durchlaufen die beiden wieder zusammengeführten Lichtstrahlen eine λ/4 Platte 41. Der Abregungslaserstrahl wird somit durch diese Anordnung geteilt und die beiden Teilstrahlen durchlaufen jeweils unterschiedliche Phasenfilter 34, 35, so dass hierdurch insgesamt die axiale und dies laterale Auflösung beeinflusst werden kann.
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4 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Trägers 1 mit mehreren Phasenfiltern. Der Träger 1 ist hier als Filterrad 50 ausgebildet mit mehreren Phasenfiltern 51, 52, 53, 54 und 55. Das Filterrad 50 ist ein optische transparentes Material wie Glas oder Kunststoff und die Phasenfilter 51 - 55 sind auf das Filterrad 50 aufgedampft. Zweckmäßigerweise befindet sich zu Justagezwecken auf dem Träger 1 noch eine Position 56, bei deren Durchgang das Licht nicht beeinflusst wird, d.h. ist eine Leerstelle vorgesehen. Die optische Achse 70 befindet sich senkrecht zur Fläche des Filterrades 1, 50.
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Zur Justage des Strahlenganges des Lichtes wird zunächst die Leerstelle 7, 56 in den Strahlengang eingestellt, so dass der Strahlengang beginnend vom Laserausgang 11 bzw. dem Anregungspinhole oder einem Ende einer Lichtleitfaser, in die der Laser 11 eingekoppelt wurde, bis zum Fokus in der Probenebene 28 ohne Beeinflussung durch einen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 justiert werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn beispielsweise ein in der
DE 10 2007 011 305 A1 beschriebenes Justageverfahren für die Justage von zwei Lichtstrahlen, wie dies in der STED-Mikroskopie erforderlich ist, zur Anwendung kommt.
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Vorteilhafterweise sollten sich die Phasenfilter 2 -6, 51 - 55 in der Pupille des Mikroskopobjektivs 27 oder einer dazu konjugierten Ebene befinden. Da die Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 in der Regel jedoch aus baulichen Gründen nicht direkt in die Objektivpupille eingebaut werden können, werden sie entweder möglichst nahe an der Objektivpupille platziert oder mittels einer Abbildungsoptik in die Objektivpupille abgebildet. Der Phasenfilter wird in Bezug auf die optische Achse des Mikroskops justiert, so dass er bzw. sein Abbild zentrisch in der Pupille des Objektivs angeordnet sind. Bei Verwendung eines Filterrades 1, 50 für die Phasenfilter ist es erforderlich, dass beim Drehen des Filterrades 1, 50 der Mittelpunkt der einzelnen Phasenfilter 2 -6, 51 - 55 jeweils auf den Mittelpunkt der Pupille des Objektivs abbildbar ist. Daher ist es erforderlich, dass die Drehachse des Filterrades 1, 50 entsprechend justiert worden ist, so dass beim Drehen des Rades 1, 50 der Mittelpunkt der jeweiligen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 auch mit dem Mittelpunkt der Pupille übereinstimmt. Das Filterrad 1, 50 kann angetrieben durch einen Motor 60 gedreht werden. Die Platzierung der einzelnen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 im Strahlengang kann elektronisch gesteuert durch einen Computer erfolgen, wobei ein exaktes Positionieren der einzelnen Phasenfilter in Bezug auf den Mittelpunkt der Objektivpupille erzielt werden muss. Zur Vermessung der Phasenfilterposition wird ein hochgenaues Messsystem 61, beispielsweise ein magnetoresistives Messsystem verwendet, mit dem eine exakte Vermessung der Position des jeweiligen in den Strahlengang eingeschwenkten Phasenfilter möglich ist. Es sind aber auch andere Messverfahren - optisch oder elektronisch - denkbar. Die Justage des Phasenfilters kann dann z.B. wie folgt erfolgen: Die Position der Drehachse des Filterrades 1, 50 wird zunächst von Hand justiert und die jeweiligen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 werden dann durch Drehen des Filterrades 1, 50 justiert. Die beiden Freiheitsgrade der Justage sind dabei (a) die Positionierbarkeit entlang einer Verschieberichtung r und (b) die Bewegung entlang einer Drehrichtung φ. Insbesondere ist die in 4 dargestellte Ausführungsvariante vorteilhaft: In X-Richtung (Verschieberichtung r) wird mittels einer Feinstellschraube 62 der Kreis der einzelnen Phasenfilterpositionen auf den Strahlengang ausgerichtet. In Y-Richtung (Drehrichtung φ) wird durch Drehen des Rades 1, 50 über einen Schrittmotorantrieb 60 die exakte Y-Position eingestellt. Durch Verwendung eines Abtasters 61, vorteilhafterweise ein magnetoresistiver Sensor in Verbindung mit einem magnetischen Polrad 65, welches direkt am Phasenfilterrad 50 angebracht ist, kann die Drehposition exakt und reproduzierbar eingestellt werden. Es ist darüber hinaus denkbar, dass auch die Einstellung in x-Richtung über einen Abtaster (hier nicht dargestellt) erfolgt. Hierdurch kann die Justage automatisch mittels eines in einem Computer implementieren Algorithmus gesteuert werden.
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Vorteilhafterweise werden die Messwerte der richtigen Radstellungen in einer Datentabelle elektronisch gespeichert. Bei der späteren Positionierung der Phasenfiltermatrix im Betrieb werden die Phasenfilter in einem iterativen Verfahren platziert, wobei das Filterrad 1, 50 gedreht und die aktuelle Position gemessen wird. Falls die Zielposition noch nicht erreicht worden ist, wird das Rad 1, 50 wieder bewegt, die aktuelle Position gemessen usw., bis endlich die Endposition erreicht worden ist.
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Eine andere Vorgehensweise zur korrekten Positionierung ist die Verwendung eines Positionsreglers. Durch eine Justage der Phasenfiltermatrix 1, 50 in Bezug auf die optischen Achse 70 kann die optimale Positionierung der Phasenfiltermatrix 1, 50 bzw. ihres Abbildes in der Pupille erreicht werden. Dies kann auch motorisiert durchgeführt werden, um z.B. für unterschiedliche Objektive mit jeweils verschiedener Pupillenlage automatisch die richtige Einstellung zu erhalten. Hierfür kann wieder eine Datentabelle verwendet werden. Die Auswahl des Objektivs erfolgt ebenfalls computergesteuert. Damit kann dann für jedes gewählte Objektiv der Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 entsprechend positioniert werden.
