WO2011066936A1 - Phasenfilter für ein rastermikroskop - Google Patents

Phasenfilter für ein rastermikroskop Download PDF

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WO2011066936A1
WO2011066936A1 PCT/EP2010/007236 EP2010007236W WO2011066936A1 WO 2011066936 A1 WO2011066936 A1 WO 2011066936A1 EP 2010007236 W EP2010007236 W EP 2010007236W WO 2011066936 A1 WO2011066936 A1 WO 2011066936A1
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filter
light beam
optical device
carrier
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PCT/EP2010/007236
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Hilmar Gugel
Arnold Giske
Marcus Dyba
Roland Seifert
Bernd Widzgowski
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
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    • G—PHYSICS
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    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/248—Base structure objective (or ocular) turrets

Definitions

  • the invention relates to an optical device with a focusing optics, which focuses at least one light beam in a focal plane, and a phase filter for shaping the focus of the light beam, wherein the phase filter
  • Phase shift of the light beam causes.
  • the invention further relates to a scanning microscope with a focusing optics, which focuses a light beam in a focal plane, and with a phase filter for shaping the focus of the light beam, wherein the phase filter
  • Phase shift of the light beam causes.
  • a confocal scanning microscope In scanning microscopy, a sample is illuminated with a light beam in order to observe a reflection or fluorescent light emanating from the sample.
  • the focus of the illumination light beam is moved by means of a controllable beam deflection device (scanning device), generally by tilting two mirrors, in an object plane, wherein the deflection axes are usually perpendicular to one another, so that one mirror deflects in the x direction and the other in the y direction.
  • a confocal scanning microscope generally comprises a light source, a
  • Focusing optics with which the light of the source is focused on a pinhole, a beam splitter, a beam deflecting device for beam control, a microscope optics, a detection aperture and the detectors for detecting the detection or
  • Fluorescent light The * illumination light is coupled in via a beam splitter.
  • the fluorescent light or reflection light coming from the object passes back to the beam splitter via the beam deflection device and passes through it
  • Detection light that does not originate directly from the focal plane occupies a different light path and does not pass through the detection apertures, so as to obtain point information from the sample obtained by sequentially scanning the detector
  • Object leads to a three-dimensional image.
  • a three-dimensional image is achieved by layered image data acquisition.
  • the resolution of a confocal scanning microscope is, among other things, due to the intensity distribution and the spatial extent of the focus of the
  • CONFIRMATION COPY Excitation light beam given.
  • STED Stimulated Emission Depletion
  • the lateral edge regions of the focus volume of the excitation light beam are illuminated with a light beam of another wavelength, the so-called stimulation light beam or emission light beam, which is preferably emitted by a second laser, in order to generate the sample regions excited by the light of the first laser (ie the fluorescence molecules there ) stimulates in the
  • Intensity profile of the stimulation light beam is formed a hollow sphere in which the intensity of the stimulation light beam is zero, i. E. no radiation is present.
  • the shape of the stimulation focus results from the Fourier transform of the
  • Phase filter function In this case, various phase filters are known. For example, there are so-called vortex phase filters or axial phase filters, e.g. in Appl. Phys. Lett., Vol. 82, no. 18, 5 May 2003, 3125-3177.
  • vortex phase filters or axial phase filters
  • axial phase filter With an axial phase filter, the light passing through the central part of the plate is delayed by half a wavelength from the edge of the plate. The proportion of light that passes through the central area must be the same as the proportion that passes through the border area. This is what happens
  • phase filters have the disadvantage that they only perform a phase shift for a certain wavelength of light, which leads to the desired intensity distribution in the focus exactly. They are therefore generally usable only in a narrow wavelength band of about 60 nm around the central wavelength.
  • this is a great disadvantage, since fluorescent dyes occur in a wide wavelength range and for certain biological
  • the invention has for its object to provide an optical device that allows a far-reaching wavelength-independent focus shaping of a light beam and thus allows high-resolution microscopy, in particular STED microscopy in a larger wavelength spectrum.
  • optical device which is characterized in that at least two phase filters are arranged on a carrier.
  • the carrier is a filter wheel or a
  • Filter slide which can be introduced into the beam path of a light beam.
  • this is the beam path of the stimulation light beam in a STED microscope.
  • a plurality of phase filters are arranged in matrix form on the carrier.
  • the carrier is a
  • Glass substrate on which the respective phase filters are vapor-deposited it is expedient to additionally have a position on the support, the passage of which does not influence the wavefront of the light, i. this is a blank where there is no phase filter.
  • the empty space ie the location in the filter wheel or filter slide on which there is no phase filter, is set in the beam path, so that the beam path starting from the laser output or the excitation pinhole or one end of an optical fiber, in the laser has been coupled, can be adjusted to the focus in the sample plane without being affected by a phase filter.
  • This is particularly advantageous if, for example, an adjustment method described in DE102007011305A1 for the Adjustment of two light beams, as required in STED microscopy, is used.
  • the phase filters should be located in the pupil of the microscope objective or a plane conjugate thereto.
  • the phase filters can not be installed directly in the objective pupil for structural reasons, they are either placed as close as possible to the objective pupil or imaged into the objective pupil by means of imaging optics.
  • the phase filter is adjusted with respect to the optical axis of the microscope so that it or its image are arranged centrally in the pupil of the objective.
  • the axis of rotation of the filter wheel has been adjusted accordingly, so that when turning the wheel, the center of each phase filter also coincides with the center of the pupil.
  • a filter wheel it is particularly advantageous to use a polar coordinate system for the adjustment and to define the center point of the filter wheel by a distance and an angle.
  • the filter wheel can be driven driven by a motor.
  • the placement of the individual phase filters in the beam path can be controlled electronically by a computer. In this case, an exact positioning of the individual phase filters is necessary with respect to the center of the objective pupil.
  • a high-precision measuring system for example a magnetoresistive measuring system, is used with which an exact measurement of the position of the respective phase filter pivoted into the beam path is possible.
  • the adjustment of the phase filter can then be e.g. as follows: The position of
  • the axis of rotation of the filter wheel is adjusted along the optical axis of the light beam by hand, and the respective phase filters are then adjusted by turning the filter wheel.
  • the following embodiment variant is advantageous: In the r direction, the circle of the individual phase filter positions is aligned with the beam path by means of a fine adjustment screw. In ⁇ -direction the exact ⁇ -position is adjusted by turning the wheel via a stepping motor drive.
  • a scanner advantageously a magnetoresistive sensor in conjunction with a magnetic flywheel, which is mounted directly on the phase filter wheel, the rotational position can be adjusted accurately and reproducibly. It is also conceivable that the adjustment in the r-direction also takes place via a scanner. This allows the adjustment to be automatically controlled by means of an algorithm implemented in a computer.
  • the measured values become the correct ones
  • Positioning the phase filter array in operation places the phase filters in an iterative process, rotating the filter wheel and measuring the current position. If the target position has not yet been reached, the wheel is moved again, the current position measured, etc., until finally the end position has been reached.
  • Another approach to correct positioning is to use a position controller. By adjusting the phase filter matrix with respect to the optical axis, the optimal positioning of the phase filter matrix or its image in the pupil can be achieved. This can also be done motorized, e.g. automatically get the right setting for different lenses, each with different pupil position. For this purpose, a data table can be used again. The selection of the lens is computer controlled. Thus, the phase filter can then be positioned accordingly for each lens selected.
  • the phase filter matrix can be equipped both with phase filters which increase the lateral resolution and with phase filters which increase the axial resolution.
  • the stimulation beam is divided into two partial beams by means of a beam splitter.
  • a polarization splitter can be used and the ratio of the light power for the two partial beams with a ⁇ / 2 plate can be adjusted.
  • Partial beams may pass through a phase filter, wherein each of the two phase filters is part of the phase filter carrier according to the invention. After the passage of the two partial beams through the respective phase filters, the two
  • Sub-beams stored again on top of each other so that then as possible forms a kind of hollow sphere in the focus of the stimulation beam and thus a high resolution of the STED microscope in lateral and in the axial direction is possible.
  • a carrier will only populate phase filters that increase only the lateral resolution and the other carrier only with phase filters that increase the axial resolution. This is next to the two extreme positions - only lateral increase in resolution and only axial increase in resolution - also one
  • Microscopy is required that the focus of the excitation light and the focus of the stimulation light or Abregungslichtes are exactly superimposed, i. the permissible deviation is less than 100 nm. To realize this, it is advantageous if the laser used are coupled by means of an optical fiber in the STED microscope. Then all the rays of light go from one to another
  • Fluorescent markers are used and the with different excitation laser and / or Abregungslaser on or be excited.
  • the lasers are coupled in via an acousto-optical beam splitter (AOBS).
  • AOBS acousto-optical beam splitter
  • an AOBS can be used for all wavelengths or several AOBS, e.g. a first for coupling the excitation light and a second for coupling the de-excitation light.
  • phase filter User interface of the software. This then controls the electronics and the mechanics for positioning the phase filter. There are several ways to customize the user input. A first possibility is that the user selects the corresponding phase filter or phase filters directly in the user interface. Another possibility is to select the phase filter or phase filter to the used Abregungslaser or Make excitation wavelengths. For example, when choosing a
  • the software controls the electronics or mechanics accordingly, so that the phase filters required for this laser are moved into the beam path for lateral and axial resolution increase and the light power between the two paths, e.g. is split by rotating a ⁇ / 2 plate so that the corresponding ratio corresponds to the ratio of the resolution increases in the lateral and axial directions. Lookup tables can also be used for this.
  • the resolution is then set in the STED microscope. This is possible since the increase in resolution in a STED microscope is proportional to a conventional confocal microscope
  • FIG. 1 shows a carrier according to the invention with a plurality of phase filters
  • Fig. 4 shows an embodiment of a carrier according to Fig. 1 with a plurality of phase filters.
  • Fig. 1 shows a carrier 1 according to the invention with at least two phase filters 2, 3.
  • the carrier 1 is formed here as a filter and on the filter wheel are next to the two phase filters 2, 3 even more phase filters 4, 5 and 6, the ring on the carrier are arranged.
  • the support is advantageously a glass substrate onto which the phase filters are vapor-deposited. It is expedient for adjustment purposes to additionally have a position 7 on the support 1, whose passage does not affect the wavefront of the light, ie it is a vacancy where there is no phase filter.
  • the optical axis 10 extends perpendicularly through the center of a position of a phase filter on the filter wheel.
  • the two directions 8 and 9 are provided, which in a polar coordinate system so that on the one the length of the radius r and the angle ⁇ is meant.
  • FIG. 2 shows a scanning microscope according to the invention, here in particular for STED microscopy.
  • There are two lasers 11, 18 are provided, wherein the laser 18 emits light 21 for exciting the sample, the first optics 19, an unspecified optical fiber and a second optics 20 to a
  • Illumination pinhole 22 is guided. Then the excitation light 21 impinges on a first beam splitter 17 and a second beam splitter 29 and reaches the scanning module 23.
  • the scanning module 23 has one or more scanning mirrors. Alternatively, acousto-optic elements are also conceivable. Finally, the excitation light 21 passes through two further optics 25, 25 to the objective 27 and then impinges on the sample 28.
  • the laser 11 emits light for de-excitation, which strikes the phase filter matrix 15 according to the invention through a first optical system 12, an optical fiber 13 and a second optical system 14.
  • the phase filter matrix 15 consists of a carrier 1, which is equipped with at least two phase filters. After the reflection at the beam splitter 17, the light takes the same path to the sample 28 as the excitation light 21.
  • FIG. 3 shows a second scanning microscope according to the invention, in particular for STED microscopy, wherein elements having the same functions as in FIG. 2 are provided with the same reference numerals.
  • a ⁇ / 2 plate 36 is provided here as well as a polarization beam splitter 37, which contains the
  • Laser beam split into two sub-beams The continuous part of the laser beam strikes a first phase filter matrix 34 and, after passing through a beam splitter 40, is brought together again with the other partial beam.
  • the reflected part of the light beam strikes a mirror 38 and then a second phase filter array 35. After being deflected by a mirror 39 and the beam splitter 40, it again meets the other part of the laser beam. Then the two recombined light beams pass through a ⁇ / 4 plate 41.
  • the depletion laser beam is thus divided by this arrangement and the two partial beams pass through each different phase filters 34, 35, so that in total the axial and lateral resolution can be influenced thereby.
  • FIG. 4 shows an exemplary embodiment of a carrier 1 according to the invention with a plurality of phase filters.
  • the carrier 1 is designed here as a filter wheel 50 with several
  • the filter wheel 50 is an optical transparent material such as glass or plastic and the phase filters 51-55 are vapor-deposited on the filter wheel 50. Conveniently, there is still a position 56 for adjustment purposes on the support 1, in the passage of which the light is not affected, i. a blank space is provided.
  • the optical axis 70 is perpendicular to the surface of the filter wheel 1, 50.
  • the blank 7, 56 is adjusted in the beam path, so that the beam path starting from the laser output 11 or the Anreungspinhole or one end of an optical fiber, in which the laser 11 was coupled to the focus in the sample plane 28 can be adjusted without being influenced by a phase filter 2 - 6, 51 - 55.
  • This is particularly advantageous if, for example, an adjustment method described in DE102007011305A1 is used for the adjustment of two light beams, as is required in STED microscopy.
  • Microscope lens 27 or a plane conjugate to it. Because the
  • Phase filters 2 - 6, 51 - 55 usually can not be installed directly into the objective pupil for structural reasons, they are either placed as close to the objective pupil or imaged by means of imaging optics in the objective pupil.
  • the phase filter is adjusted with respect to the optical axis of the microscope so that it or its image are arranged centrally in the pupil of the objective.
  • a filter wheel 1, 50 for the phase filter it is necessary that upon rotation of the filter wheel 1, 50, the center of the individual phase filters 2-6, 51-55 can be imaged on the center of the pupil of the lens.
  • the axis of rotation of the filter wheel 1, 50 has been adjusted accordingly, so that when rotating the wheel 1, 50, the center of the respective phase filters 2-6, 51-55 also coincides with the center of the pupil.
  • the filter wheel 1, 50 can be driven by a motor 60 to be rotated.
  • the placement of the individual phase filters 2 - 6, 51 - 55 in the beam path can be controlled electronically by a computer, with an exact positioning of the individual phase filters in Reference must be made to the center of the lens pupil.
  • a high-precision measuring system 61 for example a magnetoresistive measuring system, is used, with which an exact measurement of the position of the respective phase filter pivoted into the beam path is possible. But there are also other measuring methods - optically or electronically - conceivable.
  • the adjustment of the phase filter can then take place, for example, as follows: The position of the phase filter 61, for example a magnetoresistive measuring system, is used, with which an exact measurement of the position of the respective phase filter pivoted into the beam path is possible. But there
  • the axis of rotation of the filter wheel 1, 50 is first adjusted by hand and the respective phase filters 2 - 6, 51 - 55 are then adjusted by turning the filter wheel 1, 50.
  • the two degrees of freedom of the adjustment are (a) the positionability along a displacement direction r and (b) the movement along a direction of rotation ⁇ .
  • the embodiment variant shown in FIG. 4 is advantageous: in the X direction (displacement direction r), the circle of the individual phase filter positions is aligned with the beam path by means of a fine adjustment screw 62. In the Y direction (direction of rotation ⁇ ) is set by turning the wheel 1, 50 via a stepping motor drive 60, the exact Y position.
  • a scanner 61 By using a scanner 61,
  • a magnetoresistive sensor in conjunction with a magnetic pole wheel 65, which is mounted directly on the phase filter wheel 50, the rotational position can be set accurately and reproducibly. It is also conceivable that the setting in the x-direction via a scanner (not shown here) is done.
  • the measured values of the correct wheel positions are electronically stored in a data table.
  • the measured values of the correct wheel positions are electronically stored in a data table.
  • phase filter matrix in operation the phase filters are placed in an iterative process, the filter wheel 1, 50 is rotated and the current position is measured. If the target position has not yet been reached, the wheel 1, 50 is moved again, the current position measured, etc., until finally the end position has been reached.
  • phase filter matrix 1, 50 By adjusting the phase filter matrix 1, 50 with respect to the optical axis 70, the optimal positioning of the phase filter matrix 1, 50 or its image in the pupil can be achieved. This can also be done motorized, for example, to automatically get the right setting for different lenses, each with different pupil position. For this purpose, a data table can be used again. The selection of the lens is also computer controlled. Thus, the phase filter 2 - 6, 51 - 55 can be positioned accordingly for each lens selected.

Abstract

Eine optische Vorrichtung für ein Rastermikroskop wird beschrieben, mit der eine weitgehende wellenlängenunabhängige Fokusformung eines Lichtstrahls ermöglicht wird und somit hochauflösende Mikroskopie, insbesondere STED-Mikroskopie, in einem größeren Wellenlängenspektrum erleichtert wird. Dabei sind zumindest zwei Phasenfilter auf einem Träger angeordnet sind. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Träger um ein Filterrad oder einen Filterschieber, der in den Strahlengang des Lichtstrahls einbringbar ist, wobei es sich vorzugsweise dabei um den Strahlengang des Stimulationslichtstrahles in einem STED-Mikroskop handelt. Vorzugsweise sind mehrere Phasenfilter matrixförmig auf dem Träger angeordnet. Der Träger ist als Glassubstrat ausgebildet, auf das die jeweiligen Phasenfilter aufgebracht sind. Zweckmäßigerweise befindet sich zu Justagezwecken auf dem Träger zusätzlich noch eine Position, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird, d.h. es handelt sich hierbei um eine Leerstelle, an der sich kein Phasenfilter befindet.

Description

Phasenfilter für ein Rastermikroskop
Die Erfindung betrifft eine optische Vorrichtung mit einer fokussierenden Optik, die zumindest einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert, und einem Phasenfilter zur Formung des Fokus des Lichtstrahls, wobei der Phasenfilter eine
Phasenverschiebung des Lichtstrahls bewirkt.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Rastermikroskop mit einer fokussierenden Optik, die einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert, und mit einem Phasenfilter zur Formung des Fokus des Lichtbündels, wobei der Phasenfilter eine
Phasenverschiebung des Lichtstrahls bewirkt.
In der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um ein von der Probe ausgehendes Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung (Scaneinrichtung), im allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x- und der andere in y-Richtung ablenkt. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine
Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw.
Fluoreszenzlichtes. Das* Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkungsvorrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um
anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusebene stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblenden nicht, so dass man eine Punktinformation von der Probe erhält, die durch sequentielles Abtasten des
Objektes zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatenaufnahme erzielt.
Das Auflösungsvermögen eines konfokalen Rastermikroskops ist unter anderem durch die Intensitätsverteilung und die räumliche Ausdehnung des Fokus des
BESTÄTIGUNGSKOPIE Anregungslichtstrahles gegeben. Eine Möglichkeit der Auflösungssteigerung bietet die STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskopie, wie sie von Prof. Stefan Hell entwickelt worden ist. Dabei werden die lateralen Randbereiche des Fokusvolumens des Anregungslichtstrahles mit einem Lichtstrahl einer anderen Wellenlänge, dem sog. Stimulationslichtstrahl bzw. Abregungslichtstrahl, der vorzugsweise von einem zweiten Laser emittiert wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten Probenbereiche (d.h. die dortigen Fluoreszenzmoleküle) stimuliert in den
Grundzustand zurückzubringen. Detektiert wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht vom zweiten Laser beleuchteten Bereichen, so dass insgesamt eine Auflösungsverbesserung erreicht wird.
Es hat sich gezeigt, dass man gleichzeitig sowohl lateral als auch axial eine
Auflösungsverbesserung erzielen kann, wenn es idealerweise gelingen würde, den Fokus des Stimulationslichtstrahles im Innern als Nullstelle auszubilden, und zwar in allen drei Raumrichtungen. Bildlich gesprochen heißt dies, dass im Inneren des
Intensitätsprofils des Stimulationslichtstrahles eine Hohlkugel ausgebildet wird, in der die Intensität des Stimulationslichtstrahles null wird, d.h. keine Strahlung vorhanden ist. Die Form des Stimulationsfokus ergibt sich aus der Fouriertransformierten der
Phasenfilterfunktion. Dabei sind verschiedene Phasenfilter bekannt. Beispielsweise gibt es sogenannte Vortex-Phasenfilter oder axiale Phasenfilter, wie sie z.B. in Appl. Phys. Lett., Vol. 82, No. 18, 5 May 2003, 3125 - 3127 beschrieben sind. Bei einem axialen Phasenfilter wird das Licht, das den zentralen Teil der Platte durchläuft, gegenüber dem Randbereich der Platte um eine halbe Wellenlänge verzögert. Dabei muss der Anteil des Lichtes, das den zentralen Bereich durchläuft, der gleiche sein wie der Anteil, der die Randbereich durchläuft. Hierdurch kommt es durch
Interferenzeffekte zu einer Auslöschung im zentralen Bereich des Lichtstrahles. In der Praxis gelingt es häufig nicht, sowohl in lateraler als auch in axialer Richtung gleichermaßen eine sehr hohe Auflösungsverbesserung zu erzielen, da die
geschilderte ideale Hohlkugel nur schwierig herzustellen ist. Daher entscheidet man sich daher häufig für eine Anordnung, mit der entweder eine hohe Auflösung in lateraler oder in axialer Richtung erzielt werden kann, wobei dies dann auch von der jeweiligen Anwendung abhängt. Daneben müssen für unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe auch unterschiedliche Wellenlängen des Anregungs- und Abregungslichtes verwendet werden. Die bekannten Phasenfilter besitzen allerdings den Nachteil, dass sie nur für eine bestimmte Lichtwellenlänge eine Phasenverschiebung, die zu der gewünschten Intensitätsverteilung im Fokus führt, exakt durchführen. Sie sind daher im allgemeinen nur in einem schmalen Wellenlängenband von ca. 60 nm um die zentrale Wellenlänge verwendbar. Dies ist jedoch ein großer Nachteil, da Fluoreszenzfarbstoffe in einem breiten Wellenlängenbereich vorkommen und für bestimmte biologische
Fragestellungen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen. Dann ist aber aufgrund der nicht auf diese Fluoreszenzfarbstoffe abgestimmten Phasenfilter nur eine schlechtere Auflösung erzielbar.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine optische Vorrichtung anzugeben, die eine weitgehende wellenlängenunabhängige Fokusformung eines Lichtstrahls ermöglicht und somit hochauflösende Mikroskopie, insbesondere STED-Mikroskopie in einem größeren Wellenlängenspektrum erlaubt.
Die Aufgabe wird durch eine optische Vorrichtung gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest zwei Phasenfilter auf einem Träger angeordnet sind.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Träger um ein Filterrad oder einen
Filterschieber, der in den Strahlengang eines Lichtstrahls einbringbar ist. Vorzugsweise handelt es sich dabei um den Strahlengang des Stimulationslichtstrahles in einem STED-Mikroskop. Vorzugsweise sind mehrere Phasenfilter matrixförmig auf dem Träger angeordnet. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Träger um ein
Glassubstrat, auf das die jeweiligen Phasenfilter aufgedampft sind. Zweckmäßiger- weise befindet sich zu Justagezwecken auf dem Träger zusätzlich noch eine Position, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird, d.h. es handelt sich hierbei um eine Leerstelle, an der sich kein Phasenfilter befindet.
Zur Justage des Strahlenganges des Lichtes wird zunächst die Leerstelle, d.h. die Stelle im Filterrad bzw. Filterschieber, an der sich kein Phasenfilter befindet, in den Strahlengang eingestellt, so dass der Strahlengang beginnend vom Laserausgang bzw. dem Anregungspinhole oder einem Ende einer Lichtleitfaser, in die der Laser eingekoppelt wurde, bis zum Fokus in der Probenebene ohne Beeinflussung durch einen Phasenfilter justiert werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn beispielsweise ein in der DE102007011305A1 beschriebenes Justageverfahren für die Justage von zwei Lichtstrahlen, wie dies in der STED-Mikroskopie erforderlich ist, zur Anwendung kommt.
Vorteilhafterweise sollten sich die Phasenfilter in der Pupille des Mikroskopobjektivs oder einer dazu konjugierten Ebene befinden. Da die Phasenfilter in der Regel jedoch aus baulichen Gründen nicht direkt in die Objektivpupille eingebaut werden können, werden sie entweder möglichst nahe an der Objektivpupille platziert oder mittels einer Abbildungsoptik in die Objektivpupille abgebildet. Der Phasenfilter wird in Bezug auf die optische Achse des Mikroskops justiert, so dass er bzw. sein Abbild zentrisch in der Pupille des Objektivs angeordnet sind. Bei Verwendung eines Filterrades für die Phasenfilter ist es erforderlich, dass beim Drehen des Filterrades der Mittelpunkt der einzelnen Phasenfilter jeweils auf den Mittelpunkt der Pupille des Objektivs abbildbar ist. Daher ist es erforderlich, dass die Drehachse des Filterrades entsprechend justiert worden ist, so dass beim Drehen des Rades der Mittelpunkt der jeweiligen Phasenfilter auch mit dem Mittelpunkt der Pupille übereinstimmt. Besonders vorteilhaft ist es bei Verwendung eines Filterrades, für die Justage ein Polarkoordinatensystem zu verwenden und den Mittelpunkt des Filterrades durch einen Abstand und einen Winkel zu definieren. Das Filterrad kann angetrieben durch einen Motor gedreht werden. Die Platzierung der einzelnen Phasenfilter im Strahlengang kann elektronisch gesteuert durch einen Computer erfolgen. Es ist dabei ein exaktes Positionieren der einzelnen Phasenfilter nötig in Bezug auf den Mittelpunkt der Objektivpupille. Zur Vermessung der Phasenfilterposition wird ein hochgenaues Messsystem, beispielsweise ein magnetoresistives Messsystem verwendet, mit dem eine exakte Vermessung der Position des jeweiligen in den Strahlengang eingeschwenkten Phasenfilter möglich ist.
Die Justage des Phasenfilters kann dann z.B. wie folgt erfolgen: Die Position der
Drehachse des Filterrades wird entlang der optischen Achse des Lichtstrahls von Hand justiert, und die jeweiligen Phasenfilter werden dann durch Drehen des Filterrades justiert. Insbesondere ist die folgende Ausführungsvariante vorteilhaft: In r-Richtung wird mittels einer Feinstellschraube der Kreis der einzelnen Phasenfilterpositionen auf den Strahlengang ausgerichtet. In φ-Richtung wird durch Drehen des Rades über einen Schrittmotorantrieb die exakte φ-Position eingestellt. Durch Verwendung eines Abtasters, vorteilhafterweise ein magnetoresistiver Sensor in Verbindung mit einem magnetischen Polrad, welches direkt am Phasenfilterrad angebracht ist, kann die Drehposition exakt und reproduzierbar eingestellt werden. Es ist auch denkbar, dass die Einstellung in r-Richtung auch über einen Abtaster erfolgt. Hierdurch kann die Justage automatisch mittels eines in einem Computer implementieren Algorithmus gesteuert werden. Vorteilhafterweise werden die Messwerte der richtigen
Radstellungen in einer Datentabelle elektronisch gespeichert. Bei der späteren
Positionierung der Phasenfiltermatrix im Betrieb werden die Phasenfilter in einem iterativen Verfahren platziert, wobei das Filterrad gedreht und die aktuelle Position gemessen wird. Falls die Zielposition noch nicht erreicht worden ist, wird das Rad wieder bewegt, die aktuelle Position gemessen usw. , bis endlich die Endposition erreicht worden ist. Eine andere Vorgehensweise zur korrekten Positionierung ist die Verwendung eines Positionsreglers. Durch eine Justage der Phasenfiltermatrix in Bezug auf die optische Achse kann die optimale Positionierung der Phasenfiltermatrix bzw. ihres Abbildes in der Pupille erreicht werden. Dies kann auch motorisiert durchgeführt werden, um z.B. für unterschiedliche Objektive mit jeweils verschiedener Pupillenlage automatisch die richtige Einstellung zu erhalten. Hierfür kann wieder eine Datentabelle verwendet werden. Die Auswahl des Objektivs erfolgt computergesteuert. Damit kann dann für jedes gewählte Objektiv der Phasenfilter entsprechend positioniert werden.
Um in einem Mikroskop sowohl eine laterale als auch eine axiale Auflösungserhöhung zu realisieren, kann die Phasenfiltermatrix sowohl mit Phasenfiltern, die die laterale Auflösung erhöhen als auch mit Phasenfiltern, die die axiale Auflösung erhöhen, bestückt werden. Alternativ kann z.B. für die STED-Mikroskopie der Stimulationsstrahl mittels eines Strahlteilers in zwei Teilstrahlen geteilt werden. Hierzu kann z.B. ein Polarisationsteiler verwendet werden und das Verhältnis der Lichtleistung für die beiden Teilstrahlen mit einer λ/2-Platte eingestellt werden. Jeder der beiden
Teilstrahlen kann durch einen Phasenfilter hindurchgehen, wobei jeder der beiden Phasenfilter Teil des erfindungsgemäßen Phasenfilterträgers ist. Nach dem Durchgang der beiden Teilstrahlen durch die jeweiligen Phasenfilter werden die beiden
Teilstrahlen wieder übereinander gelagert, so dass sich dann möglichst eine Art Hohlkugel im Fokus des Stimulationsstrahls ausbildet und somit eine hohe Auflösung des STED-Mikroskops in lateraler als auch in axialer Richtung ermöglicht wird. Bei dieser Ausführungsbeispiel wird ein Träger nur mit Phasenfiltern bestücken, die nur die laterale Auflösung erhöhen und der andere Träger nur mit Phasenfiltern, welche die axiale Auflösung erhöhen. Dadurch ist neben den beiden Extremstellungen - nur laterale Auflösungserhöhung und nur axiale Auflösungserhöhung - auch eine
Kombination aus lateraler und axialer Auflösungserhöhung ermöglicht.
Es ist auch denkbar, dass verschiedene Abregungslaser gleichzeitig verwendet werden, wobei jeweils ein Laser einem spezifischen Phasenfilter zugeordnet ist. Diese können sich auf verschiedenen Phasenfilterträgern befinden. Für die STED-
Mikroskopie ist erforderlich, dass der Fokus des Anregungslichts und der Fokus des Stimulationslichts bzw. Abregungslichtes exakt übereinander liegen, d.h. die zulässige Abweichung liegt bei weniger als 100 nm. Um dies zu realisieren, ist es vorteilhaft, wenn die verwendeten Laser mittels einer Lichtleitfaser in das STED-Mikroskop eingekoppelt werden. Dann gehen alle Lichtstrahlen sozusagen von einer
Punktlichtquelle aus, so dass bei einer Drift von Systemkomponenten des Mikroskops die Lage der Fokusse zueinander unverändert bleibt. In der praktischen Umsetzung ist es aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften von Anregungs- und Abregungslicht oftmals vorteilhaft, zwei unterschiedliche Fasern für Anregungs- und Abregungslicht zu verwenden. Eventuell bietet sich auch eine Verwendung von unterschiedlichen Fasern für unterschiedliche Abregungswellenlängen an, um z.B. das Licht jeweils im
Monomode führen zu können. Die Verwendung einer Punktlichtquelle bzw. einer Lichtleitfaser, aus der Licht verschiedener Wellenlängen, tritt erfordert eine
entsprechend gut korrigierte Optik. Insbesondere chromatische Aberrationen der beteiligten Wellenlängen müssen im Fokus bis auf 100 nm korrigiert sein. Dies ist insbesondere für Mehrfarbenaufnahmen notwendig, bei denen mehrere
Fluoreszenzmarker verwendet werden und die mit unterschiedlichen Anregungslaser und/oder Abregungslaser an- bzw. abgeregt werden.
Für maximale Flexibilität werden die Laser über einen akustooptischen Strahlteiler (AOBS) eingekoppelt. Hierfür kann ein AOBS für alle Wellenlängen verwendet werden oder mehrere AOBS, z.B. ein erster zur Einkopplung des Anregungslichts und ein zweiter zur Einkopplung des Abregungslichts.
Die Auswahl des Phasenfilters bzw. der Phasenfilter erfolgt über die
Benutzeroberfläche der Software. Diese steuert dann die Elektronik und die Mechanik zur Positionierung des Phasenfilters. Es bieten sich verschiedene Möglichkeiten, die Benutzereingabe zu gestalten. Eine erste Möglichkeit ist, dass der Benutzer den entsprechenden Phasenfilter bzw. die entsprechenden Phasenfilter direkt in der Benutzeroberfläche auswählt. Eine weitere Möglichkeit ist es, die Auswahl des Phasenfilters bzw. der Phasenfilter an die benutzten Abregungslaser bzw. Abregungswellenlängen zu knüpfen. So könnte z.B. bei der Auswahl eines
Abregungslasers mit der Wellenlänge von 592 nm der Phasenfilter für 592 nm bzw. der Phasenfilter des entsprechenden Wellenlängenbandes eingefahren werden. Hierfür können Nachschlagetabellen erstellt und verwendet werden. Es ist auch denkbar, dass bei gleichzeitiger Benutzung von Phasenfiltern, die die laterale Auflösung erhöhen und von Phasenfiltern, die die axiale Auflösung erhöhen, der Benutzer in der
Benutzeroberfläche die Werte für die gewünschte laterale und axiale Auflösung eingibt. Die Software steuert dann die Elektronik bzw. Mechanik entsprechend an, so dass die für diesen Laser benötigten Phasenfilter zur lateralen und axialen Auflösungserhöhung in den Strahlengang gefahren werden und die Lichtleistung zwischen den beiden Pfaden, z.B. durch Drehen einer λ/2- Platte, so aufgeteilt wird, dass das entsprechende Verhältnis dem Verhältnis der Auflösungserhöhungen in lateraler und axialer Richtung entspricht. Hierfür können ebenfalls Nachschlagetabellen verwendet werden. Durch Einstellen der Laserleistung des Abregungslasers wird dann die Auflösung im STED- Mikroskop eingestellt. Dies ist möglich, da die Auflösungserhöhung in einem STED- Mikroskop gegenüber einem üblichen Konfokalmikroskop proportional zur
Quadratwurzel aus der Laserleistung des Abregungslasers ist. Auch hierfür können Nachschlagetabellen verwendet werden und/oder der einzustellende Wert kann berechnet werden.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
Fig. 1 einen erfindungsgemäßen Träger mit mehreren Phasenfiltern,
Fig. 2 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
Fig. 3 ein erfindungsgemäßes zweites Rastermikroskop,
Fig. 4 ein Ausführungsbeispiel eines Trägers nach Fig. 1 mit mehreren Phasenfiltern.
Fig. 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Träger 1 mit zumindest zwei Phasenfiltern 2, 3. Der Träger 1 ist hier als Filterrad ausgebildet und auf dem Filterrad befinden sich neben den zwei Phasenfiltern 2, 3 noch weitere Phasenfilter 4, 5 und 6., die ringförmig auf dem Träger angeordnet sind. Bei dem Träger handelt es sich vorteilhafterweise um ein Glassubstrat, auf das die Phasenfilter aufgedampft sind.. Zweckmäßigerweise befindet sich zu Justagezwecken auf dem Träger 1 zusätzlich noch eine Position 7, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird, d.h. es handelt sich hierbei um eine Leerstelle, an der sich kein Phasenfilter befindet.
Die optische Achse 10 verläuft jeweils senkrecht durch die Mitte einer Position eines Phasenfilters auf dem Filterrad. Für Justagezwecke sind die beiden Richtungen 8 und 9 vorgesehen, wobei in einem Polarkoordinatensystem damit zum einen die die Länge des Radius r sowie der Winkel φ gemeint ist.
In Fig. 2 ist ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop dargestellt, hier insbesondere für die STED-Mikroskopie. Es sind zwei Laser 11 , 18 vorgesehen, wobei der Laser 18 Licht 21 zur Anregung der Probe aussendet, das über eine erste Optik 19 , eine nicht näher bezeichnete Lichtleitfaser und ein zweite Optik 20 zu einem
Beleuchtungspinhole 22 geführt wird. Dann trifft das Anregungslicht 21 auf einen ersten Strahlteiler 17 und einen zweiten Strahlteiler 29 und gelangt zum Scanmodul 23. Das Scanmodul 23 weist ein oder mehrere Scanspiegel auf. Alternativ sind auch akustooptische Elemente denkbar. Schließlich gelangt das Anregungslicht 21 über zwei weitere Optiken 25, 25 zum Objektiv 27 und trifft dann auf die Probe 28.
Der Laser 11 emittiert Licht zur Abregung, welches durch eine erste Optik 12, eine Lichtleitfaser 13 und eine zweite Optik 14 auf die erfindungsgemäße Phasenfiltermatrix 15 trifft. Die Phasenfiltermatrix 15 besteht aus einem Träger 1 , der mit zumindest zwei Phasenfiltern bestückt ist. Nach der Reflexion am Strahlteiler 17 nimmt das Licht denselben Weg zur Probe 28 wie auch das Anregungslicht 21.
In der Fig. 3 ist ein zweites erfindungsgemäßes Rastermikroskop, insbesondere für die STED-Mikroskopie, wobei Elemente mit gleichen Funktionen wie in Fig. 2 mit den gleichen Bezugszeichen versehen sind. Zusätzlich zu der Darstellung in Fig. 2 ist hier eine λ/2 Platte 36 vorgesehen sowie ein Polarisationsstrahlteiler 37, der den
Laserstrahl in zwei Teilstrahlen aufteilt. Der durchgehende Teil des Laserstrahls trifft auf eine erste Phasenfiltermatrix 34 und wird nach dem Durchlaufen eines Strahlteilers 40 wieder mit dem anderen Teilstrahl zusammengeführt. Der reflektierte Teil des Lichtstrahls trifft auf einen Spiegel 38 und dann auf eine zweite Phasenfiltermatrix 35. Nach der Umlenkung durch einen Spiegel 39 und den Strahlteiler 40 trifft er wieder mit dem anderen Teil des Laserstrahls zusammen. Dann durchlaufen die beiden wieder zusammengeführten Lichtstrahlen eine λ/4 Platte 41. Der Abregungslaserstrahl wird somit durch diese Anordnung geteilt und die beiden Teilstrahlen durchlaufen jeweils unterschiedliche Phasenfilter 34, 35, so dass hierdurch insgesamt die axiale und dies laterale Auflösung beeinflusst werden kann.
Fig. 4 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Trägers 1 mit mehreren Phasenfiltern. Der Träger 1 ist hier als Filterrad 50 ausgebildet mit mehreren
Phasenfiltern 51 , 52, 53, 54 und 55. Das Filterrad 50 ist ein optische transparentes Material wie Glas oder Kunststoff und die Phasenfilter 51 - 55 sind auf das Filterrad 50 aufgedampft. Zweckmäßigerweise befindet sich zu Justagezwecken auf dem Träger 1 noch eine Position 56, bei deren Durchgang das Licht nicht beeinflusst wird, d.h. ist eine Leerstelle vorgesehen. Die optische Achse 70 befindet sich senkrecht zur Fläche des Filterrades 1 , 50.
Zur Justage des Strahlenganges des Lichtes wird zunächst die Leerstelle 7, 56 in den Strahlengang eingestellt, so dass der Strahlengang beginnend vom Laserausgang 11 bzw. dem Anregungspinhole oder einem Ende einer Lichtleitfaser, in die der Laser 11 eingekoppelt wurde, bis zum Fokus in der Probenebene 28 ohne Beeinflussung durch einen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 justiert werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn beispielsweise ein in der DE102007011305A1 beschriebenes Justageverfahren für die Justage von zwei Lichtstrahlen, wie dies in der STED-Mikroskopie erforderlich ist, zur Anwendung kommt.
Vorteilhafterweise sollten sich die Phasenfilter 2 -6 , 51 - 55 in der Pupille des
Mikroskopobjektivs 27 oder einer dazu konjugierten Ebene befinden. Da die
Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 in der Regel jedoch aus baulichen Gründen nicht direkt in die Objektivpupille eingebaut werden können, werden sie entweder möglichst nahe an der Objektivpupille platziert oder mittels einer Abbildungsoptik in die Objektivpupille abgebildet. Der Phasenfilter wird in Bezug auf die optische Achse des Mikroskops justiert, so dass er bzw. sein Abbild zentrisch in der Pupille des Objektivs angeordnet sind. Bei Verwendung eines Filterrades 1 , 50 für die Phasenfilter ist es erforderlich, dass beim Drehen des Filterrades 1 , 50 der Mittelpunkt der einzelnen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 jeweils auf den Mittelpunkt der Pupille des Objektivs abbildbar ist. Daher ist es erforderlich, dass die Drehachse des Filterrades 1 , 50 entsprechend justiert worden ist, so dass beim Drehen des Rades 1 , 50 der Mittelpunkt der jeweiligen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 auch mit dem Mittelpunkt der Pupille übereinstimmt. Das Filterrad 1 , 50 kann angetrieben durch einen Motor 60 gedreht werden. Die Platzierung der einzelnen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 im Strahlengang kann elektronisch gesteuert durch einen Computer erfolgen, wobei ein exaktes Positionieren der einzelnen Phasenfilter in Bezug auf den Mittelpunkt der Objektivpupille erzielt werden muss. Zur Vermessung der Phasenfilterposition wird ein hochgenaues Messsystem 61 , beispielsweise ein magnetoresistives Messsystem verwendet, mit dem eine exakte Vermessung der Position des jeweiligen in den Strahlengang eingeschwenkten Phasenfilter möglich ist. Es sind aber auch andere Messverfahren - optisch oder elektronisch - denkbar. Die Justage des Phasenfilters kann dann z.B. wie folgt erfolgen: Die Position der
Drehachse des Filterrades 1 , 50 wird zunächst von Hand justiert und die jeweiligen Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 werden dann durch Drehen des Filterrades 1 , 50 justiert. Die beiden Freiheitsgrade der Justage sind dabei (a) die Positionierbarkeit entlang einer Verschieberichtung r und (b) die Bewegung entlang einer Drehrichtung φ.
Insbesondere ist die in Fig. 4 dargestellte Ausführungsvariante vorteilhaft: In X- Richtung (Verschieberichtung r) wird mittels einer Feinstellschraube 62 der Kreis der einzelnen Phasenfilterpositionen auf den Strahlengang ausgerichtet. In Y-Richtung (Drehrichtung φ) wird durch Drehen des Rades 1 , 50 über einen Schrittmotorantrieb 60 die exakte Y-Position eingestellt. Durch Verwendung eines Abtasters 61 ,
vorteilhafterweise ein magnetoresistiver Sensor in Verbindung mit einem magnetischen Polrad 65, welches direkt am Phasenfilterrad 50 angebracht ist, kann die Drehposition exakt und reproduzierbar eingestellt werden. Es ist darüber hinaus denkbar, dass auch die Einstellung in x-Richtung über einen Abtaster (hier nicht dargestellt) erfolgt.
Hierdurch kann die Justage automatisch mittels eines in einem Computer
implementieren Algorithmus gesteuert werden.
Vorteilhafterweise werden die Messwerte der richtigen Radstellungen in einer Datentabelle elektronisch gespeichert. Bei der späteren Positionierung der
Phasenfiltermatrix im Betrieb werden die Phasenfilter in einem iterativen Verfahren platziert, wobei das Filterrad 1 , 50 gedreht und die aktuelle Position gemessen wird. Falls die Zielposition noch nicht erreicht worden ist, wird das Rad 1 , 50 wieder bewegt, die aktuelle Position gemessen usw., bis endlich die Endposition erreicht worden ist.
Eine andere Vorgehensweise zur korrekten Positionierung ist die Verwendung eines Positionsreglers. Durch eine Justage der Phasenfiltermatrix 1 , 50 in Bezug auf die optischen Achse 70 kann die optimale Positionierung der Phasenfiltermatrix 1 , 50 bzw. ihres Abbildes in der Pupille erreicht werden. Dies kann auch motorisiert durchgeführt werden, um z.B. für unterschiedliche Objektive mit jeweils verschiedener Pupillenlage automatisch die richtige Einstellung zu erhalten. Hierfür kann wieder eine Datentabelle verwendet werden. Die Auswahl des Objektivs erfolgt ebenfalls computergesteuert. Damit kann dann für jedes gewählte Objektiv der Phasenfilter 2 - 6, 51 - 55 entsprechend positioniert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Optische Vorrichtung mit einer fokussierenden Optik, die einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert und mit einem Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) zur Formung des Fokus des Lichtstrahls, wobei der Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55 ) zur Formung des Fokus eine Phasenverschiebung des Lichtstrahls bewirkt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger (1 ; 50) vorgesehen ist, der mit zumindest zwei Phasenfiltern (2,3 ; 51 , 52) bestückt ist, und wobei die Phasenfilter (2,3; 51 , 52) jeweils einzeln in den Strahlengang des Lichtstrahls einbringbar sind.
2. Optische Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1 ; 50) als Filterrad ausgebildet ist, das durch einen Motor gedreht werden kann.
3. Optische Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1 ; 50) als Glassubstrat ausgebildet ist, auf das die Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) aufgebracht sind.
4. Optische Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionierung der Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) im Strahlengang des Lichtstrahls elektronisch gesteuert durch einen Computer erfolgen kann.
5. Optische Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger (1 ; 50) sich eine Position (7, 56) befindet, bei deren Durchgang die
Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird.
6. Optische Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Position (7, 56) eine Leerstelle, an der sich kein Phasenfilter befindet, handelt.
7. Optische Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Filterrad (1 ; 50) in Bezug auf eine optische Achse (70) justierbar ist durch eine Verschiebung in r-Richtung und eine Drehung um einen Winkel <P-
8. Optische Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass für die Einstellung der Drehposition des Filterrades (1 ; 50) ein Abtaster vorgesehen ist.
9. Optische Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Abtaster als Kombination aus einem magnetoresistiver Sensor und einem
magnetischen Polrad, das direkt am Filterrad (1 ; 50) angebracht ist, ausgebildet ist.
10. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, dass die Justage des Filterrades (1 ; 50) mittels eines in einem
Computer hinterlegten Algorithmus erfolgt.
11. Optische Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) derart ausgebildet sind, dass sie eine Auflösungserhöhung in axialer oder in lateraler
Richtung bewirken.
12. Optische Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass sich die Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) in einer Pupille eines Mikroskopobjektivs oder einer dazu konjugierten Ebene befinden. 3. Rastermikroskop mit einer fokussierenden Optik, die einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert und mit einem Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) zur
Formung des Fokus des Lichtstrahls, wobei der Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) zur Formung des Fokus eine Phasenverschiebung des Lichtstrahls bewirkt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger (1 , 50) vorgesehen ist, der zumindest zwei Phasenfilter (2,3 ; 51 , 52) aufweist, und wobei die Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) jeweils einzeln in den Strahlengang des Lichtstrahls einbringbar sind.
14. Rastermikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1 ;50) als Filterrad ausgebildet ist.
15. Rastermikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger
1 , 50 als Glassubstrat ausgebildet ist, auf das die Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) aufgedampft sind.
16. Rastermikroskop nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger (1 , 50) sich eine Position (7, 56) befindet, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird.
17. Rastermikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Position (7, 56) eine Leerstelle, an der sich kein Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) befindet, handelt.
18. Rastermikroskop nach einem oder mehreren der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Filterrad (1 , 50) in Bezug auf eine optische Achse (70) justierbar ist durch eine Verschiebung in r-Richtung und eine Drehung um einen Winkel φ·
19. Rastermikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Lichtstrahl um einen Laserlichtstrahl handelt und die Auswahl der Phasenfilter (2, 3, 4, 5, 6; 51 , 52, 53, 54, 55) in Abhängigkeit von dem verwendeten Laser erfolgt.
20. Rastermikroskop nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein STED-Mikroskop mit einem Anregungs- und einem Abregungslaser handelt und die Phasenfilter für den Abregungslaser vorgesehen sind.
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