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Die
Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit mindestens einer Lichtquelle,
die ein Beleuchtungslichtstrahlenbündel erzeugt, mit einem akustooptischen
Bauteil zur Einstellung der Lichtleistung des Beleuchtungslichtstrahlenbündels und
mit einer Strahlablenkeinrichtung zum Führen des Beleuchtungslichtstrahlenbündels über bzw.
durch eine Probe.
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In
der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet,
um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht
zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit
Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen
durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei
die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein
Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung
der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell
in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales
Scanmikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik,
mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog.
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis
des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird
beispielsweise über
einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
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Anstelle
des Strahlteilers kann zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens
einer Lichtquelle in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt
gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der Anregungswellenlänge aus
dem über
den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Lichts auch eine
als akustooptisches Bauteil ausgestaltete optische Anordnung vorgesehen
sein, wie beispielsweise aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 199 06 757 A1 bekannt
ist.
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Meist
wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt idealer Weise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Bei
einigen mikroskopischen Anwendungen ist es notwendig, die Probe
während
des Abrasterns oder zwischen zwei Abrastervorgängen manipulieren zu können. Eine
Manipulation kann beispielsweise das Freisetzen gebundener Farbstoffe,
einen Bleichvorgang, einen Schneidvorgang oder die Anwendung einer
optischen Pinzette beinhalten.
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Aus
US 6,094,300 ist ein Laser-Scanning-Mikroskop
mit einer ersten Lichtquelle, deren Licht von einem ersten Scanner über eine
Probe geführt
wird, und mit einer zweiten Lichtquelle, deren Licht als Manipulationslicht
von einem zweiten Scanner über
die Probe führbar
ist, bekannt.
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Auch
DE 100 39 520 A1 offenbart
ein Rastermikroskop mit zwei Strahlablenkeinrichtungen, die jeweils
das Licht unterschiedlicher Lichtquellen, unabhängig voneinander über bzw.
durch eine Probe führen.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Rastermikroskop
anzugeben, mit dem eine Probe sowohl beobachtbar als auch manipulierbar ist,
wobei die Zahl der mindestens erforderlichen Lichtquellen reduziert
ist und darüber
hinaus eine schnelle Modulation der Manipulations- bzw. Beleuchtungslichtleistung
ermöglicht
ist.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass das akustooptische Bauteil ein Teillichtstrahlenbündel aus
dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel
räumlich abspaltet,
und dass Strahlführungsmittel
vorgesehen sind, die das Teillichtstrahlenbündel – vorzugsweise zur Manipulation – auf die
Probe lenken.
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Das
erfindungsgemäße Rastermikroskop
hat den Vorteil, dass mit dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel und
mit dem Teillichtstrahlenbündel
unabhängig
voneinander die Probe simultan oder sequenziell beobachtet und manipuliert
werden kann. Hierbei ist es ermöglicht,
die Lichtleistung im Beleuchtungslichtstrahlenbündel und im Teillichtstrahlenbündel präzise und
schnell einzustellen.
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Vorteilhafterweise
kann als Teillichtstrahlenbündel
das Licht verwendet werden, das ein die Lichtleistung regelndes
akustooptisches Bauteil ohnehin in eine Strahlfalle lenken würde.
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In
einer besonders bevorzugten Ausgestaltung beinhaltet das akustooptische
Bauteil einen AOTF (acousto optical tunable filter).
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Vorzugsweise
ist eine weitere Strahlablenkeinrichtung zum Führen des Teillichtstrahlenbündels über bzw.
durch die Probe vorgesehen. Die weitere Strahlablenkeinrichtung
kann, wie in der Rastermikroskopie üblich, Galvanometerspiegel
oder akustooptisch ablenkende Scanner oder beispielsweise Mikrospiegel
beinhalten.
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Das
Rastermikroskop beinhaltet ein Objektiv, das das Beleuchtungslichtstrahlenbündel auf
die Probe fokussiert. Vorzugsweise fokussiert das Objektiv auch
das Teillichtstrahlenbündel
auf die Probe. Hierzu werden die Strahlengänge des Beleuchtungslichtstrahlenbündels bzw.
des Teillichtstrahlenbündels
nach Passieren der Strahlablenkeinrichtung bzw. der weiteren Strahlablenkeinrichtung
vor dem Objektiv zusammengeführt.
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In
einer anderen vorteilhaften Ausgestaltungsform des Rastermikroskops
ist ein weiteres Objektiv vorgesehen, das das Teillichtstrahlenbündel auf
die Probe fokussiert. Bei dieser Variante kann die Probe beispielsweise
von oben durch das Objektiv beobachtet werden, während gleichzeitig von unten durch
ein weiteres Objektiv bzw. durch den Kondensor eine Probenmanipulation
erfolgen kann.
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Vorzugsweise
beinhalten die Strahlführungsmittel,
die das Teillichtstrahlenbündel
auf die Probe lenken, einen Lichtleiter.
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In
einer besonderen Variante spaltet das akustooptische Bauteil den
Anteil aus dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel als Teillichtstrahlenbündel ab,
der eine bestimmte Polarisationseigenschaft aufweist. Beispielsweise
kann das von der Lichtquelle ausgehende Beleuchtungslichtstrahlenbündel linear polarisiert
sein, wobei das akustooptische Bauteil beispielsweise den saggital
polarisierten Anteil als Teillichtstrahlenbündel abspaltet und den tangential polarisierten
Anteil als Beleuchtungslichtstrahlenbündel passieren lässt. Durch
Drehung der Polarisationsebene des von der Lichtquelle ausgehenden
Beleuchtungslichtstrahlenbündels
mit einem Polarisationsbeeinflussungsmittel, das beispielsweise
als λ/2-Platte
ausgebildet sein kann, lässt
sich das Verhältnis
der Lichtleistungen von Teillichtstrahlenbündel und von dem durch das
akustooptische Bauteil getretenen Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellen.
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Vorzugsweise
sind Kompensationsmittel vorgesehen, die eine von dem akustooptischen
Bauteil hervorgerufene räumliche
spektrale Aufspaltung des Teillichtstrahlenbündels und/oder des Beleuchtungslichtstrahlenbündels kompensieren.
Diese Kompensationsmittel können
beispielsweise als Prisma und/oder als Gitter und/oder als weiteres
akustooptisches Bauteil ausgebildet sein. Die Kompensation einer
räumlich
spektralen Aufspaltung ist insbesondere dann wichtig, wenn das Teillichtstrahlenbündel und/oder
das Beleuchtungslichtstrahlenbündel
zum weiteren Transport in eine Lichtleitfaser eingekoppelt werden
sollen.
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In
einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante lenkt das
akustooptische Bauteil von der Probe ausgehendes Detektionslicht
mittelbar oder unmittelbar zu einem Detektor bzw. einer Detektoranordnung.
In diesem Fall fungiert das akustooptische Bauteil zusätzlich als
akustooptischer Beamsplitter, wie er beispielsweise in
DE 199 06 757 A1 offenbart
ist.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante
ist das Rastermikroskop ein konfokales Rastermikroskop.
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In
der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder
gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind.
Dabei zeigen:
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1 eine
erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
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2 ein
weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
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3 ein
anderes erfindungsgemäßes Rastermikroskop.
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4 eine
Detailansicht des Strahlverlaufs im Bereich eines akustooptischen
Bauteils und
-
5 eine
weitere Detailansicht des Strahlverlaufs im Bereich eines akustooptischen
Bauteils.
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1 zeigt
ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop
mit einer ersten Lichtquelle 1, die als Argon-Krypton-Laser
ausgebildet ist und einer zweiten Lichtquelle 3, die als
Helium-Neon-Laser ausgebildet ist. Das von der Lichtquelle 1 erzeugte
erste Laserlicht 5 wird mit Hilfe eines dichroitischen
Strahlteilers 7 mit dem von der zweiten Lichtquelle 3 emittierten zweite
Laserlicht 9 zu einem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 vereinigt.
Im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11 befindet
sich ein als AOTF 13 ausgebildetes akustooptisches Bauteil 15 zur
Einstellung der Lichtleistung des Beleuchtungslichtstrahlenbündels. Das
akustooptische Bauteil spaltet aus dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 ein
Teillichtstrahlenbündel 16 ab,
das über
den Umlenkspiegel 17 zu einer weiteren Strahlablenkeinrichtung 19,
die einen weiteren kardanisch aufgehängten Scanspiegel 21 beinhaltet,
geführt
wird. Von der weiteren Strahlablenkeinrichtung 19 gelangt
das Teillichtstrahlenbündel 16 über einen
weiteren Umlenkspiegel 23 zu einem dichroitischen Strahlumlenker 26,
der das Teillichtstrahlenbündel 16 durch
das Objektiv 25 zur Manipulation auf die Probe 27 lenkt. Der übrige Teil
des Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird
mit einem Hauptstrahlteiler 29 zu einer Strahlablenkeinrichtung 31,
die einen kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 33 beinhaltet, geführt. Die Strahlablenkeinrichtung 31 führt das
Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 durch
die nicht gezeigte Scanoptik und die ebenfalls nicht gezeigte Tubusoptik
und das Objektiv 25 über
die Probe 27. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 35 gelangt
auf demselben Lichtweg, nämlich
durch das Objektiv 25 durch die nicht gezeigte Scanoptik
und die nicht gezeigte Tubusoptik hindurch zur Strahlablenkeinrichtung 31 zurück und trifft
nach Passieren des Hauptstrahlteilers 29 und des Detektionspinholes 37 auf
die Detektionseinrichtung 39, die zur Leistung des Detektionslichts
proportionale elektrische Signale erzeugt. Die erzeugten elektrischen
Detektionssignale werden an eine Verarbeitungseinheit 41 weitergegeben,
die auf dem Monitor 43 eines PCs 46 ein Abbild
der Probe darstellt. Die Strahlablenkeinrichtung 31 und
die weitere Strahlablenkeinrichtung 19 werden gemäß den Vorgaben
des Benutzers von der Verarbeitungseinheit 41 gesteuert.
Im Strahlengang des ersten Lasers ist eine λ/2-Platte 45 vorgesehen,
mit der die Polarisationslichtrichtung des vom ersten Laser emittierten Lichts 5 einstellbar ist.
Ebenso ist im Strahlengang des zweiten Lasers 3 eine zweite λ/2-Platte 47 als Polarisationsbeeinflussungsmittel 49 vorgesehen, die
zur Einstellung der Polarisationsrichtung des vom zweiten Laser
emittierten Lichts 9 dient. Durch Drehen der λ/2-Platten 45, 47 lässt sich
das Verhältnis der
Lichtleistungen des Teillichtstrahlenbündels 16 zu dem des
Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11 bezüglich der
jeweiligen von den Lasern emittierten Lichtwellenlängen Anteile
einstellen.
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2 zeigt
ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
bei dem das akustooptische Bauteil 15 als AOTF 13 ausgebildet
ist. Der AOTF 13 hat bei diesem Rastermikroskop zusätzlich die
Aufgabe, das von der Probe ausgehende Detektionslicht 35, der
Detektoreinrichtung 39 zuzuführen. Gleichzeitig spaltet
der AOTF 13 ein Teillichtstrahlenbündel 16 ab, das nach
Durchlaufen eines als weiteren AOTF 51 ausgeführten Kompensationsmittel 53 mit
Hilfe der Optik 55 in eine Lichtleitfaser 57 eingekoppelt wird.
Das mit Hilfe der weiteren Optik 59 aus der Lichtleitfaser 57 ausgekoppelte
Teillichtstrahlenbündel 16 gelangt
anschließend
zu der weiteren Strahlablenkeinrichtung 19 und wird analog
wie bei dem in 1 gezeigten Rastermikroskop über bzw.
durch die Probe geführt.
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3 zeigt
eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops, bei dem
ein weiteres Objektiv 61 vorgesehen ist, um das von der
weiteren Strahlablenkeinrichtung 19 gesteuerte Teillichtstrahlenbündel 16 von
unten auf die Probe 27 zu lenken.
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4 zeigt
eine Detailansicht der Wirkungsweise des akustooptischen Bauteils 15,
das als AOTF 13 ausgeführt
ist. Das von der ersten und der zweiten Lichtquelle kommende Licht 5, 9 wird
mit einem Strahlvereiniger 7 zu einem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 vereinigt
und von der durch den AOTF 13 laufenden akustischen Welle
gebeugt und aufgespalten. Der AOTF 13 spaltet aus dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 ein
Teillichtstrahlenbündel 16 ab,
das über
Strahlführungsmittel
als Manipulationslicht auf die Probe 27 gelenkt wird. Es handelt
sich hierbei um die erste Beugungsordnung für saggital polarisiertes Licht.
In der ersten Ordnung für
tangential polarisiertes Licht befindet sich der Teil des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11,
der zur Strahlablenkeinrichtung 31 geführt wird. Das übrige Licht,
nämlich
das, das akut nicht benötigt
wird, befindet sich hauptsächlich
in der nullten Beugungsordnung und wird in eine Strahlfalle 63 gelenkt.
Prinzipiell wäre
es jedoch auch möglich,
dieses Licht zur Manipulation auf die Probe zu lenken. Mit Hilfe
einer λ/2-Platte 45 im
Strahlengang des Lichtes 5 lässt sich die Orientierung der
Linearpolarisation des Lichts 5 und damit das Verhältnis der
Lichtleistungen des Teillichtstrahlenbündels 16 und des in
die erste Ordnung gebeugten Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11 einstellen.
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5 zeigt
eine weitere Detailansicht, bei der der AOTF 13 ein Teillichtstrahlenbündel 16 abspaltet,
das von einem Umlenkspiegel 65 zu einem Kompensationsmittel 53 gelenkt
wird. Das Kompensationsmittel besteht aus einem weiteren AOTF 51, der
so angeordnet ist, dass er die räumlich
spektrale Aufspaltung, die durch den AOTF 13 verursacht
wurde, rückgängig macht,
so dass die verschiedenen spektralen Anteile des Teillichtstrahlenbündels 16 weitgehend
koaxial verlaufen. Bei diesem Ausführungsbeispiel befindet sich
das Teillichtstrahlenbündel 16 in
der nullten Beugungsordnung, während
das der Strahlablenkeinrichtung zuzuführende Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 in
der ersten Beugungsordnung zu finden ist.
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Die
Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Lichtquelle
- 5
- erstes
Laserlicht
- 7
- Strahlteilers
- 9
- zweites
Laserlicht
- 11
- Beleuchtungslichtstrahlenbündel
- 13
- AOTF
- 15
- akustooptisches
Bauteil
- 16
- Teillichtstrahlenbündel
- 17
- Umlenkspiegel
- 19
- weitere
Strahlablenkeinrichtung
- 21
- weiterer
Scanspiegel
- 23
- weiterer
Umlenkspiegel
- 25
- Objektiv
- 26
- Strahlumlenker
- 27
- Probe
- 29
- Hauptstrahlteiler
- 31
- Strahlablenkeinrichtung
- 33
- Scanspiegel
- 35
- Detektionslicht
- 37
- Detektionspinhole
- 39
- Detektionseinrichtung
- 41
- Verarbeitungseinheit
- 43
- Monitor
- 45
- λ/2-Platte
- 46
- PC
- 47
- λ/2-Platte
- 49
- Polarisationsbeeinflussungsmittel
- 51
- weiterer
AOTF
- 53
- Kompensationsmittel
- 55
- Optik
- 57
- Lichtleitfaser
- 59
- weitere
Optik
- 61
- weiteres
Objektiv
- 63
- Strahlfalle
- 65
- Umlenkspiegel