EP1606665A1 - Rastermikroskop mit konfokalem spaltscanner zum abbilden eines objektes - Google Patents

Rastermikroskop mit konfokalem spaltscanner zum abbilden eines objektes

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Publication number
EP1606665A1
EP1606665A1 EP03770874A EP03770874A EP1606665A1 EP 1606665 A1 EP1606665 A1 EP 1606665A1 EP 03770874 A EP03770874 A EP 03770874A EP 03770874 A EP03770874 A EP 03770874A EP 1606665 A1 EP1606665 A1 EP 1606665A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
detection
light
beam path
scanning microscope
detector
Prior art date
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Ceased
Application number
EP03770874A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Werner Knebel
Holger Birk
Rafael Storz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP1606665A1 publication Critical patent/EP1606665A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
    • G02B21/0084—Details of detection or image processing, including general computer control time-scale detection, e.g. strobed, ultra-fast, heterodyne detection

Definitions

  • the present invention relates to a scanning microscope for imaging an object, with a light source, an almost infinitely variably adjustable spectrally selective element, an almost infinitely variable spectrally selective detection device, an illumination beam path running from the light source to the object, a detection beam path running from the object to the detection device , with the spectrally selective element light of the light source for object illumination being selectable, with the spectrally selective element reflecting and / or scattering selected light from the light source from the detection beam path being faded out, with at least one wavelength range of the light running in the detection beam path with the spectrally selective detection device is detectable.
  • Scanning microscopes in the sense of the present invention are understood to mean microscopes in which the object to be imaged is scanned with an illumination pattern. This raster process is usually meandering, so that the object is scanned with the illumination pattern in a manner similar to how, for example, an electron beam is directed onto the screen of a Braun tube.
  • the inflexible coloring or interference filters arranged in front of the detectors of conventional confocal scanning microscopes are direction for the selection and detection of at least two spectral ranges of a light beam replaced.
  • the light beam is first spectrally broken down with a prism, an optical grating or a hologram.
  • a spectral split light is then used to select a first spectral range with the aid of movably arranged mirror diaphragms and to detect it with a first detector.
  • An optical arrangement is known from DE 199 06 757 A1 with which the dichroic or multichroitic beam splitters of a confocal scanning microscope can be replaced.
  • light of the laser light source is selected for at least one wavelength for object illumination and the light of the laser light source reflected and / or scattered on the object is masked out of the detection beam path.
  • a controllable active optical component is used as the spectrally selective element, which is designed, for example, in the form of an AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) or an AOD (Acousto-Optical-Deflector).
  • the light beam used to illuminate the object has a residence time that is too short per scanned object point. Accordingly, the signal-to-noise ratio of the detected object point is usually too low, if not unusable.
  • physiological applications in particular there is a great need to examine living samples.
  • rapid movement processes take place, which can only be sensibly detected if the detected images of the object can be taken correspondingly quickly.
  • Such a high detection speed usually also results in an insufficient signal-to-noise ratio of the detected image data.
  • the present invention is therefore based on the object of specifying and developing a scanning microscope of the generic type such that an object can also be detected at a high raster speed with an improved signal-to-noise ratio.
  • a parallelization of the scanning process with the scanning microscope results in a longer dwell time of the illuminating light beam on the object and thus the detection of each object point is possible over a longer period of time. This in turn results in an increased signal-to-noise ratio of the light coming from the object and detected by the detection device.
  • a parallelization of the object detection is provided by designing the illumination beam path and the detection beam path in the sense of a confocal gap scanner.
  • the almost infinitely variably adjustable spectrally selective element as well as the almost infinitely variably adjustable detection device is used in conventional scanning microscopes only as a confocal scanning microscope in the sense of a point scanner. This means that the object is scanned in a point-like manner and the spectrally selective element and the spectrally selective detection device act on a point-shaped light beam.
  • both the spectrally selective element and the detection device can also act in a comparable manner on a linear light beam, so that a scanning microscope in the sense of a confocal slit scanner can also be realized with these components.
  • a confocal slit scanner In a confocal slit scanner, the object is illuminated with a linear illumination pattern in the focal plane of the microscope objective of the scanning microscope. A special configuration of the detection beam path then only detects the light coming from the object, which comes from the linearly illuminated object area, for example from the focal plane of the microscope objective.
  • a confocal slit scanner has a confocality in the direction transverse to the linear object lighting. In the direction of the linear object there is almost no confocality. By scanning the object in lines or cells, however, a longer illumination and detection time is achieved for the same frame rate per object point compared to the line-by-point scanning of the object. As a result, weakly fluorescent or living samples with an improved signal-to-noise ratio can also be detected in a particularly advantageous manner.
  • an illumination slit is provided in the illumination beam path.
  • the illumination slit diaphragm is preferably arranged in a plane corresponding to the focal plane of a microscope objective, so that the illumination slit diaphragm is imaged in the focal plane of the microscope objective of the scanning microscope on the illumination side and thus generates a linear illumination pattern in the object area.
  • this line-shaped illumination pattern can be moved relative to the object, for example with a pivotable mirror arranged in the illumination beam path, namely by tilting the illumination beam path in a suitable manner about a pivot point that lies in the entrance pupil of the microscope objective.
  • Detection in the sense of a confocal slit scanner could be achieved in that a detection slit diaphragm is provided in the detection beam path.
  • the detection slit diaphragm is preferably arranged in a plane in the detection beam path that corresponds to the focal plane of the microscope objective.
  • the microscope objective maps the object arranged in its focal plane with the additional optics, which may be arranged in the detection beam path between the microscope objective and the detection slit diaphragm, onto the plane in which the detection slit plane is arranged.
  • the detection slit plane is arranged in the plane corresponding to the focal plane of the microscope objective in such a way that only the light coming from the object can pass through the detection slit aperture, which comes from the linear illumination area from the focal plane of the microscope objective.
  • the length of the linear illumination pattern will have to be shortened accordingly.
  • the width of the linear illumination pattern could have to be varied, which ultimately changes the resolution of the scanning microscopic image across the linear illumination pattern.
  • the gap length and / or the gap width of the illumination slit diaphragm and / or the detection slit diaphragm can be variably adjusted.
  • a variation of the slit length and slit width preferably takes place independently of one another, ie with a certain slit length only the slit width of the illuminating slit diaphragm and / or the detection slit diaphragm can be variably adjusted. Confocal imaging is always ensured if both the illumination slit and the detection slit are changed in the same way with a variation of the slit length and / or the slit width.
  • the illumination slit diaphragm and / or the detection slit diaphragm could comprise diaphragms arranged movably.
  • diaphragms arranged movably.
  • an arrangement of four rectangular diaphragms is conceivable, each of which can be moved or shifted in one direction, preferably motor-controlled.
  • two of the diaphragms, each with one side or edge of a diaphragm could be arranged lying parallel to one another in a plane, the illuminating or detection light then being able to pass between the two sides or edges of the diaphragm, ie the gap being formed in one direction is.
  • the two other diaphragms could be oriented with one side or edge of one diaphragm oriented perpendicularly thereto and arranged essentially in the same plane, so that the two other diaphragms delimit the gap along the direction perpendicular to it.
  • Such an arrangement of four diaphragms enables the gap length to be varied independently of a variation in the gap width of the illumination slit diaphragm and / or the detection slit diaphragm.
  • a variation of the slit length and / or the slit width could also be brought about by a vario-optics assigned to the illuminating slit diaphragm and / or the detection slit diaphragm.
  • the vario optics is here in the lighting or Detection beam path arranged that the effective slit width and / or the effective slit length of the corresponding slit diaphragm can be changed.
  • it could be a zoom optic that changes the overall magnification of the illuminating or detection beam path from the respective aperture to the object.
  • a vario-optic can be used as a fully configured module in the corresponding beam path, so that mechanical adjustment of individual diaphragm parts is advantageously not required.
  • the spectrally selective element comprises a controllable active optical component. As a result, it can be variably adjusted almost infinitely, assuming appropriate control.
  • all of the embodiments of a spectrally selective element disclosed in DE 199 06 757 A1 can be used in the scanning microscope according to the present invention, so that the disclosure content of DE 199 06 757 A1 is expressly included here and is therefore assumed to be known.
  • two AOTF crystals are provided as the spectrally selective element, one of which forms the active optical component, to which a corresponding ultrasonic wave is applied.
  • the other AOTF crystal is arranged as an optically inactive component after the first AOTF crystal in the detection beam path, namely it is arranged in such a way that it reverses a spectral decomposition of the luminescent light coming from the luminescent object as well as a splitting of the different polarization directions by the first AOTF crystal ,
  • the second AOTF crystal is arranged rotated by 180 degrees with respect to the longitudinal axis of the first AOTF crystal.
  • the second AOTF crystal is also subjected to an ultrasound wave. In the arrangement, the crystal serves to further suppress the residual light that was not effectively reflected by the first AOTF crystal.
  • the spectrally selective detection device comprises means for spectrally decomposing the light running in the detection beam path.
  • This means is preferably designed in the form of a prism. Alternatively, a grid or a hologram could be provided.
  • the spectrally selective detection device comprises means which on the one hand have a first detector for selecting a spectral range for detection and on the other hand have means for reflecting at least part of the non-selected spectral range for detection with a second detector.
  • the light running in the detection beam path thus passes through First, the means for spectral decomposition, for example in the form of a prism, and then - spectrally decomposed or spatially fanned out - meets the means for selecting a first spectral range.
  • the part of the spectrally split light that strikes the means for reflecting at least a part of the unselected spectral range is reflected to a second detector.
  • the spectrally selective detection device could thus be designed in accordance with the embodiments known from DE 43 30 347 A1 and DE 199 02 625 A1. In this respect, the disclosure content of these German patent applications is expressly included here and is also assumed to be known in this respect.
  • the means for selecting the first spectral range or the means for reflecting at least a part of the non-selected spectral range are implemented by displaceably arranged diaphragms, slit diaphragms and / or mirror diaphragms, whereby a shift or mechanical adjustment can take place at least almost continuously, there is almost infinitely variable spectrally selective detection device.
  • the detection device has a flat-shaped or a linen-shaped detector.
  • This detector has a spatial resolution corresponding to its area or line shape.
  • the sheet-like or line-shaped detector can be used to detect the detection light that passes through the detection slit and is spectrally split and selected at once.
  • the location information of the scanned object is detected in one direction - parallel to the long side of the detection slit diaphragm.
  • the spectral component of the detection light which was spatially fanned out by the means for spectral decomposition, is detected perpendicular to this for each object point imaged.
  • the detector could comprise a CCD element, which in the form of a CCD array or CCD chip - i.e. a flat CCD element - or a line photomultiplier or a CCD line - i.e. a line-shaped CCD element - or be designed as a CMOS element in combination with an image intensifier.
  • a CCD element which in the form of a CCD array or CCD chip - i.e. a flat CCD element - or a line photomultiplier or a CCD line - i.e. a line-shaped CCD element - or be designed as a CMOS element in combination with an image intensifier.
  • an adaptation lens could be arranged in the detection beam path in front of a detector of the detection device. This could be a lens or a lens arrangement which brings about an enlargement or reduction or a further image.
  • the adaptation optics are preferably designed to be variable, for example in the form of a zoom optics. In this way,
  • a means for combining the light which generates an essentially line-shaped or focused light beam, is arranged in the detection beam path in front of a detector of the detection device.
  • the means for combining the light at least largely reverses the spectral decomposition or spatial fanning out of the means for spectral decomposition of the spectrally selective detection device or at least focuses the spectrally fanned light onto a line that can be detected by the line-shaped detector.
  • the means for bringing the light together could comprise a lens, a prism, a grating or a hologram. If the means for bringing the light together comprises a lens, the spatially fanned out light beam is focused only on one line, the spectral decomposition is in any case not completely reversed with a lens alone. With a correspondingly arranged prism, grating or optical module, which has a hologram, spectral decomposition of the means for spectrally decomposing the detection device could, however, be almost completely reversed, so that the spectrally fanned light beam by the means for combining the light into a linear one Light beam is transferred, which can then be detected by the line-shaped detector.
  • the detector of the detection device could have a readout rate which is in the ⁇ s or ns range.
  • Line or line detectors that have corresponding readout rates are known from the prior art and are used in particular in the above-mentioned applications, in the temporal resolution of the decay behavior of luminescent preparations and in gas injection experiments in explosion chambers.
  • the detector of the detection device could have an activation unit that enables the detector to be activated and deactivated over time.
  • an activation unit is implemented in the case of CCD arrays or CCD chips or CMOS amplifiers with readout rates in the ns range by means of a time gate circuit which enables the detector to be detected in a predefinable time window.
  • the scanning microscope is designed in the sense of a multi-photon microscope. Accordingly, the object or a marker used for object marking can be excited and detected using the methods of multi-photon excitation.
  • a suitable light source is to be provided, for example a laser light source emitting a pulsed light in the near infrared range. A titanium sapphire laser is usually used for this.
  • the spectrally selective element and the spectrally selective detection device are to be set such that, for example, two-photon fluorescence excitation with light of the wavelength from a wavelength range of 720 to 1000 nm and detection of the fluorescence light excited thereby takes place in a range from 400 to 600 nm .
  • the pulse duration of the light emitted by the titanium sapphire laser is preferably in the ps range.
  • other non-linear effects can also be generated and detected in the sample, e.g. the generation of higher harmonics, for example second or third harmony generation, or CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering).
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a first exemplary embodiment of a scanning microscope according to the invention for imaging an object
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a second exemplary embodiment of a scanning microscope according to the invention in a perspective view
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of a detail from the exemplary embodiment from FIG. 2 in a perspective view
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of part of a detection device of a further exemplary embodiment
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of an embodiment of a spectrally selective element known from the prior art
  • Fig. 6 is a schematic representation of an embodiment of a spectrally selective element according to the present invention in a perspective view.
  • the scanning microscope comprises a laser light source 2, which is used to illuminate the object 1.
  • the illuminating beam path 3 extends from the laser light source 2 to the object 1.
  • the scanning microscope further comprises an almost infinitely variably adjustable spectrally selective detection device 4 which detects at least one wavelength range of the light running in the detection beam path 5.
  • the detection beam path 5 runs from the object 1 to the detectors 6 and 7.
  • the spectrally selective element 8 selects light from the laser light source 2 for object illumination by reflecting light of a specific wavelength to the scanning device 9.
  • the non-selected light of the laser light source 2 - for example of different wavelengths - passes through the spectrally selective element 8 and is in the Beam trap 10 absorbed.
  • the selected light of the laser light source 2 reflected and / or scattered on the object 1 is likewise masked out by the spectrally selective element 8 from the detection beam path 5, specifically deflected in the direction of the laser light source 2.
  • the illumination beam path 3 and the detection beam path 5 are designed in the sense of a confocal slit scanner. This can be seen particularly clearly from the perspective illustration of the exemplary embodiment shown in FIG. 2.
  • the light beam emitted by the laser light source 2 is converted by the lens 12 into a linear light beam, which at least for the most part passes through the illumination slit diaphragm 11. 1 only shows the optical axis of the linear beam path, the illuminating beam path 3 and the detection beam path 5 have a linear cross section which is arranged perpendicular to the plane of the drawing.
  • a detection slit diaphragm 13 is provided in the detection beam path 5, which is arranged on the one hand corresponding to the focal plane 14 of the microscope objective 15 and on the other hand corresponding to the illumination slit diaphragm 11.
  • Both the gap length and the gap width of the detection slit diaphragm 13 can be variably adjusted, which is indicated in FIGS. 2 and 3.
  • the detection slit diaphragm 13 in this case comprises four movably arranged diaphragms 16 to 19. In each case one side or edge of the diaphragms 16 to 19 form the gap of the detection slit diaphragm 13.
  • the diaphragms 16 and 17 can be displaced along the directions indicated by the double arrows 20.
  • the panels 18 and 19 can be displaced along the directions indicated by the double arrows 21.
  • the slit width of the detection slit 13 can thus be varied with the orifices 18 and 19.
  • the slit length of the detection slit 13 can be varied with the orifices 16 and 17.
  • the zoom lens 22 is designed in the form of a zoom lens arrangement which varies the overall magnification factor of the illumination beam path 3 - together with the microscope objective 15 - and thus produces a larger or smaller image of the illumination slit aperture 11 in the focal plane 14 of the microscope objective 15 ,
  • the spectrally selective detection device 4 shown in FIGS. 1 to 4 comprises a means 23 for spectrally splitting the light running in the detection beam path 5.
  • the means 23 is designed in the form of a prism.
  • the detection device 4 shown in FIGS. 1 and 4 comprises means 24 and 40 for selecting a first spectral range 25.
  • the light from the first spectral range 25 coming from the object 1 and selected by means 24 and 40 is detected by the detector 6.
  • the means 24 is a displaceably arranged diaphragm which can be moved by the motor 26 along the direction of the double arrow shown in the means 24.
  • the means 40 is a displaceably arranged mirror diaphragm which can be moved by the motor 27 along the direction of the double arrow shown in the means 40.
  • the light reflected at the means 40 is the spectral portion of the light spectrally split by the means 23, which comes from the object 1 and which is not selected for the first detector 6. This light at least for the most part passes through the means 28 for selecting the reflected spectral range and is detected by the detector 7.
  • the lens 29 shown in FIGS. 1 and 4 collimates or focuses the light spectrally split by the means 23 onto the plane in which the means 24 and 40 for selecting the first spectral range 25 are arranged.
  • the detection device 4 has a flat detector 6.
  • the flat detector 6 has a spatial resolution corresponding to its surface shape.
  • the flat detector 6 is designed in the form of a CCD array or a CCD chip.
  • a part of the detection device 4 is shown enlarged in FIG. 3.
  • the spectral information of each detected object point is imaged on the detector 6 along the direction 31.
  • there are lenses and other optical means necessary for guiding and shaping the light are omitted from the figures.
  • the detector 6 shown in FIGS. 2 and 3, designed as a CCD array, has a readout speed of 100 images per second. With an object image size of 512 x 512 pixels, the detector 6 512 times can be read out for an entire object image recording. This results in a total exposure time of an object image of approx. 5 seconds.
  • the raster speed of the scanning device 9 is synchronized with the readout speed of the detector 6 or adapted to it. Thus, both the location information and the spectral information of each pixel are present as the object representation of an object 1 that has been scanned once, given the image size of 512 ⁇ 512 pixels mentioned above.
  • FIG. 4 shows a further exemplary embodiment of a detection device 4, in which between the means 24, 40 for selecting a first spectral range 25 and the detector 32, a means 33 for combining the light, the means 24, 40 for selecting the first spectral range 25 happens is arranged.
  • the means 33 for combining the light is designed in the form of a prism and generates a linear light beam which is detected by the detector 32 designed as a CCD line.
  • a means 33 for combining the light running there is provided, so that the means 33 for combining the light likewise produces a linear light beam which is in the form of the light a line-shaped detector 34 formed on a CCD line.
  • the selected light from the laser light source 2 reflected and / or scattered on the object 1 passes through the first AOTF crystal 36 in the opposite direction, then - bent into the 1st order - hits the mirror 35, which reflects and / or scattered the light coming from the object Light reflected to the laser light source 2.
  • the fluorescent light coming from the object 1 passes through the first AOTF crystal 36 in the 0th order and passes the mirror 35 towards the second AOTF crystal 37.
  • the AOTF crystal 37 is rotated by 180 degrees about the schematically indicated - optical - axis 38 arranged.
  • the second AOTF crystal 37 reverses spectral decomposition of the first AOTF crystal 36 of the fluorescent light and polarization splitting.
  • the two mirrors 39 only serve to bring the light that has passed through the AOTF crystals 36, 37 back coaxially to the optical axis 38.
  • FIG. 6 shows a perspective illustration of the functioning of the spectrally selective element 8 in the confocal scanning microscope according to the invention, which operates in the sense of a confocal slit scanner.
  • a light beam with a linear cross section comes from the laser light source 2, which is reflected by the mirror 35 to the first AOTF crystal 36.
  • the further functioning of the spectrally selective element 8 shown in FIG. 6 essentially corresponds to that of the spectrally selective element 8 shown in FIG. 5, both the part of the illuminating beam path 3 shown in FIG. 6 and the part of the detection beam path 5 shown there in each case has a linear cross section.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Rastermikroskop zum Abbilden eines Objekts (1), mit einer Lichtquelle (2), einem nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven Element (8), einer nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven Detektionseinrichtung (4), einem von der Lichtquelle (2) bis zum Objekt (1) verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang (3), einem vom Objekt (1) zur Detektionseinrichtung (4) verlaufenden Detektionsstrahlengang (5), wobei mit dem spektral selektiven Element (8) Licht der Lichtquelle (2) zur Objektbeleuchtung selektierbar ist, wobei mit dem spektral selektiven Element (8) das am Objekt (1) reflektierte und/oder gestreute selektierte Licht der Lichtquelle (2) aus dem Detektionsstrahlengang (5) ausblendbar ist, wobei zumindest ein Wellenlängenbereich des im Detektionsstrahlengang (5) verlaufenden Lichts mit der spektral selektiven Detektionseinrichtung (4) detektierbar ist, und ist zur Detektion eines Objekts (1) bei einer hohen Rastergeschwindigkeit bei einem verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsstrahlengang (3) und der Detektionsstrahlengang (5) im Sinn eines konfokalen Spaltscanners ausgebildet sind.

Description

RASTERMIKROSKOP MIT KONFOKALEM SPALTSCANNER ZUM ABBILDEN EINES OBJEKTES
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Rastermikroskop zum Abbilden eines Objekts, mit einer Lichtquelle, einem nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven Element, einer nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven Detektionseinrichtung, einem von der Lichtquelle bis zum Objekt verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang, einem vom Objekt zur Detektionseinrichtung verlaufenden Detektionsstrahlengang, wobei mit dem spektral selektiven Element Licht der Lichtquelle zur Objektbeleuchtung selektierbar ist, wobei mit dem spektral selektiven Element das am Objekt reflektierte und/oder gestreute selektierte Licht der Lichtquelle aus dem Detektionsstrahlengang ausblendbar ist, wobei zumindest ein Wellenlängenbereich des im Detektionsstrahlengang verlaufenden Lichts mit der spektral selektiven Detektionseinrichtung detektierbar ist.
Unter Rastermikroskopen im Sinn der vorliegenden Erfindung sind Mikroskope zu verstehen, bei denen das abzubildende Objekt mit einem Beleuchtungsmuster abgerastert wird. Dieser Rastervorgang erfolgt üblicherweise mäanderförmig, so dass das Objekt mit dem Beleuchtungsmuster in ähnlicher Weise abgerastert wird, wie beispielsweise ein Elektronenstrahl auf den Bildschirm einer Braun'schen Röhre gelenkt wird.
Insbesondere bei biomedizinischen Anwendungen werden seit geraumer Zeit ganz besondere Rastermikroskope, nämlich konfokale Rastermikroskope, dann eingesetzt, wenn - verglichen zu konventionellen Auflicht- oder Durchlichtmikroskopen - eine verbesserte Auflösung entlang der optischen Achse benötigt wird. Bezüglich der Ausgestaltung und Einsatzmöglichkeiten konfokaler Rastermikroskope wird beispielsweise auf die Literaturstelle „Handbook of biological confocal microscopy", Editor: J. Pawley, Plenum Press 1995 verwiesen.
Im Rahmen der deutschen Patentanmeldungen DE 43 30 347 A1 und DE 199 02 625 A1 wurde eine Möglichkeit gefunden, die Detektionseinrichtung eines herkömmlichen konfokalen Rastermikroskops durch eine nahezu stufenlos variabel einstellbare spektral selektive Detektionseinrichtung zu ersetzen. Hierzu werden die vor den Detektoren herkömmlicher konfokaler Rastermikroskope angeordneten unflexiblen Färb- oder Interferenzfilter durch den Einsatz einer entsprechenden Vor- richtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls ersetzt. Hierbei wird der Lichtstrahl zunächst mit einem Prisma, einem optischen Gitter oder einem Hologramm spektral zerlegt. Sodann wird von dem spektral zerlegten Licht ein erster Spektralbereich mit Hilfe von beweglich angeordneten Spiegelblenden selektiert und mit einem ersten Detektor detektiert. Das auf die Spiegelblenden treffende, nicht selektierte Licht wird zur Detektion mit einem zweiten Detektor reflektiert. Insoweit ist durch die in den deutschen Patentanmeldungen DE 43 30 347 A1 und DE 199 02 625 A1 beschriebenen Vorrichtungen eine Möglichkeit bekannt, auf die den Detektoren vorgeschalteten, im Hinblick auf die spektrale Einstellungsmöglichkeit unflexiblen Filter zu verzichten.
Aus der DE 199 06 757 A1 ist eine optische Anordnung bekannt, mit der die dichroitischen oder multichroitischen Strahlteiler eines konfokalen Rastermikroskops ersetzt werden können. Hierbei wird mit einem nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven Element Licht der Laserlichtquelle mindestens einer Wellenlänge zur Objektbeleuchtung selektiert und das am Objekt reflektierte und/oder gestreute Licht der Laserlichtquelle aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet. Als spektral selektives Element wird ein ansteuerbares aktives optisches Bauteil eingesetzt, das beispielsweise in Form eines AOTF (Acousto-Optical- Tunable-Filter) oder eines AOD (Acousto-Optical-Deflector) ausgeführt ist.
Insbesondere bei der konfokalen Rastermikroskopie schwach fluoreszierender Proben hat der zur Objektbeleuchtung dienende Lichtstrahl eine zu kurze Verweildauer pro abgerasterten Objektpunkt. Dementsprechend ist das Signal-zu-Rausch-Ver- hältnis des detektierten Objektpunkts in der Regel zu gering, wenn nicht sogar unbrauchbar. Insbesondere bei physiologischen Applikationen besteht ein großer Bedarf, lebende Proben zu untersuchen. Hierbei finden naturgemäß schnelle Bewegungsvorgänge statt, die nur dann in sinnvoller Weise detektiert werden können, wenn die detektierten Bilder des Objekts entsprechend schnell aufgenommen werden können. Eine derart hohe Detektionsgeschwindigkeit ergibt üblicherweise ebenfalls ein ungenügendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis der detektierten Bilddaten.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Rastermikroskop der gattungsbildenden Art derart anzugeben und weiterzubilden, dass ein Objekt auch bei einer hohen Rastergeschwindigkeit mit einem verbesserten Signal-zuRausch-Verhältnis detektiert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren der gattungsbildenden Art löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist ein solches Rastermikroskop dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang im Sinn eines konfokalen Spaltscanners ausgebildet sind.
Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass eine Parallelisierung des Rastervorgangs mit dem Rastermikroskop eine längere Verweildauer des Beleuchtungslichtsstrahls auf dem Objekt zur Folge hat und somit über einen längeren Zeitraum die Detektion eines jeden Objektpunkts möglich ist. Dies wiederum ergibt ein erhöhtes Signal-zu-Rausch-Verhältnis des mit der Detektionseinrichtung detektierten, vom Objekt kommenden Lichts. Eine Parallelisierung der Objektdetektion ist durch eine Ausbildung des Beleuchtungsstrahiengangs und des Detektionsstrah- lengangs im Sinn eines konfokalen Spaltscanners vorgesehen.
Das nahezu stufenlos variabel einstellbare spektral selektive Element wie auch die nahezu stufenlos variabel einstellbare Detektionseinrichtung wird bei konventionellen Rastermikroskopen lediglich als konfokales Rastermikroskop im Sinn eines Punktscanners eingesetzt. Das heißt, das Objekt wird punktförmig abgerastert und das spektral selektive Element und die spektral selektive Detektionseinrichtung wirken auf einen punktförmigen Lichtstrahl. Sowohl das spektral selektive Element als auch die Detektionseinrichtung können jedoch auch auf einen linienförmigen Lichtstrahl in vergleichbarer Weise wirken, so dass mit diesen Komponenten auch ein Rastermikroskop im Sinn eines konfokalen Spaltscanners realisiert werden kann.
Bei einem konfokalen Spaltscanner wird das Objekt mit einem linienförmigen Beleuchtungsmuster in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs des Rastermikroskops beleuchtet. Durch eine besondere Ausgestaltung des Detektionsstrahlengangs wird dann lediglich das vom Objekt kommende Licht detektiert, das aus dem linienförmig beleuchteten Objektbereich kommt, beispielsweise aus der Fokalebene des Mikroskopobjektivs. Ein konfokaler Spaltscanner hat eine Konfokalität in Richtung quer zur linienförmigen Objektbeleuchtung. In Richtung der linienförmigen Objektbe- leuchtung liegt so gut wie keine Konfokalität vor. Durch das linien- bzw. zellenförmige Abtasten des Objekts wird jedoch - verglichen zum zeilenweise punktförmigen Abrasten des Objekts - bei derselben Bildrate pro Objektpunkt eine längere Be- leuchtungs- und Detektionsdauer erreicht. Hierdurch können in besonders vorteilhafter Weise auch schwach fluoreszierende oder lebende Proben mit einem verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis detektiert werden.
In einer konkreten Ausführungsform ist im Beleuchtungsstrahlengang eine Beleuchtungsspaltblende vorgesehen. Die Beleuchtungsspaltblende ist hierbei vorzugsweise in einer zur Fokalebene eines Mikroskopobjektivs korrespondierenden Ebene angeordnet, so dass beleuchtungsseitig die Beleuchtungsspaltblende in die Fokalebene des Mikroskopobjektivs des Rastermikroskops abgebildet wird und somit ein linienförmiges Beleuchtungsmuster im Objektbereich generiert. Zum Abra- stern des Objekts kann dieses linienförmige Beleuchtungsmuster beispielsweise mit einem im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten schwenkbaren Spiegel relativ zum Objekt bewegt werden, indem dieser nämlich den Beleuchtungsstrahlengang in geeigneter Weise um einen Drehpunkt verkippt, der in der Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs liegt.
Eine Detektion im Sinn eines konfokalen Spaltscanners könnte dadurch erzielt werden, dass im Detektionsstrahlengang eine Detektionsspaltblende vorgesehen ist. Die Detektionsspaltblende ist vorzugsweise in einer Ebene im Detektionsstrahlengang angeordnet, die zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs korrespondiert. Mit anderen Worten bildet das Mikroskopobjektiv das in seiner Fokalebene angeordnete Objekt mit der zusätzlichen Optik, die eventuell im Detektionsstrahlengang zwischen Mikroskopobjektiv und Detektionsspaltblende angeordnet ist, auf die Ebene ab, in der die Detektionspaltebene angeordnet ist. Die Detektionsspaltebene ist in der zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs korrespondierenden Ebene derart angeordnet, dass lediglich das vom Objekt kommende Licht die Detektionsspaltblende passieren kann, das aus dem linienförmigen Beleuchtungsbereich aus der Fokalebene des Mikroskopobjektivs kommt. Insoweit liegt bezüglich der Beleuchtungsspaltblende und der Detektionsspaltblende eine konfokale Anordnung vor.
Nun kann es von Applikation zu Applikation erforderlich sein, die Form des Beleuchtungsmusters variieren zu können. So könnte lediglich ein Teil der insgesamt abbildbaren Fokalebene des Mikroskopobjektivs detektiert werden, beispielsweise in Form einer Region-of-Interest-Abbildung. Hierzu wird die Länge des linienförmigen Beleuchtungsmusters entsprechend zu verkürzen sein. Andererseits könnte die Breite des linienförmigen Beleuchtungsmusters zu variieren sein, wodurch letztendlich die Auflösung der rastermikroskopischen Abbildung quer zum linienförmigen Beleuchtungsmuster verändert wird. Hierzu ist vorgesehen, dass die Spaltlänge und/oder die Spaltbreite der Beleuchtungsspaltblende und/oder der Detektionsspaltblende variabel einstellbar ist. Eine Variation der Spaltlänge und Spaltbreite erfolgt hierbei vorzugsweise unabhängig voneinander, d.h. bei einer bestimmten Spaltlänge ist lediglich die Spaltbreite der Beleuchtungsspaltblende und/oder der Detektionsspaltblende variabel einstellbar. Eine konfokale Abbildung ist stets dann sichergestellt, wenn sowohl die Beleuchtungsspaltblende als auch die Detektionsspaltblende bei einer Variation der Spaltlänge und/oder der Spaltbreite in gleicher Weise verändert werden.
Im Konkreten könnte die Beleuchtungsspaltblende und/oder die Detektionsspaltblende beweglich angeordnete Blenden umfassen. Beispielsweise ist eine Anordnung von vier rechteckförmigen Blenden denkbar, die jeweils in einer Richtung bewegt bzw. verschoben werden können, vorzugsweise motorgesteuert. Jeweils zwei der Blenden könnten mit jeweils einer Seite bzw. Kante einer Blende parallel zueinander in einer Ebene liegend angeordnet sein, wobei zwischen den beiden Seiten bzw. Kanten der Blende dann das Beleuchtungs- bzw. Detektionslicht passieren kann, also der Spalt in einer Richtung gebildet ist. Die beiden anderen Blenden könnten mit einer Seite bzw. Kante jeweils einer Blende senkrecht dazu orientiert ausgerichtet sein und im Wesentlichen in der gleichen Ebene angeordnet sein, so dass die beiden anderen Blenden den Spalt entlang der Richtung senkrecht dazu begrenzen. Eine solche Anordnung von vier Blenden ermöglicht eine Variation der Spaltlänge unabhängig von einer Variation der Spaltbreite der Beleuchtungsspaltblende und/oder der Detektionsspaltblende.
Eine Variation der Spaltlänge und/oder der Spaltbreite könnte auch durch eine jeweils der Beleuchtungsspaltblende und/oder der Detektionsspaltblende zugeordnete Vario-Optik bewirkt werden. Die Vario-Optik ist hierbei derart im Beleuchtungsbzw. Detektionsstrahlengang angeordnet, dass die wirksame Spaltbreite und/oder die wirksame Spaltlänge der entsprechenden Spaltblende verändert werden kann. Im Konkreten könnte es sich um eine Zoom-Optik handeln, die nämlich die Gesamtvergrößerung des Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengangs von der jeweiligen Blende zum Objekt verändert. Eine Vario-Optik kann unter Umständen als fertig konfigurierte Baugruppe in den entsprechenden Strahlengang eingesetzt werden, so dass in vorteilhafter Weise eine mechanische Verstellung einzelner Blendenteile nicht erforderlich ist.
Das spektral selektive Element umfasst ein ansteuerbares aktives optisches Bauteil. Hierdurch ist es, eine entsprechende Ansteuerung vorausgesetzt, nahezu stufenlos variabel einstellbar. Grundsätzlich können alle aus der DE 199 06 757 A1 bekannten Ausführungsformen eines dort offenbarten spektral selektiven Elements bei dem hier vorliegenden erfindungsgemäßen Rastermikroskop zum Einsatz kommen, so dass der Offenbarungsgehalt der DE 199 06 757 A1 hier ausdrücklich hinzugezogen und insoweit als bekannt vorausgesetzt wird. Besonders bevorzugt sind als spektral selektives Element zwei AOTF-Kristalle vorgesehen, wobei eines davon das aktive optische Bauteil bildet, das mit einer entsprechenden Ultraschallwelle beaufschlagt wird. Der andere AOTF-Kristall ist als optisch inaktives Bauteil dem ersten AOTF-Kristall im Detektionsstrahlengang nachgeordnet, und zwar ist er derart angeordnet, dass er eine spektrale Zerlegung des vom Lumineszenzobjekt kommenden Lumineszenzlichts sowie eine Aufspaltung der unterschiedlichen Polarisationsrichtungen durch den ersten AOTF-Kristall rückgängig macht. Hierzu ist der zweite AOTF-Kristall bezüglich der Längsachse des ersten AOTF-Kristalls um 180 Grad verdreht angeordnet. In einer anderen Ausführungsform wird der zweite AOTF-Kristall ebenfalls mit einer Ultraschallwelle beaufschlagt. In der Anordnung dient der Kristall zur weiteren Unterdrückung des Restlichtes, das vom ersten AOTF-Kristall nicht wirksam reflektiert wurde.
Die spektral selektive Detektionseinrichtung umfasst Mittel zur spektralen Zerlegung des im Detektionsstrahlengang verlaufenden Lichts. Vorzugsweise ist dieses Mittel in Form eines Prismas ausgeführt. Alternativ könnte ein Gitter oder ein Hologramm vorgesehen sein. Weiterhin umfasst die spektral selektive Detektionseinrichtung Mittel, die einerseits zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs zur Detektion mit einem ersten Detektor und andererseits Mittel zur Reflektion zumindest eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs zur Detektion mit einem zweiten Detektor aufweist. Somit durchläuft das im Detektionsstrahlengang verlaufende Licht zunächst das beispielsweise in Form eines Prismas ausgeführte Mittel zur spektralen Zerlegung und trifft dann - spektral zerlegt bzw. räumlich aufgefächert - auf das Mittel zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs. Der Teil des spektral zerlegten Lichts, der auf das Mittel zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs auftrifft, wird zu einem zweiten Detektor reflektiert. Die spektral selektive Detektionseinrichtung könnte somit gemäß den Ausführungsformen, die aus den DE 43 30 347 A1 und DE 199 02 625 A1 bekannt sind, ausgeführt sein. Insoweit wird der Offenbarungsgehalt dieser deutschen Patentanmeldungen hier ausdrücklich hinzugezogen und ebenfalls insoweit als bekannt vorausgesetzt.
Falls die Mittel zum Selektieren des ersten Spektralbereichs bzw. die Mittel zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs durch verschiebbar angeordnete Blenden, Spaltblenden und/oder Spiegelblenden realisiert sind, wobei eine Verschiebung bzw. mechanische Verstellung zumindest nahezu stufenlos erfolgen kann, liegt eine nahezu stufenlos variabel einstellbare spektral selektive Detektionseinrichtung vor.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Detektionseinrichtung einen flächenförmigen oder einen linenförmigen Detektor auf. Dieser Detektor weist eine seiner Flächen- oder Linienform entsprechende Ortsauflösung auf. Insoweit kann mit dem flächenförmigen oder linienförmigen Detektor das die Detektionsspaltblende passierende und spektral zerlegte und selektierte Detektionsslicht auf einmal detektiert werden. Im Fall eines flächenförmigen Detektors wird in einer Richtung - parallel zur Längsseite der Detektionsspaltblende - die Ortsinformation des abgerasterten Objekts detektiert. Senkrecht dazu wird für jeden abgebildeten Objektpunkt die spektrale Komponente des Detektionslichts detektiert, die vom Mittel zur spektralen Zerlegung räumlich aufgefächert wurde.
Im Konkreten könnte der Detektor ein CCD-Element umfassen, das in Form eines CCD-Arrays bzw. CCD-Chips - also ein flächenförmiges CCD-Element - oder eines Zeilen-Photomultipliers oder einer CCD-Zeile - also ein linienförmiges CCD-Element - oder als CMOS-Element in Kombination mit einem Bildverstärker ausgebildet sein. Falls die Form des Lichtstrahls des zu detektierenden Spektralbereichs auf die Detektorform - also beispielsweise flächen- oder linienförmig - anzupassen ist, könnte im Detektionsstrahlengang vor einem Detektor der Detektionseinrichtung eine Adaptionsoptik angeordnet sein. Hierbei könnte es sich um eine Linse oder eine Linsenanordnung handeln, die eine Vergrößerung oder Verkleinerung oder eine weitere Abbildung bewirkt. Vorzugsweise ist die Adaptionsoptik variabel ausgeführt, beispielsweise in Form einer Zoom-Optik. Hierdurch könnte in besonders vorteilhafter Weise ein Lichtstrahl kleinerer räumlicher Ausmaße auf die volle Fläche bzw. Linie des flächen- oder linienförmigen Detektors vergrößert werden.
Insbesondere wenn ein linienförmiger Detektor zur Detektion des Detektionslichts eingesetzt wird, ist es von Vorteil, wenn im Detektionsstrahlengang vor einem Detektor der Detektionseinrichtung ein Mittel zum Zusammenführen des Lichts angeordnet ist, das einen im Wesentlichen linienförmigen oder fokussierten Lichtstrahl erzeugt. Das Mittel zum Zusammenführen des Lichts macht die spektrale Zerlegung bzw. räumliche Auffächerung des Mittels zur spektralen Zerlegung der spektral selektiven Detektionseinrichtung zumindest weitgehend rückgängig oder fokussiert zumindest das spektral aufgefächerte Licht auf eine Linie, der von dem linienförmigen Detektor detektiert werden kann.
Das Mittel zum Zusammenführen des Lichts könnte eine Linse, ein Prisma, ein Gitter oder ein Hologramm umfassen. Falls das Mittel zum Zusammenführen des Lichts eine Linse umfasst, wird der räumlich aufgefächerte Lichtstrahl lediglich auf eine Linie fokussiert, die spektrale Zerlegung wird mit einer Linse allein jedenfalls nicht vollständig rückgängig gemacht. Mit einem entsprechend angeordneten Prisma, Gitter oder optischen Baustein, das ein Hologramm aufweist, könnte jedoch eine spektrale Zerlegung des Mittels zur spektralen Zerlegung der Detektionseinrichtung nahezu vollständig rückgängig gemacht werden, so dass der spektral aufgefächerte Lichtstrahl durch das Mittel zum Zusammenführen des Lichts in einen linienförmigen Lichtstrahl überführt wird, der sodann von dem linienförmigen Detektor detektiert werden kann.
Insbesondere für Fluoreszenzlebensdauer-Applikationen oder Photon-Counting- Applikationen könnte der Detektor der Detektionseinrichtung eine Ausleserate aufweisen, die im μs- oder ns-Bereich liegt. Linien- oder zeilenförmige Detektoren, die entsprechende Ausleseraten aufweisen, sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden insbesondere bei den obengenannten Applikationen, bei der zeitlichen Auflösung des Abklingverhaltens von Lumineszenzpräparaten sowie bei Gasinjektionsexperimenten in Explosionskammern eingesetzt.
Insbesondere könnte der Detektor der Detektionseinrichtung eine Aktivierungseinheit aufweisen, die ein zeitliche Aktivierung und Deaktivierung des Detektors ermöglicht. Eine solche Aktivierungseinheit ist bei CCD-Arrays bzw. CCD-Chips oder CMOS-Verstärkem mit Ausleseraten im ns-Bereich durch eine Time-Gate-Schaltung realisiert, die eine Detektion des Detektors in einem vorgebbaren zeitlichen Fenster ermöglicht.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Rastermikroskop im Sinn eines Mehr-Photonen-Mikroskops ausgeführt. Dementsprechend kann das Objekt bzw. ein zur Objektmarkierung dienender Marker mit den Methoden der Mehr-Photonen-Anregung angeregt und detektiert werden. Insoweit ist eine hierzu geeignete Lichtquelle vorzusehen, beispielsweise eine ein gepulstes Licht im nahen Infrarot-Bereich emittierende Laserlichtquelle. Üblicherweise wird hierzu ein Titan- Saphir-Laser eingesetzt. Weiterhin ist das spektral selektive Element sowie die spektral selektive Detektionseinrichtung derart einzustellen, dass beispielsweise eine Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung mit Licht der Wellenlänge aus einem Wellenlängenbereich von 720 bis 1000 nm und eine Detektion des hiermit angeregten Fluoreszenzlichts in einem Bereich von 400 bis 600 nm erfolgt. Die Pulsdauer des von dem Titan-Saphir-Laser emittierten Lichts liegt vorzugsweise im ps- Bereich. Neben der Zwei-Photonen-Fluoreszenz sind auch noch andere nichtlineare Effekte in der Probe erzeugbar und detektierbar, wie z.B. die Erzeugung höherer Harmonischer, beispielsweise Second- oder Third Harmonie Generation, oder CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering).
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im All- gemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops zum Abbilden eines Objekts,
Fig. 2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops in perspektivischer Ansicht,
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Ausschnitts aus dem Ausführungsbeispiel aus Fig. 2 in perspektivischer Ansicht,
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines Teils einer Detektionseinrichtung eines weiteren Ausführungsbeispiels,
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines aus dem Stand der Technik bekannten Ausführungsbeispiels eines spektral selektiven Elements und
Fig. 6 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines spektral selektiven Elements gemäß der hier vorliegenden Erfindung in einer perspektivischen Ansicht.
Fig. 1 zeigt ein Rastermikroskop zum Abbilden eines Objekts 1. Das Rastermikroskop umfasst eine Laseriichtquelle 2, die zur Objektbeleuchtung des Objekts 1 dient. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 erstreckt sich von der Laserlichtquelle 2 zum Objekt 1. Das Rastermikroskop umfasst des Weiteren eine nahezu stufenlos variabel einstellbare spektral selektive Detektionseinrichtung 4, die zumindest einen Wellenlängenbereich des im Detektionsstrahlengang 5 verlaufenden Lichts detektiert. Der Detektionsstrahlengang 5 verläuft vom Objekt 1 bis zu den Detektoren 6 und 7. Das spektral selektive Element 8 selektiert Licht der Laserlichtquelle 2 zur Objektbeleuchtung, indem es Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Scaneinrichtung 9 reflektiert. Das nicht selektierte Licht der Laserlichtquelle 2 - beispielsweise anderer Wellenlängen - passiert das spektral selektive Element 8 und wird in der Strahlfalle 10 absorbiert. Das am Objekt 1 reflektierte und/oder gestreute selektierte Licht der Laserlichtquelle 2 wird ebenfalls vom spektral selektiven Element 8 aus dem Detektionsstrahlengang 5 ausgeblendet, und zwar in Richtung zur Laserlichtquelle 2 abgelenkt.
Erfindungsgemäß ist der Beleuchtungsstrahlengang 3 und der Detektionsstrahlengang 5 im Sinn eines konfokalen Spaltscanners ausgebildet. Dies ist der perspektivischen Darstellung des in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiels besonders deutlich entnehmbar.
In Fig. 1 ist gezeigt, dass im Beleuchtungsstrahlengang 3 eine Beleuchtungsspaltblende 11 vorgesehen ist. Der von der Laserlichtquelle 2 emittierte Lichtstrahl wird von der Linse 12 in einen linienförmigen Lichtstrahl umgewandelt, der zumindest größtenteils die Beleuchtungsspaltblende 11 passiert. In Fig. 1 ist lediglich die optische Achse des linienförmigen Strahlengangs gezeigt, der Beleuchtungsstrahlengang 3 und der Detektionsstrahlengang 5 weisen einen linienförmigen Querschnitt auf, der senkrecht zur Zeichenebene angeordnet ist.
Im Detektionsstrahlengang 5 ist eine Detektionsspaltblende 13 vorgesehen, die einerseits korrespondierend zur Fokalebene 14 des Mikroskopobjektivs 15 und andererseits korrespondierend zur Beleuchtungsspaltblende 11 angeordnet ist.
Sowohl die Spaltlänge als auch die Spaltbreite der Detektionsspaltblende 13 ist variabel einstellbar, was in den Fig. 2 und 3 angedeutet ist. Die Detektionsspaltblende 13 umfasst hierbei vier beweglich angeordnete Blenden 16 bis 19. Jeweils eine Seite bzw. Kante der Blenden 16 bis 19 bilden den Spalt der Detektionsspaltblende 13. Die Blenden 16 und 17 sind entlang der mit den Doppelpfeilen 20 angedeuteten Richtungen verschiebbar. Die Blenden 18 und 19 sind entlang den mit den Doppelpfeilen 21 angedeuteten Richtungen verschiebbar. Somit kann mit den Blenden 18 und 19 die Spaltbreite der Detektionsspaltblende 13 variiert werden. Mit den Blenden 16 und 17 kann die Spaltlänge der Detektionsspaltblende 13 variiert werden.
In Fig. 1 ist gezeigt, dass zwischen der Beleuchtungsspaltblende 11 und dem spektral selektivem Element 8 eine Vario-Optik 22 angeordnet ist, mit der die wirksame Spaltbreite und die wirksame Spaltlänge der Beleuchtungsspaltblende 11 verändert werden kann. Die Vario-Optik 22 ist in Form einer Zoom-Linsen-Anordnung ausgebildet, die den Gesamt-Vergrößerungsfaktor des Beleuchtungsstrahlengangs 3 - zusammen mit dem Mikroskopobjektiv 15 - variiert und somit ein größeres oder kleineres Bild der Beleuchtungsspaltblende 11 in der Fokalebene 14 des Mikroskopobjektivs 15 erzeugt.
Die in den Fig. 1 bis 4 gezeigte spektral selektive Detektionseinrichtung 4 umfasst ein Mittel 23 zur spektralen Zerlegung des im Detektionsstrahlengang 5 verlaufenden Lichts. Das Mittel 23 ist in Form eines Prismas ausgeführt. Weiterhin umfasst die in den Fig. 1 und 4 gezeigte Detektionseinrichtung 4 Mittel 24 und 40 zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs 25. Das vom Objekt 1 kommende, mit dem Mittel 24 und 40 selektierte Licht des ersten Spektralbereichs 25 wird mit dem Detektor 6 detektiert. Das Mittel 24 ist eine verschiebbar angeordnete Blende, die mit dem Motor 26 entlang der Richtung des bei dem Mittel 24 eingezeichneten Doppelpfeils bewegbar ist.
Das Mittel 40 ist eine verschiebbar angeordnete Spiegelblende, die vom Motor 27 entlang der Richtung des bei dem Mittel 40 eingezeichneten Doppelpfeils bewegbar ist. Das am Mittel 40 reflektierte Licht ist der spektrale Anteil des vom Mittel 23 spektral zerlegten Lichts, das vom Objekt 1 kommt und das nicht für den ersten Detektor 6 selektiert ist. Dieses Licht passiert zumindest größtenteils das Mittel 28 zum Selektieren des reflektierten Spektralbereichs und wird mit dem Detektor 7 detektiert. Die in den Fig. 1 und 4 gezeigte Linse 29 kollimiert bzw. fokussiert das vom Mittel 23 spektral zerlegte Licht auf die Ebene, in der das Mittel 24 und 40 zum Selektieren des ersten Spektralbereichs 25 angeordnet ist.
In den Fig. 2 und 3 ist perspektivisch angedeutet, dass die Detektionseinrichtung 4 einen flächenförmigen Detektor 6 aufweist. Der flächenförmige Detektor 6 weist eine seiner Flächenform entsprechenden Ortsauflösung auf. Der flächenförmige Detektor 6 ist in Form eines CCD-Arrays bzw. eines CCD-Chips ausgebildet. In Fig. 3 ist ein Teil der Detektionseinrichtung 4 vergrößert gezeigt. Hierbei ist schematisch angedeutet, dass entlang der Richtung 30 die Ortsinformation des vom Objekt 1 kommenden Lichts entlang des linienförmigen Beleuchtungsmusters detektierbar ist. Entlang der Richtung 31 ist die spektrale Information eines jeden detektierten Objektpunkts auf den Detektor 6 abgebildet. Zur besseren Anschauung sind Linsen und andere optische Mittel, die zur Führung und Formung des Lichtes notwendig sind, in den Figuren weggelassen.
Der in den Fig. 2 und 3 gezeigte, als CCD-Array ausgebildete Detektor 6 weist eine Auslesegeschwindigkeit von 100 Bildern pro Sekunde auf. Bei einer Objektbildgröße von 512 x 512 Pixeln ist für eine gesamte Objektbildaufnahme der Detektor 6 512 mal auszulesen. Somit ergibt sich eine Gesamtaufnahmedauer eines Objektbilds von ca. 5 Sekunden. Die Rastergeschwindigkeit der Scaneinrichtung 9 ist mit der Auslesegeschwindigkeit des Detektors 6 synchronisiert bzw. darauf angepasst. Somit liegt als Objektrepräsentation eines einmal abgerasterten Objekts 1 - bei der obengenannten Bildgröße von 512 x 512 Pixel - sowohl die Ortsinformation als auch die spektrale Information eines jeden Bildpunkts vor.
In Fig. 4 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Detektionseinrichtung 4 gezeigt, bei der zwischen den Mitteln 24, 40 zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs 25 und dem Detektor 32 ein Mittel 33 zum Zusammenführen des Lichts, das die Mittel 24, 40 zum Selektieren des ersten Spektralbereichs 25 passiert, angeordnet ist. Das Mittel 33 zum Zusammenführung des Lichts ist in Form eines Prismas ausgebildet und erzeugt einen linienförmigen Lichtstrahl, der von dem als CCD-Zeile ausgebildeten Detektor 32 detektiert wird. In gleicher Weise ist zwischen dem Mittel 28 zum Selektieren des reflektierten Spektralbereichs und dem Detektor 34 ein Mittel 33 zum Zusammenführen des dort verlaufenden Lichts vorgesehen, so dass durch das Mittel 33 zum Zusammenführen des Lichts ebenfalls ein linienförmiger Lichtstrahl erzeugt wird, der mit dem in Form einer CCD-Zeile ausgebildeten, linienförmigen Detektor 34 detektiert wird.
Die Fig. 5 und 6 zeigen eine Detailvergrößerung eines spektral selektiven Elements 8. Der im Querschnitt punktförmige Lichtstrahl des Lichts der Laserlichtquelle 2 trifft auf einen Spiegel 35, der das Licht in einen ersten AOTF-Kristall 36 reflektiert. Falls der AOTF-Kristall 36 derart eingestellt ist, dass kein Licht der Laserlichtquelle 2 zur Objektbeleuchtung selektiert wird, durchläuft dieses Licht den ersten AOTF-Kristall 36 derart, dass es vollständig von der Strahlfalle 10 absorbiert wird. Falls der erste AOTF-Kristall derart eingestellt wird, dass beispielsweise Licht einer Wellenlänge zur Objektbeleuchtung selektiert wird, durchläuft dieses Licht den ersten AOTF-Kristall 36 abgelenkt - in die 1. Ordnung gebeugt -, so dass es in den Beleuchtungs- strahlengang 3 eintritt und zur Objektbeleuchtung genutzt wird, was durch den unteren Pfeil auf das Objekt 1 angedeutet ist. Das am Objekt 1 reflektierte und/oder gestreute selektierte Licht der Laserlichtquelle 2 durchläuft den ersten AOTF-Kristall 36 in umgekehrter Richtung, trifft sodann - in die 1. Ordnung gebeugt - auf den Spiegel 35, der das vom Objekt kommende reflektierte und/oder gestreute Licht zur Laserlichtquelle 2 reflektiert. Das vom Objekt 1 kommende Fluoreszenzlicht durchläuft den ersten AOTF-Kristall 36 in der 0. Ordnung und passiert den Spiegel 35 hin zum zweiten AOTF-Kristall 37. Der AOTF-Kristall 37 ist um die schematisch angedeutete - optische - Achse 38 um 180 Grad gedreht angeordnet. Somit macht der zweite AOTF-Kristall 37 eine spektrale Zerlegung des ersten AOTF-Kristalls 36 des Fluoreszenzlichts sowie eine Polarisationsaufspaltung rückgängig. Die beiden Spiegel 39 dienen lediglich dazu, das die AOTF-Kristalle 36, 37 durchlaufene Licht wieder koaxial zur optischen Achse 38 zu bringen.
Fig. 6 zeigt in einer perspektivischen Darstellung die Funktionsweise des spektral selektiven Elements 8 bei dem erfindungsgemäßen konfokalen Rastermikroskop, das im Sinn eines konfokalen Spaltscanners arbeitet. Hierbei kommt von der Laserlichtquelle 2 ein im Querschnitt linienförmig ausgebildeter Lichtstrahl, der vom Spiegel 35 zum ersten AOTF-Kristall 36 reflektiert wird. Die weitere Funktionsweise des in Fig. 6 gezeigten spektral selektiven Elements 8 entspricht im Wesentlichen dem des in Fig. 5 gezeigten spektral selektiven Elements 8, wobei sowohl der in Fig. 6 gezeigte Teil des Beleuchtungsstrahlengangs 3 als auch der dort gezeigte Teil des Detektionsstrahlengangs 5 jeweils einen linienförmigen Querschnitt aufweist.
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Rastermikroskop zum Abbilden eines Objekts (1), mit einer Lichtquelle (2), einem nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven Element (8), einer nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven Detektionseinrichtung (4), einem von der Lichtquelle (2) bis zum Objekt (1) verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang (3), einem vom Objekt (1) zur Detektionseinrichtung (4) verlaufenden Detektionsstrahlengang (5), wobei mit dem spektral selektiven Element (8) Licht der Lichtquelle (2) zur Objektbeleuchtung selektierbar ist, wobei mit dem spektral selektiven Element (8) das am Objekt (1) reflektierte und/oder gestreute selektierte Licht der Lichtquelle (2) aus dem Detektionsstrahlengang (5) ausblendbar ist, wobei zumindest ein Wellenlängenbereich des im Detektionsstrahlengang (5) verlaufenden Lichts mit der spektral selektiven Detektionseinrichtung (4) detektierbar ist, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass der Beleuchtungsstrahlengang (3) und der Detektionsstrahlengang (5) im Sinn eines konfokalen Spaltscanners ausgebildet sind.
2. Rastermikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (3) eine Beleuchtungsspaltblende (11 ) vorgesehen ist.
3. Rastermikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang (5) eine Detektionsspaltblende (13) vorgesehen ist.
4. Rastermikroskop nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltlänge und/oder die Spaltbreite der Beleuchtungsspaltblende (11) und/oder der Detektionsspaltblende (13) variabel einstellbar ist.
5. Rastermikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsspaltblende (11) und/oder die Detektionsspaltblende (13) beweglich angeordnete Blenden (16, 17, 18, 19) umfasst, wobei vorzugsweise eine Seite einer jeden Blende (16, 17, 18, 19) den Spalt der Beleuchtungsspaltblende (11) bzw. der Detektionsspaltblende (13) bildet.
6. Rastermikroskop nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsspaltblende (11) und/oder der Detektionsspaltblende (13) jeweils eine Vario-Optik (22) zugeordnet ist, mit der die wirksame Spaltbreite und/oder die wirksame Spaltlänge der Beleuchtungsspaltblende (11) bzw. der Detektionsspaltblende (13) veränderbar ist bzw. sind.
7. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das spektral selektive Element (8) ein ansteuerbares aktives optisches Bauteil umfasst, vorzugsweise einen AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) oder einen AOD (Acousto-Opti- cal-Deflector).
8. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die spektral selektive Detektionseinrichtung (4) Mittel (23) zur spektralen Zerlegung des im Detektionsstrahlengang (5) verlaufenden Lichts - vorzugsweise in Form eines Prismas -, Mittel (24, 40) zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs (25) zur Detektion mit einem ersten Detektor (6) und Mittel (24, 40) zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs zur Detektion mit einem zweiten Detektor (7) aufweist.
9. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (4) einen flächenförmigen oder einen linienförmigen Detektor (6, 7, 32, 34) aufweist, der eine seiner Flächen- oder Linienform entsprechende Ortsauflösung aufweist.
10. Rastermikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6, 7, 32, 34) ein CCD-Element umfasst, das in Form eines CCD-Arrays oder einer CCD-Zeile ausgebildet ist.
11. Rastermikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang (5) vor einem Detektor (6, 7, 32, 34) der Detektionseinrichtung (4) eine - vorzugsweise variierbare - Adaptionsoptik angeordnet ist, mit der die Form des Lichtstrahls des zu detektierenden Spektralbereichs auf die Detektorform anpassbar ist.
12. Rastermikroskop nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang (5) vor einem Detektor (32, 34) der Detektionseinrichtung (4) ein Mittel (33) zum Zusammenführen des Lichts angeordnet ist, das einen im Wesentlichen linienförmigen oder fokussierten Lichtstrahl erzeugt.
13. Rastermikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (33) zum Zusammenführen des Lichts eine Linse, ein Prisma, ein Gitter oder ein Hologramm umfasst.
14. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6, 7, 32, 34) der Detektionseinrichtung (4) eine Ausleserate aufweist, die im μs- oder ns-Bereich liegt, so dass vorzugsweise Fluoreszenzlebensdauerexperimente und/oder Abklingverhalten von Lumineszenzpräparaten zeitlich aufgelöst werden können.
15. Rastermikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6, 7, 32, 34) der Detektionseinrichtung (4) eine Aktivierungseinheit aufweist, die eine zeitliche Aktivierung und Deaktivierung des Detektors ermöglicht.
16. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet durch eine Mehr-Photonen-Anregung des Objekts (1) oder eines zur Objektmarkierung dienenden Markers.
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