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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Rastermikroskop zum Abbilden eines Objekts, mit einer Lichtquelle,
einem nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral selektiven
Element, einer nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral
selektiven Detektionseinrichtung, einem von der Lichtquelle bis zum
Objekt verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang, einem vom Objekt zur
Detektionseinrichtung verlaufenden Detektionsstrahlengang, wobei
mit dem spektral selektiven Element Licht der Lichtquelle zur Objektbeleuchtung
selektierbar ist, wobei mit dem spektral selektiven Element das
am Objekt reflektierte und/oder gestreute selektierte Licht der Lichtquelle
aus dem Detektionsstrahlengang ausblendbar ist, wobei zumindest
ein Wellenlängenbereich
des im Detektionsstrahlengang verlaufenden Lichts mit der spektral
selektiven Detektionseinrichtung detektierbar ist.
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Unter Rastermikroskopen im Sinn der
vorliegenden Erfindung sind Mikroskope zu verstehen, bei denen das
abzubildende Objekt mit einem Beleuchtungsmuster abgerastert wird.
Dieser Rastervorgang erfolgt üblicherweise
mäanderförmig, so
dass das Objekt mit dem Beleuchtungsmuster in ähnlicher Weise abgerastert
wird, wie beispielsweise ein Elektronenstrahl auf den Bildschirm
einer Braun'schen Röhre gelenkt
wird.
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Insbesondere bei biomedizinischen
Anwendungen werden seit geraumer Zeit ganz besondere Rastermikroskope,
nämlich
konfokale Rastermikroskope, dann eingesetzt, wenn – verglichen
zu konventionellen Auflicht- oder Durchlichtmikroskopen – eine verbesserte
Auflösung
entlang der optischen Achse benötigt
wird. Bezüglich
der Ausgestaltung und Einsatzmöglichkeiten
konfokaler Rastermikroskope wird beispielsweise auf die Literaturstelle „Handbook
of biological confocal microscopy", Editor: J. Pawley, Plenum Press 1995
verwiesen.
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Im Rahmen der deutschen Patentanmeldungen
DE 43 30 347 A1 und
DE 199 02 625 A1 wurde eine
Möglichkeit
gefunden, die Detektionseinrichtung eines herkömmlichen konfokalen Rastermikroskops durch
eine nahezu stufenlos variabel einstellbare spektral selektive Detektionseinrichtung
zu ersetzen. Hierzu werden die vor den Detektoren herkömmlicher
konfokaler Rastermikroskope angeordneten unflexiblen Farb- oder
Interferenzfilter durch den Einsatz einer entsprechenden Vorrichtung
zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines
Lichtstrahls ersetzt. Hierbei wird der Lichtstrahl zunächst mit
einem Prisma, einem optischen Gitter oder einem Hologramm spektral
zerlegt. Sodann wird von dem spektral zerlegten Licht ein erster
Spektralbereich mit Hilfe von beweglich angeordneten Spiegelblenden
selektiert und mit einem ersten Detektor detektiert. Das auf die
Spiegelblenden treffende, nicht selektierte Licht wird zur Detektion
mit einem zweiten Detektor reflektiert. Insoweit ist durch die in den
deutschen Patentanmeldungen
DE
43 30 347 A1 und
DE
199 02 625 A1 beschriebenen Vorrichtungen eine Möglichkeit
bekannt, auf die den Detektoren vorgeschalteten, im Hinblick auf
die spektrale Einstellungsmöglichkeit
unflexiblen Filter zu verzichten.
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Aus der
DE 199 06 757 A1 ist eine
optische Anordnung bekannt, mit der die dichroitischen oder multichroitischen
Strahlteiler eines konfokalen Rastermikroskops ersetzt werden können. Hierbei
wird mit einem nahezu stufenlos variabel einstellbaren spektral
selektiven Element Licht der Laserlichtquelle mindestens einer Wellenlänge zur
Objektbeleuchtung selektiert und das am Objekt reflektierte und/oder
gestreute Licht der Laserlichtquelle aus dem Detektionsstrahlengang
ausgeblendet. Als spektral selektives Element wird ein ansteuerbares aktives
optisches Bauteil eingesetzt, das beispielsweise in Form eines AOTF
(Acousto-Optical-Tunable-Filter)
oder eines AOD (Acousto-Optical-Deflector) ausgeführt ist.
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Insbesondere bei der konfokalen Rastermikroskopie
schwach fluoreszierender Proben hat der zur Objektbeleuchtung dienende
Lichtstrahl eine zu kurze Verweildauer pro abgerasterten Objektpunkt. Dementsprechend
ist das Signal-zu-Rausch-Verhältnis
des detektierten Objektpunkts in der Regel zu gering, wenn nicht
sogar unbrauchbar. Insbesondere bei physiologischen Applikationen
besteht ein großer Bedarf,
lebende Proben zu untersuchen. Hierbei finden naturgemäß schnelle
Bewegungsvorgänge
statt, die nur dann in sinnvoller Weise detektiert werden können, wenn
die detektierten Bilder des Objekts entsprechend schnell aufgenommen
werden können. Eine
derart hohe Detektionsgeschwindigkeit ergibt üblicherweise ebenfalls ein
ungenügendes
Signal-zu-Rausch-Verhältnis
der detektierten Bilddaten.
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Der vorliegenden Erfindung liegt
daher die Aufgabe zugrunde, ein Rastermikroskop der gattungsbildenden
Art derart anzugeben und weiterzubilden, dass ein Objekt auch bei
einer hohen Rastergeschwindigkeit mit einem verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis detektiert
werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren der gattungsbildenden
Art löst
die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs
1. Danach ist ein solches Rastermikroskop dadurch gekennzeichnet,
dass der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang
im Sinn eines konfokalen Spaltscanners ausgebildet sind.
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Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass eine
Parallelisierung des Rastervorgangs mit dem Rastermikroskop eine
längere
Verweildauer des Beleuchtungslichtsstrahls auf dem Objekt zur Folge
hat und somit über
einen längeren
Zeitraum die Detektion eines jeden Objektpunkts möglich ist.
Dies wiederum ergibt ein erhöhtes
Signal-zu-Rausch-Verhältnis
des mit der Detektionseinrichtung detektierten, vom Objekt kommenden
Lichts. Eine Parallelisierung der Objektdetektion ist durch eine
Ausbildung des Beleuchtungsstrahlengangs und des Detektionsstrahlengangs
im Sinn eines konfokalen Spaltscanners vorgesehen.
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Das nahezu stufenlos variabel einstellbare spektral
selektive Element wie auch die nahezu stufenlos variabel einstellbare
Detektionseinrichtung wird bei konventionellen Rastermikroskopen
lediglich als konfokales Rastermikroskop im Sinn eines Punktscanners
eingesetzt. Das heißt,
das Objekt wird punktförmig
abgerastert und das spektral selektive Element und die spektral
selektive Detektionseinrichtung wirken auf einen punktförmigen Lichtstrahl.
Sowohl das spektral selektive Element als auch die Detektionseinrichtung
können
jedoch auch auf einen linienförmigen
Lichtstrahl in vergleichbarer Weise wirken, so dass mit diesen Komponenten
auch ein Rastermikroskop im Sinn eines konfokalen Spaltscanners
realisiert werden kann.
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Bei einem konfokalen Spaltscanner
wird das Objekt mit einem linienförmigen Beleuchtungsmuster in
der Fokalebene des Mikroskopobjektivs des Rastermikroskops beleuchtet.
Durch eine besondere Ausgestaltung des Detektionsstrahlengangs wird dann
lediglich das vom Objekt kommende Licht detektiert, das aus dem
linienförmig
beleuchteten Objektbereich kommt, beispielsweise aus der Fokalebene
des Mikroskopobjektivs. Ein konfokaler Spaltscanner hat eine Konfokalität in Richtung
quer zur linienförmigen
Objektbeleuchtung. In Richtung der linienförmigen Objektbeleuchtung liegt
so gut wie keine Konfokalität
vor. Durch das linien- bzw. zeilenförmige Abtasten des Objekts
wird jedoch – verglichen
zum zeilenweise punktförmigen Abrasten
des Objekts – bei
derselben Bildrate pro Objektpunkt eine längere Beleuchtungs- und Detektionsdauer
erreicht. Hierdurch können
in besonders vorteilhafter Weise auch schwach fluoreszierende oder
lebende Proben mit einem verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis detektiert
werden.
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In einer konkreten Ausführungsform
ist im Beleuchtungsstrahlengang eine Beleuchtungsspaltblende vorgesehen.
Die Beleuchtungsspaltblende ist hierbei vorzugsweise in einer zur
Fokalebene eines Mikroskopobjektivs korrespondierenden Ebene angeordnet,
so dass beleuchtungsseitig die Beleuchtungsspaltblende in die Fokalebene
des Mikroskopobjektivs des Rastermikroskops abgebildet wird und somit
ein linienförmiges
Beleuchtungsmuster im Objektbereich generiert. Zum Abrastern des
Objekts kann dieses linienförmige
Beleuchtungsmuster beispielsweise mit einem im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten
schwenkbaren Spiegel relativ zum Objekt bewegt werden, indem dieser
nämlich
den Beleuchtungsstrahlengang in geeigneter Weise um einen Drehpunkt
verkippt, der in der Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs liegt.
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Eine Detektion im Sinn eines konfokalen Spaltscanners
könnte
dadurch erzielt werden, dass im Detektionsstrahlengang eine Detektionsspaltblende
vorgesehen ist. Die Detektionsspaltblende ist vorzugsweise in einer
Ebene im Detektionsstrahlengang angeordnet, die zur Fokalebene des
Mikroskopobjektivs korrespondiert. Mit anderen Worten bildet das
Mikroskopobjektiv das in seiner Fokalebene angeordnete Objekt mit
der zusätzlichen
Optik, die eventuell im Detektionsstrahlengang zwischen Mikroskopobjektiv
und Detektionsspaltblende angeordnet ist, auf die Ebene ab, in der
die Detektionspaltebene angeordnet ist. Die Detektionsspaltebene
ist in der zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs korrespondierenden
Ebene derart angeordnet, dass lediglich das vom Objekt kommende
Licht die Detektionsspaltblende passieren kann, das aus dem linienförmigen Beleuchtungsbereich
aus der Fokalebene des Mikroskopobjektivs kommt. Insoweit liegt
bezüglich
der Beleuchtungsspaltblende und der Detektionsspaltblende eine konfokale
Anordnung vor.
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Nun kann es von Applikation zu Applikation erforderlich
sein, die Form des Beleuchtungsmusters variieren zu können. So
könnte
lediglich ein Teil der insgesamt abbildbaren Fokalebene des Mikroskopobjektivs
detektiert werden, beispielsweise in Form einer Region-of-Interest-Abbildung.
Hierzu wird die Länge
des linienförmi gen
Beleuchtungsmusters entsprechend zu verkürzen sein. Andererseits könnte die
Breite des linienförmigen
Beleuchtungsmusters zu variieren sein, wodurch letztendlich die
Auflösung der
rastermikroskopischen Abbildung quer zum linienförmigen Beleuchtungsmuster verändert wird. Hierzu
ist vorgesehen, dass die Spaltlänge
und/oder die Spaltbreite der Beleuchtungsspaltblende und/oder der
Detektionsspaltblende variabel einstellbar ist. Eine Variation der
Spaltlänge
und Spaltbreite erfolgt hierbei vorzugsweise unabhängig voneinander,
d.h. bei einer bestimmten Spaltlänge
ist lediglich die Spaltbreite der Beleuchtungsspaltblende und/oder
der Detektionsspaltblende variabel einstellbar. Eine konfokale Abbildung
ist stets dann sichergestellt, wenn sowohl die Beleuchtungsspaltblende als
auch die Detektionsspaltblende bei einer Variation der Spaltlänge und/oder
der Spaltbreite in gleicher Weise verändert werden.
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Im Konkreten könnte die Beleuchtungsspaltblende
und/oder die Detektionsspaltblende beweglich angeordnete Blenden
umfassen. Beispielsweise ist eine Anordnung von vier rechteckförmigen Blenden
denkbar, die jeweils in einer Richtung bewegt bzw. verschoben werden
können,
vorzugsweise motorgesteuert. Jeweils zwei der Blenden könnten mit jeweils
einer Seite bzw. Kante einer Blende parallel zueinander in einer
Ebene liegend angeordnet sein, wobei zwischen den beiden Seiten
bzw. Kanten der Blende dann das Beleuchtungs- bzw. Detektionslicht passieren
kann, also der Spalt in einer Richtung gebildet ist. Die beiden
anderen Blenden könnten
mit einer Seite bzw. Kante jeweils einer Blende senkrecht dazu orientiert
ausgerichtet sein und im Wesentlichen in der gleichen Ebene angeordnet
sein, so dass die beiden anderen Blenden den Spalt entlang der Richtung
senkrecht dazu begrenzen. Eine solche Anordnung von vier Blenden
ermöglicht
eine Variation der Spaltlänge
unabhängig
von einer Variation der Spaltbreite der Beleuchtungsspaltblende
und/oder der Detektionsspaltblende.
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Eine Variation der Spaltlänge und/oder
der Spaltbreite könnte
auch durch eine jeweils der Beleuchtungsspaltblende und/oder der
Detektionsspaltblende zugeordnete Vario-Optik bewirkt werden. Die Vario-Optik
ist hierbei derart im Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang angeordnet,
dass die wirksame Spaltbreite und/oder die wirksame Spaltlänge der
entsprechenden Spaltblende verändert
werden kann. Im Konkreten könnte
es sich um eine Zoom-Optik handeln, die nämlich die Gesamtvergrößerung des
Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengangs von der jewei ligen Blende
zum Objekt verändert.
Eine Vario-Optik kann unter Umständen
als fertig konfigurierte Baugruppe in den entsprechenden Strahlengang
eingesetzt werden, so dass in vorteilhafter Weise eine mechanische
Verstellung einzelner Blendenteile nicht erforderlich ist.
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Das spektral selektive Element umfasst
ein ansteuerbares aktives optisches Bauteil. Hierdurch ist es, eine
entsprechende Ansteuerung vorausgesetzt, nahezu stufenlos variabel
einstellbar. Grundsätzlich
können
alle aus der
DE 199
06 757 A1 bekannten Ausführungsformen eines dort offenbarten spektral
selektiven Elements bei dem hier vorliegenden erfindungsgemäßen Rastermikroskop
zum Einsatz kommen, so dass der Offenbarungsgehalt der
DE 199 06 757 A1 hier ausdrücklich hinzugezogen und
insoweit als bekannt vorausgesetzt wird. Besonders bevorzugt sind
als spektral selektives Element zwei AOTF-Kristalle vorgesehen,
wobei eines davon das aktive optische Bauteil bildet, das mit einer
entsprechenden Ultraschallwelle beaufschlagt wird. Der andere AOTF-Kristall
ist als optisch inaktives Bauteil dem ersten AOTF-Kristall im Detektionsstrahlengang nachgeordnet,
und zwar ist er derart angeordnet, dass er eine spektrale Zerlegung
des vom Lumineszenzobjekt kommenden Lumineszenzlichts sowie eine
Aufspaltung der unterschiedlichen Polarisationsrichtungen durch
den ersten AOTF-Kristall rückgängig macht.
Hierzu ist der zweite AOTF-Kristall bezüglich der Längsachse des ersten AOTF-Kristalls um
180 Grad verdreht angeordnet. In einer anderen Ausführungsform
wird der zweite AOTF-Kristall ebenfalls mit einer Ultraschallwelle
beaufschlagt. In der Anordnung dient der Kristall zur weiteren Unterdrückung des
Restlichtes, das vom ersten AOTF-Kristall nicht wirksam reflektiert
wurde.
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Die spektral selektive Detektionseinrichtung umfasst
Mittel zur spektralen Zerlegung des im Detektionsstrahlengang verlaufenden
Lichts. Vorzugsweise ist dieses Mittel in Form eines Prismas ausgeführt. Alternativ
könnte
ein Gitter oder ein Hologramm vorgesehen sein. Weiterhin umfasst
die spektral selektive Detektionseinrichtung Mittel, die einerseits zum
Selektieren eines ersten Spektralbereichs zur Detektion mit einem
ersten Detektor und andererseits Mittel zur Reflektion zumindest
eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs zur Detektion
mit einem zweiten Detektor aufweist. Somit durchläuft das
im Detektionsstrahlengang verlaufende Licht zunächst das beispielsweise in
Form eines Prismas ausgeführte
Mittel zur spektralen Zerlegung und trifft dann – spektral zerlegt bzw. räumlich aufgefächert – auf das Mittel
zum Selektieren eines ersten Spektralbereichs. Der Teil des spektral
zerlegten Lichts, der auf das Mittel zur Reflexion zumindest eines
Teils des nicht selektierten Spektralbereichs auftrifft, wird zu
einem zweiten Detektor reflektiert. Die spektral selektive Detektionseinrichtung
könnte
somit gemäß den Ausführungsformen,
die aus den
DE 43 30
347 A1 und
DE
199 02 625 A1 bekannt sind, ausgeführt sein. Insoweit wird der
Offenbarungsgehalt dieser deutschen Patentanmeldungen hier ausdrücklich hinzugezogen
und ebenfalls insoweit als bekannt vorausgesetzt.
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Falls die Mittel zum Selektieren
des ersten Spektralbereichs bzw. die Mittel zur Reflexion zumindest
eines Teils des nicht selektierten Spektralbereichs durch verschiebbar
angeordnete Blenden, Spaltblenden und/oder Spiegelblenden realisiert sind,
wobei eine Verschiebung bzw. mechanische Verstellung zumindest nahezu
stufenlos erfolgen kann, liegt eine nahezu stufenlos variabel einstellbare
spektral selektive Detektionseinrichtung vor.
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In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
weist die Detektionseinrichtung einen flächenförmigen oder einen linenförmigen Detektor auf.
Dieser Detektor weist eine seiner Flächen- oder Linienform entsprechende
Ortsauflösung
auf. Insoweit kann mit dem flächenförmigen oder
linienförmigen
Detektor das die Detektionsspaltblende passierende und spektral
zerlegte und selektierte Detektionsslicht auf einmal detektiert
werden. Im Fall eines flächenförmigen Detektors
wird in einer Richtung – parallel
zur Längsseite
der Detektionsspaltblende – die
Ortsinformation des abgerasterten Objekts detektiert. Senkrecht
dazu wird für
jeden abgebildeten Objektpunkt die spektrale Komponente des Detektionslichts
detektiert, die vom Mittel zur spektralen Zerlegung räumlich aufgefächert wurde.
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Im Konkreten könnte der Detektor ein CCD-Element
umfassen, das in Form eines CCD-Arrays bzw. CCD-Chips – also ein
flächenförmiges CCD-Element – oder eines
Zeilen-Photomultipliers oder einer CCD-Zeile – also ein linienförmiges CCD-Element – oder als
CMOS-Element in Kombination mit einem Bildverstärker ausgebildet sein.
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Falls die Form des Lichtstrahls des
zu detektierenden Spektralbereichs auf die Detektorform – also beispielsweise
Flächen-
oder linienförmig – anzupassen
ist, könnte im
Detektionsstrahlengang vor einem Detektor der Detektionseinrichtung
eine Adaptionsoptik angeordnet sein. Hierbei könnte es sich um eine Linse
oder eine Linsenanordnung handeln, die eine Vergrößerung oder
Verkleinerung oder eine weitere Abbildung bewirkt. Vorzugsweise
ist die Adaptionsoptik variabel ausgeführt, beispielsweise in Form einer
Zoom-Optik. Hierdurch könnte
in besonders vorteilhafter Weise ein Lichtstrahl kleinerer räumlicher
Ausmaße
auf die volle Fläche
bzw. Linie des Flächen-
oder linienförmigen
Detektors vergrößert werden.
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Insbesondere wenn ein linienförmiger Detektor
zur Detektion des Detektionslichts eingesetzt wird, ist es von Vorteil,
wenn im Detektionsstrahlengang vor einem Detektor der Detektionseinrichtung ein
Mittel zum Zusammenführen
des Lichts angeordnet ist, das einen im Wesentlichen linienförmigen oder
fokussierten Lichtstrahl erzeugt. Das Mittel zum Zusammenführen des
Lichts macht die spektrale Zerlegung bzw. räumliche Auffächerung
des Mittels zur spektralen Zerlegung der spektral selektiven Detektionseinrichtung
zumindest weitgehend rückgängig oder
fokussiert zumindest das spektral aufgefächerte Licht auf eine Linie,
der von dem linienförmigen
Detektor detektiert werden kann.
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Das Mittel zum Zusammenführen des
Lichts könnte
eine Linse, ein Prisma, ein Gitter oder ein Hologramm umfassen.
Falls das Mittel zum Zusammenführen
des Lichts eine Linse umfasst, wird der räumlich aufgefächerte Lichtstrahl
lediglich auf eine Linie fokussiert, die spektrale Zerlegung wird
mit einer Linse allein jedenfalls nicht vollständig rückgängig gemacht. Mit einem entsprechend
angeordneten Prisma, Gitter oder optischen Baustein, das ein Hologramm
aufweist, könnte
jedoch eine spektrale Zerlegung des Mittels zur spektralen Zerlegung
der Detektionseinrichtung nahezu vollständig rückgängig gemacht werden, so dass
der spektral aufgefächerte Lichtstrahl
durch das Mittel zum Zusammenführen des
Lichts in einen linienförmigen
Lichtstrahl überführt wird,
der sodann von dem linienförmigen
Detektor detektiert werden kann.
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Insbesondere für Fluoreszenzlebensdauer-Applikationen
oder Photon-Counting-Applikationen
könnte
der Detektor der Detektionseinrichtung eine Ausleserate aufweisen,
die im μs-
oder ns-Bereich liegt. Linien- oder zeilenförmige Detektoren, die entsprechende
Ausleseraten aufweisen, sind aus dem Stand der Technik bekannt und
werden insbesondere bei den obengenannten Applikationen, bei der
zeitlichen Auflösung
des Abklingverhaltens von Lumineszenzpräparaten sowie bei Gasinjektionsexperimenten
in Explosionskammern eingesetzt.
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Insbesondere könnte der Detektor der Detektionseinrichtung
eine Aktivierungseinheit aufweisen, die ein zeitliche Aktivierung
und Deaktivierung des Detektors ermöglicht. Eine solche Aktivierungseinheit
ist bei CCD-Arrays bzw. CCD-Chips oder CMOS-Verstärkern mit
Ausleseraten im ns-Bereich durch eine Time-Gate-Schaltung realisiert,
die eine Detektion des Detektors in einem vorgebbaren zeitlichen
Fenster ermöglicht.
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In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
ist das Rastermikroskop im Sinn eines Mehr-Photonen-Mikroskops ausgeführt. Dementsprechend
kann das Objekt bzw. ein zur Objektmarkierung dienender Marker mit
den Methoden der Mehr-Photonen-Anregung angeregt und detektiert werden.
Insoweit ist eine hierzu geeignete Lichtquelle vorzusehen, beispielsweise
eine ein gepulstes Licht im nahen Infrarot-Bereich emittierende
Laserlichtquelle. Üblicherweise
wird hierzu ein Titan-Saphir-Laser
eingesetzt. Weiterhin ist das spektral selektive Element sowie die
spektral selektive Detektionseinrichtung derart einzustellen, dass
beispielsweise eine Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung mit Licht
der Wellenlänge
aus einem Wellenlängenbereich
von 720 bis 1000 nm und eine Detektion des hiermit angeregten Fluoreszenzlichts
in einem Bereich von 400 bis 600 nm erfolgt. Die Pulsdauer des von
dem Titan-Saphir-Laser emittierten Lichts liegt vorzugsweise im
ps-Bereich. Neben
der Zwei-Photonen-Fluoreszenz sind auch noch andere nichtlineare Effekte
in der Probe erzeugbar und detektierbar, wie z.B. die Erzeugung
höherer
Harmonischer, beispielsweise Second- oder Third Harmonic Generation, oder
CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering).
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch
1 nachgeordneten Patentansprüche
und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit
der Erläuterung
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte
Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In
der Zeichnung zeigen
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1 eine
schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops
zum Abbilden eines Objekts,
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2 eine
schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops
in perspektivischer Ansicht,
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3 ein
schematische Darstellung eines Ausschnitts aus dem Ausführungsbeispiel
aus 2 in perspektivischer
Ansicht,
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4 eine
schematische Darstellung eines Teils einer Detektionseinrichtung
eines weiteren Ausführungsbeispiels,
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5 eine
schematische Darstellung eines aus dem Stand der Technik bekannten
Ausführungsbeispiels
eines spektral selektiven Elements und
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6 eine
schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines spektral
selektiven Elements gemäß der hier
vorliegenden Erfindung in einer perspektivischen Ansicht.
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1 zeigt
ein Rastermikroskop zum Abbilden eines Objekts 1. Das Rastermikroskop
umfasst eine Laserlichtquelle 2, die zur Objektbeleuchtung des
Objekts 1 dient. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 erstreckt
sich von der Laserlichtquelle 2 zum Objekt 1.
Das Rastermikroskop umfasst des Weiteren eine nahezu stufenlos variabel
einstellbare spektral selektive Detektionseinrichtung 4,
die zumindest einen Wellenlängenbereich
des im Detektionsstrahlengang 5 verlaufenden Lichts detektiert.
Der Detektionsstrahlengang 5 verläuft vom Objekt 1 bis
zu den Detektoren 6 und 7. Das spektral selektive
Element 8 selektiert Licht der Laserlichtquelle 2 zur
Objektbeleuchtung, indem es Licht einer bestimmten Wellenlänge zur
Scaneinrichtung 9 reflektiert. Das nicht selektierte Licht
der Laserlichtquelle 2 – beispielsweise anderer Wellenlängen – passiert
das spektral selektive Element 8 und wird in der Strahlfalle 10 absorbiert. Das
am Objekt 1 reflektierte und/oder gestreute selektierte
Licht der Laserlichtquelle 2 wird ebenfalls vom spektral
selektiven Element 8 aus dem Detektionsstrahlengang 5 ausgeblendet,
und zwar in Richtung zur Laserlichtquelle 2 abgelenkt.
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Erfindungsgemäß ist der Beleuchtungsstrahlengang 3 und
der Detektionsstrahlengang 5 im Sinn eines konfokalen Spaltscanners
ausgebildet. Dies ist der perspektivischen Darstellung des in 2 gezeigten Ausführungsbeispiels
besonders deutlich entnehmbar.
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In 1 ist
gezeigt, dass im Beleuchtungsstrahlengang 3 eine Beleuchtungsspaltblende 11 vorgesehen
ist. Der von der Laserlichtquelle 2 emittierte Lichtstrahl
wird von der Linse 12 in einen linienförmigen Lichtstrahl umgewandelt,
der zumindest größtenteils
die Beleuchtungsspaltblende 11 passiert. In 1 ist lediglich die optische
Achse des linienförmigen
Strahlengangs gezeigt, der Beleuchtungsstrahlengang 3 und
der Detektionsstrahlengang 5 weisen einen linienförmigen Querschnitt
auf, der senkrecht zur Zeichenebene angeordnet ist.
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Im Detektionsstrahlengang 5 ist
eine Detektionsspaltblende 13 vorgesehen, die einerseits
korrespondierend zur Fokalebene 14 des Mikroskopobjektivs 15 und
andererseits korrespondierend zur Beleuchtungsspaltblende 11 angeordnet
ist.
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Sowohl die Spaltlänge als auch die Spaltbreite
der Detektionsspaltblende 13 ist variabel einstellbar,
was in den 2 und 3 angedeutet ist. Die Detektionsspaltblende 13 umfasst
hierbei vier beweglich angeordnete Blenden 16 bis 19.
Jeweils eine Seite bzw. Kante der Blenden 16 bis 19 bilden
den Spalt der Detektionsspaltblende 13. Die Blenden 16 und 17 sind
entlang der mit den Doppelpfeilen 20 angedeuteten Richtungen
verschiebbar. Die Blenden 18 und 19 sind entlang
den mit den Doppelpfeilen 21 angedeuteten Richtungen verschiebbar.
Somit kann mit den Blenden 18 und 19 die Spaltbreite
der Detektionsspaltblende 13 variiert werden. Mit den Blenden 16 und 17 kann
die Spaltlänge
der Detektionsspaltblende 13 variiert werden.
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In 1 ist
gezeigt, dass zwischen der Beleuchtungsspaltblende 11 und
dem spektral selektivem Element 8 eine Vario-Optik 22 angeordnet
ist, mit der die wirksame Spaltbreite und die wirksame Spaltlänge der
Beleuchtungsspaltblende 11 verändert werden kann. Die Vario-Optik 22 ist
in Form einer Zoom-Linsen-Anordnung ausgebildet, die den Gesamt-Vergrößerungsfaktor
des Beleuchtungsstrahlen gangs 3 – zusammen mit dem Mikroskopobjektiv 15 – variiert
und somit ein größeres oder
kleineres Bild der Beleuchtungsspaltblende 11 in der Fokalebene 14 des
Mikroskopobjektivs 15 erzeugt.
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Die in den 1 bis 4 gezeigte
spektral selektive Detektionseinrichtung 4 umfasst ein
Mittel 23 zur spektralen Zerlegung des im Detektionsstrahlengang 5 verlaufenden
Lichts. Das Mittel 23 ist in Form eines Prismas ausgeführt. Weiterhin
umfasst die in den 1 und 4 gezeigte Detektionseinrichtung 4 Mittel 24 und 40 zum
Selektieren eines ersten Spektralbereichs 25. Das vom Objekt 1 kommende,
mit dem Mittel 24 und 40 selektierte Licht des
ersten Spektralbereichs 25 wird mit dem Detektor 6 detektiert.
Das Mittel 24 ist eine verschiebbar angeordnete Blende,
die mit dem Motor 26 entlang der Richtung des bei dem Mittel 24 eingezeichneten
Doppelpfeils bewegbar ist.
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Das Mittel 40 ist eine verschiebbar
angeordnete Spiegelblende, die vom Motor 27 entlang der Richtung
des bei dem Mittel 40 eingezeichneten Doppelpfeils bewegbar
ist. Das am Mittel 40 reflektierte Licht ist der spektrale
Anteil des vom Mittel 23 spektral zerlegten Lichts, das
vom Objekt 1 kommt und das nicht für den ersten Detektor 6 selektiert
ist. Dieses Licht passiert zumindest größtenteils das Mittel 28 zum
Selektieren des reflektierten Spektralbereichs und wird mit dem
Detektor 7 detektiert. Die in den 1 und 4 gezeigte
Linse 29 kollimiert bzw. fokussiert das vom Mittel 23 spektral
zerlegte Licht auf die Ebene, in der das Mittel 24 und 40 zum
Selektieren des ersten Spektralbereichs 25 angeordnet ist.
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In den 2 und 3 ist perspektivisch angedeutet,
dass die Detektionseinrichtung 4 einen flächenförmigen Detektor 6 aufweist.
Der flächenförmige Detektor 6 weist
eine seiner Flächenform
entsprechenden Ortsauflösung
auf. Der flächenförmige Detektor 6 ist
in Form eines CCD-Arrays bzw. eines CCD-Chips ausgebildet. In 3 ist ein Teil der Detektionseinrichtung 4 vergrößert gezeigt.
Hierbei ist schematisch angedeutet, dass entlang der Richtung 30 die
Ortsinformation des vom Objekt 1 kommenden Lichts entlang
des linienförmigen
Beleuchtungsmusters detektierbar ist. Entlang der Richtung 31 ist
die spektrale Information eines jeden detektierten Objektpunkts
auf den Detektor 6 abgebildet. Zur besseren Anschauung
sind Linsen und andere optische Mittel, die zur Führung und
Formung des Lichtes notwendig sind, in den Figuren weggelassen.
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Der in den 2 und 3 gezeigte,
als CCD-Array ausgebildete Detektor 6 weist eine Auslesegeschwindigkeit
von 100 Bildern pro Sekunde auf. Bei einer Objektbildgröße von 512 × 512 Pixeln
ist für eine
gesamte Objektbildaufnahme der Detektor 6 512 mal auszulesen.
Somit ergibt sich eine Gesamtaufnahmedauer eines Objektbilds von
ca. 5 Sekunden. Die Rastergeschwindigkeit der Scaneinrichtung 9 ist
mit der Auslesegeschwindigkeit des Detektors 6 synchronisiert
bzw. darauf angepasst. Somit liegt als Objektrepräsentation
eines einmal abgerasterten Objekts 1 – bei der obengenannten Bildgröße von 512 × 512 Pixel – sowohl
die Ortsinformation als auch die spektrale Information eines jeden
Bildpunkts vor.
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In 4 ist
ein weiteres Ausführungsbeispiel einer
Detektionseinrichtung 4 gezeigt, bei der zwischen den Mitteln 24, 40 zum
Selektieren eines ersten Spektralbereichs 25 und dem Detektor 32 ein
Mittel 33 zum Zusammenführen
des Lichts, das die Mittel 24, 40 zum Selektieren
des ersten Spektralbereichs 25 passiert, angeordnet ist.
Das Mittel 33 zum Zusammenführung des Lichts ist in Form
eines Prismas ausgebildet und erzeugt einen linienförmigen Lichtstrahl,
der von dem als CCD-Zeile ausgebildeten Detektor 32 detektiert
wird. In gleicher Weise ist zwischen dem Mittel 28 zum
Selektieren des reflektierten Spektralbereichs und dem Detektor 34 ein
Mittel 33 zum Zusammenführen
des dort verlaufenden Lichts vorgesehen, so dass durch das Mittel 33 zum Zusammenführen des
Lichts ebenfalls ein linienförmiger
Lichtstrahl erzeugt wird, der mit dem in Form einer CCD-Zeile ausgebildeten,
linienförmigen
Detektor 34 detektiert wird.
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Die 5 und 6 zeigen eine Detailvergrößerung eines
spektral selektiven Elements 8. Der im Querschnitt punktförmige Lichtstrahl
des Lichts der Laserlichtquelle 2 trifft auf einen Spiegel 35,
der das Licht in einen ersten AOTF-Kristall 36 reflektiert.
Falls der AOTF-Kristall 36 derart eingestellt ist, dass
kein Licht der Laserlichtquelle 2 zur Objektbeleuchtung selektiert
wird, durchläuft
dieses Licht den ersten AOTF-Kristall 36 derart, dass es
vollständig
von der Strahlfalle 10 absorbiert wird. Falls der erste AOTF-Kristall
derart eingestellt wird, dass beispielsweise Licht einer Wellenlänge zur
Objektbeleuchtung selektiert wird, durchläuft dieses Licht den ersten AOTF-Kristall 36 abgelenkt – in die
1. Ordnung gebeugt -, so dass es in den Beleuchtungsstrahlengang 3 eintritt
und zur Objektbeleuchtung genutzt wird, was durch den unteren Pfeil
auf das Objekt 1 angedeutet ist. Das am Objekt 1 reflektierte
und/oder ge streute selektierte Licht der Laserlichtquelle 2 durchläuft den
ersten AOTF-Kristall 36 in umgekehrter Richtung, trifft
sodann – in
die 1. Ordnung gebeugt – auf
den Spiegel 35, der das vom Objekt kommende reflektierte
und/oder gestreute Licht zur Laserlichtquelle 2 reflektiert.
Das vom Objekt 1 kommende Fluoreszenzlicht durchläuft den
ersten AOTF-Kristall 36 in der 0. Ordnung und passiert
den Spiegel 35 hin zum zweiten AOTF-Kristall 37.
Der AOTF-Kristall 37 ist um die schematisch angedeutete – optische – Achse 38 um
180 Grad gedreht angeordnet. Somit macht der zweite AOTF-Kristall 37 eine
spektrale Zerlegung des ersten AOTF-Kristalls 36 des Fluoreszenzlichts
sowie eine Polarisationsaufspaltung rückgängig. Die beiden Spiegel 39 dienen
lediglich dazu, das die AOTF-Kristalle 36, 37 durchlaufene
Licht wieder koaxial zur optischen Achse 38 zu bringen.
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6 zeigt
in einer perspektivischen Darstellung die Funktionsweise des spektral
selektiven Elements 8 bei dem erfindungsgemäßen konfokalen Rastermikroskop,
das im Sinn eines konfokalen Spaltscanners arbeitet. Hierbei kommt
von der Laserlichtquelle 2 ein im Querschnitt linienförmig ausgebildeter
Lichtstrahl, der vom Spiegel 35 zum ersten AOTF-Kristall 36 reflektiert
wird. Die weitere Funktionsweise des in 6 gezeigten spektral selektiven Elements 8 entspricht
im Wesentlichen dem des in 5 gezeigten
spektral selektiven Elements 8, wobei sowohl der in 6 gezeigte Teil des Beleuchtungsstrahlengangs 3 als
auch der dort gezeigte Teil des Detektionsstrahlengangs 5 jeweils
einen linienförmigen
Querschnitt aufweist.
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Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen,
dass die voranstehend erörterten
Ausführungsbeispiele
lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese
jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele
einschränken.