JP5248924B2 - レーザー走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明はレーザー走査型顕微鏡の技術に関わる。

生物分野におけるレーザー走査型顕微鏡は、標本内に導入された蛍光色素をレーザー光の照射により励起して、その結果として放出される蛍光を検出する。この観察方法でも多色染色は有効な観察方法であり、複数波長のレーザー光を照射して複数種類の蛍光を検出することが多い。

この場合、複数種類の蛍光を検出する方法として、フィルターやダイクロイックミラーを組み合わせる方法と、分光器を使う方法とに大きく分けられる。この中でも、分光器を使った分離方法は、蛍光波長のスペクトルにクロストークがある場合にも高精度に蛍光分離ができることから、多くのレーザー走査型顕微鏡で採用されている。
特表平９−５０２２６９号公報

レーザー走査型顕微鏡における分光器でＳ／Ｎ比の高い観察を行うには、蛍光を分離することだけが問題ではない。一般に、蛍光観察では励起光と蛍光の強度比率は１万倍以上といわれる。つまり、散乱などによって励起光の一部でも検出器に到達してしまうと、蛍光の検出に大きな影響を与えてしまう。そこで、レーザー走査型顕微鏡における分光器では励起光と確実に排除する技術が重要となっている。

本発明は上記問題を鑑みてなされたものであり、レーザー走査型顕微鏡における分光器で励起光を確実に排除する技術を提供する。

上記課題は、励起レーザー光を照射した標本から発する蛍光を検出するレーザー走査型顕微鏡において、前記標本の観察面と光学的に共役な位置に配置された共焦点絞りと、前記共焦点絞りの後段に配置され、前記共焦点絞りを通過した光線を平行光化するコリメータレンズと、前記コリメータレンズの後段に配置され、前記コリメータレンズによって平行光化された光線をスペクトル分解する分光素子と、前記分光素子の後段に配置され、前記分光素子によってスペクトル分解された光線を集光する集光光学系と、前記集光光学系の焦点位置に配置されたスリットと、前記スリットを通過した光線を検出する検出器を備え、前記標本から反射した前記励起レーザー光を分離するための分離素子を前記集光光学系と前記スリットの間に配置することによって解決される。

上記構成において、前記分離素子はスペクトル分解された光の光路に対し部分的に配置されて、励起レーザー光を遮断または光路外へ偏向させるもので、例えば遮光板やミラーやプリズムであることが考えられる。

前記ミラーによって反射された光線はトラップへ導かれる構成が好ましい。トラップへ導かれた励起レーザー光は確実に観察光路から排除される。
前記ミラーによって反射された光線は、前記検出器とは異なる検出器へ導かれる構成も好ましい。レーザ走査型顕微鏡の分光ユニットは複数の検出器を備えて、多チャンネル観察ができるものが多い。その場合、未使用の検出器または検出部をトラップのように使用することができる。

前記分離素子としてプリズムを利用する場合は、全反射を用いて光線を反射する構成が好ましい。全反射を用いて光線を反射する構成では、反射時のロスがないので好適である。

前記プリズムによって反射された光線はトラップへ導かれる構成が好ましい。トラップへ導かれた励起レーザー光は確実に観察光路から排除される。
前記プリズムによって反射された光線は、前記検出器とは異なる検出器へ導かれる構成も好ましい。レーザ走査型顕微鏡の分光ユニットは複数の検出器を備えて、多チャンネル観察ができるものが多い。その場合、未使用の検出器または検出部をトラップのように使用することができる。

前記分離素子は以下の条件式を満たすことが好ましい。
（１） ０＜ＮＡ×Ｌ＜Ｄ／２
ただし、ＮＡは前記集光光学系の射出側の開口数を表し、Ｌは前記分離素子が光線を分離する位置から前記スリットまでの距離を表し、Ｄは前記励起レーザー光と前記蛍光のスリット面上での距離である。

最も正確にスペクトルを分離するならば、共焦点絞りの共役の位置に分離素子を配置するのが良い。しかし、本発明の構成ではこの位置にスリットを配置して、検出波長領域を制限することに利用している。また、本発明では、励起レーザー光を確実に観察光路から排除したいために、検出器から可能な限り離れたところで励起レーザー光の分離を行いたい。一方で、スリットから離れた位置で分離素子を配置しようとすると、分離の正確性が落ちてしまい、蛍光と励起レーザー光の間にクロストークが発生してしまう。上記条件式（１）の範囲であれば、クロストークが発生せずに蛍光と励起レーザー光とを分離することができる。

前記分光素子をスペクトル分散方向に駆動可能とすることは好ましい。前記分光素子をスペクトル分散方向に駆動することによって、検出される蛍光を波長方向にスキャンすることができる。

上記構成のレーザー走査型顕微鏡を使って１チャンネル分光検出方法は好ましい。本発明は多チャンネル分光検出系を備えたレーザー走査型顕微鏡において、１チャンネル分光検出系のみを利用する場合に、Ｓ／Ｎ比を向上するために好適である。

本発明によれば、レーザー走査型顕微鏡における分光器で励起光を確実に排除できる。

以下では、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
図１は一般的なレーザー走査型顕微鏡の全体の光路を示した概略図である。
図１に示されるように、本構成のレーザー走査型顕微鏡は、大きく分けてレーザー光源部１と観察光学系２と走査ユニット３と光路分割部４と結像光学系５と共焦点絞り６と分光ユニット７とで構成される。

レーザー光源部１には複数のレーザー光源を備え、多波長励起に対応できるようになっている。複数のレーザー光源から射出されたレーザー光は、ダイクロイックミラーや音響光学素子などのビームスプリッターによってひとつの光路に結合され、顕微鏡本体（あるいは顕微鏡に備えられたスキャンユニット）に導入される。このとき、レーザー光源部１と顕微鏡本体の間はファイバーケーブルによって結合しても良い。あるいはレーザー光源部１と顕微鏡本体を一体化した構成としても良い。

顕微鏡本体に導入されたレーザー光はダイクロイックミラーや音響光学素子などの光路分割素子４によって観察光路に導入される。その後、走査ユニット３に導かれる。
走査ユニット３は観察光学系２の瞳位置と共役な位置に配置され、光線を偏向することによって、標本面を走査する。走査ユニット３に利用されうる走査手段としては、ガルバノミラーや共振ガルバノミラーやそれらの組み合わせを用いることができる。

観察光学系２は、対物レンズと結像レンズと瞳投影レンズを備え、対物レンズの瞳位置を結像レンズと瞳投影レンズがリレーして走査ユニット３へ導く。
観察光学系２は、レーザー光の照射のみならず、標本から放射される蛍光の検出にも用いられる。このとき、標本から放射された蛍光は、対物レンズから結像レンズと瞳投影レンズとを経て、走査ユニット３へ導かれる。励起光として使われるレーザー光と検出される蛍光は、観察光学系２と走査ユニット３を共有することにより、常に標本面上の同じ点を走査する。

走査ユニット３を通過した蛍光は、光路分割素子４によってレーザー導入光路と分離され、観察光路に導かれる。このとき、励起光と蛍光は波長が異なるので、ダイクロイックミラーのような波長に依存して光線を分離する方法が一般的であるが、本構成では波長に依存しない光学素子で分離しても良い。その理由は、本構成では後段で分光器によって蛍光を検出するので、励起光と蛍光を分離することができるからである。例えば、単なる無コートガラス（あるいは適度に反射防止コートを施したガラス）を配置して、ガラス自身が持っている反射によって光路を分離することも可能である。

光路分割素子４を通過した蛍光は、結像光学系５によって共焦点絞り６上に集光される。すなわち、共焦点絞り６は対物レンズの焦点面と共役な位置に配置されている。これにより、焦点面以外から検出された光線は、共焦点絞り６を通過することがでないため、焦点面の蛍光のみを取得でき、ボケの少ない画像が取得される。また、対物レンズと標本の相対的な距離を変化させることにより、標本の光軸方向の走査が可能となる。

共焦点絞り６の後段に配置された分光ユニット７は、コリメータレンズ８と分光素子９と集光光学系１０とスリット１１と検出器１２を備えている。共焦点絞り６を通過した蛍光はコリメータレンズ８によって平行光束化され、分光素子９に照射される。この分光素子９としては、回折格子やプリズムなどを使うことができる。分光素子９によってスペクトル分解された蛍光は集光光学系１０によってスリット１１に集光される。すなわち、共焦点絞り６とスリット１１は共役な位置であり、スリット１１面上には蛍光のスペクトル像が結像される。この位置にスリット１１を配置して所望の波長領域に制限した蛍光を検出器によって検出する。ここで、分光素子９をスペクトル分散方向に駆動可能な構成とすれば、検出される波長領域を走査することができる。また、スリット１１を可変構成とすれば、検出する波長領域を制御することもできる。また、スリット１１をスペクトル分散方向に駆動可能な構成として、波長領域を走査する構成としてもよい。

以下では、本発明の実施による分光ユニット７の詳細を説明する。

図２は本発明の実施例１による分光ユニット７の構成を表す。
図２に示されるように、本実施例の分光ユニット７はコリメータレンズ８と回折格子９と集光レンズ１０とスリット１１とフォトマルチプライア１２と遮光板１３を備える。

コリメータレンズ８は共焦点絞り６を透過した、光線を平行光化して回折格子９に照射する。そして回折格子９に照射された光線は光線の波長ごとに分離され、波長ごとに異なる角度に反射される。なお、この回折格子９はプリズムなどの分散を持つ光学素子によって代用することも可能である。

波長ごとに分離された光線は集光レンズ１０によってスリット１１の面上に集光される。すなわち、スリット１１は共焦点絞り６と共役であり、回折格子９によって分光されたスペクトル像はスリット１１面上に結像される。結像されたスペクトル像は、スリット１１によって所望の波長領域に制限して後段のフォトマルチプライア１２によって検出する。

本実施例では、集光レンズ１０とスリット１１の間に遮光板を配置し、共焦点絞り６を通過した光線の中から、励起光に対応した波長領域を遮光する。励起光として標本に照射されたレーザー光は標本内の蛍光物質を励起するだけではなく、標本自体によって反射され観察光学系２へと進入してくる。そして、この反射光は最終的には分光ユニット７へ導かれてしまう。スリット１１の開口領域は励起光を透過しないような設定になっているが、光路内の乱反射などの結果で検出器１２に到達してしまうものがある。この光がノイズの原因となっている。

本実施例では、上記の励起光を早い段階で蛍光と分離することにより、ノイズを低減させる。
本実施例の遮光板１３は以下の条件式を満たす位置に配置されている。

０＜ＮＡ×Ｌ＜Ｄ／２
ただし、ＮＡは集光レンズ１０の射出側の開口数を表し、Ｌは遮光板１３が光線を分離する位置からスリット１１までの距離を表し、Ｄは励起光がスリット１１面上へと到達したと仮定したときの、励起光と蛍光のスリット１１面上での距離である。

図３は本発明の実施例２による分光ユニット７の構成を表す。
図３に示されるように、本実施例の分光ユニット７はコリメータレンズ８と回折格子９と集光レンズ１０とスリット１１とフォトマルチプライア１２とミラー１４とトラップ１５を備える。ここでトラップ１５と呼ぶものは、レーザートラップやレーザーポケットやターミネイターなどの名で呼ばれるものであり、入射された光線を閉じ込める働きを持つものである。

コリメータレンズ８は共焦点絞り６を透過した、光線を平行光化して回折格子９に照射する。そして回折格子９に照射された光線は光線の波長ごとに分離され、波長ごとに異なる角度に反射される。なお、この回折格子９はプリズムなどの分散を持つ光学素子によって代用することも可能である。

波長ごとに分離された光線は集光レンズ１０によってスリット１１の面上に集光される。すなわち、スリット１１は共焦点絞り６と共役であり、回折格子９によって分光されたスペクトル像はスリット１１面上に結像される。結像されたスペクトル像は、スリットによって所望の波長領域に制限して後段のフォトマルチプライア１２によって検出する。

本実施例では、集光レンズ１０とスリット１１の間にミラー１４を配置し、共焦点絞り６を通過した光線の中から励起光に対応した波長領域を反射して、進行方向をスリット１１方向から逸らす。その後、励起光をトラップ１５へ導き、確実に励起光を排除する。

本実施例のミラーは以下の条件式を満たす位置に配置されている。
０＜ＮＡ×Ｌ＜Ｄ／２
ただし、ＮＡは集光レンズ１０の射出側の開口数を表し、Ｌはミラー１４が光線を分離する位置からスリット１１までの距離を表し、Ｄは励起光がスリット１１面上へと到達したと仮定したときの、励起光と蛍光のスリット１１面上での距離である。

図４は本発明の実施例３による分光ユニット７の構成を表す。
図４に示されるように、本実施例の分光ユニット７はコリメータレンズ８と回折格子９と集光レンズ１０と２つのスリット１１Ａ，１１Ｂと２つのフォトマルチプライア１２Ａ，１２Ｂと２つの直角プリズム１６Ａ，１６Ｂと２つの遮光板１３Ａ，１３Ｂを備える。

コリメータレンズ８は共焦点絞り６を透過した、光線を平行光化して回折格子９に照射する。そして回折格子９に照射された光線は光線の波長ごとに分離され、波長ごとに異なる角度に反射される。

波長ごとにスペクトル分解された光線は集光レンズ１０によってスリット１１の面上に集光する。このとき、本実施例ではフォトマルチプライア１２Ａ，１２Ｂを２つ備え、２チャンネル検出をするためにスリット１１Ａ，１２Ｂも２つ備えている。さらに、本実施例では２チャンネル検出をする波長分離のために、２つの直角プリズム１６Ａ，１６Ｂを利用している。

詳述すれば、回折格子９によってスペクトル分解された光線は、集光レンズ１０を透過した後に、２つの直角プリズム１６Ａ，１６Ｂによって波長分離される。このときの直角プリズム１６Ａ，１６Ｂの利用方法としては、全反射を利用して９０度方向に光線を反射する方法を使って、２チャンネル検出のそれぞれに対して異なる直角プリズム１６Ａ，１６Ｂを割り当てている。

さらに、本実施例では２チャンネル検出のそれぞれに遮光板１３Ａ，１３Ｂを備えて、励起光と蛍光を分離している。つまり、本実施例では標本を２種類の蛍光色素で染色をして、２種類の励起光で励起し、発した２種類の蛍光を異なるフォトマルチプライア１２Ａ，１２Ｂで検出するときに好適な構成となっている。

本実施例の遮光板１３Ａ，１３Ｂは以下の条件式を満たす位置に配置されている。
０＜ＮＡ×Ｌ＜Ｄ／２
ただし、ＮＡは集光レンズ１０の射出側の開口数を表し、Ｌは遮光板１３Ａ，１３Ｂが光線を分離する位置からスリット１１Ａ，１１Ｂまでの距離を表し、Ｄは励起光がスリット１１Ａ，１１Ｂ面上へと到達したと仮定したときの、励起光と蛍光のスリット１１Ａ，１１Ｂ面上での距離である。

なお、本実施の形態は２チャンネル検出をする波長分離のために、２つの直角プリズムを利用しているが、ミラーによって代用する構成やプリズムの形状を異なるものに置き換えることや２チャンネルのうちで一方を反射させない構成も考えられる。さらには、２チャンネル検出ではなく、より多チャンネル検出へと本実施例を発展することも可能である。

図５は本発明の実施例４による分光ユニット７の構成を表す。本実施例は２チャンネル検出をすることができる構成を使って１チャンネル検出を行う場合に、励起光を確実に排除する方法を示している。

図５に示されるように、本実施例の分光ユニット７はコリメータレンズ８と回折格子９と集光レンズ１０と２つのスリット１１Ａ，１１Ｂと２つのフォトマルチプライア１２Ａ，１２Ｂと２つの直角プリズム１６Ａ，１６Ｂを備える。

コリメータレンズ８は共焦点絞り６を透過した、光線を平行光化して回折格子９に照射する。そして回折格子９に照射された光線は光線の波長ごとに分離され、波長ごとに異なる角度に反射される

波長ごとにスペクトル分解された光線は集光レンズ１０によってスリット１１の面上に集光する。このとき、本実施例では励起光を第二のフォトマルチプライア１２Ｂ方向に導き、蛍光を第一のフォトマルチプライア１２Ａの方向に導く。すなわち、本実施例によれば、遮光板やトラップなどの特別な構成を持たずに、励起光を適切に排除することができる。

本実施例の直角プリズム１６Ａ，１６Ｂは以下の条件式を満たす位置に配置されている。
０＜ＮＡ×Ｌ＜Ｄ／２
ただし、ＮＡは集光レンズ１０の射出側の開口数を表し、Ｌは直角プリズム１６Ａ，１６Ｂが光線を分離する位置からスリット１１Ａ，１１Ｂまでの距離を表し、Ｄは励起光がスリット１１Ａ，１１Ｂ面上へと到達したと仮定したときの、励起光と蛍光のスリット１１Ａ，１１Ｂ面上での距離である。

レーザー走査型顕微鏡の全体の光路図である。 分光ユニットの実施例１ 分光ユニットの実施例２ 分光ユニットの実施例３ 分光ユニットの実施例４

符号の説明

１・・・レーザー光源部
２・・・観察光学系
３・・・走査ユニット
４・・・光路分割素子
５・・・結像光学系
６・・・共焦点絞り
７・・・分光ユニット
８・・・コリメータレンズ
９・・・分光素子、回折格子
１０・・・集光レンズ
１１・・・スリット
１２・・・検出器、フォトマルチプライア
１３・・・遮光板
１４・・・ミラー
１５・・・トラップ
１６・・・直角プリズム

Claims (12)

1. 励起レーザー光を照射した標本から発する蛍光を検出するレーザー走査型顕微鏡において、
   前記標本の観察面と光学的に共役な位置に配置された共焦点絞りと、
   前記共焦点絞りの後段に配置され、前記共焦点絞りを通過した光線を平行光化するコリメータレンズと、
   前記コリメータレンズの後段に配置され、前記コリメータレンズによって平行光化された光線をスペクトル分解する分光素子と、
   前記分光素子の後段に配置され、前記分光素子によってスペクトル分解された光線を集光する集光光学系と、
   前記集光光学系の焦点位置に配置されたスリットと、
   前記スリットを通過した光線を検出する検出器を備え、
   前記標本から反射した前記励起レーザー光を分離するための分離素子を前記集光光学系と前記スリットの間に配置したことを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
2. 前記分離素子は遮光板であることを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
3. 前記分離素子はミラーであることを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
4. 前記分離素子はプリズムであることを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
5. 前記ミラーによって反射された光線はトラップへ導かれることを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査型顕微鏡。
6. 前記ミラーによって反射された光線は、前記検出器とは異なる検出器へ導かれることを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査型顕微鏡。
7. 前記プリズムは全反射を利用して、光線を反射することと特徴とする請求項４に記載のレーザー走査型顕微鏡。
8. 前記プリズムによって全反射された光線はトラップへ導かれることを特徴とする請求項７に記載のレーザー走査型顕微鏡。
9. 前記プリズムによって全反射された光線は、前記検出器とは異なる検出器へ導かれることを特徴とする請求項７に記載のレーザー走査型顕微鏡。
10. 前記分離素子は以下の条件式を満たすことを特徴とする請求項１から請求項９の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
    ０＜ＮＡ×Ｌ＜Ｄ／２
    ただし、ＮＡは前記集光光学系の射出側の開口数を表し、Ｌは前記分離素子が光線を分離する位置から前記スリットまでの距離を表し、Ｄは前記励起レーザー光と前記蛍光のスリット面上での距離である。
11. 前記分光素子をスペクトル分散方向に駆動可能としたことを特徴とする請求項１から請求項１０の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
12. 請求項６または請求項９に記載のレーザー走査型顕微鏡を使った、１チャンネル分光検出方法。