JP5415854B2

JP5415854B2 - 分光装置および走査型顕微鏡装置

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Publication number: JP5415854B2
Application number: JP2009163565A
Authority: JP
Inventors: 真荒木; 林　　真市; 浩佐々木
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Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2014-02-12
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Description

本発明は、分光装置およびこれを備える走査型顕微鏡装置に関するものである。

従来、標本に励起光を照射し、標本から発せられる光を分散素子によりスペクトル成分に分光してマルチチャンネルＰＭＴにより検出する分光装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。特許文献１に記載の光学装置は、マルチチャンネルＰＭＴを複数のチャンネル群に分割し、スペクトル列とマルチチャンネルＰＭＴとの相対位置をずらしながら光を複数回検出して各チャンネル群内で特殊な処理（ビニングプロセス）を行うことで、分解能を高めて所望の波長範囲の分光検出を行うこととしている。

また、特許文献２に記載の分光装置は、標本等により反射された励起光等の不要光がマルチチャンネルＰＭＴに入射されるのを抑制するため、マルチチャンネルＰＭＴの受光面の前に励起光の光束幅に対応した遮光板を配置している。例えば、蛍光の強度は極めて弱いため、蛍光より強度が強い不要光がマルチチャンネルＰＭＴに入射されるのを遮光板によって防ぐことで、検出すべき波長範囲の蛍光の検出精度が低下するのを防ぐこととしている。

特開２００６−９８４１９号公報特開２００６−１２５９７０号公報

しかしながら、特許文献１に記載の光学装置は、高分解能の分光検出を行うためにスペクトル列とマルチチャンネルＰＭＴとの相対位置をずらしながら光を複数回検出しなければならず、所望の波長範囲の分光検出を行うのに時間がかかるという問題がある。また、マルチチャンネルＰＭＴのチャンネルをＯＮ／ＯＦＦ制御することにより検出する波長範囲を選択する場合、不要な波長範囲の光に対応するチャンネルをＯＦＦにしても、その波長範囲の光が隣接するチャンネルに光が漏れこんで、検出精度が低下するという不都合がある。

また、特許文献２に記載の分光装置は、遮光板により不要光を遮ることはできるが、検出すべき蛍光の波長範囲を細かく設定することができず、多波長検出の場合に蛍光のクロストークを避けることができないという問題がある。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、検出波長範囲を自由に設定でき、精度が高い分光検出を迅速に行うことができる分光装置および走査型顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本からの光を波長ごとに分散させる分散素子と、該分散素子により分散させられた前記光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管と、複数の前記検出部に対する前記光の入射を、その入射範囲の一端と他端の少なくとも一方を前記検出部の幅より小さい変化量で変化させて制限し、前記複数の検出部により検出される前記光の波長範囲の上限と下限の少なくとも一方を該検出部の幅に対応する波長範囲よりも小さい波長分解能で調整する制限手段と、該制御手段により入射が制限された前記光を検出した前記複数の検出部の検出信号を合算する合算部とを備える分光装置を提供する。

本発明によれば、分散素子により波長ごとに分散された標本からの光が、光の分散方向に沿って配列された光電子増倍管の複数の検出部に入射されることで、光を波長ごとに１度で検出することができる。また、制限手段により、複数の検出部に入射される光の入射範囲を制限することで、検出すべき波長範囲を分割したり限定したりすることができる。

この場合に、制限手段による光の入射範囲の制限幅が検出部の幅より小さい変化量で変更することで、検出すべき波長範囲を検出部の幅より細かい幅で増減することができる。したがって、標本等から戻る励起光や多波長検出の場合の光のクロストーク部分の波長範囲に制限幅をほぼ一致させ、これらの光が検出部に入射してしまうのを防ぐことができる。これにより、検出すべき波長範囲の光だけを検出部に入射させ、ノイズが少なく精度が高い分光検出を迅速に行うことができる。
上記発明においては、前記制限手段は、前記検出部の幅より小さい変化量で前記分散素子の分散方向に位置調整可能な遮光部材であることとしてもよい。
上記発明においては、前記制限手段が、前記複数の検出部の配列の一部への前記光の入射を制限することにより、それぞれが前記検出部の幅に対応する波長範囲よりも小さい波長分解能で調整された検出波長範囲を有する複数の検出部群を構成し、前記合算部が、前記複数の検出部群ごとに、対応する前記検出部からの検出信号をそれぞれ合算することとしてもよい。
上記発明においては、前記制限手段が、前記標本から発せられる複数種類の蛍光のクロストーク部分の光の入射を制限することにより、当該複数種類の蛍光のそれぞれに対応した前記検出部群を構成することとしてもよい。

上記発明においては、前記分散素子が、前記標本からの光と前記検出部に入射される光とを含む平面に直交する回転軸まわりに揺動可能に配置された回折格子であることとしてもよい。

このように構成することで、回折格子を揺動させることにより、光電子増倍管に入射させる光を検出部の配列方向に沿って移動させ、各検出部に入射される光の波長範囲を変更することができる。したがって、検出すべき波長範囲に応じて回折格子の揺動角度を調整することで、その波長範囲の光を確実に検出部に入射させることができる。

また、上記発明においては、前記制限手段が、前記光の光軸に交差する方向に沿って幅寸法が変化する遮光板であり、該光軸に交差する方向に移動可能に配置されていることとしてもよい。

このように構成することで、検出しない波長範囲に対応する検出部と分散素子との間に遮光板を配置することにより、複数の検出部に入射される光を部分的に遮光し、検出すべき波長範囲の光だけを検出部に入射させることができる。この場合に、検出部に入射される光の光軸に交差する方向に遮光板を移動させることにより、遮光する波長範囲を遮光板の幅寸法に応じて検出部の幅より細かい幅で増減することができ、検出すべき波長範囲を簡易かつ迅速に制限することができる。

また、上記発明においては、前記制限手段が、前記検出部と共役な位置に配置された複数の微小偏向素子を備える微小偏向素子アレイであり、各前記微小偏向素子に入射される前記光の波長幅が各前記検出部に入射される前記光の波長幅より小さいこととしてもよい。

このように構成することで、各微小偏向素子の揺動角度を調整することにより、微小偏向素子アレイに入射された光のうち、検出すべき波長範囲の光を複数の検出部に向けて偏向し、それ以外の波長範囲の光を他の方向に向けて偏向することができる。この場合に、各微小偏向素子に入射される光の波長幅が各検出部に入射される光の波長幅より小さいので、検出部に入射させる光の入射範囲を微小偏向素子の揺動角度に応じて検出部の幅より細かい幅で増減することができ、検出すべき波長範囲を簡易かつ迅速に制限することができる。

また、上記発明においては、前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されていることとしてもよい。

このように構成することで、光電子増倍管の検出部間に電極を構成するための不感帯（ギャップ）が存在する場合であっても、シリンドリカルレンズにより各検出部の受光面に効率的に光を入射させ、ギャップによる光の光量損失を防ぐことができる。

本発明は、標本に励起光を照射する光源と、該光源から照射された前記励起光を前記標本上で走査させるスキャナと、該スキャナにより走査された前記励起光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る光を集光する対物レンズと、該対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、該対物レンズにより集光された前記光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過した前記光が入射される上記本発明の前記分光装置とを備える走査型顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、光源から発せられスキャナによって走査された励起光が対物レンズにより標本に照射されると、標本からの光が対物レンズによって集光され、共焦点ピンホールを部分的に通過して分光装置に入射される。これにより、標本の観察を行うとともに、分光装置により所望の波長範囲の光の分光情報を高精度かつ迅速に取得することができる。
上記発明においては、前記分光装置の前記制限手段が、前記複数の検出部の配列の一部への前記光の入射を制限することにより、それぞれが前記検出部の幅に対応する波長範囲よりも小さい波長分解能で調整された検出波長範囲を有する複数の検出部群を構成し、前記合算部が、前記複数の検出部群ごとに、対応する前記検出部からの検出信号をそれぞれ合算することとしてもよい。
上記発明においては、前記制限手段が、前記標本から発せられる複数種類の蛍光のクロストーク部分の光の入射を制限することにより、当該複数種類の蛍光のそれぞれに対応した前記検出部群を構成することとしてもよい。
上記発明においては、前記制限手段が、前記光の光軸に交差する方向に沿って幅寸法が変化する遮光板であり、該光軸に交差する方向に移動可能に配置されていることとしてもよい。
本発明は、標本に励起光を照射する光源と、該光源から照射された前記励起光を前記標本上で走査させるスキャナと、該スキャナにより走査された前記励起光を前記標本照射する一方、該標本から戻る光を集光する対物レンズと、該対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、該対物レンズにより集光された前記光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過した前記光が入射される上記の分光装置とを備えた走査型顕微鏡装置であって、前記分光装置の制限手段が、前記検出部と共役な位置に配置された複数の微小偏向素子を備える微小偏向素子アレイであり、各前記微小偏向素子に入射される前記光の波長幅が各前記検出部に入射される前記光の波長幅より小さい、走査型顕微鏡装置を提供する。
上記発明においては、上記発明においては、前記分散素子が、前記標本からの光と前記検出部に入射される光とを含む平面に直交する回転軸まわりに揺動可能に配置された回折格子であることとしてもよい。
上記発明においては、前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されていることとしてもよい。

本発明によれば、検出波長範囲を自由に設定でき、精度が高い分光検出を迅速に行うことができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡装置の概略構成図である。図１の分光装置の概略構成図である。図２の分光装置のマルチチャンネルＰＭＴのセルおよびシリンドリカルレンズを蛍光の光路に直交する方向から見た概略図である。図３のマルチチャンネルＰＭＴのセルおよびシリンドリカルレンズを示す拡大図である。図２のマルチチャンネルＰＭＴのセルおよび遮光板を蛍光の入射方向から見た概略図である。図５の遮光板の配置位置と蛍光の波長範囲との関係を示す概略図である。本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡装置における分光装置の概略構成図である。図７のＤＭＤおよびマルチチャンネルＰＭＴ周辺を別の角度から見た概略図である。図７のＡ矢視図である。図７のＢ矢視図である。本発明の第２の実施形態の変形例に係る走査型顕微鏡装置における分光装置の概略構成図である。図１１のＡ矢視図である。

〔第１の実施形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る分光装置および走査型顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００は、図１に示すように、複数の蛍光色素によって標識された生細胞等の標本１に照射する励起光を発する可視レーザユニット１０と、可視レーザユニット１０から発せられた励起光を標本１上で走査させるＸＹガルバノミラー（スキャナ）２２を有するスキャンユニット２０と、スキャンユニット２０からの励起光を標本１に照射するとともに標本１の照射位置において発生する蛍光を集光する対物レンズ４０と、スキャンユニット２０と対物レンズ４０との間に配置され、分光検出と顕微鏡観察とを切り替えるスキャンユニット導入投光管５０と、スキャンユニット導入投光管５０により分光検出時にスキャンユニット２０に戻された蛍光の分光検出を行う分光装置６０とを備えている。

可視レーザユニット１０は、励起光を発生する、例えば、ＡｒＫｒ（アルゴン・クリプトン）レーザ等の光源１２と、光源１２から発せられた励起光の透過波長を制御するＡＯＴＦ（波長可変フィルタ）１４とを備えている。符号１６は、可視レーザユニット１０からの励起光をスキャンユニット２０へ導光する可視用シングルモードファイバである。

スキャンユニット２０は、可視用シングルモードファイバ１６により可視レーザユニット１０から導光された励起光を反射して標本１上で走査させるＸＹガルバノミラー（スキャナ）２２と、ＸＹガルバノミラー２２により反射された励起光を集光する瞳投影レンズ２４とを備えている。

スキャンユニット導入投光管５０は、スキャンユニット２０の瞳投影レンズ２４を透過した励起光をコリメートする結像レンズ５２と、結像レンズ５２を透過した励起光を反射して対物レンズ４０に入射させるとともに、標本１において発生し対物レンズ４０により集光された蛍光を反射してスキャンユニット２０へ戻す反射ミラー５４とを備えている。
符号４２は対物レンズ４０の瞳位置を示している。

反射ミラー５４は、分光検出時に標本１からの蛍光をＸＹガルバノミラー２２に戻してディスキャンさせるものであり、ＸＹガルバノミラー２２と対物レンズ４０との間の光路に挿脱可能に配置されている。また、反射ミラー５４は、図示しない切替え手段により、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６と交換可能になっている。

ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６は、顕微鏡観察において標本１からの蛍光をＸＹガルバノミラー２２に戻さずに（ノンディスキャン）観察するためのものであり、結像レンズ５２からの励起光を反射して対物レンズ４０に入射させる一方、標本１からの蛍光を透過させるようになっている。なお、切換え手段としては、特に限定されるものでなく、例えば、手動で反射ミラー５４とノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６とを切り換えることとしてもよいし、自動で切り換えを行うことができる装置を採用することとしてもよい。

また、前記スキャンユニット２０には、標本１において発生し対物レンズ４０により集光されてスキャンユニット導入投光管５０およびＸＹガルバノミラー２２を介して励起光の光路を逆方向に戻される蛍光を励起光から分離する励起ＤＭ２６と、励起ＤＭ２６により励起光から分離された蛍光を集光する共焦点レンズ２８と、対物レンズ４０の焦点位置に共役な位置に配置され、共焦点レンズ２８により集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホール３２と、共焦点ピンホール３２を通過した蛍光を平行光にするコリメートレンズ３４とを備えている。

分光装置６０は、図２に示すように、コリメートレンズ３４により平行光となった蛍光を一方向に波長ごとに分散させる回折格子（分散素子）６２と、回折格子６２により分散された蛍光を集光する集光レンズ６４と、集光レンズ６４により集光された蛍光を検出する複数のセル（検出部)６５を有するマルチチャンネルＰＭＴ（光電子増倍管）６６と、複数のセル６５に入射される蛍光の入射範囲を制限する第１遮光板６８Ａおよび第２遮光板６８Ｂ（制限手段、図５参照）とを備えている。

回折格子６２は、図示しないモータにより、スキャンユニット２０から入射される蛍光（すなわち、入射光）とセル６５に向けて反射される蛍光（すなわち、反射光）とを含む平面に直交する回転軸まわりに揺動可能に配置されている。

マルチチャンネルＰＭＴ６６は、回折格子６２により一方向に分散される蛍光の分散方向に沿って、複数のセル６５が１次元に配列されて構成されている。マルチチャンネルＰＭＴ６６としては、例えば、３２個のセル６５が１次元に配列されて構成される３２ＣＨマルチアノードＰＭＴ（浜松ホトニクス社製）を採用することができる。

図３に示すように、マルチチャンネルＰＭＴ６６のセル６５間に電極を構成するためのギャップ（不感帯）７４が存在する場合は、複数のシリンドリカルレンズ７２により構成されるシリンドリカルレンズアレイ７３をセル６５の受光面６５ａ近傍に配置することとしてもよい。

この場合、シリンドリカルレンズ７２は、セル６５の配列ピッチに略一致するピッチで配列し、それぞれ各セル６５に対して１対１で対応するように配置するのが望ましい。同図において、符号Ｓは回折格子６２により分散された蛍光のスペクトル列の結像面を示している。シリンドリカルレンズ７２の入射面と蛍光のスペクトル列の結像面Ｓとを略一致させるのが望ましい。このようにシリンドリカルレンズ７２をセル６５の受光面６５ａ近傍に配置することにより、図４に示すように、マルチチャンネルＰＭＴ６６上のギャップ４４を避けて蛍光をセル６５に入射させることができ、検出光率の向上を図ることができる。

第１遮光板６８Ａおよび第２遮光板６８Ｂ（以下、これらを合わせて単に「遮光板６８Ａ，６８Ｂ」という。）は、例えば、図５に示すように、蛍光の光軸に交差する方向に沿って幅寸法が変化する略三角形状の板状部材であり、セル６５に入射される蛍光を部分的に遮光することができるようになっている。これらの遮光板６８Ａ，６８Ｂは、互いに鋭角の先端部分が対向するように配置されている。

また、遮光板６８Ａ，６８Ｂは、それぞれ図示しないモータによりセル６５の受光面６５ａ上を光軸に略直交する方向に移動可能に設けられている。具体的には、遮光板６８Ａ，６８Ｂは、回折格子６２による蛍光の分散方向に沿う方向（Ｘ方向）および蛍光の分散方向に直交する方向（Ｙ方向）にそれぞれセル６５の幅より小さい変化量で移動することができるようになっている。

このように構成された遮光板６８Ａ，６８Ｂによれば、蛍光の入射範囲の制限幅をセル６５の幅より小さい変化量で変更する。例えば、Ｘ方向の移動により蛍光を遮光するセル６５を決め、Ｙ方向の移動により蛍光の入射範囲の制限幅を微調整することができる。

また、この走査型顕微鏡装置１００には、鏡筒用結像レンズ８２を備える顕微鏡観察用の顕微鏡観察鏡筒８０と、顕微鏡観察時に反射ミラー５４に代えて配置されたノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を透過した蛍光を鏡筒用結像レンズ８２に集光させる投影レンズ９２を備えるノンディスキャンユニット９０と、図示しない透過光源等が備えられている。

このように構成された本実施形態に係る分光装置６０および走査型顕微鏡装置１００の作用について説明する。
まず、走査型顕微鏡装置１００により多波長検出を行う場合には、スキャンユニット導入投光管５０内の光路に反射ミラー５４を配置する。そして、ステージ（図示略）上に標本１を配置し、光源１２から励起光を発生する。光源１２から発せられた励起光は、ＡＯＴＦ１４により透過波長が制御され、可視用シングルモードファイバ１６によりスキャンユニット２０へと導光される。

スキャンユニット２０へ導光された励起光は、励起ＤＭ２６で反射されＸＹガルバノミラー２２により走査される。ＸＹガルバノミラー２２により走査された励起光は、瞳投影レンズ２４および結像レンズ５２を透過し反射ミラー５４で反射され、対物レンズ４０によって標本１に照射される。

励起光が照射されることにより標本１の照射位置において発生した蛍光は、対物レンズ４０によって集光され、反射ミラー５４で反射され励起光の光路を逆方向に戻る。そして、蛍光は結像レンズ５２および瞳投影レンズ２４を透過し、ＸＹガルバノミラー２２を介して励起ＤＭ２６で励起光から分離される。

励起光から分離された蛍光は、共焦点レンズ２８により集光されて共焦点ピンホール３２を通過し、コリメートレンズ３４により平行光とされて分光装置６０に入射される。この場合に、共焦点ピンホール３２を通過した蛍光のスポット径が、マルチチャンネルＰＭＴ６６の各セル６５の受光面６５ａより小さいことが望ましい。スポット径が小さいほど、波長分解能を高くすることができる。

分光装置６５に入射された蛍光は、回折格子６２により一方向に分散させられる。例えば、波長領域４００〜５３０ｎｍの光を蛍光１、波長領域５００〜６３０ｎｍの光を蛍光２、波長領域６００〜６３０ｎｍの光を蛍光３とする。なお、これらの蛍光には、標本１において反射された励起波長（図６の符号ａ，ｂ，ｃ参照)等も含まれている。

回折格子６２により分散された蛍光は、集光レンズ６４により集光されてマルチチャンネルＰＭＴ６６の複数のセル６５に入射される。この場合に、回折格子６２の揺動角度を調整することにより、セル６５の配列方向に沿って蛍光の入射位置を移動させ、各セル６５に入射される蛍光の波長範囲を変更することができる。そこで、例えば、蛍光１の開始波長（４００ｎｍ）がマルチチャンネルＰＭＴ６６の１番端に配置されたセル６５に入射されるように回折格子６２の揺動角度を調整する。

また、図６に示すように、蛍光２の励起波長ｂ、および、蛍光１の終了波長（５３０ｎｍ）付近と蛍光２の開始波長（５００ｎｍ）付近とのクロストーク部分に対応するセル６５の受光面６５ａ上に第１遮光板６８Ａを配置する。

この場合に、第１遮光板６８Ａの位置をセル６５の幅より小さい変化量で微調整し、蛍光２の励起波長ｂおよびクロストーク部分の波長範囲と第１遮光板６８Ａにより遮光する範囲とをほぼ一致させることで、これらの光を遮光し、蛍光１の開始波長から蛍光１と蛍光２とのクロストーク部分直前までの波長範囲の蛍光のみをセル６５に入射させることができる。同図に示すように、複数のセル６５のうち、蛍光１の開始波長から蛍光１と蛍光２とのクロストーク部分直前までの範囲に対応する領域を第１チャンネル群６７Ａとする。

また、蛍光３の励起波長ｃ、および、蛍光２の終了波長（６３０ｎｍ）付近と蛍光３の開始波長（６００ｎｍ）付近のクロストーク部分に対応するセル６５の受光面６５ａ上に第２遮光板６８Ｂを配置する。この場合も同様に、第２遮光板６８Ｂの位置を微調整し、蛍光３の励起波長ｃおよびクロストーク部分の波長範囲と第２遮光板６８Ｂにより遮光する範囲とをほぼ一致させることで、これらの光を遮光し、蛍光１と蛍光２とのクロストーク部分直後から蛍光２と蛍光３とのクロストーク部分直前までの波長範囲の蛍光のみをセル６５に入射させることができる。

また、複数のセル６５のうち、蛍光１と蛍光２とのクロストーク部分直後から蛍光２と蛍光３とのクロストーク部分直前までの範囲に対応する領域を第２チャンネル群６７Ｂとする。また、蛍光２と蛍光３とのクロストーク部分直後から蛍光３の終了波長（７３０ｎｍ）までの範囲に対応する領域を第３チャンネル群６７Ｃとする。

第１チャンネル群６７Ａ、第２チャンネル群６７Ｂおよび第３チャンネル群６７Ｃ（以下、これらを合わせて単に「チャンネル群６７Ａ，６７Ｂ，６７Ｃ」という。）により、蛍光１、蛍光２および蛍光３からクロストーク部分と励起波長とが除去された異なる波長範囲の蛍光を同時に検出することができる。

次に、顕微鏡観察を行う場合には、スキャンユニット導入投光管５０の光路にノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を配置し、透過光源により標本１を照明する。標本１からの蛍光は対物レンズ４０により集光され、ノンディスキャン検出用励起ＤＭ５６を透過して顕微鏡観察鏡筒９４に入射される。これにより、標本１の目視観察を行うことができる。

以上説明したように、本実施形態に係る分光装置６０および走査型顕微鏡装置１００によれば、遮光板６８Ａ，６８Ｂにより、蛍光の入射範囲の制限幅をセル６５の幅より小さい変化量で変更することで、チャンネル群６７Ａ，６７Ｂ，６７Ｃごとに検出する光の波長範囲をセル６５の幅より細かい幅で増減することができる。したがって、蛍光の励起波長や蛍光のクロストーク部分を遮光して検出すべき波長範囲の蛍光だけをセル６５に入射させることができる。これにより、ノイズが少なく精度が高い分光検出を迅速に行うことができる。
なお、チャンネル群６７Ａ，６７Ｂ，６７Ｃごとにピクセルを合算し、図示しないモニタ等に表示することとしてもよい。

また、本実施形態においては、２つの遮光板６８Ａ，６８ＢによりマルチチャンネルＰＭＴ６６の複数のセル６５のうち、蛍光１，２，３を検出する領域を３つのチャンネル群６７Ａ，６７Ｂ，６７Ｃに分割することとしたが、例えば、第１遮光板６８Ａまたは第２遮光板６８Ｂのいずれか一方のみを用い、マルチチャンネルＰＭＴ６６の複数のセル６５を蛍光１，２を検出する２つのチャンネル群６７Ａ，６７Ｂに分割することとしてもよいし、あるいは、蛍光２，３を検出する２つのチャンネル群６７Ｂ，６７Ｃや蛍光１，３を検出する２つのチャンネル群６７Ａ，６７Ｃに分割することとしてもよい。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る分光装置および走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００は、図７および図８に示すように、分光装置１６０が、遮光板６８Ａ，６８Ｂに代えて、回折格子６２からの蛍光を偏向するＤＭＤ（微小偏向素子アレイ、制御手段）１６８を備えるとともに、回折格子６２とＤＭＤ１６８との間の光路に配置された集光レンズ６４（本実施形態において、以下「第１集光レンズ６４」という。）に加えて、さらに、ＤＭＤ１６８とマルチチャンネルＰＭＴ６６との間の光路に配置され、ＤＭＤ１６８により偏向された蛍光を集光する第２集光レンズ１６４を備える点で、第１の実施形態と異なる。
以下、第１の実施形態に係る分光装置６０および走査型顕微鏡装置１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

ＤＭＤ１６８は、図９に示すように、セル６５と共役な位置に２次元配列された揺動可能な複数のマイクロミラー１６７を備えている。このＤＭＤ１６８は、対角線上に配列された１列の複数のマイクロミラー１６７が、回折格子６２による蛍光の分散方向およびマルチチャンネルＰＭＴ６６のセル６５の配列方向に対応するように配置されている。

ＤＭＤ１６８の対角線上に配列された１列の複数のマイクロミラー１６７は、対応するマルチチャンネルＰＭＴ６６のセル６５の数より多く、それぞれＯＮ状態の揺動角度ではマルチチャンネルＰＭＴ６６に向けて蛍光を偏向し、ＯＦＦ状態の揺動角度では他の方向に蛍光を偏向するようになっている。したがって、各マイクロミラー１６７に入射される蛍光の波長幅の方が各セル６５に入射される蛍光の波長幅より小さく、マイクロミラー１６７のＯＮ／ＯＦＦを切り替えることにより、セル６５に入射させる蛍光の入射範囲をセル６５の幅より小さい変化量で増減することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る分光装置１６０および走査型顕微鏡装置１００の作用について説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡装置１００により分光検出を行う場合、分光装置１６０に入射された蛍光は、回折格子６２により一方向に分散させられて第１集光レンズ６４に入射され、ＤＭＤ１６８に集光される。

ＤＭＤ１６８に集光された蛍光は、１列の複数のマイクロミラー１６７のうちＯＮ状態のマイクロミラー１６７によりマルチチャンネルＰＭＴ６６に向けて偏向されて第２集光レンズ１６４に入射され、図１０に示すように、マルチチャンネルＰＭＴ６６の各セル６５の前に配置されたシリンドリカルレンズアレイ７３に集光される。

この場合に、蛍光１の開始波長がマルチチャンネルＰＭＴ６６の１番端に配置されたセル６５に入射されるように回折格子６２の揺動角度を調整する。なお、例えば、回折格子６２により分散された蛍光がＤＭＤ１６８における１列の複数のマイクロミラー１６７に入射可能であれば、回折格子６２の揺動角度を調整することなく、マルチチャンネルＰＭＴ６６を蛍光の分散方向に移動させることにより、検出すべき波長範囲の蛍光を受光することとしてもよい。

また、ＤＭＤ１６８は、蛍光１の開始波長から蛍光１と蛍光２とのクロストーク部分直前までの範囲に対応するマイクロミラー１６７をＯＮ状態にし、この波長範囲の蛍光をマルチチャンネルＰＭＴ６６に向けて偏向する。一方、蛍光２の励起波長、および、蛍光１と蛍光２とのクロストーク部分に対応するマイクロミラー１６７をＯＦＦ状態にし、この波長範囲の蛍光を他の方向に向けて偏向する。

同様に、蛍光１と蛍光２とのクロストーク部分直後から蛍光２と蛍光３とのクロストーク部分直前までの範囲に対応するマイクロミラー１６７をＯＮ状態にし、この波長範囲の蛍光をマルチチャンネルＰＭＴ６６に向けて偏向するとともに、蛍光３の励起波長、および、蛍光２と蛍光３とのクロストーク部分に対応するマイクロミラー１６７をＯＦＦ状態にし、この波長範囲の蛍光を他の方向に向けて偏向する。

さらに、蛍光２と蛍光３のクロストーク部分直後から蛍光の終了波長までの範囲に対応するマイクロミラー１６７をＯＮ状態にし、この波長範囲の蛍光をマルチチャンネルＰＭＴ６６に向けて偏向する。

この場合に、セル６５に入射させる蛍光の入射範囲をマイクロミラー１６７のＯＮ／ＯＦＦに応じてセル６５の幅より細かい幅で増減することができ、検出すべき波長範囲を蛍光のクロストーク部分と励起波長とを除いた範囲に制限することができる。これにより、マルチチャンネルＰＭＴ６６において、蛍光１、蛍光２および蛍光３からクロストーク部分と励起波長とが除去された異なる波長範囲の蛍光を同時に検出することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る分光装置１６０および走査型顕微鏡装置１００によれば、ＤＭＤ１６８の１列の複数のマイクロミラー１６７のＯＮ／ＯＦＦを切り替えることにより、マルチチャンネルＰＭＴ６６に入射させる光の入射範囲を簡易かつ迅速に制限して所望の波長範囲の蛍光だけを容易に検出することができる。

なお、本実施形態においては、ＤＭＤ１６８とマルチチャンネルＰＭＴ６６との間の光路に第２集光レンズ１６４を配置することとしたが、これに代えて、例えば、ズーム光学系を配置することとしてもよい。ズーム光学系を透過させてマルチチャンネルＰＭＴ６６に蛍光を入射させることで、１つあたりのセル６５に入射される蛍光の波長範囲が狭くなり、分解能を向上することができる。この場合、検出する波長範囲に合わせてマルチチャンネルＰＭＴ６６を蛍光の分散方向に移動させることにより、所望の波長範囲の蛍光を受光させることすればよい。

なお、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、本実施形態においては、分光装置１６０がマルチチャンネルＰＭＴ６６を１つ備えることとしたが、例えば、図１１に示すように、２つのマルチチャンネルＰＭＴ６６Ａ，６６Ｂを設け、各マルチチャンネルＰＭＴ６６Ａ，６６Ｂにより、所望の波長範囲ごとに分光検出を行うこととしてもよい。この場合、ＤＭＤ１６８と各マルチチャンネルＰＭＴ６６Ａ，６６Ｂとの間の光路にそれぞれ第２集光レンズ１６４を配置することとすればよい。また、一方のマルチチャンネルＰＭＴ６６ＡをＤＭＤ１６８のＯＮ状態の揺動角度のマイクロミラー１６７に対向する位置に配置するとともに、他方のマルチチャンネルＰＭＴ６６ＢをＤＭＤ１６８のＯＦＦ状態の揺動角度のマイクロミラー１６７に対向する位置に配置し、それぞれ蛍光の励起波長やクロストーク部分を反対の作動状態のマイクロミラー１６７により反射することとすればよい。

例えば、３重染色の標本１に対しては、図１２に示すように、前記他方のマルチチャンネルＰＭＴ６６ＢをマルチチャンネルＰＭＴ６６Ｂ−１，６６Ｂ−２に分割し、ＤＭＤ１６８のＯＮ状態のマイクロミラー１６７により、蛍光１をマルチチャンネルＰＭＴ６６Ｂ−１に向けて偏向するとともに蛍光３をマルチチャンネルＰＭＴ６６Ｂ−２に向けて偏向し、ＤＭＤ１６８のＯＦＦ状態のマイクロミラー１６７により、蛍光２をマルチチャンネルＰＭＴ６６Ａに向けて偏向することとすればよい。この場合、マルチチャンネルＰＭＴ６６Ｂ−１，６６Ｂ−２は、それぞれＯＮ状態のマイクロミラー１６７により蛍光の励起波長やクロストーク部を反対方向に反射し、マルチチャンネルＰＭＴ６６ＡはＯＦＦ状態のマイクロミラー１６７により蛍光の励起波長やクロストーク部分を反対方向に反射することとすればよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
例えば、検出する蛍光の波長範囲の設定や、マルチチャンネルＰＭＴ６６のセル６５を分割する数は上記各実施形態に限定されるものではない。

１標本
１２光源
２２ＸＹガルバノミラー（スキャナ）
３２共焦点ピンホール
４０対物レンズ
６０分光装置
６２回折格子（分散素子）
６５セル（検出部）
６６，６６Ａ，６６ＢマルチチャンネルＰＭＴ（光電子増倍管）
６８Ａ，６８Ｂ遮光板（制限手段）
７２シリンドリカルレンズ
１００走査型顕微鏡装置
１６８ＤＭＤ（制御手段）

Claims

標本からの光を波長ごとに分散させる分散素子と、
該分散素子により分散させられた前記光の分散方向に沿って配列された複数の検出部を有する光電子増倍管と、
複数の前記検出部に対する前記光の入射を、その入射範囲の一端と他端の少なくとも一方を前記検出部の幅より小さい変化量で変化させて制限し、前記複数の検出部により検出される前記光の波長範囲の上限と下限の少なくとも一方を該検出部の幅に対応する波長範囲よりも小さい波長分解能で調整する制限手段と、
該制御手段により入射が制限された前記光を検出した前記複数の検出部の検出信号を合算する合算部を備える分光装置。
前記制限手段は、前記検出部の幅より小さい変化量で前記分散素子の分散方向に位置調整可能な遮光部材である請求項１に記載の分光装置。
標本に励起光を照射する光源と、
該光源から照射された前記励起光を前記標本上で走査させるスキャナと、
該スキャナにより走査された前記励起光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る光を集光する対物レンズと、
該対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、該対物レンズにより集光された前記光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、
該共焦点ピンホールを通過した前記光が入射される請求項１または請求項２に記載の分光装置とを備える走査型顕微鏡装置。
前記分光装置の前記制限手段が、前記複数の検出部の配列の一部への前記光の入射を制限することにより、それぞれが前記検出部の幅に対応する波長範囲よりも小さい波長分解能で調整された検出波長範囲を有する複数の検出部群を構成し、
前記合算部が、前記複数の検出部群ごとに、対応する前記検出部からの検出信号をそれぞれ合算する請求項３に記載の走査型顕微鏡装置。
前記制限手段が、前記標本から発せられる複数種類の蛍光のクロストーク部分の光の入射を制限することにより、当該複数種類の蛍光のそれぞれに対応した前記検出部群を構成する請求項４に記載の走査型顕微鏡装置。
前記制限手段が、前記光の光軸に交差する方向に沿って幅寸法が変化する遮光板であり、該光軸に交差する方向に移動可能に配置されている請求項３から請求項５のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
前記制限手段が、前記複数の検出部の配列の一部への前記光の入射を制限することにより、それぞれが前記検出部の幅に対応する波長範囲よりも小さい波長分解能で調整された検出波長範囲を有する複数の検出部群を構成し、
前記合算部が、前記複数の検出部群ごとに、対応する前記検出部からの検出信号をそれぞれ合算する請求項１または請求項２に記載の分光装置。
前記制限手段が、前記標本から発せられる複数種類の蛍光のクロストーク部分の光の入射を制限することにより、当該複数種類の蛍光のそれぞれに対応した前記検出部群を構成する請求項７に記載の分光装置。
前記制限手段が、前記光の光軸に交差する方向に沿って幅寸法が変化する遮光板であり、該光軸に交差する方向に移動可能に配置されている請求項１、２、７、８のいずれかに記載の分光装置。
前記制限手段が、前記検出部と共役な位置に配置された複数の微小偏向素子を備える微小偏向素子アレイであり、各前記微小偏向素子に入射される前記光の波長幅が各前記検出部に入射される前記光の波長幅より小さい請求項１に記載の分光装置。
前記分散素子が、前記標本からの光と前記検出部に入射される光とを含む平面に直交する回転軸まわりに揺動可能に配置された回折格子である請求項１、２、７、８、９、１０のいずれかに記載の分光装置。
前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されている請求項１、２、７、８、９、１０、１１のいずれかに記載の分光装置。
標本に励起光を照射する光源と、
該光源から照射された前記励起光を前記標本上で走査させるスキャナと、
該スキャナにより走査された前記励起光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る光を集光する対物レンズと、
該対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置され、該対物レンズにより集光された前記光を部分的に通過させる共焦点ピンホールと、
該共焦点ピンホールを通過した前記光が入射される請求項１に記載の分光装置とを備えた走査型顕微鏡装置であって、
前記分光装置の制限手段が、前記検出部と共役な位置に配置された複数の微小偏向素子を備える微小偏向素子アレイであり、各前記微小偏向素子に入射される前記光の波長幅が各前記検出部に入射される前記光の波長幅より小さい、走査型顕微鏡装置。
前記分光装置の前記分散素子が、前記標本からの光と前記検出部に入射される光とを含む平面に直交する回転軸まわりに揺動可能に配置された回折格子である請求項３、４、５、６、１３のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。
前記分光装置の前記光電子増倍管の前記検出部の受光面近傍に配列された複数のシリンドリカルレンズを備え、該シリンドリカルレンズの配列ピッチが前記検出部の配列ピッチと略一致し、かつ、各前記シリンドリカルレンズが各前記検出部にそれぞれ対応して配置されている請求項３、４、５、６、１３、１４のいずれかに記載の走査型顕微鏡装置。