JP6768289B2

JP6768289B2 - 走査型顕微鏡

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Inventors: 小原　直樹; 直樹小原; 山本　亮; 亮山本
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Description

本発明は、走査型顕微鏡に関する。

レゾナントスキャナやガルバノスキャナを利用して照射光を集光点（スポット）に集光し、スポットで試料を走査する走査型顕微鏡は、照射光を試料に照射することで発生する蛍光やラマン散乱光を検出するために利用されている。厚みがあり光の透過率が小さい試料を評価する際は、試料内で多重散乱した散乱光又は蛍光を射出光として、照射光の照射に利用した対物レンズを通して検出する反射型の顕微鏡を用いる。

特に、非線形光学過程を利用した走査型顕微鏡では、照射する光強度に対する非線形性から、試料内で多重散乱した散乱光又は蛍光に含まれる情報はスポットで発生したものとみなされる。そのため、スポットで試料内を２次元又は３次元に走査することで、試料に関する２次元又は３次元の情報が得られる。非線形光学過程として、多光子励起蛍光、第二次高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱や誘導ラマン散乱などがある。

反射型の顕微鏡の場合、照射光が試料内で多重散乱した散乱光のうち、対物レンズの視野内でかつ対物レンズの開口数の範囲内に射出されたものが検出される。得られる射出光は照射光に比べて光強度が小さいため、光路が一致又は近接している照射光から射出光を効率よく分離して検出する必要がある。

その方法としては、特許文献１には、特定の波長の光のみを透過するダイクロイックミラーを利用することで、波長の違いによって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱によって生じた射出光と照射光とを分離することが記載されている。

また、非特許文献１には、固体レーザとＹｂファイバレーザを同期させて試料へ同軸に集光することで、誘導ラマン散乱（ＳｔｉｍｕｌａｔｅｄＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＲＳ）観察が可能な顕微鏡が記載されている。非特許文献１では、試料に照射光を導く対物レンズを通過した試料からの射出光を、λ／４板と偏光ビームスプリッタ（ＰｏｌａｒｉｚｉｎｇＢｅａｍＳｐｌｉｔｔｅｒ：ＰＢＳ）とを用いて照射光の光路から分離し、検出器に伝送している。

特許４９５４４５２号公報

ＮａｔｕｒｅＰｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１５３−１５９，２０１４．

しかしながら、特許文献１に記載の方法は、非特許文献１に示されるような誘導ラマン散乱光の検出には利用できない。誘導ラマン散乱を計測するには照射光と同一の波長の光を検出するため、ダイクロイックミラーを用いても照射光の光路と射出光の光路とを分離することができないためである。

また、多重散乱した光は偏光が解消されているため、非特許文献１のような偏光ビームスプリッタを用いた構成では、射出光の２分の１程度が照射光と分離されて検出器に導光される。つまり、非特許文献１に記載の方法では、試料からの射出光の取得効率が制限される。

本発明はかかる課題に鑑みてなされたもので、照射光を試料に照射することで生じる試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一側面としての走査型顕微鏡は、光源からの照射光により試料を走査する走査手段と、前記光源と前記走査手段との間の、前記照射光の光路上に配置され、前記照射光を透過する透過部と、前記照射光により走査された試料からの射出光を反射する、前記透過部とは異なる反射部と、を有する分離手段と、前記走査手段からの前記照射光を前記試料に集光する第１の光学系と、前記走査手段からの前記照射光を前記第１の光学系に導く第２の光学系と、前記反射部により反射された前記射出光を検出する検出手段と、前記反射部により反射された前記射出光を前記検出手段の受光面に導く第３の光学系と、を有し、前記第１の光学系は、前記試料からの前記射出光を前記第２の光学系に導き、前記第２の光学系は、前記走査手段と前記第１の光学系の入射瞳とが共役になるように配置され、前記第３の光学系は、前記走査手段と前記検出手段の受光面とが共役になるように配置され、前記分離手段は、前記光路上において、前記第１の光学系の入射瞳から、前記走査手段よりも遠い位置に配置されていることを特徴とする。

また、本発明の一側面としての走査型顕微鏡は、光源からの照射光により試料を走査
する走査手段と、前記光源と前記走査手段との間の、前記照射光の光路上に配置され、前記照射光を反射する反射部と、前記照射光により走査された試料からの射出光を透過する、前記反射部とは異なる透過部と、を有する分離手段と、前記走査手段からの前記照射光を前記試料に集光する第１の光学系と、前記走査手段からの前記照射光を前記第１の光学系に導く第２の光学系と、前記反射部により反射された前記射出光を検出する検出手段と、前記反射部により反射された前記射出光を前記検出手段の受光面に導く第３の光学系と、を有し、前記第１の光学系は、前記試料からの前記射出光を前記第２の光学系に導き、前記第２の光学系は、前記走査手段と前記第１の光学系の入射瞳とが共役になるように配置され、前記第３の光学系は、前記走査手段と前記検出手段の受光面とが共役になるように配置され、前記分離手段は、前記光路上において、前記第１の光学系の入射瞳から、前記走査手段よりも遠い位置に配置されていることを特徴とする。

本発明は、照射光を試料に照射することで生じる試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる。

第１の実施形態の走査型顕微鏡の構成を説明する模式図。第１の実施形態の走査型顕微鏡の光路分離手段の構成を説明する模式図。第２の実施形態の走査型顕微鏡の構成を説明する模式図。第２の実施形態の走査型顕微鏡の光路分離手段の構成を説明する模式図。第３の実施形態の走査型顕微鏡の構成を説明する模式図。（ａ）第３の実施形態の走査型顕微鏡における第１の光パルスの光強度の時間プロファイル。（ｂ）第３の実施形態の走査型顕微鏡における第２の光パルスの光強度の時間プロファイル。

（第１の実施形態）
本実施形態の走査型顕微鏡１００（以下、「顕微鏡１００」と呼ぶ）の構成について、図１を参照して説明する。図１は、顕微鏡１００の構成を説明する模式図である。顕微鏡１００は、光源を１つ有する走査型顕微鏡で、例えば、多光子励起蛍光顕微鏡又は第二次高調波発生顕微鏡等である。本実施形態の顕微鏡１００は、光源１が出力する光を集光点（スポット）に集光して、試料７内（試料７表面を含む）を２次元に走査しながら試料７からの射出光の光強度を検出することで、試料７の画像を取得することができる。なお、以降の説明では、光源１から試料７に照射される光束を「照射光」、試料７に照射された後に試料７から射出した光を「射出光」と呼ぶ。「射出光」は、試料７内で多重散乱して試料７から射出した光で、後方散乱光等を含む。

顕微鏡１００は、光源１と、分離手段２と、走査手段３と、レンズ４、５（第２の光学系）と、光学系６（第１の光学系）と、レンズ８、９（第３の光学系）と、検出手段（検出器）１０と、を有する。

光源１は、試料７に照射する照射光１０１を出力する。光源１が出力する照射光１０１は平行ビームである。光源１からの照射光１０１は、分離手段２に入射する。

分離手段２は、光源１からの照射光１０１を透過させ、試料７からの射出光を反射することにより、光源１からの照射光１０１の光路と試料７からの射出光の光路とを分離する。分離手段２についての詳細は、後述する。

分離手段２を透過した照射光１０１は、走査手段３で反射する。走査手段３は、光源１と光学系６との間の照射光１０１の光路上に配置されている。走査手段３は、照射光のスポットの試料７内における位置を変更することにより、照射光１０１により試料７を走査するための構成である。走査手段３は、走査手段３から射出する照射光１０１の方向を変更して（偏向して）、照射光１０１の光学系６に対する入射角を変更する光偏向素子を含む。例えば、走査手段３は、ガルバノスキャナとレゾナントスキャナとを有し、照射光１０１が進行する向きを直交する２方向に変える。なお、走査手段３の構成は上述の構成に限らず、高速走査のためにレゾナントミラーやポリゴンミラーと組み合わせてもよいし、２つのミラーを利用せずＭＥＭＳスキャナなど１枚のミラーを用いて構成してもよい。

走査手段３で偏向された照射光１０１は、レンズ４、５を通して、光学系６に入射する。レンズ４、５は、走査手段３と光学系６の入射瞳とが共役となるように配置する。走査手段３と光学系６の入射瞳とを共役にすることにより、照射光１０１が光学系６に遮光されて光強度が変化することなく、試料７に集光される。なお、本明細書における「走査手段３と光学系６の入射瞳とが共役」とは、完全に共役でなくてもよく、略共役の関係も含むものとする。例えば、走査手段３を２つのミラーで構成した場合、光学系６の入射瞳に共役な位置が、２つのミラーの間（例えば２つのミラーの一方のミラー上又は２つのミラーの中間位置）であれば、「走査手段３と光学系６の入射瞳とが共役」に含むものとする。

レンズ４、５による光学系の倍率は、光学系６の入射瞳と、光学系６に入射する照射光１０１のビームのサイズが同等になるように選択する。そうすれば、光学系６により集光された照射光１０１のスポットのサイズを最小化させ、得られる散乱光強度の画像の空間分解能を向上することができる。

光学系６は、照射光１０１を試料７内のスポットに導き、且つ、試料７から光学系６側へ射出される射出光を採光して走査手段３に導く光学系である。本実施形態では、対物レンズを用いるが、これに限らず、ミラーを含んでいてもよい。試料７内に集光された照射光は、試料７において多重散乱し、試料７から射出される。試料７から射出された射出光は光学系６に再入射され、走査手段３に導かれる。

試料７からの射出光は、走査手段３を介して分離手段２に到達する。試料７からの射出光のうち試料７における照射光１０１のスポットの位置と異なる位置から射出した光が、分離手段２で反射する。このように、分離手段２を用いることにより、照射光１０１の光路と射出光の光路とを分離することができる。

分離手段２の構成について、図２を参照して説明する。図２は、分離手段２の構成を説明する模式図である。本実施形態の分離手段２は、その中心部に照射光１０１が透過する透過領域（透過部）２１を有する。また、分離手段２は、透過部２１の周囲には、試料７からの射出光を反射する反射領域（反射部）２２を有する。反射部３２は、光を反射する反射ミラーを有し、効率よく射出光を検出するため、反射部３２として金属蒸着膜又は射出光の波長において反射率が高くなるよう設計した誘電体多層膜が施されている。透過部２１は、反射ミラーに物理的に空けた穴（開口）等でもよいし、平板の一部の領域に反射部材が施されないようにして構成してもよい。後者の場合、透過部２１に、照射光１０１の透過率が高くなるような反射防止膜を施してもよい。

照射光１０１の光が偏光している場合、照射光１０１の偏光の光を透過し、直交する偏光の光を反射する偏光素子で透過部２１を構成してもよい。この場合、反射部３２に加えて、透過部２１でも射出光の一部を反射させることができるため、より効率よく射出光を検出することが可能となる。なお、分離手段２の外形及び透過部２１の形状は、図２では円形となっているが、任意の領域に広がる射出光を反射できる形状であればよい。例えば、射出光を反射させる方向に長軸をもった楕円等でもよい。

透過部２１のサイズは、照射光１０１が直進する方向を法線とした面内において、照射光１０１のビーム径以上とする。この条件を満たさないと、照射光１０１が分離手段２で完全に透過できず、光強度が低下する恐れがある。また、照射光１０１の一部が分離手段２を透過せずに試料７に照射されると、試料７に集光した照射光のスポットが小さくなるため、顕微鏡１００で得られる画像の空間分解能が損なわれる恐れがある。

分離手段２における射出光の光路について、試料７の様々な位置から光学系６に再入射する射出光に含まれる複数の光線のうちの１つである射出光１０３の光路を例にとって説明する。

射出光１０３は、試料７のスポットの位置と異なる位置から射出するため、光学系６の入射瞳の位置において、光学系６に対する照射光１０１の入射角と異なる角度で射出される。光学系６の入射瞳の位置と走査手段３とが共役に配置されているため、射出光１０３は、走査手段３に対する照射光１０１の入射角度とは異なる角度で走査手段３から射出される。そのため、走査手段３と離して配置した分離手段２の反射部３２で反射される。反射部２２で反射した射出光１０３は、レンズ８、９を介して検出器１０に入射する。

このように、試料７内における照射光１０１のスポットの位置と異なる位置から射出された試料７からの射出光は、光学系６及び走査手段３を介して分離手段２に到達し、分離手段２で反射される。すなわち、本実施形態の分離手段２は、試料７内における照射光１０１のスポットの位置と異なる位置からの射出光を反射することにより、照射光１０１の光路と射出光の光路とを分離する構成となっている。そのため、分離手段２は、光学系６の像面とフーリエ変換の関係にない位置に配置されている。すなわち、分離手段２は、光学系６の入射瞳と共役でない位置に配置されている。また、分離手段２は光源１と走査手段３の間に配置する必要がある。分離手段２を走査手段３と光学系６との間に置いた場合、走査手段３により照射光１０１の方向を変更した際に、照射光１０１が透過部２１を透過できないためである。

分離手段２の位置は、走査手段３から遠いほど、集光したスポットの近傍で発生した射出光を反射部２２で反射することが出来る。一方で、分離手段２が走査手段３から遠い位置に配置されるほど、試料７内のある領域で発生した射出光を反射するためには、反射部２２をより大きくすることが必要となる。よって、射出光の取得効率を上げるには、分離手段２を走査手段３から遠い位置に配置し、且つ、分離手段２の外形のサイズを分離手段２と走査手段３の距離に比例させて大きくすることが好ましい。

検出器１０は、射出光１０３を含む射出光に感度を持ち、入射した光の強度に応じた電圧を出力する検出手段である。ここでは、検出器１０は、試料７からの射出光を検出する。走査手段３と検出器１０の受光面とが共役になるようにそれぞれを配置することが望ましい。共役に配置することにより、検出器１０の受光面に照射される射出光の位置が、走査手段３の偏向角度によらず一定となる。そのため、受光面外に射出光が照射されることを低減でき、かつ受光面内の受光感度むらの影響を低減して検出を行うことができる。

なお、「走査手段３と検出器１０の受光面とが共役」とは、完全に共役でなくてもよく、略共役の関係も含むものとする。例えば、走査手段３が２つのミラーを有する場合、検出器１０の受光面（検出面）に共役な位置が、２つのミラーの間（例えば一方のミラー上又は２つのミラーの中間位置）であれば、「走査手段３と検出器１０の受光面とが共役」に含むものとする。

コンピュータ１１は、走査手段３の制御信号と検出器１０が出力する信号とを用いて、２次元画像のデータを取得する。具体的には、コンピュータ１１は、射出光の強度の２次元の画像のデータを取得できる。取得した２次元画像のデータは、不図示の表示部で画像として表示する。

上述したように、顕微鏡１００は、光源１と走査手段３との間の照射光１０１の光路に分離手段２を配置している。試料７に照射光１０１が照射されると、試料７内で発生した散乱光、蛍光又は高調波発生光などが多重散乱し、試料７から射出光として射出される。分離手段２は、照射光１０１を透過し、射出光を反射する構成となっているため、分離手段２を用いれば、照射光１０１の光路と射出光の光路とを分離して、射出光を取り出すことができる。分離手段２は、ダイクロイックミラーを使うことなく光路を分離するため、蛍光や高調波発生光だけでなく、照射光１０１の波長と同じ波長の射出光も検出することができる。また、偏光によって分離を行う構成と比較して、分離手段２に到達した射出光の大部分を検出器１０に導くことが可能である。そのため、本実施形態の顕微鏡１００によれば、試料７からの射出光を従来よりも効率よく検出することができる。

（第２の実施形態）
本実施形態の走査型顕微鏡３００（以下、「顕微鏡３００」と呼ぶ）について、図３を参照して説明する。図３は、顕微鏡３００の構成を説明する図である。本実施形態の顕微鏡３００は、試料７からの射出光と照射光１０１とを分離する分離手段１２の構成が第１の実施形態と異なる。具体的には、第１の実施形態の分離手段２は射出光を反射して取り出すのに対し、本実施形態の分離手段１２は、照射光１０１を反射し、射出光を透過させることにより射出光を取り出す。その他の構成は、第１の実施形態と同様である。第１の実施形態と同様の構成については、図３において同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。

図４は、分離手段１２の構成を説明する模式図である。分離手段１２は、中心部に照射光１０１を反射する反射領域（反射部）４２を有し、反射部４２の外周に、試料７からの射出光が透過する透過領域（透過部）４１を有する。光源１からの照射光１０１は、分離手段１２で反射して走査手段３に導かれる。射出光１０３を含む試料７からの射出光は、光学系６、レンズ４、５及び走査手段３を介して分離手段１２に到達し、分離手段１２の透過部４１を透過する。透過部４１を透過した射出光は、レンズ８、９を介して検出器１０に入射して検出される。

このように、試料７内における照射光１０１のスポットの位置と異なる位置から射出された試料７からの射出光は、光学系６、レンズ４、５及び走査手段３を介して分離手段２に到達し、分離手段１２を透過する。すなわち、本実施形態の分離手段１２は、試料７内における照射光１０１のスポットの位置と異なる位置からの射出光を透過させることにより、照射光１０１の光路と射出光の光路とを分離する構成となっている。そのため、分離手段１２は、光学系６の入射瞳と共役でない位置に配置されている。

反射部４２は、第１の実施形態の反射部２２と同様に、照射光１０１の波長の光を反射するよう平板の中心部に反射部材を設けて構成する。透過部４１は、射出光を効率よく検出するために反射防止膜を設けることが望ましい。

分離手段１２は透過部４１としての部材を有さず、射出光が空気中等の空間を伝搬する構成であってもよい。この場合、空間を透過部４１とみなす。照射光１０１の光が偏光である場合、その偏光の光を反射し、且つ照射光１０１の偏光と直交する偏光の光を透過する偏光素子を用いて反射部４２を構成することが好ましい。この場合、透過部４１に加えて、反射部４２でも射出光の一部を透過させることができるため、より効率の良い検出が可能となる。

分離手段１２の透過部４１の形状は、図４では円形となっているが、散乱光が広がる範囲を覆う形状であればよい。例えば、散乱光を透過させる方向に長軸をもった楕円としてもよい。

反射部４２のサイズは、照射光１０１の分離手段１２への入射方向を法線とした面内において、照射光１０１のビーム径以上とする。この条件を満たさないと、照射光１０１が分離手段１２で完全に反射されず光強度が低下する恐れがある。また、照射光１０１の一部が分離手段１２で反射されずに試料７に照射すると、試料７に集光した照射光１０１のスポットが大きくなるため、顕微鏡３００で得られる画像の空間分解能が損なわる恐れがある。

本実施形態においても、走査手段３と検出器１０の受光面とが共役になるように、走査手段３及び検出器１０を配置する。

上述したように、顕微鏡３００は、光源１と走査手段３との間の照射光１０１の光路に分離手段１２を配置している。試料７に照射光１０１が照射されると、試料７内のスポットで発生した散乱光、蛍光あんたは高調波発生光が多重散乱し、試料７から射出光として射出される。分離手段１２は、照射光１０１を反射し、射出光を透過させる構成となっているため、分離手段２を用いれば、照射光１０１の光路と射出光の光路とを分離して、射出光を取り出すことができる。分離手段１２は、ダイクロイックミラーを使うことなく光路を分離するため、蛍光や高調波発生光だけでなく、照射光１０１の波長と同じ波長の射出光も検出することができる。また、偏光によって分離を行う構成と比較して、分離手段１２に到達した射出光の大部分を検出器１０に導くことが可能である。そのため、本実施形態の顕微鏡３００によれば、試料７からの射出光を従来よりも効率よく検出することができる。

（第３の実施形態）
本実施形態の走査型顕微鏡５００（以下、「顕微鏡５００」と呼ぶ）について、図５を参照して説明する。図５は、顕微鏡５００の構成を説明する模式図である。本実施形態の顕微鏡５００は、誘導ラマン散乱（ＳｔｉｍｕｌａｔｅｄＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ、以下ＳＲＳ）顕微鏡である。

コヒーレントラマン散乱（ＣＲＳ；ＣｏｈｅｒｅｎｔＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＣＲＳ）を利用すると、生体内分子の３次元分布や体内組成を観察することが可能である。ＣＲＳの１つであるＳＲＳを利用すると、スペクトル歪みなく、定量的な観察が可能である。ＳＲＳは、非線形光学過程の一つであり、２つの異なる波長の光の強度の積に比例して発生する。

ＳＲＳを効率よく発生させるためには、２つの光源５１、５２が射出する波長の異なる２つの光パルス５０１、５０２を試料７の同一の集光点（スポット）に集光し、且つこれら２つの光パルス５０１、５０２を同時に試料に照射させる。２つの光パルス５０１、５０２の光周波数の差が試料の分子の固有振動数と一致すると、スポットでＳＲＳが生じる。その結果、試料７を透過した２つの照射光５０１、５０２のうち、波長が短い光パルス（ポンプ光）の強度が減少し（誘導ラマンロス）、波長が長い光パルス（ストークス光）の強度が増大する（誘導ラマンゲイン）。ＳＲＳをより効率よく発生させるため、パルス時間幅が１〜１０ピコ秒の短パルスレーザを利用するのが望ましい。

顕微鏡５００は、第１の光源５１と第２の光源５２との２つの光源、合波部５３、及び分光部５４を有する点が第１の実施形態と異なるが、その他の構成は顕微鏡１００と同様である。第１の実施形態と同様の構成には、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。

第１の光源５１は、波長λ１の第１の光パルス（第１の照射光、ポンプ光）５０１を出力する。第２の光源５２は、波長λ１より長い波長λ２の光パルス（第２の照射光、ストークス光）５０２を出力する。具体的には、第１の光源５１は、中心波長８００ナノメートル、パルス周期１２．５ナノ秒の光パルスを出力する固体レーザ（チタンサファイアレーザ）とする。例えば、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社のＭａｉＴａｉが利用できる。第２の光源５２は、中心波長１０３０ナノメートル、パルス周期２５ナノ秒の光パルスを出力するイッテルビウムドープファイバレーザとする。

図６（ａ）は第１の光源５１が射出する第１の照射光５０１の試料７の集光点におけるパルス列を表し、図６（ｂ）は第２の光源５２が射出する第２の照射光５０２の試料７の集光点におけるパルス列を表す。図６（ａ）と図６（ｂ）は、共に横軸が時間（ｔ）を表し、縦軸は光強度を表している。

ＳＲＳによる散乱光を検出するため、第１の照射光５０１の光パルス列の繰り返し周期と第２の照射光５０２の光パルス列の繰返し周期との比は、１：２とする。繰り返し周期の比を１：２とし、２つの波長の照射光５０１、５０２を同時に試料に照射するためには、例えば、第１の光源５１又は第２の光源５２をモードロックレーザとして構成し、その共振器長を制御すればよい。共振器長の変更により繰り返し周期が変更され、試料７に光パルスが照射されるタイミングを調整することができる。

図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すように、波長の異なる２つの照射光５０１、５０２が、タイミングが一致した状態で試料７内の同一地点に集光されると、波長差に応じてＳＲＳにより照射光５０１の光強度に変調が生じる。つまり、図６（ａ）におけるパルス３１、３３、３５の強度は小さくなり、パルス３２、３４の強度は変化しない。この強度変調は、試料を透過した光だけでなく、多重散乱し、照射した方向に射出した光にも生じる。この隣接したパルス同士の強度の差は微小であるため、ロックインアンプなどの同期検波手段により計測する。

計測した強度変調の大きさがＳＲＳ信号に対応し、レーザビームの集光点に含まれる分子の情報が反映される。例えば、前記集光点に含まれる分子振動の共振周波数と２つの照射光５０１、５０２の光周波数の差（ｃ／λ１−ｃ／λ２）が一致したとき、ＳＲＳ信号が大きくなる。なお、ｃは光速である。２つの照射光５０１、５０２の光周波数の差（ｃ／λ１−ｃ／λ２）を変化させながら、ＳＲＳ信号を取得することでラマンスペクトルを取得できる。ラマンスペクトルを得るためには、２つの照射光５０１、５０２の少なくとも一方の波長を変化させる。ラマンスペクトルから試料７にどのような分子が含まれるか推定できる。また、ＳＲＳ顕微鏡５００は、自発ラマン散乱を利用した顕微鏡と同等のスペクトルを取得することができる。ＳＲＳの散乱効率は自発ラマン散乱の散乱効率より非常に大きいため、ＳＲＳ顕微鏡５００は自発ラマン散乱を利用した顕微鏡より短い時間でラマンスペクトルを取得することができる。

第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２は、合波部５３としてのダイクロイックミラーにより同軸に合波された後、走査手段３で反射される。走査手段３は、第１の実施形態と同様に、例えばガルバノスキャナとレゾナントスキャナで構成され、直交する２方向に第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２が進行する向きを変える。レゾナントスキャナ（スキャン周波数８ｋＨｚ）とガルバノスキャナ（スキャン周波数１５Ｈｚ）を利用すれば、５００ラインの画像を毎秒３０フレーム取得することができる。

走査手段３で偏向された第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２は、レンズ４、５を通して光学系６に入射する。このとき、走査手段３と光学系６の入射瞳とが略共役となるようにレンズ４、５を配置することで、走査手段３で第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２が偏向しても、遮光により光量が変化することなく試料７に集光する。

レンズ４、５による光学系の倍率は、光学系６の入射瞳と第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２のサイズが同等になるように選択する。そうすれば、光学系６により集光したスポットのサイズを最小化させ、ＳＲＳ信号を検出する空間分解能を向上させることができる。また、集光により光強度を大きくすることでＳＲＳ信号が大きくなるので、ＳＲＳ信号を検出するＳＮ比も向上する。光学系６は、ＳＲＳ信号を検出する空間分解能と信号対雑音比の観点から、大きい開口数（ＮＡ）が望ましい。

試料７は、不図示の２つのカバーガラスやスライドガラスに挟まれて配置されている。走査手段３によって第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２が偏向されることにより、試料７上で集光したスポットが２次元走査される。このようにして試料７上の各位置からの射出光を検出してＳＲＳ信号を得ることにより、ＳＲＳ信号が２次元画像化される。ＳＲＳ信号は、集光したスポット近傍でのみ生じるため、不図示のステージにより試料７を光軸方向に移動させることで３次元画像を得ることもできる。

第１の照射光５０１を構成する光パルス列は、第１の照射光５０１と第２の照射光５０２との波長差に応じてＳＲＳにより光強度に変調を受ける。第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２のそれぞれの光パルス列は、試料７において多重散乱し、試料７内のスポットとは異なる位置から光学系６に再入射する。そして、射出光は、走査手段３で反射した後、分離手段２で反射され、レンズ８、９を介して検出器１０に導かれる。

検出器１０の直前には、分光部５４が配置されている。分光部５４は、特定の波長範囲の光を抽出するフィルタで、具体的には、バンドパスフィルタ又はショートパスフィルタ等を用いることができる。本実施形態では、分光部５４に入射した射出光のうち、波長λ２の光はカットされ、波長λ１の射出光が抽出されて検出器１０に入射して検出される。その結果、分光部５４に入射した射出光のうち、ＳＲＳにより光強度に変調を受けた第１の照射光５０１の波長の射出光が検出器１０に入射して検出される。

走査手段３と検出器１０の受光面とが共役になるようにそれぞれを配置することが望ましい。共役に配置することにより、検出器１０の受光面に照射される射出光の位置が、走査手段３の偏向角度によらず一定となる。そのため、受光面外に射出光が照射されることを低減でき、かつ受光面内の受光感度むらの影響を低減して検出を行うことができる。

コンピュータ５６は、走査手段３の制御信号と信号取得回路５５の出力信号（ＳＲＳ信号）とを用いて、試料７のＳＲＳ信号に関する２次元画像のデータを取得し、それを不図示の表示部に表示する。コンピュータ５６は、不図示のステージで試料７を光学系６の光軸方向に移動させて取得したＳＲＳ信号から、３次元画像のデータを取得することもできる。また、コンピュータ５６は、第１の光源５１及び第２の光源５２の少なくとも一方の波長を変化させて取得したＳＲＳ信号を用いてラマンスペクトルを取得することもできる。

ここで、分離手段２における射出光の光路について、試料７の様々な位置から光学系６に再入射する射出光に含まれる複数の光線のうちの１つである射出光５０３の光路を例にとって説明する。集光したスポットとは異なる位置から射出して、光学系に再入射した射出光５０３は、光学系６の瞳位置において、第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の入射角度とは異なる角度で射出される。

光学系６の瞳位置と走査手段３とは、共役に配置されているため、射出光５０３は第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の入射角度とは異なる角度で走査手段３から射出される。よって、射出光５０３は、走査手段３と離して配置した分離手段２で反射される。このように、試料７に照射する第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の光路と、射出光５０３の光路とを分離することができる。

ここで、光学系６、レンズ４及びレンズ５の焦点距離をそれぞれ３ｍｍ、１００ｍｍ及び２００ｍｍとした場合の、集光スポットから０．１ｍｍ離れた位置で発生した射出光５０３を例にとって分離手段２に必要な外形サイズを考察する。この射出光５０３の走査手段３への入射角及び射出角は、第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の走査手段３への入射角及び射出角と約０．０６７ラジアン（０．１／３×２００／１００）異なる。分離手段２を走査手段３から２００ｍｍ離し、第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２に対して４５度傾けて配置した場合について述べる。この場合、射出光５０３は分離手段２の中心から短軸方向に約１３．４ｍｍ（０．０６７×２００）、長軸方向に約１９ｍｍ（０．０６７×２００×√２）離れた位置を通過する。よって、分離手段２の外形サイズを直径３８ｍｍ以上とすれば、第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の光路と射出光５０３の光路とを分離し、射出光５０３を検出することができる。分離手段２を配置する角度は４５度に限らず、９０度に近づけてよい。その場合、分離手段２の外形サイズをより小さくできる。

続いて、分離手段２の透過部２１のサイズを考察する。対物レンズ６の瞳サイズを７ｍｍとすると、走査手段３上の対物レンズ６の瞳の共役像のサイズは３．５ｍｍである。走査手段３上で３．５ｍｍ以上のビームは対物レンズ６を透過しないため、透過部２１のサイズは第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の入射方向から見て３．５ｍｍより大きくする必要はない。よって、第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２のビームサイズが３ｍｍだとすると、透過部２１のサイズは第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の入射方向から見て３．０ｍｍ以上３．５ｍｍ以下とすることが望ましい。

分離手段２を第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２に対して４５度傾けて配置する場合、透過部２１は、分離手段２の正面から見て、短軸方向（図５の紙面の垂直方向）が３．０以上３．５ｍｍ以下、長軸方向が短軸方向の√２倍の楕円形状とする。

次に、集光スポットと射出光の射出位置の間の距離が前述の０．１ｍｍより小さい０．０１ｍｍの場合の射出光５０３について考察する。このとき、射出光５０３の走査手段３への入射角及び射出角は、第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２の走査手段３への入射角及び射出角と約０．００６７ラジアン（０．０１／３×２００／１００）異なる。分離手段２を走査手段３から２００ｍｍ離し、第１の照射光５０１及び第２の照射光５０２に対して４５度傾けて配置した場合について述べる。この場合、射出光５０３は分離手段２の中心から短軸方向に約１．３４ｍｍ（０．００６７×２００）、長軸方向に約１．９ｍｍ（０．００６７×２００×√２）離れた位置を通る。よって、射出光５０３は透過部２１を透過してしまい、検出器１０で検出することができない。

このような場合、透過部２１のサイズを小さくしたり、分離手段２を走査手段３から離れた位置に配置したりすることが好ましい。透過部２１のサイズを小さくすると、試料７内におけるスポットのサイズが大きくなり、ＳＲＳ信号を検出する空間分解能が低下するおそれがあるため、分離手段２の位置を走査手段３からより離すことが好ましい。一方で、分離手段２が走査手段３から遠い位置に配置されるほど、試料７内のある領域で発生した射出光を反射するためには、反射部２２をより大きくすることが必要となる。よって、射出光の取得効率を上げるには、分離手段２を走査手段３から遠い位置に配置し、且つ、分離手段２の外形のサイズを分離手段２と走査手段３の距離に比例させて大きくすることが好ましい。

なお、本実施形態のように分離手段２を利用する構成に限らず、第２の実施形態のように分離手段１２を利用することもできる。

本実施形態の顕微鏡５００によれば、２つの光源５１、５２を用いる構成の場合でも、分離手段２によって第１の照射光１０１の光路及び第２の照射光５０２の光路と射出光の光路とを分離することができる。本実施形態の顕微鏡５００によれば、照射光１０１の波長と射出光の波長とが同じであっても光路を分離することができる。また、偏光によって分離を行う構成と比較して、分離手段２に到達した射出光の大部分を検出器１０に導くことが可能である。そのため、本実施形態の顕微鏡５００によれば、試料７からの射出光を従来よりも効率よく検出することができる。

本実施形態と異なる方法として、光学系６の瞳位置で光路を分離する方法も考えられるが、本実施形態の方が効率がよい。これは、多重散乱により射出光が特定の角度に集中していないため瞳上の特定の領域で効率よく分離することができないためである。また、光利用効率の観点で本実施形態は照射光を遮光することなくそのまま試料に照射させることができる。

なお、本実施形態の検出器１０が検出する射出光は、ストークス光でもポンプ光でもよい。さらに、ＳＲＳ信号ではなくＣＡＲＳ（ＣｏｈｅｒｅｎｔＡｎｔｉ−ＳｔｏｋｅｓＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ）信号を計測するように装置を構成してもよい。例えば、分光部５４をＣＡＲＳ信号の波長帯のみを透過するフィルタへ変更することでＣＡＲＳ信号を検出できる。この場合、検出器１０には光電子増倍管を用いればよい。

以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。

例えば、上述の実施形態では、分離手段２、１２に平板状のミラーを用いていたが、曲面を有するミラーを用いることも可能である。曲面を有するミラーを用いる場合は、走査手段３と検出器１０の受光面とが共役となるよう、曲面及びレンズ８、９を設計する。

上述の各実施形態では、走査手段３を用いて試料７内（試料７の表面を含む）の２次元走査を行っている。しかし、試料７の走査方法はこれに限らず、１軸のガルバノミラーによる走査と、試料７を支持するステージ（不図示）のガルバノミラーの走査方向の垂直方向の駆動と、を組み合わせて２次元走査を行ってもよい。さらに、ステージ（不図示）を２次元面内で駆動してもよい。さらに、試料７の画像を取得する必要がなければ、走査手段３による集光点の走査を行わずに、試料７内の１点のみを観察すればよい。

検出器１０が射出光を検出する方式としては、変調器を用いずに繰り返し周波数がｎ：ｍ（ｎ、ｍは整数）となる光源を用いてロックイン検出を行う方式に限らず、強度変調器を用いたロックイン検出方式を採用してもよい。

また、上述の各実施形態は、ＣＲＳ計測、光源が１つの多光子顕微鏡等に限定せず、光源を複数有する多光子吸収、多光子蛍光を計測する顕微鏡等にも適用できる。また、上述の各実施形態では、試料７からの射出光の計測を行う構成を示したが、試料７への光を照射するための構成をプローブ化して、顕微鏡の一形態である内視鏡を構成してもよい。

１光源
２分離手段
３走査手段
６光学系
１０検出器

Claims

光源からの照射光により試料を走査する走査手段と、
前記光源と前記走査手段との間の、前記照射光の光路上に配置され、前記照射光を透過する透過部と、前記照射光により走査された試料からの射出光を反射する、前記透過部とは異なる反射部と、を有する分離手段と、
前記走査手段からの前記照射光を前記試料に集光する第１の光学系と、
前記走査手段からの前記照射光を前記第１の光学系に導く第２の光学系と、
前記反射部により反射された前記射出光を検出する検出手段と、
前記反射部により反射された前記射出光を前記検出手段の受光面に導く第３の光学系と、を有し、
前記第１の光学系は、前記試料からの前記射出光を前記第２の光学系に導き、
前記第２の光学系は、前記走査手段と前記第１の光学系の入射瞳とが共役になるように配置され、
前記第３の光学系は、前記走査手段と前記検出手段の受光面とが共役になるように配置され、
前記分離手段は、前記光路上において、前記第１の光学系の入射瞳から、前記走査手段よりも遠い位置に配置されていることを特徴とする走査型顕微鏡。
光源からの照射光により試料を走査する走査手段と、
前記光源と前記走査手段との間の、前記照射光の光路上に配置され、前記照射光を反射する反射部と、前記照射光により走査された試料からの射出光を透過する、前記反射部とは異なる透過部と、を有する分離手段と、
前記走査手段からの前記照射光を前記試料に集光する第１の光学系と、
前記走査手段からの前記照射光を前記第１の光学系に導く第２の光学系と、
前記反射部により反射された前記射出光を検出する検出手段と、
前記反射部により反射された前記射出光を前記検出手段の受光面に導く第３の光学系と、を有し、
前記第１の光学系は、前記試料からの前記射出光を前記第２の光学系に導き、
前記第２の光学系は、前記走査手段と前記第１の光学系の入射瞳とが共役になるように配置され、
前記第３の光学系は、前記走査手段と前記検出手段の受光面とが共役になるように配置され、
前記分離手段は、前記光路上において、前記第１の光学系の入射瞳から、前記走査手段よりも遠い位置に配置されていることを特徴とする走査型顕微鏡。
前記分離手段は、前記第１の光学系の像面とフーリエ変換の関係にない位置に配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の走査型顕微鏡。
前記分離手段は、前記照射光の前記試料における集光点と異なる位置から射出された前記射出光を反射することを特徴とする請求項１又は３に記載の走査型顕微鏡。
前記透過部のサイズは、前記照射光のビーム径以上であることを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
前記分離手段は、前記照射光の前記試料内における集光点と異なる位置から射出された前記射出光を透過するように構成されていることを特徴とする請求項２に記載の走査型顕微鏡。
前記反射部のサイズは、前記照射光のビーム径以上であることを特徴とする請求項２に記載の走査型顕微鏡。
前記光源を第１の光源、前記照射光を第１の照射光とすると、
前記第１の照射光と異なる波長の第２の照射光を出力する第２の光源と、
前記第１の照射光と前記第２の照射光とを合波する合波部と、を有し、
前記第１の光学系は、前記合波部で合波された前記第１の照射光及び前記第２の照射光を前記試料に集光することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
前記分離手段は、前記合波部と前記第１の光学系との間の前記第１の照射光の光路上に配置されており、
前記分離手段と前記検出手段との間に配置されており、前記射出光から前記第１の照射光の波長の光を抽出するフィルタを有することを特徴とする請求項８に記載の走査型顕微鏡。
前記射出光は、前記試料でコヒーレントラマン散乱された散乱光を含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の走査型顕微鏡。
前記射出光は、前記試料で誘導ラマン散乱された散乱光を含むことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
前記射出光は、前記試料で後方散乱された散乱光を含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
前記走査手段は２つのミラーを有し、
前記２つのミラーのうちの一方のミラー上、又は、前記２つのミラーの中間位置と、前記第１の光学系の入射瞳と、が共役であることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
前記走査手段は２つのミラーを有し、
前記２つのミラーのうちの一方のミラー上、又は、前記２つのミラーの中間位置と、前記検出手段の受光面と、が共役であることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。