JP4954452B2 - 顕微鏡 - Google Patents

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Description

本発明は、多光子励起蛍光、コヒーレントラマン散乱光、第二高調波等を観察するための顕微鏡に関する。
従来、例えば、生体組織内の深部の観察を目的とした顕微鏡として、例えば、次の特許文献１に開示されたような多光子励起蛍光顕微鏡が知られている。
また、例えば、細胞膜を形成するコラーゲンや筋繊維、蛋白質配列等の生体組織の観察を目的とした顕微鏡として、例えば、次の特許文献２に開示されたような第二高調波の持つナノ構造依存性を利用した第二高調波顕微鏡が知られている。
また、分子生物学においては、生体内の分子、たとえばＤＮＡやアミノ酸、細胞小器官などの活動を生きたまま観察したいという需要が多い。従来の蛍光顕微鏡や多光子励起蛍光顕微鏡を用いても、生体内の分子を観察することはある程度可能であるが、目標とする分子を蛍光色素で染色する必要がある。しかし、生体を蛍光色素で染色することは、蛍光色素に毒性が存在することや、蛍光色素によって分子の自由な運動が妨げられるなど、少なからず生体に影響を及ぼすと考えられるため好ましくない。
そこで、近年、生体内の分子の３次元分布を無染色で観察すること等を目的した顕微鏡として、例えば、次の特許文献３〜５に開示されたようなコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を観察するコヒーレントラマン散乱顕微鏡が提案されている。
特開２０００−３３８４０５号公報 特開２０００−３１０７９９号公報 特表２００２−５２０６１２号公報 ＷＯ０２／０６７７８Ａ１ ＵＳ２００３／００１１７６５
多光子励起蛍光顕微鏡では、波長λでパルス間隔がナノ秒、ピコ秒、或いはフェムト秒等の超短パルスレーザを蛍光物質を着色した試料に照射し、試料上の照射強度が十分に大きくなったときに、波長λの光子が同時に複数（ｎ）個吸収される多光子吸収が生じ、試料に着色された蛍光物質がλ／ｎの波長で励起されλ／ｎよりやや長い波長の蛍光を発する現象を利用して、この蛍光を観察する。
また、第二高調波を観察する顕微鏡では、試料にレーザ光を入射したときに、試料から入射したレーザ光の２倍の振動数（半分の波長）を持つ第二高調波を発する現象を利用して、この第二高調波を観察する。
また、コヒーレントラマン散乱顕微鏡では、試料に励起光を照射したときに、照射光の光子エネルギーが試料の分子振動により非弾性散乱を受けて、物質固有の分子の振動数に相当するエネルギー分、波長がずれた散乱光を生ずる現象を利用して、このラマン散乱光を観察する。
ところで、近年、生体の顕微鏡観察においては、観察対象の関心領域に応じて、上述した観察手法を組み合わせた多様な観察が求められる傾向にある。
例えば、American journal of Pathology，Vol.159，p.983 には、表皮細胞の細胞形態形成時における、インテグリン分子の放出とコラーゲンの分化の観察を目的とする記述がある。このような観察のためには、標本としての表皮細胞に対し、細胞全体を多光子励起蛍光で、コラーゲンを第二高調波で、インテグリン分子をコヒーレントラマン散乱光で、並行して或いは選択的に観察することが望まれる。
また、例えば、Journal of Biological Chemistry，Vol.17，p.15441 には、脂肪細胞におけるインシュリン投与時の脂肪細胞からの脂質分子の放出の観察を目的とする記述がある。このような観察のためには、標本としての脂肪細胞に対し、レセプタを多光子励起蛍光で、細胞膜を第二高調波で、脂質分子をコヒーレントラマン散乱光で、並行して或いは選択的に観察することが望まれる。
また、例えば、Alcohol Health & Research World，Vol.21，p.107 には、神経細胞における細胞膜上の電位差と、それに伴うアミノ酸分子放出の観察を目的とする記述がある。このような観察のためには、標本としての神経細胞に対し、感電位色素を多光子励起蛍光で、細胞膜を第二高調波で、標的アミノ酸分子をコヒーレントラマン散乱光で、並行して或いは選択的に観察することが望まれる。
また、例えば、PNAS，Vol.99，p.14801 には、カルシウム波の放出とアクチン繊維状のミオシン分子の滑動の観察を目的とする記述がある。このような観察のためには、標本としての筋肉細胞に対し、カルシウム感受色素を多光子励起蛍光で、アクチン繊維を第二高調波で、ミオシン分子をコヒーレントラマン散乱光で、並行して或いは選択的に観察することが望まれる。
また、例えば、PNAS，Vol.100，p.7075 には、ＮＡＤＨの量とコラーゲン繊維の崩壊度（コラーゲン繊維の崩壊度は第二高調波とコヒーレントラマン散乱光の強度比により検出できる。）を用いた、ガン化の診断を目的とする記述がある。このような診断のためには、標本としてのガン細胞に対し、ＮＡＤＨを多光子励起蛍光で、コラーゲン繊維を第二高調波で、コラーゲン分子をコヒーレントラマン散乱光で、並行して或いは選択的に観察することが望まれる。
しかし、従来は、一台の顕微鏡でもって、一つの標本に対し、観察する目的に応じて、多光子励起蛍光観察、第二高調波観察、コヒーレントラマン散乱光観察の全てを並行して或いは選択的に行うことができる顕微鏡は存在しなかった。
本発明は、上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、一台の顕微鏡でもって、一つの標本に対し、観察する目的に応じて、多光子励起蛍光観察、第二高調波観察、コヒーレントラマン散乱光観察の全てを並行して或いは選択的に行うことができる顕微鏡を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明による顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する多光子励起蛍光抽出手段と、前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する第二高調波抽出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、前記多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する多光子励起蛍光検出手段と、前記第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する第二高調波検出手段と、を有しており、前記コヒーレントラマン散乱光と、前記多光子励起蛍光と、前記第二高調波とを同時に検出することを特徴としている。
また、上記目的を達成するため、本発明による顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する落射多光子励起蛍光抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する透過第二高調波抽出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、前記落射多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する落射多光子励起蛍光検出手段と、前記透過第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する透過第二高調波検出手段と、を有しており、前記コヒーレントラマン散乱光と、前記落射多光子励起蛍光と、前記透過第二高調波とを同時に検出することを特徴としている。
また、上記目的を達成するため、本発明の顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する落射第二高調波抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する透過多光子励起蛍光抽出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、前記透過多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する透過多光子励起蛍光検出手段と、前記落射第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する落射第二高調波検出手段と、を有しており、前記コヒーレントラマン散乱光と、前記透過多光子励起蛍光と、前記落射第二高調波とを同時に検出することを特徴としている。
また、上記目的を達成するため、本発明による顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみ、又は、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを切替可能に抽出する落射第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみ、又は、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを切替可能に抽出する透過第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、前記落射第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段を介して抽出された光を検出する落射切替抽出光検出手段と、前記透過第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段を介して抽出された光を検出する透過切替抽出光検出手段と、を有しており、前記コヒーレントラマン散乱光と、前記落射多光子励起蛍光又は前記透過多光子励起蛍光と、前記落射第二高調波又は前記透過第二高調波とを同時に検出することを特徴としている。
また、本発明による顕微鏡は、上記目的を達成するため、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する落射多光子励起蛍光抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する落射第二高調波抽出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、前記落射多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する落射多光子励起蛍光検出手段と、前記落射第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する落射第二高調波検出手段と、前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する透過多光子励起蛍光抽出手段と、前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する透過第二高調波抽出手段と、前記透過多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する透過多光子励起蛍光検出手段と、前記透過第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する透過第二高調波検出手段と、を有しており、前記コヒーレントラマン散乱光と、前記落射多光子励起蛍光と、前記落射第二高調波と、前記透過多光子励起蛍光と、前記透過第二高調波とを同時に検出することを特徴としている。
また、本発明の顕微鏡においては、前記第二のパルス光の波長が、前記第一のパルス光の波長の近傍であって該第一のパルス光の波長よりも短い波長の所定波長帯域を走査され、前記コヒーレントラマン散乱光が、コヒーレントストークスラマン散乱光であるのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記第二のパルス光の波長が、前記第一のパルス光の波長の近傍であって該第一のパルス光の波長よりも長い波長の所定波長帯域を走査され、前記コヒーレントラマン散乱光が、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光であり、少なくとも一部の波長帯域で波長が重なり得る、前記多光子励起蛍光と前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを分離する多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段を備えて構成してもよい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段が、前記多光子励起蛍光と前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを時間分解で分離する時間分解分離手段を有する前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光抽出手段で構成されているのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記時間分解分離手段が、斜めに光が入射したときに、透過する直線偏光の偏光方向を変えるカーゲートと、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光が前記カーゲートへ入射するタイミングと同じタイミングでもって、前記第二のパルス光を前記カーゲートに斜めに入射させるゲート光入射手段と、前記多光子励起蛍光を直線偏光に変換する第一の偏光部材と、前記カーゲートを透過することによって偏光方向が変えられた直線偏光を透過し、該カーゲートを透過したときに偏光方向が変わらない直線偏光を遮断する第二の偏光部材と、を有して構成されているのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段が、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を変調した状態で発生させる変調手段と、前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と前記多光子励起蛍光検出手段とを兼ねていて、前記変調されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と前記多光子励起蛍光とを共に受光し、受光した光から変調成分と非変調成分とを分離して検出する検出装置とで構成されているのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記変調手段が、前記第一のパルス光を変調する変調器で構成され、前記検出装置が、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器で構成されているのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記第一のパルス光で所定波長帯域を走査するとともに、前記第二のパルス光を多光子励起に最適な波長に固定するのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記第一のパルスレーザ発生手段、及び前記第二のパルスレーザ発生手段のオンオフを切替える切替手段を備えたレーザ光選択手段と、前記レーザ光選択手段を制御する制御手段を備えるのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記コヒーレントラマン散乱光検出手段、前記多光子励起蛍光検出手段、及び前記第二高調波検出手段を介して検出された信号を処理する画像処理装置と、前記画像処理装置で処理した画像を表示する画像表示装置と、前記標本に照射する光を２次元方向に走査する走査手段を有し、前記制御手段が、前記画像処理装置及び前記画像表示装置を介して該画像表示装置の表示画面における前記標本の関心領域が表示される位置に前記コヒーレントラマン散乱光による観察像、前記多光子励起蛍光による観察像、及び前記第二高調波による観察像のうち複数の像を並行して観察可能に或いはいずれかの像を選択して観察可能に表示するように、前記レーザ光選択手段を制御するのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記第一のパルスレーザ発生手段が、パルス幅がピコ秒のパルスレーザビームを発振するパルスレーザ光源であり、前記第二のパルスレーザ発生手段が、パルス幅がフェムト秒のパルスレーザビームを発振するパルスレーザ光源であるのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡においては、前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段は、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光と前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光の両方のコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、を切替可能に構成されているのが好ましい。
本発明によれば、一つの標本に対し、観察する目的に応じて、多光子励起蛍光観察、第二高調波観察、コヒーレントラマン散乱光観察とを並行して或いは選択的に行うことができる顕微鏡が得られる。
実施例の説明に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
本発明の顕微鏡によれば、第二高調波、多光子励起蛍光、コヒーレントラマン散乱光とを分離して抽出、検出することができる。
そのことを具体的に説明する前に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光及びコヒーレントストークスラマン散乱光の発生原理について説明する。
まず、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生原理は次のように説明される。図１に示すように、ポンプ光１０２の振動数ωPとストークス光１０３の振動数ωSの差が、標本内の集光位置にある分子１０５の固有振動数ωVと一致したときに、基底状態１００にある分子１０５が振動数ωVで共鳴振動を起こして励起状態１０１となる。そして、振動数ωPであるポンプ光の一部１０２’が分子１０５の固有振動数ωVのドップラー変調を受けて、振動数ωASのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光（ＣＡＲＳ光）１０４が発生する。このとき、
ωAS＝ωP＋ωV＝２ωP−ωS
の関係がある。
従って、ポンプ光１０２の振動数ωPを固定したままストークス光１０３の振動数ωSを走査すれば、分子１０５の固有振動スペクトルが観察される。その固有振動スペクトルは、分子の種類によって異なるため、複数種類の分子が同時に存在する場合においても、それぞれの分子の種類を特定することができる。
また、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生強度ＩASは、次の式に示すように、ポンプ光の強度ＩPの二乗とストークス光の強度ＩSの積に比例する。
ＩAS∝ＩP 2ＩS
このように、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光１０４は、標本内におけるポンプ光とストークス光の集光位置においてのみ強く発生する。
また、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生強度ＩASは、分子１０５の局所的な存在量の二乗にも比例する。従って、ポンプ光とストークス光の集光位置を標本内で空間的に走査することにより、特定の分子の標本内の空間分布を求めることが可能である。
次に、コヒーレントストークスラマン散乱光の発生原理を図２を用いて説明する。
上述したストークス光のレーザパルスの代わりにポンプ光よりも波長の短いレーザパルスを用いた場合、コヒーレントラマン散乱光の波長はポンプ光よりも長くなる。これをコヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ：Coherent Stokes Raman Scattering）光と呼ぶ。また、このときのポンプ光よりも波長の短いレーザパルスを、アンチストークス光と呼ぶ。
図２に示すように、ポンプ光１０２’の振動数ωPとアンチストークス光１０４の振動数ωASの差が、標本内の集光位置にある分子１０５の固有振動数ωVと一致したときに、励起状態１０１にある分子１０５が振動数ωVで共鳴振動を起こして基底状態１００となる。そして、振動数ωPであるポンプ光の一部１０２が分子１０５の固有振動数ωVのドップラー変調を受けて、振動数ωSのコヒーレントストークスラマン散乱光（ＣＳＲＳ光）１０３が発生する。このとき、
ωS＝ωP−ωV＝２ωP−ωAS
の関係がある。
従って、ポンプ光１０２の振動数ωPを固定したままアンチストークス光１０４の振動数ωASを走査すれば、分子１０５の固有振動スペクトルが観察される。その固有振動スペクトルは、分子の種類によって異なるため、複数種類の分子が同時に存在する場合においても、それぞれの分子の種類を特定することができる。
このように、ＣＳＲＳ光は、ポンプ光よりも波長が長いことを除けば、ＣＡＲＳ光と同様な性質を持つ。また、アンチストークス光よりも波長が長いので、アンチストークス光パルスによって励起されて生じた多光子励起蛍光との波長の重なりがほとんどないという性質を持っている。
コヒーレントラマン散乱光の発生過程に際しては、ポンプ光により、照射対象からポンプ光よりも長い波長の自家蛍光が生ずる。このため、通常の可視光領域でポンプ光よりも長い波長のコヒーレントストークスラマン散乱光を用いて観察を行おうとすると自家蛍光と重なり観察に支障を来たしやすい。
ところで、第二高調波は、ストークス光又はアンチストークス光である励起光の半分の波長である。また、多光子励起蛍光は、励起光よりも短い波長である。従って、本発明の顕微鏡において、第二高調波と、多光子励起蛍光と、コヒーレントラマン散乱光とを観察するためのポンプ光の波長帯域とが互いに重ならず、かつ、観察光の波長領域として可視光領域を有効に用いることを考慮すると、最も短い波長領域で第二高調波を用い、それよりも長い波長帯域で多光子励起蛍光を用いることが必然的に定まる。そして、これらの波長と励起光及びポンプ光とが重ならないようにすることを考慮すると、ポンプ光の波長領域は、近赤外領域になる。
このように、本発明の顕微鏡では、ポンプ光の波長領域が近赤外領域に必然的に定まる。そこで、本発明の顕微鏡において、第二のパルス光の波長が、前記第一のパルス光の波長の近傍であって該第一のパルス光の波長よりも短い波長の所定波長帯域を走査され、コヒーレントラマン散乱光が、コヒーレントストークスラマン散乱光であるように構成すれば、第二高調波、多光子励起蛍光、コヒーレントストークスラマン散乱光のそれぞれの波長が重ならないので、それぞれの波長を分離した状態で検出することができる。
また、その場合、近赤外領域で生じる自家蛍光はコヒーレントストークスラマン散乱光に比べて強度が微弱であるため、観察に支障は生じない。
一方、アンチストークスラマン散乱光は、ポンプ光よりも波長が短いため、ポンプ光による自家蛍光の影響は受けない。しかしながら、アンチストークス光の強度は、一般的に、ポンプ光やストークス光の強度に比べて例えば３〜４桁程度弱い。
そして、上述のように、多光子励起蛍光は、励起光よりも短い波長である。このため、第二高調波と、多光子励起蛍光と、コヒーレントストークスラマン散乱光とを観察するようにすると、アンチストークスラマン散乱光と多光子励起蛍光とが一部の波長帯域で波長が重なり、強度の弱いアンチストークスラマン散乱光の検出が困難になる場合が起こり得る。
そこで、本発明の顕微鏡において、第二のパルス光の波長が、第一のパルス光の波長の近傍であって該第一のパルス光の波長よりも長い波長の所定波長帯域を走査され、コヒーレントラマン散乱光が、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光であり、少なくとも一部の波長帯域で波長が重なり得る、多光子励起蛍光とコヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを分離する多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段を備えれば、それぞれの波長を分離した状態で検出することができる。
このため、本発明の顕微鏡によれば、一台の顕微鏡でもって、一つの標本に対し、観察する目的に応じて、多光子励起蛍光観察、第二高調波観察、コヒーレントラマン散乱光観察の全てを並行して行うことができる。
なお、多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段は、多光子励起蛍光と、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを時間分解で分離する時間分解分離手段を有する前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光抽出手段で構成することができる。
或いは、多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を変調した状態で発生させる変調手段と、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と多光子励起蛍光検出手段とを兼ねていて、変調されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と多光子励起蛍光とを共に受光し、受光した光から変調成分と非変調成分とを分離して検出する検出装置とで構成してもよい。
また、本発明の顕微鏡では、上述のように、第二のパルス光が、第一のパルス光の波長の近傍の所定波長帯域を走査されるように構成されている。
多光子励起蛍光には吸収スペクトルがあり、ストークス光の波長を走査することにより、多光子励起蛍光の発光強度が変化する。そこで、本発明の顕微鏡のように、第二のパルス光が走査されるように構成すれば、多光子励起蛍光の発光強度が最大となるようにストークス光として用いる第二のパルス光の波長を調整でき、多光子励起蛍光を効率よく検出することができる。
また、多光子励起蛍光色素の吸収スペクトルはそれぞれ異なる。このため、第二のパルス光の波長を走査すれば、多光子励起蛍光の発光強度の変化から蛍光色素を同定することができる。
また、第二高調波は非線形効果のため、ポンプ光に比べてパルス幅が狭く尖頭出力値の高いストークス光によるものが支配的となる。そして、第二高調波の発生効率は、励起光（この場合はストークス光）の波長に依存する。そこで、第二のパルス光の波長を走査すれば、第二高調波の発生効率が最適となるように調整することができる。
また、本発明の顕微鏡においては、第一のパルス光で所定波長帯域を走査するとともに、第二のパルス光を多光子励起に最適な波長に固定してもよい。
本発明の顕微鏡において、第二のパルス光（ストークス光、又はアンチストークス光）は、多光子励起蛍光観察、第二高調波観察における励起光として機能する。ストークス光又はアンチストークス光として用いられる第二のパルス光の波長を走査した場合、吸収スペクトルが変化するため、蛍光の発光効率が変わる。一方、ポンプ光を走査させても多光子励起蛍光、第二高調波の発光効率は変化しない。このため、多光子励起蛍光、又は第二高調波の発光効率が最適となる波長をストークス光、又はアンチストークス光として用いれば、最適な発光状態の多光子励起蛍光、又は第二高調波を検出しながら、コヒーレントラマン散乱光を検出することができる。
また、励起光としてパルス幅がフェムト秒のレーザ光を用いた方が、パルス幅がピコ秒のレーザ光を用いた場合に比べて、多光子励起蛍光、及び第二高調波の発光効率が良くなる。
従って、本発明の顕微鏡においては、第一のパルスレーザ発生手段を、パルス幅がピコ秒のパルスレーザビームを発振するパルスレーザ光源で構成するとともに、第二のパルスレーザ発生手段を、パルス幅がフェムト秒のパルスレーザビームを発振するパルスレーザ光源で構成するのが好ましい。
また、本発明の顕微鏡において、照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光と、照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光のそれぞれおいて、第二高調波と多光子励起蛍光とを切替えて抽出する切替手段を備えれば、第二高調波、多光子励起蛍光を観察する場合、落射観察、透過観察のうち観察により適した光強度が得られる観察手法を選択することができる。
また、本発明の顕微鏡において、コヒーレントラマン散乱光抽出手段は、照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光と照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光の両方のコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、を切替可能に構成してもよい。このようにすれば、観察により適した光強度が得られる観察手法を選択することができる。
また、本発明の顕微鏡において、第一のパルスレーザ発生手段、及び第二のパルスレーザ発生手段のオンオフを切替える切替手段を備えたレーザ光選択手段と、前記レーザ光選択手段を制御する制御手段を備えれば、観察対象の関心領域に応じてレーザ光を選択して所望の観察手法に切替えることができる。また、観察対象の関心領域へのレーザ照射を必要最小限に抑えることができる。このため、標本へのダメージを少なく抑えることができ、また、蛍光の退色を抑えることもできる。
また、本発明の顕微鏡において、コヒーレントラマン散乱光検出手段、多光子励起蛍光検出手段、及び第二高調波検出手段を介して検出した信号を処理する画像処理装置と、画像処理装置で処理した画像を表示する画像表示装置と、標本に照射する光を２次元方向に走査する走査手段を有し、制御手段が、画像処理装置及び画像表示装置を介して該画像表示装置の表示画面における標本の関心領域が表示される位置に前記コヒーレントラマン散乱光による観察像、多光子励起蛍光による観察像、及び第二高調波による観察像のうち複数の像を並行して観察可能に或いはいずれかの像を選択して観察可能に表示するように構成すれば、一つの表示画面において観察対象の関心領域毎に、目的に応じて所望の観察手法で観察することができる。
以下、本発明の実施例について、図面を用いて説明する。なお、以下の実施例を示す図面のグラフ中、ＳＨＧは第二高調波、２−Ｐは多光子励起蛍光、Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓはアンチストークス光、Ｐｕｍｐはポンプ光、ＣＳＲＳはコヒーレントストークスラマン散乱光、Ｓｔｏｋｅｓはストークス光、ＣＡＲＳはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光、１−Ｐは単光子励起蛍光を示している。これらの記号は以下の各実施例において共通である。
図３は本発明の実施例１にかかる顕微鏡の概略構成図、図４は実施例１の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。
実施例１の顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段１と、第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段２と、第一のパルス光と第二のパルス光を合成して標本４に照射する照射手段（符号省略）と、照射手段を介して照射光を照射された標本４からの光から、コヒーレントストークスラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントストークスラマン散乱光抽出手段（符号省略）と、照射手段を介して照射光を照射された標本４からの光から、第二のパルス光の標本４への照射により発生した２光子励起蛍光のみを抽出する２光子励起蛍光抽出手段６と、照射手段３を介して照射光を照射された標本４からの光から、第二のパルス光の標本４への照射により発生した第二高調波成分の光のみを抽出する第二高調波抽出手段７と、コヒーレントストークスラマン散乱光を検出するコヒーレントストークスラマン散乱光検出手段８と、２光子励起蛍光あるいは第二高調波を検出する落射光検出手段９及び透過光検出手段１０とを有して構成されている。
第一のパルスレーザ発生手段１は、第一のパルス光として、波長が例えば約９００ｎｍでパルス幅がピコ秒のパルス光を発生させるパルスレーザ光源で構成されている。
第二のパルスレーザ発生手段２は、第二のパルス光として、波長が第一のパルス光の波長の近傍であって該第一のパルス光の波長よりも短い波長である所定波長帯域（例えば、約７００〜９００ｎｍ）の波長でパルス幅がフェムト秒のパルス光を発生させるパルスレーザ光源で構成されている。また、第二のパルスレーザ発生手段２は、第二のパルス光の波長を上記所定波長帯域内（約７００〜９００ｎｍ）で走査することができるようになっている。
そして、実施例１の顕微鏡では、第一のパルス光がポンプ光、第二のパルス光がアンチストークス光として機能するようになっている。
照射手段は、ミラー１１と、ハーフミラー１２と、ダイクロイックミラー１３，１４と、ガルバノミラー１５，１６と対物レンズ１７を有して構成されている。
ハーフミラー１２は、第一のパルス光と第二のパルス光とが交差する光路上に設けられている。
ダイクロイックミラー１３は、２光子励起蛍光の波長帯域（例えば、約５００〜６５０ｎｍ）以下の波長の光を透過し、アンチストークス光の波長帯域（例えば、約７００〜９００ｎｍ）以上の波長の光を反射する光学特性を有している。
ダイクロイックミラー１４は、ポンプ光の波長（約９００ｎｍ）以下の波長の光を透過し、ポンプ光の波長よりも長い波長の光を反射する光学特性を有している。
ガルバノミラー１５，１６は、標本４内における照射光の集光位置を２次元方向に走査するように構成されている。
コヒーレントストークスラマン散乱光抽出手段は、照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう標本４からの光からコヒーレントストークスラマン散乱光を抽出するＥ−ＣＳＲＳ（EPI-DETECTED COHERENT STOKES RAMAN）光抽出手段（符号省略）と、照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう標本４からの光からコヒーレントストークスラマン散乱光を抽出するＦ−ＣＳＲＳ（FORWARD-DETECTED COHERENT STOKES RAMAN）光抽出手段（符号省略）とで構成されている。
Ｅ−ＣＳＲＳ光抽出手段は、ダイクロイックミラー１４と、ミラー２２と、ハーフミラー２３と、分光器２４と、レンズ２５を有して構成されている。
分光器２４は、入射光を分光素子２７に導くミラー２６と、グレーティング等からなる分光素子２７と、分光素子２７で分散された光を投影する分散投影レンズ２８と、コヒーレントストークスラマン散乱光を通過させ、それ以外の光を遮断するように配置された遮光部材２９を有して構成されている。
Ｆ−ＣＳＲＳ光抽出手段は、ダイクロイックミラー１４と同様の光学特性を有するダイクロイックミラー３０と、ハーフミラー２３と、分光器２４と、レンズ２５を有して構成されている。
ハーフミラー２３は、ミラー２２で反射された光とダイクロイックミラー３０で反射された光とが交わる光路上に配置されている。
また、ハーフミラー２３は、図示省略したミラーとともに図示省略したスライダに設けられており、スライダを介してハーフミラー２３を光路から外した状態と、ハーフミラー２３から図示省略したミラーに切替えた状態の３つの状態に切替可能に構成されている。図３では、ハーフミラー２３が光路上に配置されており、Ｅ−ＣＳＲＳ光とＦ−ＣＳＲＳ光の両方のＣＳＲＳ光が抽出できる状態を示している。なお、ハーフミラー２３を光路から外したときにはＦ−ＣＳＲＳ光のみが抽出され、図示省略したミラーに切替えたときにはＥ−ＣＳＲＳ光のみが抽出されるようになっている。
また、コヒーレントストークスラマン散乱光抽出手段において、偏光型のコヒーレントストークスラマン散乱光を抽出するＰ−ＣＳＲＳ（POLARIZATION COHERENT STOKES RAMAN）光抽出手段（符号省略）として、第一のパルスレーザ発生手段１とミラー１１との間に所定の直線偏光に変換する偏光子３２が、第二のパルスレーザ発生手段２とハーフミラー１２との間に偏光子３２で変換される直線偏光とは異なる角度の直線偏光に変換する偏光子３３が、ハーフミラー２３と分光器２４との間にコヒーレントストークスラマン散乱光の直線偏光を透過し、非共鳴散乱光を遮断する検光子３４が、それぞれスライダ等を介して着脱可能に設けられている。
Ｐ−ＣＳＲＳ光抽出手段を上記光路上に挿入すると、第一のパルス光と第二のパルス光をそれぞれ振動方向の異なる直線偏光に変換してから標本に照射し、更に散乱光から特定方向の直線偏光成分のみを抽出することにより、背景雑音となる非共鳴ラマン散乱成分が除去され、コヒーレントストークスラマン散乱光を高感度で検出することができる。
２光子励起蛍光抽出手段６は、２光子励起蛍光の波長帯域（例えば、約５００〜６５０ｎｍ）の波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断するバンドパスフィルタで構成されている。
第二高調波抽出手段７は、第二のパルスレーザ光の第二高調波の波長帯域（例えば、約３５０〜４５０ｎｍ）の波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断するバンドパスフィルタで構成されている。
バンドパスフィルタ６，７は、それぞれ、いずれか一方をダイクロイックミラー１３と落射光検出手段９との間の光路、及びダイクロイックミラー３０と透過光検出手段１０との間の光路に挿脱可能に設けられている。そして、バンドパスフィルタ６を挿入した場合には、２光子励起蛍光が抽出され、バンドパスフィルタ７を挿入した場合には、第二高調波が抽出されるようになっている。
検出手段８，９，１０は、ディテクタで構成されている。
その他、３５は対物レンズである。
このように構成された実施例１の顕微鏡の作用について説明する。なお、ここでは、便宜上、図３に示すように、偏光子３２、偏光子３３、検光子３４、及びハーフミラー２３がそれぞれ光路上の所定位置に挿入されているとともに、バンドパスフィルタ７がダイクロイックミラー１３と落射光検出手段９との間の光路、バンドパスフィルタ６がダイクロイックミラー３０と透過光検出手段１０との間の光路にそれぞれ挿入されている場合について説明する。
実施例１の顕微鏡によれば、第一のパルスレーザ発生手段１から発せられたポンプ光は、偏光子３２を経て所定方向の直線偏光成分に偏光され、ミラー１１で反射されてハーフミラー１２に入射する。第二のパルスレーザ発生手段２から発せられたアンチストークス光は、偏光子３３を経てポンプ光とは異なる角度の直線偏光に偏光され、ハーフミラー１２に入射する。ハーフミラー１２で反射されたポンプ光とハーフミラー１２を透過したストークス光は、同一光路上を通る光として合成される。合成された光は、ダイクロイックミラー１３で反射され、ダイクロイックミラー１４を透過し、ガルバノミラー１５，１６を介して標本４内の集光位置を２次元方向に走査され、対物レンズ１７で集光されて標本４内の所定の箇所を照射する。
標本４は、ポンプ光とアンチストークス光とが照射されることによりコヒーレントストークスラマン散乱光を発する。また、標本４は、アンチストークス光を照射されることにより、アンチストークス光の半分の波長の第二高調波を発する。さらに、標本４は、アンチストークス光を照射されることにより、２光子励起現象を生じ、コヒーレントストークスラマン散乱光や第二高調波に遅れたタイミングで蛍光を発する。
照射手段を介して光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、反射される方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ１７、ガルバノミラー１６，１５を経て、ダイクロイックミラー１４に入射する。ダイクロイックミラー１４に入射した光のうち、コヒーレントストークスラマン散乱光がダイクロイックミラー１４で反射され、コヒーレントストークスラマン散乱光よりも短い波長の光（ポンプ光、アンチストークス光、２光子励起蛍光、及び第二高調波）がダイクロイックミラー１４を透過する。
ダイクロイックミラー１４を透過した光は、ダイクロイックミラー１３に入射する。ダイクロイックミラー１３に入射した光のうち、アンチストークス光以上の波長の光（アンチストークス光、及びポンプ光）がダイクロイックミラー１３で反射され、アンチストークス光よりも短い波長の光（第二高調波、及び２光子励起蛍光）がダイクロイックミラー１３を透過する。
ダイクロイックミラー１３を透過した光は、バンドパスフィルタ７に入射する。バンドパスフィルタ７に入射した光のうち、第二高調波のみがバンドパスフィルタ７を透過し、第二高調波以外の光（２光子励起蛍光、及びダイクロイックミラー１４を極く僅かに透過したその他の波長の光）が遮断される。バンドパスフィルタ７を透過した第二高調波は、落射光検出手段９で検出される。
照射手段を介して光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、透過する方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ３５を経て、ダイクロイックミラー３０に入射する。ダイクロイックミラー３０に入射した光のうち、コヒーレントストークスラマン散乱光がダイクロイックミラー３０で反射され、コヒーレントストークスラマン散乱光よりも短い波長の光（ポンプ光、アンチストークス光、２光子励起蛍光、及び第二高調波）がダイクロイックミラー３０を透過する。
ダイクロイックミラー３０を透過した光は、バンドパスフィルタ６に入射する。バンドパスフィルタ６に入射した光のうち、２光子励起蛍光のみがバンドパスフィルタ６を透過し、２光子励起蛍光以外の光（ポンプ光、アンチストークス光、２光子励起蛍光、第二高調波、及びダイクロイックミラー３０を極く僅かに透過したその他の波長の光）が遮断される。バンドパスフィルタ６を透過した２光子励起蛍光は、透過光検出手段１０で検出される。
ダイクロイックミラー１４で反射された光は、ミラー２２で反射され、ハーフミラー２３に入射する。また、ダイクロイックミラー３０で反射された光は、ハーフミラーに入射する。
ハーフミラー２２で反射された光及びハーフミラー２３を透過した光は、検光子３４に入射する。検光子３４に入射した光のうち、非共鳴散乱光が検光子３４で遮断され、コヒーレントストークスラマン散乱光、及び、ダイクロイックミラー１４，３０を極く僅かに反射したその他の光が検光子３４を通過して、分光器２４のミラー２６に入射する。
ミラー２６に入射した光は、ミラー２６で反射されて分光素子２７に入射する。分光素子２７に入射した光は、所定の波長分解能でもって分散されて分散投影レンズ２８に入射し、分散投影レンズ２８を介して分光投影される。分光投影される光のうち、コヒーレントストークスラマン散乱光以外の波長の光が遮光部材２９で遮断され、コヒーレントストークスラマン散乱光が遮光部材２９を通過し、検出手段８で検出される。
なお、バンドパスフィルタ６をダイクロイックミラー１３と落射光検出手段９との間の光路に挿入し、バンドパスフィルタ７をダイクロイックミラー３０と透過光検出手段１０との間の光路に挿入した場合には、落射光検出手段９で落射照明による２光子励起蛍光が、透過光検出手段１０で透過照明による第二高調波がそれぞれ検出される。
また、ハーフミラー２３を光路から外したときには、Ｆ−ＣＳＲＳ光のみが検出手段８で検出され、図示省略したミラーに切替えたときにはＥ−ＣＳＲＳ光のみが検出手段８で検出される。
従って、実施例１の顕微鏡によれば、１台の顕微鏡でもって、一つの標本に対し、観察する目的に応じて、２光子励起蛍光観察、第二高調波観察、コヒーレントストークスラマン散乱光観察とを並行して或いは選択的に行うことができる。
なお、実施例１の顕微鏡では、バンドパスフィルタ６，７を切替え可能に構成したが、それぞれいずれかの位置に固定して設けてもよい。また、ハーフミラー２３を、図示省略したスライダを介してミラーと切替可能に構成したが、いずれか一方を固定する、或いはいずれも設けない構成としてもよい。さらに、偏光子３２、偏光子３３、及び検光子３４も同様に、固定して配置する、或いはいずれも設けない構成としてもよい。また、対物レンズ３５の代わりに、コンデンサレンズを用いても良い。
図５は本発明の実施例２にかかる顕微鏡の概略構成図、図６は実施例２の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。
実施例２の顕微鏡では、ハーフミラー２３がミラー２２で反射した光とダイクロイックミラー３０で反射した光とが交わる光路上に固定されており、Ｆ−ＣＳＲＳ光とＥ−ＣＳＲＳ光の両方のコヒーレントストークスラマン散乱光が抽出される構成に限定されている。
また、ダイクロイックミラー１３の透過側光路には、第二のパルスレーザ光の第二高調波の波長帯域（例えば、約３５０〜４５０ｎｍ）の波長の光を透過し、第二高調波よりも長い波長の光を反射するダイクロイックミラー３６ａが設けられている。そして、ダイクロイックミラー３６ａの透過側光路には、第二のパルスレーザ光の第二高調波の波長帯域（例えば、約３５０〜４５０ｎｍ）の波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断するバンドバスフィルタ７ａと、落射第二高調波検出手段としてのディテクタ９ａが設けられ、ダイクロイックミラー３６ａの反射側光路には、２光子励起蛍光の波長帯域（例えば、約５００〜６５０ｎｍ）の波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断するバンドパスフィルタ６ａと、落射２光子励起蛍光検出手段としてのディテクタ１０ａが設けられており、落射２光子励起蛍光と落射第二高調波とを並行して検出することができるようになっている。
また、ダイクロイックミラー３０の透過側光路には、ダイクロイックミラー３６ａと同様の光学特性を有するダイクロイックミラー３６ｂが設けられている。そして、ダイクロイックミラー３６ｂの透過側光路には、バンドパスフィルタ７ａと同様の光学特性を有するバンドパスフィルタ７ｂと、落射第二高調波検出手段９ａと同様に構成された透過第二高調波検出手段としてのディテクタ９ｂが設けられ、ダイクロイックミラー３６ｂの反射側光路には、バンドパスフィルタ６ａと同様の光学特性を有するバンドパスフィルタ６ｂと、落射２光子励起蛍光検出手段１０ａと同様に構成された透過第二高調波検出手段としてのディテクタ１０ｂが設けられており、透過２光子励起蛍光と透過第二高調波とを並行して検出することができるようになっている。
実施例２の顕微鏡によれば、落射第二高調波、落射２光子励起蛍光、透過第二高調波、透過２光子励起蛍光、及びコヒーレントストークスラマン散乱光を一度に検出することができる。その他の作用効果は、実施例１の顕微鏡とほぼ同じである。
図７は本発明の実施例３にかかる顕微鏡の概略構成図、図８は実施例３の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。
実施例３の顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段１’と、第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段２’と、第一のパルス光と第二のパルス光を合成して標本４に照射する照射手段（符号省略）と、照射手段を介して照射光を照射された標本４からの光から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光抽出手段（符号省略）と、照射手段を介して照射光を照射された標本４からの光から、第二のパルス光の標本４への照射により発生した２光子励起蛍光のみを抽出する落射２光子励起蛍光抽出手段（符号省略）と、照射手段を介して照射光を照射された標本４からの光から、第二のパルス光の標本４への照射により発生した第二高調波成分の光のみを抽出する透過第二高調波抽出手段７’と、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段８’と、２光子励起蛍光を検出する落射２光子励起蛍光検出手段９’と、第二高調波を検出する透過第二高調波検出手段１０’とを有して構成されている。
第一のパルスレーザ発生手段１’は、第一のパルス光として、波長が例えば約７００ｎｍでパルス幅がピコ秒のパルス光を発生させるパルスレーザ光源で構成されている。
第二のパルスレーザ発生手段２’は、第二のパルス光として、波長が第一のパルス光の波長よりも長い波長である所定波長帯域（例えば、約７００〜９００ｎｍ）の波長でパルス幅がフェムト秒のパルス光を発生させるパルスレーザ光源で構成されている。また、第二のパルスレーザ発生手段２’は、第二のパルス光の波長を上記所定波長帯域内（約７００〜９００ｎｍ）で走査することができるようになっている。
そして、実施例３の顕微鏡では、第一のパルス光がポンプ光、第二のパルス光がストークス光として機能するようになっている。
照射手段は、ミラー１１と、ハーフミラー１２と、ダイクロイックミラー４１と、ガルバノミラー１５，１６と対物レンズ１７とを有して構成されている。
ハーフミラー１２は、第一のパルス光と第二のパルス光とが交差する光路上に設けられている。
ダイクロイックミラー４１は、ポンプ光の波長（約７００ｎｍ）よりも短い波長の光を透過し、ポンプ光の波長以上の波長の光を反射する光学特性を有している。
ガルバノミラー１５，１６は、標本４内における照射光の集光位置を２次元方向に走査するように構成されている。
コヒーレントアンチストークスラマン散乱光抽出手段は、照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう標本４からの光からコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を抽出するＥ−ＣＡＲＳ光抽出手段（符号省略）と、照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう標本４からの光からコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を抽出するＦ−ＣＡＲＳ光抽出手段（符号省略）とで構成されている。
Ｅ−ＣＡＲＳ光抽出手段は、偏光ビームスプリッタ４２と、ミラー２２と、ハーフミラー２３と、ダイクロイックミラー４３と、ミラー４４，４５と、カーゲート４６と、検光子４７と、分光器２４と、レンズ２５を有して構成されている。
偏光ビームスプリッタ４２は、直線偏光を反射し、直線偏光以外の光を透過又は反射する（即ち、透過する光は直線偏光以外の光に限られる。）光学特性を有しており、直線偏光でない２光子励起蛍光を抽出する落射２光子励起蛍光抽出手段としての機能も備えている。
ダイクロイックミラー４３は、ダイクロイックミラー４１と同様に、ポンプ光の波長（約７００ｎｍ）よりも短い波長の光を透過し、ポンプ光の波長以上の波長の光を反射する光学特性を有している。
ミラー４５は、光をカーゲート４６に斜めに入射させるように配置されている。
カーゲート４６は、ミラー４５から光が斜めに入射したときに、ハーフミラー２３を透過及び反射してカーゲート４６に入射した光の直線偏光の偏光方向を所定方向に回転させる機能を備えている。
検光子４７は、カーゲート４６を透過したときに偏光方向が変えられた直線偏光を透過し、カーゲート４６を透過したときに偏光方向が変わらない直線偏光を遮断する光学特性を有している。
分光器２４は、入射光を分光素子２７に導くミラー２６と、グレーティング等からなる分光素子２７と、分光素子２７で分散された光を投影する分散投影レンズ２８と、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を通過させ、それ以外の光を遮断するように配置された遮光部材２９を有して構成されている。
Ｆ−ＣＡＲＳ光抽出手段は、ダイクロイックミラー４８と、偏光子４９と、ハーフミラー２３と、ダイクロイックミラー４３と、ミラー４４，４５と、カーゲート４６と、検光子４７と、分光器２４と、レンズ２５を有して構成されている。
ダイクロイックミラー４８は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の波長帯域（例えば、５７０〜７００ｎｍ）以上の波長の光を反射し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の波長よりも短い波長の光を透過する光学特性を有している。
偏光子４９は、偏光方向がランダムな２光子励起蛍光を直線偏光に変換する光学特性を有している。
また、ミラー４４、ミラー４５は、ハーフミラー２３を反射及び透過したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光（Ｅ−ＣＡＲＳ光及びＦ−ＣＡＲＳ光）がカーゲート４６に入射するタイミングと同じタイミングでもって、ミラー４５からのストークス光をカーゲート４６に入射させる調整機能を備えている。
ハーフミラー２３は、ミラー２２で反射した光と偏光子４９を透過した光とが交わる光路上に配置されている。
また、ハーフミラー２３は、図示省略したミラーとともに図示省略したスライダに設けられており、スライダを介してハーフミラー２３を光路から外した状態と、ハーフミラー２３から図示省略したミラーに切替えた状態の３つの状態に切替可能に構成されている。図７では、ハーフミラー２３が光路上に配置されており、Ｅ−ＣＡＲＳ光とＦ−ＣＡＲＳ光の両方のＣＡＲＳ光が抽出できる状態を示している。なお、ハーフミラー２３を光路から外したときにはＦ−ＣＡＲＳ光のみが抽出され、図示省略したミラーに切替えたときにはＥ−ＣＡＲＳ光のみが抽出されるようになっている。
なお、実施例３の顕微鏡では、便宜上、図示を省略したが、実施例１のＰ−ＣＳＲＳ光抽出手段と同様に、偏光型のコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を抽出するＰ−ＣＡＲＳ（POLARIZATION COHERENT ANTISTOKES RAMAN）光抽出手段として、第一のパルスレーザ発生手段１’とミラー１１との間に所定の直線偏光に変換する第一の偏光子と、第二のパルスレーザ発生手段２’とハーフミラー１２との間に第一の偏光子で変換される直線偏光とは異なる角度の直線偏光に変換する第二の偏光子と、ハーフミラー２３と分光器２４との間にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の直線偏光を透過し、非共鳴散乱光を遮断する検光子とを、それぞれスライダ等を介して着脱可能に設けてもよい。
Ｐ−ＣＡＲＳ光抽出手段を光路上に挿入すると、第一のパルス光と第二のパルス光をそれぞれ振動方向の異なる直線偏光に変換してから標本に照射し、更に散乱光から特定方向の直線偏光成分のみを抽出することにより、背景雑音となる非共鳴ラマン散乱成分が除去できるため、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を高感度で検出することができるようになる。
２光子励起蛍光抽出手段は、上述したように、直線偏光を反射し、直線偏光以外の光を透過又は反射する光学特性を有するビームスプリッタ４２で構成されており、直線偏光であるポンプ光、ストークス光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光、第二高調波を透過させず、直線偏光以外の２光子励起蛍光の波長帯域（例えば、約５００〜６５０ｎｍ）の波長の光のみを透過させるようになっている。
第二高調波抽出手段７’は、第二のパルスレーザ光の第二高調波の波長帯域（例えば、約３５０〜４５０ｎｍ）の波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断するバンドパスフィルタで構成されている。
このように、実施例３の顕微鏡では、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と２光子励起蛍光とを分離するための分離手段として、ミラー４４,４５等の遅延光学系やカーゲート４６等を有して構成される時間分解手段を備えている。
コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と２光子励起蛍光は、波長域が一部重なり得るため、分離する必要がある。しかるに、標本では、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光はストークス光である励起光パルスの照射されている瞬間しか発生しないが、２光子励起蛍光は励起光パルスの照射から遅れて発生し、励起光パルスが消えてもしばらくは発光し続ける。そこで、カーゲート４６を設けて励起光パルス（ストークス光）、及びコヒーレントアンチストークスラマン散乱光がカーゲート４６に入射するタイミングと２光子励起蛍光がカーゲート４６に入射するタイミングとをずらすようにすれば、カーゲート４６を通過するときのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と２光子励起蛍光との偏光方向を異ならせることができ、異なる偏光成分ごとに分離することで、それぞれの光が分離できる。
このように構成された実施例３の顕微鏡の作用について説明する。なお、ここでは、便宜上、図示していないＰ−ＣＡＲＳ光抽出手段が光路上の所定位置に挿入されてなく、かつ、ＣＡＲＳ光ハーフミラー２３が光路上の所定位置に挿入されている場合について説明する。
実施例３の顕微鏡によれば、第一のパルスレーザ発生手段１’から発せられたポンプ光は、ミラー１１で反射されてハーフミラー１２に入射する。第二のパルスレーザ発生手段２’から発せられたストークス光は、ハーフミラー１２に入射する。ハーフミラー１２で反射されたポンプ光とハーフミラー１２を透過したストークス光は、同一光路上を通る光として合成される。合成された光は、ダイクロイックミラー４１で反射され、ガルバノミラー１５，１６を介して標本４内の集光位置を２次元方向に走査され、対物レンズ１７で集光されて標本４内の所定の箇所を照射する。
標本４は、ポンプ光とストークス光とが照射されることによりコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発する。また、標本４は、ストークス光を照射されることにより、ストークス光の半分の波長の第二高調波を発する。さらに、標本４は、ストークス光を照射されることにより、２光子励起現象を生じ、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光や第二高調波に遅れたタイミングで蛍光を発する。
照射手段を介して光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、反射される方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ１７、ガルバノミラー１６，１５を経て、ダイクロイックミラー４１に入射する。ダイクロイックミラー４１に入射した光のうち、ポンプ光及びストークス光がダイクロイックミラー４１で反射され、ポンプ光よりも短い波長の光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光、２光子励起蛍光、及び第二高調波）がダイクロイックミラー４１を透過する。
ダイクロイックミラー４１を透過した光は、偏光ビームスプリッタ４２に入射する。偏光ビームスプリッタ４２に入射した光のうち、直線偏光であるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光及び第二高調波は、偏光ビームスプリッタ４２で反射される。２光子励起蛍光は、もともと偏光方向がランダムであるため、極く僅かな直線偏光成分がビームスプリッタ４２で反射され、直線偏光でないほとんどの成分が偏光ビームスプリッタ４２を透過する。これにより、２光子励起蛍光のみが抽出される。偏光ビームスプリッタ４２を透過した２光子励起蛍光は、落射２光子励起蛍光検出手段９’で検出される。
照射手段を介して光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、透過する方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ３５を経て、ダイクロイックミラー４３に入射する。ダイクロイックミラー４３に入射した光のうち、ポンプ光及びストークス光がダイクロイックミラー４３で反射され、ポンプ光よりも短い波長の光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光、２光子励起蛍光、及び第二高調波）がダイクロイックミラー４３を透過する。
ダイクロイックミラー４３を透過した光は、ダイクロイックミラー４８に入射する。ダイクロイックミラー４８に入射した光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の波長帯域（約５７０〜７００ｎｍ）以上の波長の光（互いに一部の波長領域で波長が重なる２光子励起蛍光及びアンチコヒーレントラマン散乱光）がダイクロイックミラー４８で反射され、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の波長よりも短い波長の光（２光子励起蛍光及び第二高調波）がダイクロイックミラー４８を透過する。
ダイクロイックミラー４８を透過した光は、バンドパスフィルタ７’に入射する。バンドパスフィルタ７’に入射した光のうち、第二高調波のみがバンドパスフィルタ７’を透過し、第二高調波以外の光（２光子励起蛍光及びダイクロイックミラー４８を極く僅かに透過したその他の波長の光）が遮断される。バンドパスフィルタ７’を透過した第二高調波は、透過第二高調波検出手段１０’で検出される。
偏光ビームスプリッタ４２で反射された光は、ミラー２２で反射され、ハーフミラー２３に入射する。
また、ダイクロイックミラー４８で反射された光は、偏光子４９を透過する。このとき、２光子励起蛍光は、直線偏光に変換される。偏光子４９を透過した光は、ハーフミラー２３に入射する。
ハーフミラー２２で反射された光及びハーフミラー２３を透過した光は、ストークスコヒーレントラマン散乱光と２光子励起蛍光とで異なるタイミングでもってカーゲート４６に入射する。
このとき、ダイクロイックミラー４３で反射されたポンプ光及びストークス光は、ミラー４４，４５を介して、カーゲート４６にストークスコヒーレントラマン散乱光が入射するタイミングと同じタイミングでカーゲート４６に斜めに入射する。カーゲート４６にストークス光が斜めに入射すると、カーゲート４６を透過する光の偏光方向が所定方向に回転させられる（即ち、偏光方向が変わる）。
このため、カーゲート４６に入射したコヒーレントアンチストークス光は、偏光方向が所定方向に回転させられてカーゲート４６を透過する。
カーゲート４６を透過して偏光方向が変えられたコヒーレントアンチストークス光は、検光子４７を通過して、分光器２４のミラー２６に入射する。
ミラー２６に入射した光は、ミラー２６で反射されて分光素子２７に入射する。分光素子２７に入射した光は、所定の波長分解能でもって分散されて分散投影レンズ２８に入射し、分散投影レンズ２８を介して分光投影される。分光投影される光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光以外の波長の光が遮光部材２９で遮断され、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光が遮光部材２９を通過し、検出手段８’で検出される。
一方、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と異なるタイミングで２光子励起蛍光がカーゲート４６に入射するタイミングは、ストークス光がカーゲート４６に斜めに入射するタイミングとずれている。
このため、カーゲート４６に入射した２光子励起蛍光は、偏光方向を回転させられることなくカーゲート４６を透過する。
カーゲート４６を透過しても偏光方向が変わらない２光子励起蛍光は、検光子４７で遮断される。このため、２光子励起蛍光は、検出器９’には到達しない。
これにより、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と２光子励起蛍光は、それぞれ分離して抽出、検出されることになる。
なお、ハーフミラー２３を光路から外したときには、Ｆ−ＣＡＲＳ光のみが検出手段８’で検出され、図示省略したミラーに切替えたときにはＥ−ＣＡＲＳ光のみが検出手段８’で検出される。
従って、実施例３の顕微鏡によれば、１台の顕微鏡でもって、一つの標本に対し、観察する目的に応じて２光子励起蛍光観察、第二高調波観察、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察とを並行して或いは選択的に行うことができる。
なお、実施例３の顕微鏡では、２光子励起蛍光を落射光で、第二高調波を透過光で検出するように構成したが、このような構成に限定されるものでなく、２光子励起蛍光を透過光で、第二高調波を落射光で検出するように構成することも勿論可能である。
また、３光子以上の多光子励起蛍光が発生する場合においても、本実施例と同様な時間分解を行うことにより、多光子励起蛍光と第二高調波を分離して検出できる。
図９は本発明の実施例４にかかる顕微鏡の概略構成図、図１０は実施例４の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。
実施例４の顕微鏡も、実施例３の顕微鏡と同様、第二高調波と、２光子励起蛍光と、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する顕微鏡として構成されている。
実施例４の顕微鏡では、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と２光子励起蛍光とを分離する手段として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を変調した状態で発生させる変調手段としての変調器５０、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と２光子励起蛍光検出手段とを兼ねていて、変調されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と２光子励起蛍光とを共に受光し、受光した光から変調成分と非変調成分とを分離して検出する検出装置としてのｌｏｃｋ-ｉｎ検出器５３を備えている。
なお、便宜上、実施例３の顕微鏡の構成と異なる点について説明することとし、実施例３と構成が同じ光学部材には同じ符号を付し、説明は省略する。
変調器５０は、ＡＯＭ（音響光学変調素子）又はＥＯＭ（電気光学変調素子）を用いて構成されており、ミラー１１とハーフミラー１２との間の光路に設けられている。
ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３は、検出器８’に接続されており、検出器８’で受光した信号のうち、変調がかけられたＡＣ成分と、変調がかけられていないＤＣ成分とを分離して検出する機能を備えている。
また、実施例４の顕微鏡では、実施例３の顕微鏡におけるダイクロイックミラー４３、ミラー４４，４５、偏光子４９、カーゲート４６、検光子４７、検出器９’を設けていないとともに、実施例３の顕微鏡における偏光ビームスプリッタ４２、ダイクロイックミラー４８に代えてダイクロイックミラー５１，５２が設けられている。ダイクロイックミラー５１は、単光子励起光の波長（例えば、約５００ｎｍ）の光のみを透過し、コヒーレントアンチストークス光及び２光子励起蛍光を含めてその他の波長帯域の光を反射する光学特性を有している。また、ダイクロイックミラー５２は、第二のパルスレーザ光の第二高調波の波長帯域（例えば、約３５０〜４５０ｎｍ）の波長の光を透過し、第二高調波よりも長い波長の光を反射する光学特性を有している。
また、実施例４の顕微鏡では、分光器２４が、分散投影レンズ２８を介して分光投影する光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光及び２光子励起蛍光以外の波長の光を遮光部材２９で遮断し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光及び２光子励起蛍光は遮光部材２９を通過するように構成されている。そして、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と２光子励起蛍光は、共に検出器８’で受光されるようになっている。
なお、実施例４の顕微鏡では、実施例１のＰ−ＣＳＲＳ光抽出手段と同様に、偏光型のコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を抽出するＰ−ＣＡＲＳ（POLARIZATION COHERENT ANTISTOKES RAMAN）光抽出手段として、第一のパルスレーザ発生手段１’とミラー１１との間に所定の直線偏光に変換する偏光子５４が、第二のパルスレーザ発生手段２’とハーフミラー１２との間に偏光子５４で変換される直線偏光とは異なる角度の直線偏光に変換する偏光子５５が、ハーフミラー２３と分光器２４との間にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の直線偏光を透過し、非共鳴散乱光を遮断する検光子５６が、それぞれスライダ等を介して着脱可能に設けられている。
さらに、実施例４の顕微鏡では、ダイクロイックミラー５１の入射側光路に単光子励起用レーザ光源５７が設けられており、通常の単光子励起蛍光も、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３を介して検出することができるようになっている。なお、単光子励起用レーザ光源５７を設けないで構成しても勿論良い。
このように構成された実施例４の顕微鏡の作用について説明する。なお、ここでは、便宜上、偏光子５４、偏光子５５、検格子５６、ハーフミラー２３が光路上の所定位置に挿入されている場合について説明する。
実施例４の顕微鏡によれば、第一のパルスレーザ発生手段１’から発せられたポンプ光は、偏光子５４を経て所定方向の直線偏光成分に偏光され、ミラー１１で反射されて変調器５０に入射し、変調器５０を介して変調されて、ハーフミラー１２に入射する。第二のパルスレーザ発生手段２’から発せられたストークス光は、第２の偏光子５５を経てポンプ光とは異なる角度の直線偏光に偏光され、ハーフミラー１２に入射する。ハーフミラー１２で反射された変調ポンプ光とハーフミラー１２を透過したストークス光は、同一光路上を通る光として合成される。合成された光は、ダイクロイックミラー４１で反射され、ガルバノミラー１５，１６を介して標本４内の集光位置を２次元方向に走査され、対物レンズ１７で集光されて標本４内の所定の箇所を照射する。
標本４は、ポンプ光とストークス光とが照射されることによりコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発する。また、標本４は、ストークス光を照射されることにより、ストークス光の半分の波長の第二高調波を発する。さらに、標本４は、ストークス光を照射されることにより、２光子励起現象を生じ、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光や第二高調波に遅れたタイミングで蛍光を発する。このとき、ポンプ光には変調がかかっているため、発生するコヒーレントストークスラマン散乱光にも変調がかかる。一方、ストークス光には変調がかかっていないため、発生するストークス光の第二高調波及び２光子励起蛍光には変調がかからない。
照射手段を介して光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、反射される方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ１７、ガルバノミラー１６，１５を経て、ダイクロイックミラー４１に入射する。ダイクロイックミラー４１に入射した光のうち、ポンプ光及びストークス光がダイクロイックミラー４１で反射され、ポンプ光よりも短い波長の光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光、２光子励起蛍光、及び第二高調波）がダイクロイックミラー４１を透過する。
ダイクロイックミラー４１を透過した光は、ダイクロイックミラー５１に入射する。ダイクロイックミラー５１に入射した光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光、２光子励起蛍光、及び第二高調波は、ダイクロイックミラー５１で反射され、ミラー２２で反射されて、ハーフミラー２３に入射する。
照射手段３を介して光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、透過する方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ３５を経て、ダイクロイックミラー５２に入射する。ダイクロイックミラー５２に入射した光のうち、第二のパルスレーザ光の第二高調波の波長帯域（例えば、約３５０〜４５０ｎｍ）の波長の光がダイクロイックミラー５２を透過し、第二高調波よりも長い波長の光（２光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光、ポンプ光、及びストークス光）がダイクロイックミラー５２で反射される。
ダイクロイックミラー５２を透過した光は、バンドパスフィルタ７’に入射する。バンドパスフィルタ７’に入射した光のうち、第二高調波のみがバンドパスフィルタ７’を透過し、第二高調波以外のダイクロイックミラー５２を極く僅かに透過したその他の波長の光が遮断される。バンドパスフィルタ７’を透過した第二高調波は、透過第二高調波検出手段１０’で検出される。
ダイクロイックミラー５２で反射された光は、ハーフミラー２３に入射する。
ハーフミラー２２で反射された光及びハーフミラー２３を透過した光は、検光子５６に入射する。検光子５６に入射した光のうち、非共鳴散乱光が検光子５６で遮断され、その他の光（２光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光、ポンプ光、及びストークス光）が検光子５６を通過して、分光器２４のミラー２６に入射する。
ミラー２６に入射した光は、ミラー２６で反射されて分光素子２７に入射する。分光素子２７に入射した光は、所定の波長分解能でもって分散されて分散投影レンズ２８に入射し、分散投影レンズ２８を介して分光投影される。分光投影される光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光及び２光子励起蛍光以外の波長の光が遮光部材２９で遮断され、コヒーレントストークスラマン散乱光及び２光子励起蛍光が遮光部材２９を通過し、共に検出手段８’で受光される。このとき、検出手段８’で受光された光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光には変調がかかっており、２光子励起蛍光には、変調がかかっていない。
検出手段８’で受光された信号は、光電変換され、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３に送られる。
ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３に送られた信号は、変調がかけられたＡＣ成分の信号と、変調がかけられていないＤＣ成分の信号とに分離して検出される。
これにより、変調がかけられたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と、変調がかけられていない２光子励起蛍光は、それぞれ分離して、抽出、検出されることになる。
なお、ハーフミラー２３を光路から外したときには、Ｆ−ＣＡＲＳ光のみが検出手段８’で検出され、図示省略したミラーに切替えたときにはＥ−ＣＡＲＳ光のみが検出手段８’で検出される。
従って、実施例４の顕微鏡によれば、１台の顕微鏡でもって、一つの標本に対し、観察する目的に応じて２光子励起蛍光観察、第二高調波観察、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察とを並行して或いは選択的に行うことができる。
なお、実施例４の顕微鏡では、第二高調波を透過光で検出するように構成したが、このような構成に限定されるものでなく、第二高調波を落射光で検出するように構成することも勿論可能である。
また、実施例４の顕微鏡において、単光子励起蛍光を検出する場合には、単光子励起用レーザ光源５７から所定波長（約５００ｎｍ）のレーザパルスを発するようにする。単光子励起用レーザ光源５７から発せられた励起光は、ダイクロイックミラー５１、ダイクロイックミラー４１、ガルバノミラー１５，１６、対物レンズ１７を経て、標本４を照射する。標本４で発した単光子励起蛍光は、２光子励起蛍光と同様の光路を辿り、検出手段８’で受光され、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３で検出される。
このように、実施例４の顕微鏡では、上記効果に加えて、単光子励起蛍光を検出することもできるため、観察の用途がより広くなる。
なお、実施例４の顕微鏡では、検出手段８’は１チャンネルのＰＭＴ（光電子倍増管）で構成してもよいが、ＰＭＴアレイやＣＣＤアレイからなるマルチチャンネルディテクタを用いて構成してもよい。
マルチチャンネルディテクタを用いれば、２光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光のそれぞれについてスペクトル分解することができ、分解したスペクトルから検出した照射対象の成分の分析をすることができる。
図１１は本発明の実施例５にかかる顕微鏡の概略構成図、図１２は実施例５の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性をグラフで示す説明図である。
実施例５の顕微鏡の光学部材の基本的な配置構成は、実施例３の顕微鏡と同じであり、パルスレーザ発生手段から発されるパルス光の波長、及びダイクロイックミラー、バンドパスフィルタ等の光学特性が異なる。
実施例５の顕微鏡では、第一のパルスレーザ発生手段１”は、第一のパルス光として波長が第二のパルス光の波長よりも短い波長である所定波長帯域（例えば、約７００〜８００ｎｍ）の波長でパルス幅がピコ秒のパルス光を発生させるパルスレーザ光源で構成されている。第一のパルスレーザ発生手段１”は、第一のパルス光の波長を上記所定波長帯域内（約７００〜８００ｎｍ）で走査することができるようになっている。
第二のパルスレーザ発生手段２”は、第二のパルス光として波長が第一パルス光の波長よりも長い波長である所定波長（約９００ｎｍ）でパルス幅がフェムト秒のパルス光を発生させるパルスレーザ光源で構成されている。
また、ダイクロイックミラー４１’，４３’は、ポンプ光の波長帯域（約７００〜８００ｎｍ）よりも短い波長の光を透過し、ポンプ光の波長帯域以上の波長の光を反射する光学特性を有している。
ダイクロイックミラー４８’は、実施例５とは発生する波長帯域の異なるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の波長帯域以上の波長の光を反射し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の波長帯域よりも短い波長の光を透過する光学特性を有している。
第二高調波抽出手段７”は、第二のパルスレーザ光の第二高調波の波長帯域（約４５０ｎｍ）の波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断するバンドパスフィルタで構成されている。
その他の構成は、図７及び図８に示した構成と同じである。
本発明の顕微鏡では、ストークス光は、２光子励起蛍光観察、第二高調波観察における励起光となっている。ストークス光の波長を走査した場合、吸収スペクトルが変化するため、蛍光の発光効率が変わる。このため、２光子励起蛍光、第二高調波を最適な発光効率を保って観察することができない。
しかるに、実施例５の顕微鏡によれば、ポンプ光の波長を走査し、ストークス光の波長を固定する構成としたので、ポンプ光の波長を走査中に２光子励起蛍光の発光効率は変化しない。このため、２光子励起蛍光、又は第二高調波の発光効率が最適となる波長をストークス光として用いれば、最適な発光状態で２光子励起蛍光、又は第二高調波を検出しながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出することができる。
図１３は本発明の実施例６にかかる顕微鏡の概略構成図、図１４は実施例６の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。
実施例６の顕微鏡は、図９及び図１０に示した実施例４の顕微鏡の照射手段にレーザ光選択手段としてのレーザコンバイナ６１と、制御手段としてのコントローラ６２を備えて構成されており、観察対象の関心領域に応じてレーザ光を選択して観察手法を切替えることができるようになっている。
レーザコンバイナ６１は、第一のパルスレーザ発生手段（ポンプ光発生手段）１’と、第一のパルスレーザ発生手段１’のオンオフを切替える切替手段としての機能と第一のパルスレーザを変調する変調手段（図９に示した実施例４の顕微鏡における変調器５０）としての機能とを兼ね備えた音響光学素子６３と、第二のパルスレーザ発生手段（ストークス光発生手段）２’と、第二のパルスレーザ発生手段２’のオンオフを切替える切替手段である音響光学素子６４と、単光子励起用パルスレーザ発生手段６５と、単光子励起用パルスレーザ発生手段６５のオンオフを切替える切替手段である音響光学素子６６と、これらのパルスレーザの光路を合成するための合成手段としてのミラー６７、及びハーフミラー６８，６９を有している。
コントローラ６２は、レーザコンバイナ６１の音響光学素子６３，６４，６６に接続されており、音響光学素子６３，６４，６６によるオンオフを制御する機能を備えている。また、コントローラ６２は、ｌｏｃｋ-ｉｎ検出器５３に接続されており、音響光学素子６３，６３を共にオンにするときに同期してｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３による波長分離をオンにし、それ以外のときにｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３をオフにするように制御する機能も備えている。
なお、実施例６の顕微鏡では、レーザコンバイナ６１に単光子励起用パルスレーザ発生手段６５を備えて構成したが、備えないで構成してもよい。
なお、図１３では、説明の便宜上、図９に示した実施例４の顕微鏡におけるミラー２２、ハーフミラー２３、偏光子５４，５５、検光子５６を省き、コヒーレントラマン散乱光は、Ｆ−ＣＡＲＳ光のみが検出できる状態を示している。勿論、実施例６の顕微鏡においてもＥ−ＣＡＲＳ光、Ｐ−ＣＡＲＳ光を検出できるように構成することは可能である。
また、実施例６の顕微鏡では、図９及び図１０に示した実施例４の顕微鏡におけるダイクロイックミラー４１，５２、及びバンドパスフィルタ７’に代えて、これらと光学特性が異なるダイクロイックミラー４１”，５２’、及びバンドパスフィルタ７’”が設けられているとともに、ダイクロイックミラー４１”の透過側光路には、図９及び図１０に示した実施例４の顕微鏡におけるダイクロイックミラー５１、及び単光子用レーザ発生手段５７に代えて、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と波長が重ならない波長帯域の２光子励起蛍光のみを抽出するためのバンドパスフィルタ７０と、２光子励起蛍光部分検出手段９”が設けられている。
ダイクロイックミラー４１”は、第二高調波と２光子励起蛍光及びコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を透過し、単光子励起光の波長、及びポンプ光の波長以上の波長の光を反射する光学特性を有している。
ダイクロイックミラー５２’は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光よりも短い波長の光を透過し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光以上の波長の光を反射する光学特性を有している。
バンドパスフィルタ７’”は、第二高調波の波長帯域の光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断する光学特性を有している。
バンドパスフィルタ７０は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と重ならない波長帯域の２光子励起蛍光のみを透過し、それ以外の波長の光を遮断する光学特性を有している。
その他の構成は、実施例４の顕微鏡とほぼ同じである。
このように構成された実施例６の顕微鏡によれば、観察対象の関心領域に応じて観察手法を切替えることができる。
例えば、第二高調波、２光子励起蛍光、及びコヒーレントラマン散乱光による観察を並行して行う場合は、コントローラ６２及び音響光学素子６３，６４，６５を介して、第一のパルスレーザ発生手段（ポンプ光発生手段）１’と、第二のパルスレーザ発生手段（ストークス光発生手段）２’をオンにし、単光子励起用パルスレーザ発生手段６５をオフにするとともに、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３をオンにする。すると、第一のパルスレーザ発生手段１’からポンプ光が変調されて発せられ、ミラー６７で反射して、ハーフミラー６８に入射するとともに、第二のパルスレーザ発生手段からストークス光が発せられ、ハーフミラー６８に入射する。ハーフミラー６８を透過したポンプ光とハーフミラー６８を透過したストークス光は、同一光路を通る光として合成され、ミラー６９、ダイクロイックミラー４１”、ガルバノミラー１５，１６、対物レンズ１７を経て、標本４内の所定の箇所を照射する。
標本４は、ポンプ光とストークス光とが照射されることによりコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発する。また、標本４は、ストークス光を照射されることにより、ストークス光の半分の波長の第二高調波を発する。さらに、標本４は、ストークス光を照射されることにより、２光子励起現象を生じ、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光や第二高調波に遅れたタイミングで蛍光を発する。このとき、ポンプ光には変調がかかっているため、発生するコヒーレントストークスラマン散乱光にも変調がかかる。一方、ストークス光には変調がかかっていないため、発生するストークス光の第二高調波及び２光子励起蛍光には変調がかからない。
照射光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、反射される方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ１７、ガルバノミラー１６，１５を経て、ダイクロイックミラー４１”に入射する。ダイクロイックミラー４１”に入射した光のうち、第二高調波と２光子励起蛍光及びコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、ダイクロイックミラー４１”を透過し、ポンプ光の波長以上の波長の光がダイクロイックミラー４１”で反射される。ダイクロイックミラー４１”を透過した光は、バンドパスフィルタ７０に入射する。バンドパスフィルタ７０に入射した光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と重ならない波長帯域の２光子励起蛍光のみがバンドパスフィルタ７０を透過し、それ以外の波長の光がバンドパスフィルタ７０で遮断される。バンドパスフィルタ７０を透過した光は、検出手段９”で検出される。これにより、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と重ならない波長帯域の２光子励起蛍光が検出されることになる。
照射光を照射されることにより標本４から発する光及び標本４を透過又は反射する光のうち、透過する方向に向かう標本４からの光は、対物レンズ３５を通り、ダイクロイックミラー５２’に入射する。ダイクロイックミラー５２’に入射した光のうち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光よりも短い波長の光がダイクロイックミラー５２’を透過し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光以上の波長の光がダイクロイックミラー５２’を反射する。
ダイクロイックミラー５２’を透過した光は、バンドパスフィルタ７’”に入射する。バンドパスフィルタ７’”に入射した光のうち、第二高調波の波長帯域の光のみがバンドパスフィルタ７’”を透過し、それ以外の波長の光がバンドパスフィルタ７’”で遮断される。バンドパスフィルタ７’”を透過した第二高調波は、検出器１０’で検出される。
ダイクロイックミラー５２’で反射された光は、検出器２４のミラー２６に入射し、分散素子２７、分散投影レンズ２８、遮光部材２９を介して、コヒーレントストークスラマン散乱光と波長が重なる２光子励起蛍光、及びコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が、共に検出手段８’で受光される。
検出手段８’で受光された信号は、光電変換され、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３に送られる。ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３に送られた信号は、変調がかけられたＡＣ成分の信号と、変調がかけられていないＤＣ成分の信号とに分離して検出される。これにより、変調がかけられたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と重なる波長帯域における変調がかけられていない２光子励起蛍光は、それぞれ分離して、抽出、検出されることになる。
このように実施例７の顕微鏡は、第二高調波、２光子励起蛍光、及びコヒーレントラマン散乱光による観察手法を並行して用いて観察することができる。しかしながら、顕微鏡観察においては、観察対象の関心領域に応じて上記観察手法のすべてを必要としない場合がある。また、レーザパルス照射手段によるレーザ光の照射は標本へダメージを与えるとともに、更には、蛍光の退色の原因にもなる。このため、レーザパルス照射手段による照射は観察手法に応じて極力少なくするのが望ましい。
しかるに、実施例６の顕微鏡によれば、レーザコンバイナ６１とコントローラ６２を備えて観察に必要なレーザ光を選択することができるようにしたので、観察対象の関心領域に応じた観察手法に合わせてレーザ光の照射を必要最低限に抑えることができる。
観察手法に応じたレーザ光の切替えは、コントローラ６２を介して音響光学素子６３，６４，６６を駆動することにより照射すべきレーザパルス照射手段１’，２’，６５の組合せを切替えて行う。実施例６の顕微鏡における各観察手法と、それらに対応して選択されるレーザパルス発生手段及び検出手段の組合せを表１に示す。なお、表１中、ＣＡＲＳはコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、２−Ｐは２光子励起蛍光観察、ＳＨＧは第二高調波観察、１−Ｐは単光子励起蛍光観察を示している。
表１に示すように、第二のパルスレーザ（ストークス光）発生手段２’のみをオンにすれば、第一のパルスレーザ（ポンプ光）発生手段１’をオフにしても、検出手段９”で透過２光子励起蛍光、検出手段８’で落射２光子励起蛍光、検出手段７’”で透過第二高調波が、それぞれ検出できる。なお、ポンプ光とストークス光のいずれかをオフとした場合は、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器５３もオフとなり、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光と波長が重ならない波長帯域の２光子励起蛍光又は単光子励起蛍光は、表１に示すように、検出手段８’で検出される。
このように、実施例６の顕微鏡によれば、観察対象における関心領域に応じて必要最小限のレーザ照射光量で観察手法を切替えることができる。
なお、実施例６の顕微鏡では、レーザコンバイナ６１及びコントローラ６２を、ＣＡＲＳ光が検出可能な構成の顕微鏡に用いたが、実施例１又は２に示したようなＣＳＲＳ光が検出可能な構成の顕微鏡に用いても良い。
図１５は本発明の実施例７にかかる顕微鏡の概略構成図、図１６は実施例７の顕微鏡の画像表示装置で表示される画像における各観察光の表示形態の例を示す説明図であり、(a)は各観察手法による像を全画面に表示して切替える場合、(b)は表示画面内における観察対象の関心領域毎にコヒーレントラマン散乱光、第二高調波、２光子励起蛍光の像をスキャンした場合、(c)は、表示画面内における観察対象の同一関心領域内で異なる観察手法を組み合わせてスキャンした場合を示している。
実施例７の顕微鏡は、実施例６の顕微鏡の構成に加えて、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段、２光子励起蛍光検出手段、第二高調波検出手段で検出した信号を処理する画像処理装置８０と、画像処理装置８０で処理された画像を表示する画像表示装置８１を有している。
また、コントローラ６２は、顕微鏡本体に備わるガルバノミラー１５，１６に接続されている。
そして、コントローラ６２は、画像処理装置８０及び画像表示装置８１を介して画面内において所望の部位にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光による観察像、２光子励起蛍光による観察像、第二高調波による観察像を表示するように、レーザコンバイナ６１とガルバノミラー１５，１６とを制御する機能を備えている。
このように構成された実施例７の顕微鏡によれば、観察対象関心領域に応じて一つの表示画面で多様な観察手法を用いた観察を行うことができる。
例えば、観察手法毎にガルバノミラー１５，１６を介して観察対象領域全体をシーケンシャルスキャンさせることができる。このようにすれば、図１６(a)に示すように、画像表示装置８１の表示画面毎に２光子励起蛍光、第二高調波、ＣＡＲＳ光又はＣＳＲＳ光、単光子励起蛍光のそれぞれの像を切替えて表示することができる。
また、例えば、観察対象の関心領域毎に観察手法を切替えるとともに、ガルバノミラー１５，１６を介してベクトルスキャンすることができる。このようにすれば、図１６(b)に示すように、画像表示装置８１の表示画面内において観察対象の関心領域毎に２光子励起蛍光、第二高調波、ＣＡＲＳ光又はＣＳＲＳ光、単光子励起蛍光の像を表示することができる。
また、例えば、観察対象の関心領域毎に複数の観察手法を組み合わせて切替えるとともに、ガルバノミラー１５，１６を介してベクトルスキャンすることができる。このようにすれば、図１６(c)に示すように、例えば、観察対象の関心領域毎にＦ−ＣＡＲＳ光と第二高調波、Ｅ−ＣＡＲＳ光と２光子励起蛍光というように、画像表示装置８１の表示画面内において観察対象の関心領域毎に２光子励起蛍光、第二高調波、ＣＡＲＳ光又はＣＳＲＳ光、単光子励起蛍光のうち所望の観察光の像を組み合わせて表示することができる。
このため、実施例７の顕微鏡によれば、例えば、一つの生体標本に対し、単光子励起蛍光で表層を、２光子励起蛍光で深層を、第二高調波でコラーゲンや繊維膜を、ＣＡＲＳ，ＣＳＲＳでタンパク質や分子を同一画面内に表示させ、あるいは画面毎に切替え表示させて観察することができる。
なお、ガルバノミラー１５，１６による各観察光の像を得るための照射光の走査方法は、上述した観察対象領域全体のシーケンシャルスキャン、観察対象の関心領域毎のベクトルスキャンのいずれでもよい。
観察対象領域全体をシーケンシャルスキャンした場合は、観察画像のクロストークを少なくすることができる。
また、観察対象の関心領域毎にベクトルスキャンした場合には、処理速度が速くなる。
また、ベクトルスキャンとしては、ポイントスキャン、フリーラインスキャン、トルネードスキャン等のいずれも用いることができる。
さらに、観察手法に応じて、例えば、シーケンシャルスキャンの各画面毎、あるいはベクトルスキャンの各ＲＯＩ毎にガルバノミラー１５，１６の走査速度を変えることができるようにコントローラ６２で制御するとよい。
観察手法によって検出される光量が異なる。このため、観察手法に関係なく走査速度を同じにした場合には、観察手法によって検出される光量が不足し、或いは過度になる場合がある。走査速度を変えることができるようにすれば、検出される光量が調整され、各観察手法による検出光像が観察しやすくなる。
また、同様の目的のために、観察手法に応じて、ガルバノミラー１５，１６による走査回数を異ならせてもよい。
あるいは、観察手法に応じてレーザ光の照射出力を変えるようにしてもよい。レーザの出力は、パルスレーザ発生手段自体で調整する、或いは、音響光学素子等を用いて調整することができるようにするとよい。
更には、観察手法に応じて、パルスピッカー等を用いてレーザ光のパルスを間引くようにしてもよい。
なお、実施例７の顕微鏡は、実施例６の顕微鏡を基に画像処理装置８０、画像表示装置８１等を付加して構成したが、本発明の顕微鏡は、このような構成に限定されるものではなく、上記いずれの実施例の顕微鏡を基に構成してもよい。
ＣＡＲＳにおけるポンプ光、ストークス光、及びアンチストークス光と分子の振動数の関係を示す説明図である。 ＣＳＲＳにおけるポンプ光、アンチストークス光、及びストークス光と分子の振動数の関係を示す説明図である。 本発明の実施例１にかかる顕微鏡の概略構成図である。 実施例１の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。 本発明の実施例２にかかる顕微鏡の概略構成図である。 実施例２の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。 本発明の実施例３にかかる顕微鏡の概略構成図である。 実施例３の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。 本発明の実施例４にかかる顕微鏡の概略構成図である。 実施例４の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。 本発明の実施例５にかかる顕微鏡の概略構成図である。 実施例５の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。 本発明の実施例６にかかる顕微鏡の概略構成図である。 実施例６の顕微鏡に用いるダイクロイックミラー、バンドパスフィルタの光学特性を示すグラフである。 本発明の実施例７にかかる顕微鏡の概略構成図である。 実施例７の顕微鏡の画像表示装置で表示される画像における各観察光の表示形態の例を示す説明図であり、(a)は各観察手法による像を全画面に表示して切替える場合、(b)は表示画面内における観察対象の関心領域毎にコヒーレントラマン散乱光、第二高調波、２光子励起蛍光の像をスキャンした場合、(c)は、表示画面内における観察対象の同一関心領域内で異なる観察手法を組み合わせてスキャンした場合を示している。
符号の説明
１，１’，１” 第一のパルスレーザ発生手段
２，２’，２” 第二のパルスレーザ発生手段
４ 標本
６，６ａ，６ｂ，７，７’，７”，７’”，７ａ，７ｂ，７０ バンドパスフィルタ
８，８’，９，９’，９”，９ａ，９ｂ，１０，１０’，１０ａ，１０ｂ 検出手段（ディテクタ）
１１，１３，２２，２６，４４，４５，６７ ミラー
１２，２３，６８，６９ ハーフミラー
１４，３０，３６ａ，３６ｂ，４１，４１’，４１”，４３，４３’，４８，４８’，５１，５２，５２’ ダイクロイックミラー
１５，１６ ガルバノミラー
１７，１８ 対物レンズ
２４ 分光器
２５ レンズ
２７ 分光手段（グレーティング）
２８ 分散投影レンズ
２９ 遮光部材
３２，３３，４９，５４，５５ 偏光子
３４，４７，５６ 検光子
４２ 偏光ビームスプリッタ
４６ カーゲート
５０ 変調器
５３ ｌｏｃｋ-ｉｎ検出器
５７，６５ 単光子励起用レーザ光発生手段
６１ レーザコンバイナ
６２ コントローラ
６３，６４，６６ 音響光学素子
８０ 画像処理装置
８１ 画像表示装置
１００ 基底状態
１０１ 振動状態
１０２，１０２’ ポンプ光
１０３ ストークス光
１０４ アンチストークス光
１０５ 分子

Claims (16)

  1. 第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、
    第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、
    前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、
    前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、
    前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する多光子励起蛍光抽出手段と、
    前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する第二高調波抽出手段と、
    前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、
    前記多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する多光子励起蛍光検出手段と、
    前記第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する第二高調波検出手段と、
    を有しており、
    前記コヒーレントラマン散乱光と、前記多光子励起蛍光と、前記第二高調波とを同時に検出することを特徴とする顕微鏡。
  2. 第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、
    第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、
    前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、
    前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する落射多光子励起蛍光抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する透過第二高調波抽出手段と、
    前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、
    前記落射多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する落射多光子励起蛍光検出手段と、
    前記透過第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する透過第二高調波検出手段と、
    を有しており、
    前記コヒーレントラマン散乱光と、前記落射多光子励起蛍光と、前記透過第二高調波とを同時に検出することを特徴とする顕微鏡。
  3. 第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、
    第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、
    前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、
    前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する落射第二高調波抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する透過多光子励起蛍光抽出手段と、
    前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、
    前記透過多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する透過多光子励起蛍光検出手段と、
    前記落射第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する落射第二高調波検出手段と、
    を有しており、
    前記コヒーレントラマン散乱光と、前記透過多光子励起蛍光と、前記落射第二高調波とを同時に検出することを特徴とする顕微鏡。
  4. 第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、
    第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、
    前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、
    前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみ、又は、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを切替可能に抽出する落射第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみ、又は、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを切替可能に抽出する透過第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段と、
    前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、
    前記落射第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段を介して抽出された光を検出する落射切替抽出光検出手段と、
    前記透過第二高調波多光子励起蛍光切替抽出手段を介して抽出された光を検出する透過切替抽出光検出手段と、
    を有しており、
    前記コヒーレントラマン散乱光と、前記落射多光子励起蛍光又は前記透過多光子励起蛍光と、前記落射第二高調波又は前記透過第二高調波とを同時に検出することを特徴とする顕微鏡。
  5. 第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、
    第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、
    前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を合成して標本に照射可能に構成された照射手段と、
    前記照射手段を介して光を照射された標本からの光から、コヒーレントラマン散乱光のみを抽出するコヒーレントラマン散乱光抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する落射多光子励起蛍光抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する落射第二高調波抽出手段と、
    前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段を介して抽出されたコヒーレントラマン散乱光を検出するコヒーレントラマン散乱光検出手段と、
    前記落射多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する落射多光子励起蛍光検出手段と、
    前記落射第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する落射第二高調波検出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した多光子励起蛍光のみを抽出する透過多光子励起蛍光抽出手段と、
    前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光から、前記第二のパルス光の該標本への照射により発生した第二高調波のみを抽出する透過第二高調波抽出手段と、
    前記透過多光子励起蛍光抽出手段を介して抽出された多光子励起蛍光を検出する透過多光子励起蛍光検出手段と、
    前記透過第二高調波抽出手段を介して抽出された第二高調波を検出する透過第二高調波検出手段と、
    を有しており、
    前記コヒーレントラマン散乱光と、前記落射多光子励起蛍光と、前記落射第二高調波と、前記透過多光子励起蛍光と、前記透過第二高調波とを同時に検出することを特徴とする顕微鏡。
  6. 前記第二のパルス光の波長が、前記第一のパルス光の波長の近傍であって該第一のパルス光の波長よりも短い波長の所定波長帯域を走査され、
    前記コヒーレントラマン散乱光が、コヒーレントストークスラマン散乱光であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の顕微鏡。
  7. 前記第二のパルス光の波長が、前記第一のパルス光の波長の近傍であって該第一のパルス光の波長よりも長い波長の所定波長帯域を走査され、
    前記コヒーレントラマン散乱光が、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光であり、
    少なくとも一部の波長帯域で波長が重なり得る、前記多光子励起蛍光と前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを分離する多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段を備えていることを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡。
  8. 前記多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段が、
    前記多光子励起蛍光と前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光とを時間分解で分離する時間分解分離手段を有する前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光抽出手段で構成されていることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
  9. 前記時間分解分離手段が、
    斜めに光が入射したときに、透過する直線偏光の偏光方向を変えるカーゲートと、
    前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光が前記カーゲートへ入射するタイミングと同じタイミングでもって、前記第二のパルス光を前記カーゲートに斜めに入射させるゲート光入射手段と、
    前記多光子励起蛍光を直線偏光に変換する第一の偏光部材と、
    前記カーゲートを透過することによって偏光方向が変えられた直線偏光を透過し、該カーゲートを透過したときに偏光方向が変わらない直線偏光を遮断する第二の偏光部材と、
    を有して構成されていることを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡。
  10. 前記多光子励起蛍光ＣＡＲＳ光分離手段が、
    前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を変調した状態で発生させる変調手段と、
    前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光検出手段と前記多光子励起蛍光検出手段とを兼ねていて、前記変調されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光と前記多光子励起蛍光とを共に受光し、受光した光から変調成分と非変調成分とを分離して検出する検出装置とで構成されていることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
  11. 前記変調手段が、前記第一のパルス光を変調する変調器で構成され、
    前記検出装置が、ｌｏｃｋ−ｉｎ検出器で構成されていることを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡。
  12. 前記第一のパルス光で所定波長帯域を走査するとともに、前記第二のパルス光を多光子励起に最適な波長に固定したことを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の顕微鏡。
  13. 前記第一のパルスレーザ発生手段、及び前記第二のパルスレーザ発生手段のオンオフを切替える切替手段を備えたレーザ光選択手段と、前記レーザ光選択手段を制御する制御手段を備えたことを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の顕微鏡。
  14. 前記コヒーレントラマン散乱光検出手段、前記多光子励起蛍光検出手段、及び前記第二高調波検出手段を介して検出された信号を処理する画像処理装置と、
    前記画像処理装置で処理した画像を表示する画像表示装置と、
    前記標本に照射する光を２次元方向に走査する走査手段を有し、
    前記制御手段が、前記画像処理装置及び前記画像表示装置を介して該画像表示装置の表示画面における前記標本の関心領域が表示される位置に前記コヒーレントラマン散乱光による観察像、前記多光子励起蛍光による観察像、及び前記第二高調波による観察像のうち複数の像を並行して観察可能に或いはいずれかの像を選択して観察可能に表示するように、前記レーザ光選択手段を制御することを特徴とする請求項１３に記載の顕微鏡。
  15. 前記第一のパルスレーザ発生手段が、パルス幅がピコ秒のパルスレーザビームを発振するパルスレーザ光源であり、
    前記第二のパルスレーザ発生手段が、パルス幅がフェムト秒のパルスレーザビームを発振するパルスレーザ光源であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の顕微鏡。
  16. 前記コヒーレントラマン散乱光抽出手段は、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、前記照射手段を介して照射された光が反射される方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光と前記照射手段を介して照射された光が透過する方向へ向かう該標本からの光からのコヒーレントラマン散乱光の両方のコヒーレントラマン散乱光のみの抽出と、を切替可能に構成されていることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の顕微鏡。
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