JP2003177329A - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 構成簡易にして、小型化の促進を図り得、且
つ、正確なスペクトル特性データの検出を実現し得るよ
うにした走査型レーザ顕微鏡を提供すること。 【解決手段】 レーザ光を試料上に集光して、前記試料
からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズ２６と、前
記レーザ光を前記試料上に２次元的に走査させる光走査
手段２５と、前記蛍光又は反射光の光路上に配置され、
入射する蛍光又は反射光から印加される高周波電圧の周
波数に対応した波長の光のみを選択して偏向させる音響
光学素子３１１と、前記音響光学素子を経由した光を検
出する光検出手段３１２と、前記音響光学素子に印加す
る高周波電圧の周波数を切換設定する周波数走査手段４
０とを備えた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ走査型顕微
鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、蛍光試薬のラインナップの増加及
び標識状態の変化とともに、さまざまな検出ファクター
を測定することが望まれている。それらは蛍光強度に加
え、蛍光のスペクトルや偏向特性を効率よく検出し、取
得データとしての定量化も望まれている。更には、装置
としての小型化も期待されている。

【０００３】音響光学素子（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉ
ｃ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ：以下、本明細書に
おいて「ＡＯＴＦ」と称する）を用いた走査型レーザ顕
微鏡が知られている（特開２００１−１２４９９７参
照）。

【０００４】この走査型レーザ顕微鏡では、スペクトル
選択的要素（ＡＯＴＦ）の後方に光学的な部材が接続さ
れている。そして、ＡＯＴＦの１次回折光光路からレー
ザ光を入射することによって励起光を選択できる。これ
により、ＡＯＴＦが、顕微鏡からの蛍光を０次回折光の
光路上で検出器へ導くための高効率のビームスブリッタ
の機能を果している。更に、この特開２００１−１２４
９９７には、下記のような記載がある。ＡＯＴＦの分散
性あるいは複屈折率性を利用して、蛍光を異なる例えば
２つの偏光成分に分離することができる。この２つの偏
向成分のそれぞれの成分を検出することによって、偏光
子や検光子を必要としない走査型偏光レーザ顕微鏡にで
きる。

【０００５】しかし、特開２００１−１２４９９７によ
るＡＯＴＦと光学的部材の組合せでは、レーザの励起波
長に合わせた波長選択が可能ではあるが、蛍光に対する
波長選択となるような分光効果は実現されていない。ま
た、偏光成分の分離はＡＯＴＦが持つプリズムの複屈折
性を静的に利用して達成されているが、ＡＯＴＦの有す
る音響光学効果を積極的に利用していない。このため、
特開２００１−１２４９９７では、波長を選択しながら
（すなわち、分光しながら）、蛍光の偏光成分を検出す
ることはできない。

【０００６】従って、特開２００１−１２４９９７で波
長を選択するためには、ＡＯＴＦと光学的部材の更に後
方にマルチバンドの検出器及び格子分光計、プリズム分
光計といった分光計を置くことが必要なり、装置が大型
化することは避けられない。

【０００７】また、ＡＯＴＦを用いた顕微鏡が知られて
いる（ＵＳＰ５，８４１，５７７参照）。

【０００８】この顕微鏡では、ＡＯＴＦが照明光路中に
配置されている。そして、ＡＯＴＦで波長選択された互
いに偏光成分が異なる２つの出射光を合成手段を用いて
再び重ね合わせて１つの励起光として用いることによ
り、効率よく試料に励起光を照明することができる。ま
た、観察側にもＡＯＴＦを配置することにより、ＡＯＴ
Ｆで波長選択された試料からの蛍光をＣＣＤカメラにて
観察することができる。更には、ＵＳＰ５，８４１，５
７７には、２つのＡＯＴＦを用いて、分離された異なる
偏光成分を持つ光を再び光束として重ね合わせる手法
や、ダイクロイックミラーを用いて落射型蛍光照明を行
う方法についても記載されている。

【０００９】しかし、ＵＳＰ５，８４１，５７７は、蛍
光観察の照明方法に関し、走査型レーザ顕微鏡で波長選
択をしながらスペクトル・データを取得する構成ではな
い。観察光路中にＡＯＴＦを設けることによって、蛍光
観察をＣＣＤカメラで行うことができるが、走査型レー
ザ顕微鏡に適用した場合には、一方の１次回折光内に含
まれる偏光成分のみを検出することによる光損失と、こ
れによる実際のサンプルの蛍光強度を正しく反映できな
いという問題がある。

【００１０】更に、ＵＳＰ５，８４１，５７７では、所
望としない０次回折光をブロックするために、暗視野用
のコンデンサーレンズ、もしくは、光軸上でストッパー
となる部材や、分離された２つの光束を再び１つの励起
光として重ね合わせる合成手段等を用いる必要があり、
必然的に装置の構成が大型化する。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、構成簡易に
して、小型化の促進を図り得、且つ、高効率な分光がで
き、更には高速かつ高分解能な分光検出をも実現できる
走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記の課題を
解決するために次のような手段を講じた。

【００１３】本発明の第１の局面に係る走査型レーザ顕
微鏡は、レーザ光を試料上に集光して、前記試料からの
蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光
を前記試料上に２次元的に走査させる光走査手段と、前
記蛍光又は反射光の光路上に配置され、入射する蛍光又
は反射光から印加される高周波電圧の周波数に対応した
波長の光のみを選択して偏向させる音響光学素子と、前
記音響光学素子を経由した光を検出する光検出手段と、
前記音響光学素子に印加する高周波電圧の周波数を切換
設定する周波数走査手段と、を具備することを特徴とす
る。

【００１４】本発明の第２の局面に係る走査型レーザ顕
微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍
光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を
前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記
蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、
前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときに
は、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧
の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折
光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されな
いときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光
として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧
の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行
う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第
１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光
検出器と、を具備することを特徴とする。

【００１５】本発明の第３の局面に係る走査型レーザ顕
微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍
光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を
前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記
蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、
前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときに
は、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧
の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折
光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されな
いときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光
として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧
の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行
う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第
１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光
検出器と、を具備し、前記レーザ光源は、前記レーザ光
が変調されずに前記音響光学素子を透過して、前記対物
レンズに導かれるように、前記０次回折光の光路に配置
されている。

【００１６】本発明の第４の局面に係る走査型レーザ顕
微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍
光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を
前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記
蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、
前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときに
は、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧
の周波数に応じた波長の光を１次回折光に回折させると
共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射し
た前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前
記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを
制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部
と、前記１次回折光を受光する光検出器と、を具備し、
前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数
を掃引し、各周波数における前記光検出器の出力信号を
取得することによって、前記蛍光又は反射光のスペクト
ルデータを取得する。

【００１７】

【発明の実施の形態】図面を参照して本発明の実施の形
態を説明する。

【００１８】以下、本発明の実施形態について、図面を
参照して詳細に説明する。

【００１９】（第１の実施形態）図１は、本発明の第１
の実施形態に係る顕微鏡の要部を示す図である。図１に
おいて、走査ユニット２０には、コリメータレンズ２１
が設けられている。コリメータレンズ２１には、レーザ
光源２２から発振されたレーザ光がファイバ２３を介し
て導かれる。走査ユニット２０に導かれたレーザ光はコ
リメータレンズ２１により平行光に変換されて、ビーム
スプリッタ２４の反射光路に導かれる。なお、図１はシ
ステムの基本構成を表しており、レーザ光源２２に複数
の波長を持たせるために、マルチラインのレーザとした
り、複数のレーザ光源を用いて構成してもよく、それに
応じてダイクロイックミラー２４を複数兼ね備えてもか
まわない。

【００２０】ここで、レーザ光源２２から発振するレー
ザ光の波長は、Ａｒレーザの４８８ｎｍであるものと仮
定し、ビームスプリッタ２４の波長特性は、４８８ｎｍ
を反射し、４８８ｎｍより長い波長（５００ｎｍ〜７０
０ｎｍ）は透過するものと仮定する。ビームスプリッタ
２４で反射された４８８ｎｍのレーザ光は、光走査手段
２５を構成するガルバノメータスキャナである光走査ミ
ラー２５１、２５２により偏向される。光走査ミラー２
５２で偏向されたレーザ光は、さらに、瞳投影レンズ２
６１、顕微鏡の結像レンズ２６２を介して対物レンズ２
６により試料２７上に集光されて照射される。

【００２１】光走査ミラー２５１、２５２は、レーザ光
が互いに直交する方向に偏向するように、レーザ光を走
査制御し、試料２７上に集光された光スポットが試料上
を２次元に走査する。そして、４８８ｎｍのレーザ光を
照射することにより、試料から発する４８８ｎｍより長
い波長の蛍光は、レーザ光と逆方向かつ同一の光路（す
なわち、対物レンズ２６、結像レンズ２６２、瞳投影レ
ンズ２６１）を進み、光走査ミラー２５２、２５１を反
射して、ビームスプリッタ２４の透過光路に導かれる。

【００２２】ビームスプリッタ２４の透過光路に導かれ
た蛍光は、反射ミラー１９で反射された後に、共焦点レ
ンズ２８により、共焦点ピンホール２９上に結像され
る。共焦点ピンホール２９を透過した蛍光は、レンズ３
０により平行光に変換される。平行光の光路上には、周
波数走査手段を構成する音響光学素子ユニット３１が光
路切換えミラー３２を介して配設される。

【００２３】光路切換えミラー３２は、平行光の光路上
の位置３２ａから図中破線で示す位置３２ｂに退避自在
に配設されている。光路切換えミラー３２は、位置３２
ｂに退避された状態で、当該光路に導かれた蛍光は、蛍
光波長域の光を透過し、レーザ波長（ここでは４８８ｎ
ｍ）をカットするバリアフィルタ３３を介して、光電子
増倍管を有する光検出器３４に導かれて光量が検出され
る。

【００２４】光検出器３４は、通常の走査型レーザ顕微
鏡の走査画像を取得するための検出器である。光検出器
３４は、１つの光スポットに対応する蛍光光量を、光走
査ミラー２５１、２５２の走査に同期して、順次、検出
する。そして、各光スポット位置の光量を図示しないモ
ニタの各ピクセル上に表示させることによって２次元画
像を得る。ここで得られる２次元画像は、各光スポット
位置から発する蛍光のうち、バリアフィルタ３３により
抽出された波長の範囲の光量の総和を示した画像であ
り、スペクトル特性データ等の細かい波長情報を含まな
い。

【００２５】音響光学素子ユニット３１は、例えば、音
響光学素子３１１（以下、「ＡＯＴＦ」と称する）と、
光検出手段としてのスペクトラム特性測定用の光検出器
（光電子増倍管）３１２とで構成される。ＡＯＴＦ３１
１は、通常、図示しない結晶と、ＲＦトランスデューサ
とを備えている。ＲＦトランスデューサに所望の周波数
の高周波電圧（ＲＦ）が印加されると、結晶の中に所望
の周波数の音波が発生する。ＲＦの周波数と入射する光
の波長との間で、ブラッグ反射の条件が満たされた波長
のみ、１次回折光として、偏向されて、光検出器３１２
で検出される。なお、検出器３１２として、光電子変換
してシグナルを検出できるＰＭＴ以外のその他の同等の
効果を得るデバイスを用いてかまわない。

【００２６】１つのＲＦの周波数で１次回折光として偏
向される光の波長幅は、通常３ｎｍ以下であり、その他
の光の波長は、ＡＯＴＦ３１１の結晶を透過して光路に
案内される。そこで、ＲＦの周波数を順次、切換え、又
は走査させて、各周波数毎の光検出器３１２で検出され
る光量を測定していくことにより、蛍光のスペクトル特
性を検出することが可能となる。

【００２７】ここで、図１に示す制御部４０は、光走査
ミラー２５１、２５２、光検出器３４、光検出器３１
２、ＲＦトランスデューサを図示しない指令情報に基づ
いて制御する。制御部４０は、以下に示す３つの主な機
能を備えている。

【００２８】（１） 光走査ミラー２５１、２５２の走
査のタイミングに合せて（同期して）、光検出器３４、
光検出器に入射する光量を検出する機能。

【００２９】（２） ＲＦの周波数の走査のタイミング
に合せて（同期して）、光検出器３４、光検出器３１２
の光量を検出する機能。

【００３０】（３） 光走査ミラー２５１、２５２の走
査のタイミングに合わせて（同期して）、ＲＦトランス
デューサのＲＦの周波数を走査し、かつ、ＲＦトランス
デューサのＲＦの周波数の走査のタイミングに合せて
（同期して）、光検出器３１２の光量を検出する機能。

【００３１】上記の構成において、音響光学素子ユニッ
ト３１により、スペクトル特性データを測定する動作に
ついて説明する。先ず、音響光学素子ユニット３１を使
用する場合には、光路切換えミラー３２が、図示しない
切換え機構により位置３２ａに移動される。これによ
り、レーザ光源２２から発したレーザ光が、光走査ミラ
ー２５１、２５２により偏向される。これにより、試料
２７上の任意の１点に光スポットが結ばれると、試料２
７から発した蛍光は、ビームスプリッタ２４等を介し
て、共焦点ピンホール２９を透過する。そして、共焦点
スポット２９を透過した蛍光は、レンズ３０により平行
光に変換され、光路切換えミラー３２により反射され
て、ＡＯＴＦ３１１に入射する。

【００３２】ここで、ブラッグ反射の条件を満たす波長
に対するＲＦの周波数の関係は、以下のようになってい
るとする。４９２ｎｍで１３２ＭＨｚ、４９６ｎｍで１
３１ＭＨｚ、５００ｎｍで１３０ＭＨｚ、以下、４ｎｍ
波長が長くなる度に１ＭＨｚづつＲＦの周波数が減少し
ていき、６５２ｎｍで９２ＭＨｚ、６５６ｎｍで９１Ｍ
Ｈｚ、６６０ｎｍで９０ＭＨｚであるものと仮定する。
なお、ＲＦの周波数と波長の関係は、実際には、ＡＯＴ
Ｆ３１１の結晶の波長による屈折率差等により非線型関
係となる場合があるが、ここでは、簡略化のため線型関
係として説明する。

【００３３】ＡＯＴＦ３１１でＲＦトランスデューサに
よりＲＦの周波数、１３２ＭＨｚを結晶にかけると、こ
の周波数に対応する波長、４９２ｎｍの光が１次回折光
として偏向される。その結果、４９２ｎｍ付近の波長の
光の強度が光検出器３１２で検出される。そして、ＲＦ
の周波数を４９６ｎｍの波長に対応する周波数、１３１
ＭＨｚを結晶にかけると、４９６ｎｍの光が１次回折光
として偏向される。その結果、４９６ｎｍ付近の波長の
強度が光検出器３１２で検出される。

【００３４】以下、同様に、ＲＦの周波数を１ＭＨｚ毎
に、６６０ｎｍのＲＦの周波数に対応する９０ＭＨｚま
で、順次、切換えて（走査して）、各周波数に対応す
る、波長の光の強度を光検出器３１２で検出する。以上
の工程により、図２に示すように、４９２ｎｍから６６
０ｎｍまでの蛍光のスペクトル特性データが取得され
る。なお、ここで得られたスペクトル特性データは、光
スポットが結ばれた試料上の１点から発する蛍光のデー
タである。

【００３５】試料の広い範囲（走査画像取得範囲）から
のスペクトル特性データを得る場合には、光走査ミラー
２５１、２５２を走査して、試料２７上に結んだ光スポ
ットを順次走査しながら、試料２７上の１点の光スポッ
トからの蛍光のスペクトル特性データを求める上述の工
程（ＲＦの周波数の走査と光検出器３１２による各ＲＦ
の周波数に対応する波長の光量測定）を実施する。この
際、制御部４０は、光走査ミラー２５１、２５２と、Ｒ
Ｆトランスデューサの周波数走査と、光検出器３１２に
よる光の測定とを、同期させて制御する。

【００３６】ここで、各ピクセル毎のスペクトル特性デ
ータの取得時間について考える。例えば、５１２×５１
２ピクセルの画像で、１つのＲＦの周波数に対応する１
つの波長の光検出器での検出時間を１μｓｅｃとし、Ｒ
Ｆの周波数の切換え時間を１μｓｅｃとする。ＲＦの周
波数は、１３２ＭＨｚから９０ＭＨｚまで１ＭＨｚ毎に
切換えていくので、１つのピクセルでのデータ取得時間
は、（１３２−９０）×２＋１＝８５μｓｅｃとなり、
全ピクセルでのデータ取得時間は、８５（μｓｅｃ）×
５１２×５１２＝２２．３ｓｅｃとなる。光走査ミラー
２５１、２５２の帰線期間等の余裕を考慮しても３０秒
以内にはデータが取得される。

【００３７】なお、上記の説明では、ＲＦの周波数を１
ＭＨｚに変化させて、４９２ｎｍから４ｎｍづつ６６０
ｎｍまで測定して場合について述べたが、ＲＦの周波数
は、ＡＯＴＦ３１１の波長分解能や全体のデータ取得時
間、必要なスペクトル範囲、刻み幅等を考慮して適宜決
めれば良いことは言うまでもない。そして、励起光であ
るレーザ波長の４８８ｎｍより長い波長域でデータを取
得したのは、蛍光が４８８ｎｍより長い波長で発するか
らであることはいうまでもない。

【００３８】また、２種の蛍光色素で染色された２重染
色試料を測定する時は、長い波長の励起光が短い波長の
励起光による蛍光と重なってくるので、この場合は、長
い波長の励起光の波長に対応するＲＦの周波数は抜かし
て測定した方がよい。これは励起光の反射光は、蛍光波
長よりはるかに強度が高いことによる。

【００３９】上記のように、第１の実施形態に係る走査
型レーザ顕微鏡においては、ＡＯＴＦ３１１を蛍光光路
上に配置して、ＡＯＴＦ３１１の高周波電圧の周波数を
切換設定している。これにより、それぞれの波長毎にＡ
ＯＴＦ３１１を経由した光量を検出して蛍光のスペクト
ル特性データを検出することができる。

【００４０】従って、第１の実施形態では、従来の方法
である特開２０００−５６２４４の図６に記載されてい
るような、「プリズム等の分散手段と、分散された蛍光
を集光してスペクトル列を結像させる集光手段と、検出
する波長範囲を選択するためにスペクトル列結像位置に
配置された電気的に制御可能な微小偏向ミラー群からな
るデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）」からなる、複雑
な構造による蛍光スペクトル特性取得の方法を音響光学
素子１つに置き換えることが可能となる。この結果、簡
単な構成で正確なスペクトルデータを音響光学素子の周
波数を切り換えることで高速に取得でき、かつ、小型化
を促進できる。また、特開２０００−５６２４４の図７
のように、走査装置部の小型化のために分光部をファイ
バにより走査装置に接続する構成で生じるファイバ伝送
による光損失も抑えることができる。

【００４１】さらに、第１の実施形態によれば、ＲＦの
周波数の切換え速度が１００ｎｓｅｃ〜１μｓｅｃであ
ることから、高速にスペクトル特性のデータを取得する
ことができるので、迅速かつ高精度な検出が実現され
る。

【００４２】また、第１の実施形態に係る走査型レーザ
顕微鏡は、音響光学素子ユニット３１を走査ユニット２
０から着脱可能に構成している。これにより、通常の走
査型レーザ顕微鏡としての蛍光検出動作のみの装置と、
通常の蛍光検出と蛍光のスペクトル特性データの双方の
検出を選択的に行うことが可能な本実施形態の装置と
で、通常の走査型レーザ顕微鏡の部分を共通化できる。
このため、装置のシステムアップに容易に対応できる。

【００４３】なお、ＵＳＰ５，３７７，００３、ＵＳＰ
５，５２８，３６８には、ＡＯＴＦを用いて、単色の照
明を行うか、または細いバンド幅で観察光を選択して、
蛍光観察やラマン分光をＣＣＤのような２次元検出器を
用いて行う方法が開示されている。

【００４４】これらにおいては、ＡＯＴＦの主要部品で
ある複屈折性を持ったプリズム（主にＴｉＯ_２などが用
いられる）に周波数が印加された際、プリズム自体に内
部歪が発生する。この内部歪は、ＣＣＤのような２次元
検出が出来る構成に影響を及ぼす。周波数印加されたプ
リズムの内部歪に応じて、観察すべきＡＯＴＦを透過し
た画像に劣化が生じる。

【００４５】本発明においては、以下の実施形態におい
ても同様に、ＣＣＤのような２次元検出を行うのではな
く、試料表面を走査して、試料の一点から発する光の量
を検出している。従って、本発明においては、単に光量
を検出しているだけなので、このような画像劣化は生じ
ない。

【００４６】（第２の実施形態）図３を参照して、第２
の実施形態を説明する。図３は、第２の実施形態に係る
走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図である。なお、
図３においては、図１と同一部分については、同一符号
を付して、その説明を省略する。

【００４７】第２の実施形態では、ＡＯＴＦ３１１を、
図１で説明した光路切換えミラー３２の配置位置に配置
することにより、ＡＯＴＦ３１１が、光路切換えミラー
３２としての機能も有している。

【００４８】上記の構成において、光検出器３４により
通常の走査画像を取得する時には、ＡＯＴＦ３１１には
ＲＦの周波数をかけずに、該ＡＯＴＦ３１１を停止させ
る。これにより、全ての蛍光波長は、ＡＯＴＦ３１１を
透過して、バリアフィルタ３３を介して、光検出器３４
に導かれて検出される。

【００４９】そして、蛍光のスペクトル特性データを取
得する場合には、第１の実施形態と略同様に波長のＲＦ
の周波数を音響光学素子３１１にかける。これにより、
蛍光波長は、上述したようにＡＯＴＦ３１１により偏向
されて光検出器３１２に導かれ、検出される。

【００５０】第２の実施形態によれば、ＡＯＴＦ３１１
に対して全くＲＦの周波数をかけずに光を、光検出器３
４で検出するか、ＲＦの周波数をかけて光検出器３１２
で検出するかにより、走査画像あるいはスペクトル特性
データを取得することが可能となる。これにより、第１
の実施形態に比して光路切換えミラー３２が節約できる
ので、より構成の簡単化が図れる。

【００５１】上記の第１及び第２の実施形態において、
次のような変形が可能である。例えば、第１及び第２の
実施の形態では、ＲＦの周波数により回折される１次回
折光を光検出器３１２で測定することにより、スペクト
ル特性データを取得していたが、音響光学素子３１１を
透過する０次回折光を、光検出器３４で検出しても良
い。この場合、バリアフィルタ３３を透過する蛍光波長
の光量の総和から、ＲＦの周波数に対応する蛍光の波長
（１次回折光として回折する）の光量を差し引いた光量
が、各ＲＦの周波数毎に光検出器３１２により検出され
ていくことになる。これらの値を、反転処理することに
より、スペクトル特性データを得ることができる。この
ようにすれば、１次回折光を検出する時より、蛍光光量
がはるかに大きくなるため、高精度なデータの取得が可
能となる。

【００５２】（第３の実施形態）図４は、本発明の第３
の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す
図である。図４における、走査型レーザ顕微鏡は、光源
部５０と、走査光学系５１と、顕微鏡部５２と、共焦点
光学系５３と、ＡＯＴＦ３１１と、検出器３１２ａと３
１２ｂと、制御部４０と、信号処理部４５を備えてい
る。なお、図４において、図１又は図２と同じ部分に
は、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。

【００５３】図４に示す走査型レーザ顕微鏡と、図１の
それとが異なる点は、検出器３１２ａと３１２ｂとで、
ＡＯＴＦ３１１による±１次回折光を検出するようにし
た点である。このため、新たに、信号処理部４５を備え
ている。

【００５４】光源部５０からの光は、ダイクロイックミ
ラー２４によって励起光として、走査光学系５１を介し
て顕微鏡部５２に導かれ、試料２７を励起する。蛍光試
薬で標識された試料２７は励起光によって励起される。
試料２７より発した蛍光は顕微鏡部５２及び走査光学系
５１を介してダイクロイックミラー２４で蛍光として分
離される。次に共焦点光学系５３を通過し、ＡＯＴＦ３
１１に至る。ＡＯＴＦ３１１は図示されていないが、所
望の波長乃至波長幅を選択するためにＡＯＴＦ３１１に
特定の周波数を印加する固有のドライバが準備されてい
る。蛍光は、ＡＯＴＦによって選択された波長成分であ
り、かつ、お互いに直交した偏光成分となる、偏向され
た±１次回折光と、更に波長選択されず、また、偏向さ
れない成分となる０次回折光の３つの光路に分離され
る。

【００５５】±１次回折光はそれぞれ検出器３１２ａ、
３１２ｂ（以下、「ＰＭＴ」とも称する）によって受光
され光量が検出され、信号処理部４５でＰＭＴ３１２
ａ、３１２ｂからのシグナルを制御し、和信号や差信号
としてデータを作ることができる。

【００５６】このように、音響光学素子で印加される周
波数に対応した波長として異なる方向に偏向された２つ
の蛍光もしくは反射光光路にそれぞれ検出器を設け、そ
れら検出信号を、和信号や差信号などの合成信号として
扱えば所望の波長選択された蛍光もしくは反射光の総和
の蛍光強度等を効率よく取得できる。また独立信号とし
て扱えば所望の波長選択された蛍光もしくは反射光から
試料に由来した成分を取得することができる。これらは
電気的な操作で高速にでき、かつ切換も簡単に行うこと
ができる。

【００５７】ＡＯＴＦ３１１の操作は、図示されていな
いドライバと組み合わせて図５で示すように行われる。

【００５８】ドライバから印加された周波数に応じ、Ａ
ＯＴＦ３１１から、図５（ａ）で示すような波長特性を
有する１次回折光を得ることができる。ドライバからの
周波数が波長λ０に一致し、この周波数と波長依存する
回折効率の関係によって特定の波長帯域がスペクトルと
して得られ、ＡＯＴＦ３１１での波長分解能を決定する
ことができる。これらは、通常、ＡＯＴＦに入射する光
の大きさ、広がり、波長、偏光などの特性によって異な
るが、ここでは走査型共焦点レーザ顕微鏡を対象として
いるため、平行光の蛍光ビームを取り扱えばよいので、
数ｎｍ〜数十ｎｍレベルの比較的高い分解能を得ること
が出来る。また、ＡＯＴＦ３１１の音響光学効果に従っ
て、±１次回折光は上述したように選択されたほぼ同一
の波長特性を含み、更には正負それぞれの光路内でお互
いに直交した２つの偏光成分へと分離されて、それぞれ
検出される。この偏光分離の効果は、一般の偏光ビーム
スプリッタと類似している。これらにより、ランダム偏
光である蛍光を同一波長帯で２つの偏光成分に分離し、
選択波長も自由に設定することが可能となる。

【００５９】加えて、波長に対して図５（ａ）に示すよ
うに下限値λ１、上限値λ２を設定し、その帯域に対応
した周波数を掃引、すなわち中心波長を走査することに
よって、分光検出をすることができる。この動作は、機
械的な動作を全く用いる必要がなく、電気的な操作によ
って行われるため、非常に高速に、かつ、振動もなく行
うことができる。更には、本実施形態の走査光学系５１
と組み合わせることにより、２次元、３次元の画像取得
及び分光取得の複合的な検出を高速で達成することが容
易になる。

【００６０】また、選択された以外の波長となる０次回
折光は、ＡＯＴＦ３１１内の複屈折率結晶を通過し、迷
光を防ぐ光学的なストッパーでトラップされる。このと
き０次回折光に含まれる成分は、試料２７から発する蛍
光のうち、ＡＯＴＦ３１１で波長選択された図５の特性
以外の蛍光成分であり、試料２７からの蛍光の偏光特性
も保持されている。このとき、０次回折光には、結晶内
の透過率によるわずかな光量ロスが発生する。一般に、
ＡＯＴＦの波長分解能に比較して蛍光は広い波長スペク
トラムを持っており、加えて、複数の蛍光試薬を用いる
場合もあるため、特に図５には明示していない。

【００６１】ＡＯＴＦ３１１上での特定の波長選択のオ
ン・オフは、電気的な操作によって容易に達成される。
これにより、検出したい波長位置、帯域に応じて分光す
ることができる。つまり、励起波長となるレーザ光の漏
れ光が検出側へ導かれないよう、レーザの波長位置（周
波数）でＡＯＴＦ３１１がアクティブにならないよう電
気的に設定し（オフ）、完全にレーザをカットした状態
で波長選択、周波数掃引による分光検出を素早く行うこ
ともできる。これらは、複数のレーザに対しても複数の
波長位置（周波数）をドライバ上に電気的に設定し、容
易に達成することができる。

【００６２】また、更なるＡＯＴＦ３１１の特徴を図５
（ｂ）に示す。

【００６３】ＡＯＴＦ３１１は、独立した複数の周波数
を同時に印加する特性を有する。図５（ｂ）は、３種類
の周波数を与えることによって、λ０、λ３、λ４の３
つの波長帯を得た一例である。ＡＯＴＦ３１１の１つの
周波数に対する波長分解能は狭い波長半値全幅（すなわ
ち高波長分解能）で固定されており、原理的に可変する
ことはできない。そこで、λ０、λ３、λ４をお互いに
近づけ、具体的にはＡＯＴＦ３１１に印加する周波数を
近づけることによって、３つのスペクトルが包絡線を形
成し波長半値全幅を広げることができる。この包絡線
を、前述したように下限値λ１、上限値λ２を設定し
て、その波長域で掃引することも可能である。これによ
り、容易により波長幅を広くとれ、暗い蛍光を発するサ
ンプルにも対応することができる。印加できる周波数の
数はＡＯＴＦ３１１の特性とドライバの組合せによって
決定されるものであって、ここ述べた例に限らず、より
多くの周波数を印加することも可能である。

【００６４】上記のように、複数の周波数を同時に音響
光学素子に与えることによって、複数の中心波長を選択
でき、それらの中心波長を近接させることによって従来
音響光学素子で得られる比較的狭い波長分解能より、よ
り広い選択波長幅を設定することができる。更に、それ
ら近接した状態で複数の中心波長が設定された中心波長
域で掃引させることによって、比較的暗い蛍光強度の試
料でも効率のよいスペクトルデータの取得ができる。な
お、このように、複数の周波数を同時に音響光学素子に
与えて、より広い選択波長幅を設定する方法は、本実施
形態のみでなく、他の実施形態、例えば、第１および第
２の実施形態及び以降の実施形態、にも同様に適用可能
である。

【００６５】蛍光は、ほぼ同一の波長特性をもつが、お
互いに直交した偏光成分として±１次回折光へ分離され
る。ＰＭＴ３１２ａ、３１２ｂによってそれぞれの１次
回折光が検出されるが、信号処理部４５を介して、少な
くとも２種類の演算信号を得ることが出来る。信号処理
部４５からＰＭＴ３１２ａ、３１２ｂからの信号を和信
号として出力すれば、設定された波長幅から蛍光総和シ
グナルとして扱うことができる。更にＰＭＴ３１２ａ、
３１２ｂからの信号を信号処理部４５を介して差信号も
しくは独立信号として出力すれば、実際の蛍光試薬の状
態に応じて発生する蛍光偏光シグナルとして扱え、蛍光
偏光解析を行うことができる。

【００６６】図６は共焦点光学系の変形例を示す図であ
る。図６（ａ）は本発明の１つの形態として上げられて
いる共通光路内での共焦点光学系ある。一方で、分光検
出では通常さまざまな光が回折されるため、一般には図
４のように所望の±１次回折光のみを検出し、迷光を防
ぐために検出器３１２ａ、３１２ｂの手前にはスリット
もしくはやや大型ピンホールを置く場合多い。これら共
焦点光学系とスリットを光路に２つおくと、少なからず
ケラレによる光量ロスも発生しやすい。そこで、両者の
機能を兼ね合わせ、ロスを避けるため、光学系内で図６
（ｂ）で示すように回折された±１次回折光光路それぞ
れに共焦点光学系を配置してももちろんかまわない。こ
れにより、装置としての複雑さは増えるが、共焦点効果
と迷光カットの２つの効果をもたせることも可能であ
る。

【００６７】第３の実施形態では、ＡＯＴＦ３１１を分
光検出に用いることによって、機械的な駆動がなく、高
効率な分光ができ、更には高速かつ高分解能な分光検出
（スペクトルデータの検出）ができる走査型レーザ顕微
鏡を達成することができる。更に、蛍光の偏光特性をも
検出することができる。選択された同一波長成分・直交
する偏光成分をもつ±１次回折光（蛍光成分）をそれぞ
れ検出することによって、通常と同じ蛍光総和シグナル
や蛍光偏光シグナルへ簡単に切換でき、実際のサンプル
で発生する蛍光をより詳細に定量化して調べることが可
能となる。

【００６８】従来分光手法自体では比較的装置の大型化
させてしまう面があるが、本実施形態では、ＡＯＴＦを
用いて検出器を比較的小型にすることができる。

【００６９】（第４の実施形態）図７は、本発明の第４
の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す
図である。

【００７０】第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡
は、第３の実施形態のそれとほぼ同様の構成を備えてい
る。第４の実施形態では、第３の実施形態において、検
出器側に変形を加えている。すなわち、走査型レーザ顕
微鏡の主要部として、第３の検出器３１２ｃを備えてい
る。

【００７１】ＡＯＴＦ３１１では、蛍光が±１次回折光
と０次回折光に分離される。±１次回折光は上述した通
りだが、０次回折光はＡＯＴＦ３１１を透過し偏向され
ない成分であり、また、試料２７からの蛍光のうち波長
選択されていない成分をもつ。この光路に第３の検出器
を設けるが、１つの例として、従来のフィルタ式の検出
器でできる。具体的には、ＡＯＴＦ３１１の通過後の０
次回折光に、レーザ光をカットし、所望の蛍光のみを抽
出するバリアフィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）を有す
る検出器を備え、ＡＯＴＦ３１１後の迷光の度合いによ
っては必要に応じて共焦点レンズとピンホールで構成さ
れる共焦点光学系を兼ね備えてもよい。第３の検出器３
１２ｃは、従来の走査型共焦点レーザ顕微鏡と同様に複
数の検出器として設けることも可能である。

【００７２】すなわち、特別な装置を組み合わせなくと
も、分光検出はＡＯＴＦ３１１を用いた±１次回折光の
検出で行え、かつ、より広い幅の検出乃至従来と同様な
検出はフィルターを用いて行うことができ、両者の切換
が容易に可能となる。ここで、フィルターを用いた検出
では、従来フィルター検出による走査型レーザ顕微鏡で
実施可能な方法はほとんど利用できるといってよい。

【００７３】図示はしていないが、第３の検出器３１２
ｃとして、従来のフィルター式の検出器を例としてあげ
たが、この０次回折光の光路を用いて、その他外付けの
分光器やアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）、
ラインセンサやマルチチャンネルのセンサなどを用いる
ことができ、この光路の使用範囲によってより複合化で
きることはいうまでもない。

【００７４】以上により、ＡＯＴＦ３１１による分光検
出に加え、０次回折光の光路で偏光されない成分の通常
のフィルタ検出も可能となり、例えば、分光検出とフィ
ルター式の検出とを容易に切換できる複合的な（ハイブ
リッドな）走査型レーザ顕微鏡とすることができる。分
光検出と従来のフィルター式の検出の切換も容易であ
り、また、分光検出によって、より最適なフィルター選
択にも簡単に寄与できるなど、目的や使用方法によって
広い利用範囲をカバーできるようになる。

【００７５】このように、第３の検出器を音響光学素子
で周波数で偏向されない０次回折光の光路上に配置する
ことによって、波長選択されていない蛍光又は反射光成
分を検出することができ、装置として複合的な計測がで
きる構成をとることができる。

【００７６】上記のように、音響光学素子によって異な
る２つの光路に偏向された蛍光もしくは反射光が少なく
とも１つの検出器によって検出され、音響光学素子に印
加する周波数を操作することによって、所望の中心波長
の選択あるいは中心波長の所望波長域で掃引し、所望の
蛍光もしくは反射光を効率よく、高速かつ高精度にスペ
クトルデータとして取得することができる。また、この
比較的簡便な構成にも関わらず汎用性が広く、少ないス
ペースで構成でき、システムを小型にすることができ
る。

【００７７】（第５の実施形態）図８は、本発明の第５
の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す
図である。

【００７８】走査型レーザ顕微鏡の主要部は、レーザ光
源２２とコリメータレンズ２１からなる光源部５０、Ｘ
Ｙの２次元走査を行うガルバノミラー６からなる走査光
学系５１、結像レンズ８と対物レンズ９からなる顕微鏡
部５２、ピンホール１３を含む共焦点光学系部１４、音
響光学素子であるＡＯＴＦ３１１、２つの検出器である
光電子倍増管（ＰＭＴ）で構成される検出器３１２ａと
３１２ｂ、検出器３１２ａと３１２ｂのシグナルを制御
する信号処理部４５から構成される。ここで、第１の実
施形態と同様にレーザ光源部５０の導入は光ファイバ経
由して行ってももちろんかまわない。また、図８はシス
テムの基本構成を表しており、レーザ光源２２に複数の
波長を持たせるために、マルチラインのレーザとした
り、複数のレーザ光源を用いて構成してもかまわない。

【００７９】検出器として、光電子変換してシグナルを
検出できるＰＭＴ以外のその他の同等の効果を得るデバ
イスを用いてかまわない。

【００８０】第５の実施形態の作用・効果は、第３の実
施形態とほぼ同様であるが、以下説明する点で異なる。

【００８１】光源部５０からのレーザ光は、ＡＯＴＦ３
１１、共焦点光学系５３を通過し励起光として、走査光
学系５１を介して顕微鏡部５２に導かれ、試料２７を励
起する。このとき共焦点光学系５３は、励起光に対して
１つの空間フィルタとしての役割を果す。蛍光試薬で標
識された試料２７は励起光によって励起される。それに
よって発した蛍光は再び顕微鏡部１０を経て走査光学系
５１・共焦点光学系５３を通過し、ＡＯＴＦ３１１に至
る。このとき共焦点光学系は蛍光において共焦点効果を
得るために機能する。ＡＯＴＦ３１１には、図示されて
いないが、所望の波長及び波長幅を選択するためにＡＯ
ＴＦ３１１に特定の周波数を印加する固有のドライバが
準備されている。サンプルから発した蛍光は、ＡＯＴＦ
３１１によって選択された波長成分であり、かつ、お互
いに直交した偏光成分となる、偏向された±１次回折光
へと分離される。

【００８２】すなわち、ＡＴＯＦ１５は、０次回折光光
路上のレーザ光である励起光と、試料２７より発した蛍
光を波長選択して偏向した±１次回折光とを分離するビ
ームスプリッタとしての機能を持つ。このレーザ光源２
２からの励起光は、ＡＯＴＦ３１１がもつ０次回折光の
光路上で本来進む向きとは正反対の方向からＡＯＴＦ３
１１に対して入射している。従来のダイクロイックミラ
ーにコーティングされる誘電体膜における波長特性は、
それほど急峻な立ち上がり特性をもたず、最大の透過率
が８５％となりやや低く、マルチバンドの対応は多くて
３励起波長までなど、コーティング技術上の欠点があ
る。第５の実施形態の場合、ＡＯＴＦ３１１は励起光に
対してプリズムとして働き励起光を透過させるため、基
本的にはＡＯＴＦ３１１内の結晶の透過率のみにしか光
量のロスは発生しない。より高い効率を求めるため、複
屈折結晶の偏光方向に対して、レーザ光源２２からの偏
光方向を回転してあわせれば、よりロスを少なくでき
る。このときレーザ光を偏光保存光ファイバを用いてＡ
ＯＴＦ３１１に導入すれば、ファイバの方向を回転する
だけで簡単に偏光方向の合致は達成できる。

【００８３】このため、高効率で容易に複数の励起波長
への対応は、分光検出時の電気的にそれらの波長位置で
ＡＯＴＦ３１１をアクティブにしなければよく、システ
ムに大幅な追加や変更を加えることなく容易に行うこと
が出来る。また、±１次回折光の波長選択は、ＡＯＴＦ
３１１固有の高い波長分解能で行え、前述したように励
起波長の位置近傍でオフできれば、従来にない非常に高
い効率で蛍光を分光取得することができる。光の利用効
率の面から考えて、共焦点光学系５３を図６（ｂ）のよ
うに配置してももちろんかまわない。このようにＡＯＴ
Ｆ３１１にビームスプリッタと分光検出の２つの機能を
持たせることによって、非常にシンプルな構成にでき、
システム自体を小型化することもできるようになる。

【００８４】０次回折光の光路内に含まれる偏向されな
い蛍光成分は、レーザ光源に至る前までにダイクロイッ
クミラーを用いて分離し、従来のフィルター式の検出器
を設け、複合的な計測を行うことも可能である。また、
ＡＯＴＦ３１１を用いることで第３の実施形態、第４の
実施形態と同様の作用、機能を持つことができるのはも
ちろんいうまでもない。

【００８５】以上により、ＡＯＴＦ３１１にビームスプ
リッタと分光機能の２つの機能を持たせることによっ
て、高効率の励起光／蛍光の分離が行え、ＡＯＴＦ３１
１自身の機能として高速・高分解の分光検出が達成でき
ることはもちろん、システム全体を小型化することが可
能にもなる。更には±１次回折光の偏光特性を利用し
て、蛍光試薬及びサンプルに由来する蛍光偏光の特性を
も調べることができるようになり、小型でより複合的な
計測を行うことができる。

【００８６】このように、レーザ光源からのレーザ光を
本来音響光学素子から出射される０次回折光の進む向き
とは正反対から入射させることができ、音響光学素子に
印加される周波数から影響を受けることなく走査光学系
と顕微鏡を介して試料にレーザ光を照射することができ
る。従って、音響光学素子を上述したビームスプリッタ
の役割として、より高い光の利用効率をもって機能させ
ることができる。この場合、音響光学素子に印加される
周波数は単に試料に照射されるべき既知のレーザ波長に
対応させないようにすればよく、従来のダイクロイック
ミラーでは達成できない高Ｓ／Ｎの励起光と蛍光の分離
が達成でき、かつ、非常に簡便に複数のレーザ波長にも
対応できるというメリットも生じる。

【００８７】また、上記のような音響光学素子を用いた
効率のよいスペクトルデータの取得に加え、音響光学素
子から互いに直交する偏光成分である正負の１次回折光
が２つの異なる方向に偏向し、少なくとも１つの検出器
でそれぞれを検出することによって、試料状態や条件に
由来する蛍光もしくは反射光を偏光成分として取得する
ことができる。

【００８８】よって、本発明は、上記の各実施形態に限
ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しな
い範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。例
えば、本実施形態では、ＲＦの周波数により回折される
１次回折光を光検出器３１２で測定することにより、ス
ペクトル特性データを取得していたが、ＡＯＴＦ３１１
を透過する０次回折光を、光検出器３４で検出しても良
い。この場合、バリアフィルタ３３を透過する蛍光波長
の光量の総和から、ＲＦの周波数に対応する蛍光の波長
（１次回折光として回折する）の光量を差し引いた光量
が、各ＲＦの周波数毎に光検出器３１２により検出され
る。これらの値を、反転処理することにより、スペクト
ル特性データを得ることができる。このようにすれば、
１次回折光を検出する時より、蛍光光量がはるかに大き
くなるため、高精度なデータの取得が可能となる。さら
に、上記の各実施形態には、種々の段階の発明が含まれ
ており、開示される複数の構成要件における適宜な組合
せにより種々の発明が抽出され得る。

【００８９】例えば実施形態に示される全構成要件から
幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようと
する課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述
べられている効果が得られる場合には、この構成要件が
削除された構成が発明として抽出され得る。

【００９０】上述した第３から第５の実施形態におい
て、記述したように、光源として光ファイバを用いたレ
ーザ光の導入を行えば、一般に知られているように、熱
や振動に対する回避、良質な点光源化、走査光学系と検
出系の小型化を達成することができる。

【００９１】また、光源として、マルチラインを発生す
るレーザや複数のレーザを用いてビームを合成するコン
パイナを用いて、所望の複数の励起波長を組み合わせて
ももちろんかまわない。そこに第２のＡＯＴＦを備え、
レーザ選択と強度調整の機能を持たせることも可能であ
る。

【００９２】図示していないが、±１次回折光をミラー
などを用いて１つの検出器に導き、それぞれの光路にシ
ャッターを設けることによって、＋１次回折光と−１次
回折光を同時に検出したり、スイッチングしながら交互
に検出したりしても良い。両方のシャッターを同時に開
ければ蛍光の総和シグナルとなり、シャッターのスイッ
チングと検出器のタイミングを電気的に同期させ時間的
に信号を分離させることによって、異なる２つの蛍光偏
光成分を検出できる。

【００９３】特に反射光を検出する場合については、詳
細に明記していないが、１つの例として、試料２７に照
射されるレーザ光に散乱が生じ、その物性に応じて散乱
光の波長持性を調べるラマン分光法にも本発明は適用で
きる。この場合レーザ光と散乱光の波長は極めて近接し
ているが、特に第５の実施形態の構成により、ＡＯＴＦ
３１１による高い波長分解能によって、効率よくラマン
散乱を検出することができる。このように、本発明は必
ずしも蛍光の分光検出に制限されるものではなく、広く
一般の分光器として適用できることはいうまでもない。

【００９４】また、本発明は走査型共焦点レーザ顕微鏡
として記載され、走査光学系７を介してレーザ光源２２
からの励起光をサンプル面１１でＸ−Ｙ走査するように
なっているが、ある１点のみに励起光を照明する基本構
成でもＡＯＴＦ３１１を用いることによって同等の作
用、効果は得られる。この場合、所望のデータや画像取
得を得るために、走査の手段としてステージを駆動させ
たり、Ｘ−Ｙでないその他の走査手段を組み合わせても
よい。

【００９５】上記の各実施形態から下記の発明が抽出さ
れる。本発明の第１の局面に係る走査型レーザ顕微鏡
は、レーザ光を試料上に集光して、前記試料からの蛍光
又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を前
記試料上に２次元的に走査させる光走査手段と、前記蛍
光又は反射光の光路上に配置され、入射する蛍光又は反
射光から印加される高周波電圧の周波数に対応した波長
の光のみを選択して偏向させる音響光学素子と、前記音
響光学素子を経由した光を検出する光検出手段と、前記
音響光学素子に印加する高周波電圧の周波数を切換設定
する周波数走査手段と、を具備することを特徴とする。

【００９６】第１の局面に係る走査型レーザ顕微鏡の好
ましい実施態様は以下の通りである．なお、以下の各実
施態様は、それぞれ独立で適用しても良いし、適宜組み
合わせて適用することができる。

【００９７】（１） 前記レーザ光と前記蛍光又は反射
光を分離するビームスプリッタを更に備え、前記ビーム
スプリッタが、前記対物レンズと前記音響光学素子との
間に配置されている。

【００９８】（２） 前記光検出手段で検出される光
は、前記音響光学素子により偏向される１次回折光であ
る。

【００９９】（３） 前記音響光学素子を透過した０次
光を検出する第２の検出器を備える。

【０１００】（４） 前記周波数走査手段は、高周波電
圧の周波数を前記光走査手段の走査に同期させてピクセ
ル毎のスペクトル特性を検出し得るように切換設定す
る。

【０１０１】（５） 前記音響光学素子及び前記光検出
手段を１つのユニットとして構成し、前記ビームスプリ
ッタにより分離された検出光路に着脱自在に配設する。

【０１０２】（６） 前記周波数走査手段による走査範
囲は、レーザ波長に対応する高周波電圧の周波数を含ま
ない。

【０１０３】（７） 前記音響光学素子は、前記蛍光又
は前記反射光を異なる方向の第１と第２の光路に偏向
し、前記検出器は、前記第１と第２の光路上に、それぞ
れ配置された少なくとも１つの検出器を含む。

【０１０４】（８） 前記音響光学素子を透過した０次
光を検出する検出器を更に備える。

【０１０５】（９） 前記音響光学素子は、前記蛍光又
は前記反射光を異なる方向の第１と第２の光路に偏向す
ると共に、前記第１と第２の光路以外の第３の光路から
レーザ光を入射する。

【０１０６】（１０） 前記蛍光又は反射光は、前記音
響光学素子によって偏向された第１と第２の光路上の蛍
光又は反射光は、互いに直交する偏光成分である正負の
１次回折光である。

【０１０７】（１１） 前記偏向された前記第１と第２
の光路に設けられた２つの検出器からの信号を和信号も
しくは差信号となる合成信号、あるいはそれぞれを独立
信号として処理する信号処理部を更に備えた。

【０１０８】（１２） 前記音響光学素子には複数の中
心波長又は周波数の設定ができ、前記複数の中心波長又
は周波数を近接又は隣接させることによって、それぞれ
の中心波長又は周波数によって形成されるスペクトルを
部分的に重ねあわせ、より広い波長幅を選択できるよう
にする。

【０１０９】（１３） 前記音響光学素子は、前記蛍光
又は前記反射光を互いに異なる方向の第１及び第２の光
路に偏光するものであり、前記第１及び第２の光路に導
かれた前記蛍光又は前記反射光を１つの検出器に導く偏
向装置が設けられている。

【０１１０】（１４） 前記第１及び第２の光路にそれ
ぞれ設けられたシャッタを更に備える。

【０１１１】（１５） 前記第３光路は、前記音響素子
の前記周波数で偏向されない０次回折光の光路である。

【０１１２】（１６） 前記第３光路上の前記レーザ光
は、前記音響光学素子から出射する０次回折光の光路上
にあり、かつ、その進む向きが前記０次回折光とは正反
対である。

【０１１３】本発明の第２の局面に係る走査型レーザ顕
微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍
光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を
前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記
蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、
前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときに
は、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧
の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折
光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されな
いときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光
として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧
の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行
う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第
１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光
検出器と、を具備することを特徴とする。

【０１１４】第２の局面に係る走査型レーザ顕微鏡の好
ましい実施態様は以下の通りである．なお、以下の各実
施態様は、それぞれ独立で適用しても良いし、適宜組み
合わせて適用することができる。

【０１１５】（１） 前記第１の光検出器の出力信号と
前記第２の光検出器の出力信号を加算した値に基づいて
前記試料の画像を生成する手段を更に具備する。

【０１１６】（２） 前記高周波信号制御部によって前
記高周波電圧の周波数を掃引し、各周波数における前記
第１及び第２の光検出器の出力信号を取得することによ
って、前記蛍光又は反射光のスペクトルデータを取得す
る。

【０１１７】（３） （２）において、前記０次回折光
を受光する第３の光検出器を更に具備し、前記音響光学
素子に前記高周波電圧を印加しないときには、前記第３
の光検出器の出力信号を用いて前記試料の画像を生成す
る。

【０１１８】本発明の第３の局面に係る走査型レーザ顕
微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍
光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を
前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記
蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、
前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときに
は、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧
の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回折
光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加されな
いときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折光
として透過させ、前記音響光学素子への前記高周波電圧
の印加のオンオフを制御し、前記高周波電圧の設定を行
う高周波信号制御部と、前記＋１次回折光を受光する第
１の光検出器と、前記−１次回折光を受光する第２の光
検出器と、を具備し、前記レーザ光源は、前記レーザ光
が変調されずに前記音響光学素子を透過して、前記対物
レンズに導かれるように、前記０次回折光の光路に配置
されている。

【０１１９】本発明の第４の局面に係る走査型レーザ顕
微鏡は、レーザ光を試料上に集光して前記試料からの蛍
光又は反射光を取り込む対物レンズと、前記レーザ光を
前記試料上で２次元的に走査させる光走査手段と、前記
蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子と、
前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたときに
は、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電圧
の周波数に応じた波長の光を１次回折光に回折させると
共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射し
た前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、前
記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフを
制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御部
と、前記１次回折光を受光する光検出器と、を具備し、
前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数
を掃引し、各周波数における前記光検出器の出力信号を
取得することによって、前記蛍光又は反射光のスペクト
ルデータを取得する。

【０１２０】第４の局面において、前記０次回折光を受
光する第２の光検出器を更に具備し、前記音響光学素子
に前記高周波電圧を印加しないときには、前記第２の光
検出器の出力信号を用いて前記試料の画像を生成するこ
とが好ましい。

【０１２１】なお、本発明は、上記の発明の実施の形態
に限定されるものではない。本発明の要旨を変更しない
範囲で種々変形して実施できるのは勿論である。

【０１２２】

【発明の効果】本発明によれば、構成簡易にして、小型
化の促進を図り得、且つ、高効率な分光ができ、更には
高速かつ高分解能な分光検出をも実現できる走査型レー
ザ顕微鏡を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ
顕微鏡の要部を示した構成図。

【図２】 図１で取得されるスペクトル特性データの例
を示した特性図。

【図３】 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ
顕微鏡の要部を示した構成図。

【図４】 第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の
概略構成を示す図。

【図５】 擬似的にバンド幅を広くする例を説明するた
めの図。

【図６】 共焦点光学系の変形例を示す図。

【図７】 第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の
概略構成を示す図。

【図８】 第５の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の
概略構成を示す図。

【符号の説明】

１…音響光学素子 ６…ガルバノミラー ７…走査光学系 ８…結像レンズ ９…対物レンズ １０…顕微鏡部 １１…サンプル面 １３…ピンホール １４…共焦点光学系部 １５…ＡＴＯＦ １９…反射ミラー ２０…走査ユニット ２１…コリメータレンズ ２２…レーザ光源 ２３…ファイバ ２４…ダイクロイックミラー（ビームスプリッタ） ２５…光走査手段 ２６…対物レンズ ２７…試料 ２８…共焦点レンズ ２９…共焦点ピンホール（共焦点スポット） ３０…レンズ ３１…音響光学素子ユニット ３２…ミラー ３２ａ…位置 ３２ｂ…位置 ３３…バリアフィルタ ３４…光検出器 ４０…制御部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2H052 AA07 AB17 AB24 AB25 AB26 AC34 AF06 AF10 AF14 AF21 AF25 2K002 AA04 AB06 AB07 BA12

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザ光を試料上に集光して、前記試料
   からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、 前記レーザ光を前記試料上に２次元的に走査させる光走
   査手段と、 前記蛍光又は反射光の光路上に配置され、入射する蛍光
   又は反射光から印加される高周波電圧の周波数に対応し
   た波長の光のみを選択して偏向させる音響光学素子と、 前記音響光学素子を経由した光を検出する光検出手段
   と、 前記音響光学素子に印加する高周波電圧の周波数を切換
   設定する周波数走査手段と、を具備することを特徴とす
   る走査型レーザ顕微鏡。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡に
   おいて、前記レーザ光と前記蛍光又は反射光を分離する
   ビームスプリッタを更に備え、前記ビームスプリッタ
   が、前記対物レンズと前記音響光学素子との間に配置さ
   れている。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載の走査型レ
   ーザ顕微鏡において、前記光検出手段で検出される光
   は、前記音響光学素子により偏向される１次回折光であ
   る。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡に
   おいて、前記音響光学素子を透過した０次光を検出する
   第２の検出器を備える。
5. 【請求項５】 請求項１から請求項４のいずれか１項に
   記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記周波数走査手
   段は、高周波電圧の周波数を前記光走査手段の走査に同
   期させてピクセル毎のスペクトル特性を検出し得るよう
   に切換設定する。
6. 【請求項６】 請求項２から請求項５のいずれか１項に
   記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子
   及び前記光検出手段を１つのユニットとして構成し、前
   記ビームスプリッタにより分離された検出光路に着脱自
   在に配設する。
7. 【請求項７】 請求項１から請求項６のいずれか１項に
   記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記周波数走査手
   段による走査範囲は、レーザ波長に対応する高周波電圧
   の周波数を含まない。
8. 【請求項８】 請求項１又は請求項２に記載の走査型レ
   ーザ顕微鏡において、 前記音響光学素子は、前記蛍光又は前記反射光を異なる
   方向の第１と第２の光路に偏向し、 前記検出器は、前記第１と第２の光路上に、それぞれ配
   置された少なくとも１つの検出器を含む。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の走査型レーザ顕微鏡に
   おいて、前記音響光学素子を透過した０次光を検出する
   検出器を更に備える。
10. 【請求項１０】 請求項１又は請求項８に記載の走査型
    レーザ顕微鏡において、 前記音響光学素子は、前記蛍光又は前記反射光を異なる
    方向の第１と第２の光路に偏向すると共に、前記第１と
    第２の光路以外の第３の光路からレーザ光を入射する。
11. 【請求項１１】 請求項８から請求項１０のいずれか１
    項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記蛍光又は
    反射光は、前記音響光学素子によって偏向された第１と
    第２の光路上の蛍光又は反射光は、互いに直交する偏光
    成分である正負の１次回折光である。
12. 【請求項１２】 請求項８から請求項１１のいずれか１
    項に記載の走査型レーザ顕微鏡において、前記偏向され
    た前記第１と第２の光路に設けられた２つの検出器から
    の信号を和信号もしくは差信号となる合成信号、あるい
    はそれぞれを独立信号として処理する信号処理部を更に
    備えた。
13. 【請求項１３】 請求項１、請求項２、請求項３、請求
    項４、請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の
    走査型レーザ顕微鏡において、前記音響光学素子には複
    数の中心波長又は周波数の設定ができ、前記複数の中心
    波長又は周波数を近接又は隣接させることによって、そ
    れぞれの中心波長又は周波数によって形成されるスペク
    トルを部分的に重ねあわせ、より広い波長幅を選択でき
    るようにする。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の走査型レーザ顕微
    鏡において、 前記音響光学素子は、前記蛍光又は前記反射光を互いに
    異なる方向の第１及び第２の光路に偏光するものであ
    り、 前記第１及び第２の光路に導かれた前記蛍光又は前記反
    射光を１つの検出器に導く偏向装置が設けられている。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の走査型レーザ顕微
    鏡において、前記第１及び第２の光路にそれぞれ設けら
    れたシャッタを更に備える。
16. 【請求項１６】 請求項９又は請求項１０に記載の走査
    型レーザ顕微鏡において、前記第３光路は、前記音響素
    子の前記周波数で偏向されない０次回折光の光路であ
    る。
17. 【請求項１７】 請求項１０に記載の走査型レーザ顕微
    鏡において、前記第３光路上の前記レーザ光は、前記音
    響光学素子から出射する０次回折光の光路上にあり、か
    つ、その進む向きが前記０次回折光とは正反対である。
18. 【請求項１８】 レーザ光を試料上に集光して前記試料
    からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、 前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走
    査手段と、 前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子
    と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたとき
    には、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電
    圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回
    折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加され
    ないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折
    光として透過させ、 前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフ
    を制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御
    部と、 前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、 前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備
    する走査型レーザ顕微鏡。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の走査型レーザ顕微
    鏡において、前記第１の光検出器の出力信号と前記第２
    の光検出器の出力信号を加算した値に基づいて前記試料
    の画像を生成する手段を更に具備する。
20. 【請求項２０】 請求項１８に記載の走査型レーザ顕微
    鏡において、前記高周波信号制御部によって前記高周波
    電圧の周波数を掃引し、各周波数における前記第１及び
    第２の光検出器の出力信号を取得することによって、前
    記蛍光又は反射光のスペクトルデータを取得する。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の走査型レーザ顕微
    鏡において、前記０次回折光を受光する第３の光検出器
    を更に具備し、 前記音響光学素子に前記高周波電圧を印加しないときに
    は、前記第３の光検出器の出力信号を用いて前記試料の
    画像を生成する。
22. 【請求項２２】 レーザ光を試料上に集光して前記試料
    からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、 前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走
    査手段と、 前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子
    と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたとき
    には、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電
    圧の周波数に応じた波長の光を＋１次回折光と−１次回
    折光とに回折させると共に、前記高周波電圧が印加され
    ないときには、入射した前記蛍光又は反射光を０次回折
    光として透過させ、 前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフ
    を制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御
    部と、 前記＋１次回折光を受光する第１の光検出器と、 前記−１次回折光を受光する第２の光検出器と、を具備
    し、 前記レーザ光源は、前記レーザ光が変調されずに前記音
    響光学素子を透過して、前記対物レンズに導かれるよう
    に、前記０次回折光の光路に配置されている走査型レー
    ザ顕微鏡。
23. 【請求項２３】 レーザ光を試料上に集光して前記試料
    からの蛍光又は反射光を取り込む対物レンズと、 前記レーザ光を前記試料上で２次元的に走査させる光走
    査手段と、 前記蛍光又は反射光の光路上に配置された音響光学素子
    と、前記音響光学素子は、高周波電圧が印加されたとき
    には、入射した前記蛍光又は反射光のうち前記高周波電
    圧の周波数に応じた波長の光を１次回折光に回折させる
    と共に、前記高周波電圧が印加されないときには、入射
    した前記蛍光又は反射光を０次回折光として透過させ、 前記音響光学素子への前記高周波電圧の印加のオンオフ
    を制御し、前記高周波電圧の設定を行う高周波信号制御
    部と、 前記１次回折光を受光する光検出器と、を具備し、 前記高周波信号制御部によって前記高周波電圧の周波数
    を掃引し、各周波数における前記光検出器の出力信号を
    取得することによって、前記蛍光又は反射光のスペクト
    ルデータを取得する走査型レーザ顕微鏡。
24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の走査型レーザ顕微
    鏡において、前記０次回折光を受光する第２の光検出器
    を更に具備し、 前記音響光学素子に前記高周波電圧を印加しないときに
    は、前記第２の光検出器の出力信号を用いて前記試料の
    画像を生成する。