JP2006119347A - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】上下顕微鏡で画像を取得するときに、刺激を加えながら、細胞内の挙動を見るといったリアルタイムな画像取得が出来るレーザ走査型顕微鏡を提供すること。
【解決手段】 レーザ光源（３，４）からの光束を対物レンズ（１２６，２２６）で標本（１）面上に集光し、前記標本（１）からの透過光、反射光又は前記標本から発生する蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、少なくとも１つのレーザ光源（３，４）から出力されたコヒーレント光を標本面上に対して走査する、前記標本の一方側と他方側にそれぞれ配置された観察用及び刺激用のレーザ走査光学系と、観察用のレーザ走査光学系に対する刺激用のレーザ走査光学系からの光の侵入を防止する手段（１９１，２９１）とを備えた。
【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザ光源から出力されたコヒーレント光で標本面を走査したときの標本からの透過光や反射光又は標本から発生する蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡に関する。

レーザ走査型顕微鏡は種々の標本の観察に使用されている。例えば、生物標本を観察する場合には、標本に蛍光染色を施して蛍光観察を行う場合が多い。一般的なレーザ顕微鏡においては、蛍光の光が非常に弱いので、レーザ光をカットするためにレーザカットフィルタもしくは、蛍光のバンドパスフィルタにレーザカットが可能な波長特性を有するフィルタを入れるのが普通である。このレーザカット用のフィルタは、ＯＤ（消光比）４以上の特性が実用上で必要である。

また、特許文献１には、標本の上下にレーザ走査光学系を配置したレーザ顕微鏡（以下、「上下顕微鏡」と称する場合もある）が提案されている。
特開平１０−２０６７４２号公報

刺激用のレーザは、励起用のレーザに比較して、パワーが強いことが多い。例えば、ＦＲＡＰなどの測定では、蛍光が出なくなるまで、蛍光を褪色させる目的でレーザを利用することがある。そのときのパワーは、励起時のパワーより高くなっている。このため、従来技術の光学系の構成だけでは、観察系にレーザ光が漏れこみ、正確なデータ取りが難しく、正確なデータを取得するには、時系列にデータを取得する必要があった。このために、例えば、刺激を加えて、その後に観察用のレーザ走査光学系でデータを取得する、といった具合に時間差をつけてデータを取得すること等の制約条件があった。また、特に上下顕微鏡では、上下どちらかのレーザ光が他方の検出光学系に対物レンズを通して直接に導入されるため、レーザ走査系が片側にしかない通常のレーザ顕微鏡よりも高いレーザカットを行なう能力が必要である。

本発明は、上下顕微鏡で画像を取得するときに、刺激を加えながら、細胞内の挙動を見るといったリアルタイムな画像取得が出来るレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の局面に係るレーザ走査型顕微鏡は、レーザ光源からの光束を対物レンズで標本面上に集光し、前記標本からの透過光、反射光又は前記標本から発生する蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、少なくとも１つのレーザ光源から出力されたコヒーレント光を標本面上に対して走査する、前記標本の一方側と他方側にそれぞれ配置された観察用及び刺激用のレーザ走査光学系を備え、観察用のレーザ走査光学系に対する刺激用のレーザ走査光学系からの光の侵入を防止する光侵入防止手段とを具備したことを特徴とする。

本発明によれば、上下顕微鏡の他方の励起光もしくは刺激光の影響を受けずに観察画像の取得が可能である。

図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

（第１の実施の形態）
図１を参照して、第１の実施形態を説明する。図１は、本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図である。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡は、標本１に対して、上側と下側に同様のレーザ走査光学系が配置されている。なお、上側と下側のレーザ走査光学系とが同様の構成であるので、本実施形態の説明では、上側のレーザ走査光学系のみについて説明する。なお、以下の実施形態においても、特に断らない限り、上側のレーザ走査光学系のみについて説明するものとする。

レーザユニット３は、異なる波長のレーザ光を出力するレーザ光源１０１から１０３と、ダイクロイックミラー１１１及び１１２とミラー１１３を備えている。レーザ光源１０１から出力されたレーザ光は、ダイクロイックミラー１１１を透過してレーザユニット３から出力される。レーザ光源１０２から出力されたレーザ光は、ダイクロイックミラー１１２及び１１１で反射されてレーザユニット３から出力される。レーザ光源１０３から出力されたレーザ光は、ミラー１１３で反射され、ダイクロイックミラー１１２を透過し、その後ダイクロイックミラー１１１で反射されて、レーザユニット３から出力される。このようにして、レーザ光源１０１から１０３からのレーザ光或いは、それらのいずれか２つ或いは３つの合成光が、レーザユニットから出力される。

レーザユニット３から出力されたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー１２１を通過した後に、レーザ光をＸＹ方向に偏向するためのミラー１２２ａ及び１２２ｂを有する走査光学系１２２で偏向される。なお、走査光学系１２２は制御ユニット５で制御される。走査光学系１２２で偏向されたレーザ光は、瞳投影レンズ１２３で対物レンズ１２６の瞳径にビーム径を変更された後に、ミラー１２４、結像レンズ１２５を介して、対物レンズ１２６に入射して、対物レンズ１２６にて、標本１の焦点位置に集光される。

標本１は、集光した光により励起されて蛍光を発する。この蛍光は、光路を逆に進み、ダイクロイックミラー１２１まで戻る。ダイクロイックミラー１２１が、レーザ光の励起波長を通過し、蛍光波長を反射することにより、励起波長と蛍光波長が分離される。ダイクロイックミラー１２１で反射された蛍光は、フィルタ１９１を介してコンフォーカルレンズ１３１に入射し、その後ピンホール１４１にて対物レンズ１２６の焦点位置と共役な位置で焦点のあった光だけが通過して、ダイクロイックミラー１５１に導かれる。ダイクロイックミラー１５１は、２波長蛍光の標本の波長を分離するためのものであって、このダイクロイックミラー１５１で２つの波長成分に分割された光は、おのおのフィルタ１６１、１６２及びフィルタ１７１、１７２で必要な蛍光波長域が選択されて検出器１８１、１８２に入力する。検出器１８１、１８２は入射した光を光電変換する。検出器１８１、１８２で光電変換された電気信号は、図示しないＡ／Ｄコンバータにより、デジタルデータ化され、図示しないパソコン上のモニターに共焦点画像として表示される。

この場合において、標本１を通過した光は、下側の光路に入ることになる。本実施形態では、フィルタ２９１を上側レーザ光カット機構として使用している。すなわち、上側から来たレーザ光は、フィルタ２９１まで到達するが、フィルタ２９１は、標本１からの蛍光は透過するが、上側から来たレーザ光を遮断して、上側から来たレーザ光が検出器２８１、２８２に到達する（すなわち、観察系に侵入する）のを防止するようにしている。これにより、標本１からの蛍光を、検出器２８１、２８２で検出する場合に、上側から来たレーザ光が、検出器２８１、２８２に到達することはない。なお、下側から標本１を通過して上側の光路に入ったレーザ光についても同様に、フィルタ１９１をレーザ光カット機構として使用することにより、下側からのレーザ光がカットされる。ここで、フィルタ１９１として、ＯＤ値の高いものを使用することが好ましく。ＯＤ値が４以上、好ましくは、６以上のものが好ましい。この場合において、２波長蛍光のようなサンプルの場合には、図２のようにレーザ光だけをカットするには、図３のような特性ダブルバンドのバリアフィルタを配置する。また、３波長蛍光のようなサンプルの場合には、トリプルバンドフィルタを配置することになるが、ダブルバンドやトリプルバンドのフィルタは、製作難易度が高いので、フィルタホイールにして、単一波長のバリアフィルタを切り変える方式でも構わない。

（第２の実施の形態）
図４を参照して、第２の実施形態を説明する。図４は、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図である。図４において、図４の（ａ）は全体の概略構成を示す図、（ｂ）は０次方向からレーザ光が音響光学素子等のＡＯＴＦ１３５（及び２３５）に入力する場合の図、（ｃ）は１次方向からレーザ光がＡＯＴＦ１３５に入力する場合の図である。また、図４の（ａ）において、図１と同じ部分には同じ符号を付している。
図４の（ａ）に示すように、本実施形態では、ダイクロイックミラー１２１及びフィルタ１９１に替えてＡＯＴＦ１３５を（図４の（ｂ）の場合）、又はダイクロイックミラー１２１に替えてＡＯＴＦ１３５を（図４の（ｃ）の場合）使用している。ＡＯＴＦ１３５は、第１の実施形態でフィルタ１９１としてフィルタホイールを用いた場合よりも高速に切り替えることができる。また、ＡＯＴＦ１３５は、バリアしたい波長だけを複数同時にバリアすることも可能である。

図４の（ｂ）では、０次方向からＡＯＴＦ１３５にレーザ光が入射し、ＡＯＴＦ１３５の１次方向に蛍光が出力されている。このような構成によれば、０次方向では、波長選択ができないが、１次方向に対しては波長選択で可能であるので、レーザ光に対する波長選択はできないが、蛍光波長の選択ができる。従って、第１の実施形態におけるフィルタ１９１及び２９１が不要になる。一方、図４の（ｃ）のように、レーザ光が１次方向からＡＯＴＦ１３５に入射する場合には、レーザ光の波長選択は可能になるが、蛍光の波長選択ができないので、第１の実施形態と同様に、フィルタ１９１及び２９１が必要である。

（第３の実施の形態）
図５を参照して、第３の実施形態を説明する。図５は、本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図である。図５において、図５の（ａ）は全体の概略構成を示す図であり、（ｂ）はサーキュレータ１３６の動作を示す図である。また、図５の（ａ）において、図１と同じ部分には同じ符号を付している。
図５の（ｂ）に示すように、サーキュレータ１３６（２３６）は３つの接続端を備えており、接続端Ａは対物レンズ側の接続端、接続端Ｂはレーザ側の接続端、接続端Ｃは検出器側の接続端である。各接続端への光の入出力は以下のようになっている。
接続端Ａ：レーザ光の出力と蛍光の入力
接続端Ｂ：レーザ光の入力
接続端Ｃ：蛍光の出力
このように、接続端Ｂから入射したレーザ光は接続端Ａから出射され、接続端Ａから入力した蛍光は接続端Ｃから出射される。従って、本実施形態の構成においても、第１の実施形態に示すダイクロイックミラー１２１（２２１）と同様の機能が得られる。

（第４の実施の形態）
図６を参照して、第４の実施形態を説明する。図６は、本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図である。図６において、図１と同じ部分には同じ符号を付している。
本実施形態において、ピンホール１４１を介して、ダイクロイックミラー１５１で２波長蛍光の標本の波長が分離されるまでの動作は第１の実施形態と同様であるので、説明を省略する。本実施形態では、分光によって、必要な波長域のスペクトルを取得してから、レーザ波長のデータを無視している。そのため、平面グレーティング１６５及び１６６を備えている。これらの平面グレーティング１６５及び１６６は、光軸を含む平面（グレーティングによる反射前後の光の光軸を含む）に垂直な軸を中心として回動可能になっており、それにより、入射した蛍光が分光（スペクトル分解）される。

具体的には、ダイクロイックミラー１５１を通過した蛍光は、結像レンズ１６３を介して平面グレーティング１６５に入射して、スペクトル分解される。このとき、平面グレーティング１６５の入射光軸に対する角度を変化させると、可変スリット１６７を通過する蛍光の中心波長を調整することができる。なお、可変スリット１６７のスリット幅を変化させることによって、中心波長に対する検出波長幅を調整することができる。そして、スペクトル分解された蛍光は、可変スリット１６７に入射して、可変スリット１６７を通過することにより、蛍光のスペクトル範囲が制限され、可変スリット１６７を通過した蛍光だけが検出器１８１で検出される。なお、ダイクロイックミラー１５１で反射された蛍光は、上記と同様に、結像レンズ１６４を介して平面グレーティング１６６に入射して、スペクトル分解される。そして、スペクトル分解された蛍光は、可変スリット１６８に入射して、可変スリット１６８を通過することにより、蛍光のスペクトル範囲が制限され、可変スリット１６８を通過した蛍光だけが検出器１８２で検出される。

（第５の実施の形態）
上記の各実施形態の構成において、光学素子によるレーザ光カット機構を設けない場合におけるレーザ光のカット方法について説明する。なお、本実施形態の構成は、上記の各実施形態において、レーザカット機構としての光学素子を設けていない場合と同様であるので、図示及び説明を省略する。このように光学素子によるレーザカット機構を設けない場合には、レーザ走査光学系１２２、２２２によるレーザ光の走査ポイントが標本１の同一ポイントに来たときには、反対側の検出器、すなわち、下側の検出器２８１，２８２には上側からのレーザ光、上側の検出器１８１，１８２には下側からのレーザ光が入ってきてしまう。すなわち、図７に示すように上側の走査領域と下側の走査領域が重なる場合は、上側と下側の走査ポイントが同一になる可能性がある。

この場合には、上側の走査領域と下側の走査領域とが重ならないように走査制御を変えることにより、この問題を回避することができる。例えば、図７において、下側の走査領域を矢印方向に走査し、上側の走査領域を矢印と逆方向に走査すると、上側と下側の走査領域の重なり合った部分で走査ポイントが同じポイントになる可能性がある。そこで、上側の走査領域と下側の走査領域を同時に矢印方向に走査すれば、下側のレーザ走査光学系による走査が走査領域の重なり部分を走査しているときには、上側のレーザ走査光学系による走査は走査領域の重なり部分の走査を終了しているので、走査ポイントが重なることがない。このように、走査方向を制御することにより、走査ポイントが重なることを回避することが可能である。従って、本実施の形態によれば、レーザ光カット用の光学素子を設けない場合でも。他方の刺激用のレーザ走査光学系からのレーザ光が観察用のレーザ走査光学系に侵入することを防止できる。

（第６の実施の形態）
図８を参照して、第６の実施形態を説明する。図８は、本発明の第６の実施形態の動作例を示す図である。図８において、（ａ）はＸガルバノミラーの動作波形、（ｂ）は片道スキャンの場合の画像取得タイミング、（ｃ）は往復スキャンの場合の画像取得タイミング、（ｄ）は刺激のタイミングをそれぞれ示す図である。なお、第６の実施形態の構成は、図１と同様であるので、図示及び説明を省略する。
画像を取得するためにＸＹ走査する場合に、画像を取得したい領域よりやや広い領域まで、レーザ走査光学系で偏向することが一般的である。ここで、画像を取得する場合には、図８の（ｂ）及び（ｃ）に示すようにリニアリティの良い部分だけで画像を取得するようにしている。すなわち、片道スキャンの場合には、（ａ）の波形において、立ち上がりの部分で１ライン分の走査を行い、往復スキャンの場合には、立ち上がりと立下りの部分についてそれぞれ１ライン分の走査を行うようにしている。ここで、（ｂ）又は（ｃ）において、画像を取得しない部分（時間）は、標本を励起する必要がないので、レーザ光が標本にあたらないように、ＡＯＴＦなどの音響光学素子や直接レーザをＯＦＦするなどして、標本に光をあてないようにしている。従って、（ｄ）に示すように、この画像を取得していない時間を利用して、画像を取得していない側の走査光学系で、１回或いは複数回（図では２回）の刺激を加えれば、取得画像に影響させずに、刺激を加えることが可能である。

以上の説明はライン走査（主走査）におけるライン端部の折り返し期間を刺激用期間として利用する例であるが、同じように1フレーム走査後に次のフレームを走査する際に、走査点が走査開始点に戻るための帰線期間を刺激用期間として用いることができる。この場合は、フレームとフレームの間に刺激光を照射することができる。

本実施形態では、一方の走査光学系で画像を取得していない時間に他方の走査光学系で刺激を与えるようにしているが、励起波長と刺激波長の種顆が多いために、対応するバリアフィルタを全て用意することが困難な場合が考えられる。このような場合に、上下の２つの走査光学系をフレーム毎もしくは、ライン毎、もしくはピクセル毎に交互に切り替えて走査をするようにしても良い。これにより、上下の走査光学系に対して、ともに他方の影響を受けないでデータの取得が可能である。これは、上下の走査光学系の走査タイミングが重ならないように制御ユニット５にて制御することで、可能になる。なお、２つのレーザ顕微鏡を上下に配置するのみでなく、制御を集中して行なえば、制御ユニットを１つにできるので、低価格とスペースの向上が図れる。また、制御ユニットをＰＣなどのマンマシンインターフェイスを介して行なえば制御がしやすいばかりか、ユーザーの操作性の向上が図れる。

上記の各実施形態は単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用しても良い。また、本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。

例えば、上記の実施形態では、バリアフィルタ１９１をフィルタ１６１、１７１、１６２、１７２等と別に設けた例について説明をしたが、フィルタ１６１、１７１、１６２、１７２がバリアフィルタ１９１の性能を有するように構成すれば、バリアフィルタ１９１は必要がなくなる。また、ダイクロイックミラー１２１や１５１がバリアフィルタ１９１の性能を有するようにしても構わない。

レーザは、一般的に偏光方向を有している。このことから、上下の走査光学系の一方の走査光学系（例えば、上側の走査光学系とする）に係るレーザ光をＰ偏光、他方の走査光学系（例えば、下側の走査光学系とする）に係るレーザ光をＳ偏光にしても良い。この場合において、下側の走査光学系にはＰ偏光を通さない偏光フィルタを、上側の走査光学系にはＳ偏光を通さない偏光フィルタを、それぞれ標本から検出器の間に入れれば、他方のレーザ光の影響を受けないでデータを取得することが可能である。

上記の実施形態では、レーザ走査型顕微鏡について説明したが、上側もしくは下側に全反射顕微鏡を配置した場合も、上記の構成により、同じ効果が得られる。

また、上記の実施形態では、シングルフォトンのレーザ走査型顕微鏡について説明をしたが、レーザ走査型顕微鏡として、マルチフォトン・レーザ走査型顕微鏡が知られている。マルチフォトン・レーザ走査型顕微鏡を使用する場合は、マルチ光子による標本の励起のため、対物レンズの焦点位置と共役な位置にピンホ一ルを配置する必要がない。よって、この場合には、検出器を対物レンズの近傍（例えば、走査光学系１２２に戻る手前で分岐させた光路）に配置することができる。そして、検出器の前に、上記の実施形態と同様にレーザ光カット機構を配置すれば、マルチフォトン・レーザ顕微鏡においても同じ効果が得られる。

なお、レーザ走査顕微鏡では、ステージ２を光軸方向に動かすことによって、標本１の光軸方向（Ｚ方向）における任意の位置における像を観察できる。ここで、上下にそれぞれレーザ走査光学系を配置したレーザ走査顕微鏡では、例えば、上側の走査光学系における観察位置を変えるためにステージ２を動かすと、下側の走査光学系での観察位置も動いてしまう。そこで、ステージ２を移動させないで、観察位置を変更するために、対物レンズからの焦点位置を変えることが好ましい。これにより、ステージ２を移動させることなく、Ｚ方向の焦点位置を変更して、観察位置を変更することができる。この焦点位置の変更は、例えば、レーザユニット３、４からのコヒーレント光を、図９に示すように平行光（実線で表記）から収束光（破線で表記）に変えることによって、対物からの焦点位置を変えることが可能である。このように、ステージ２を動かさないで焦点位置を変えることが出来るので、一方の走査光学系の焦点位置を変えても、他方の走査光学系の焦点位置は変わらない。

このような、焦点位置を変更する方法として、デフォーマルミラーによって、波面制御することによって、焦点位置を変えても良い。構成例を図１０に示す。図１０において、図１と同じ部分には、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
図１０に示すように、光源３からのレーザ光はコリメータレンズ３１を介してダイクロイックミラー１２１に入射する。ダイクロイックミラー１２１で反射されたレーザ光は波面変換素子としての形状可変ミラー（デフォーマラブルミラー）１４２に入射して、波面が調整される。波面調整されたレーザ光は、リレー光学系１４４、１４６を介して、ジンバルミラー１４７（ＸＹ走査光学系）で偏向され、リレー光学系１４８、結像レンズ１２５を介して、対物レンズ１２６に入射して、対物レンズ１２６にて、標本１の焦点位置に集光される。
標本１からの蛍光は、光路を逆に進み、ダイクロイックミラー１２１まで戻り、検出器１８１、１８２に入力して、光電変換されて、図示しないＡ／Ｄコンバータにより、デジタルデータ化され、図示しないパソコン上のモニターに共焦点画像として表示される。なお、検出器１８１、１８２の出力は、制御ユニット５に出力され、これにより、形状可変ミラー１４２が制御されて、光束の形状が所望の形状になる。形状可変ミラー１４２を高速に制御することにより、１フレーム単位で、又は１フレーム画像取得中に焦点位置を変更することができる。

さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。

また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。

上記のように本発明の実施形態によれば、上下顕微鏡で画像を取得するときに、刺激を加えながら、細胞内の挙動を見るといったリアルタイムな画像取得が出来る。

また、観察用の画像は、刺激用の光が標本にあたっている部位及び同じタイミングでデータを取得したいこともあるが、一般的には、刺激前後のデータを取得したい。しかし、刺激用と観察用のレーザ波長が同じ時に、刺激用と観察用のスキャン位置が同一になるタイミングでは、本来取得したい刺激前後のデータにならないが、本発明の実施形態では、刺激用と観察用のスキャン位置が同一にならようにデータを取得することもできる。

また、従来技術においては、標本の焦点を合わせるために、上側のレーザ走査光学系の対物レンズと標本を上下動させるステージにより刺激用と観察用の焦点を別々に設定するようにしているが、標本を動かしてしまえば、上側の対物レンズの焦点位置も変わってしまうので、上側が刺激用で、下側が観察用の場合に観察部位をステ一ジで変えてしまうと、刺激部位も変わってしまうが、本発明の実施形態によれば、標本の位置を動かさずに観察部位と刺激部位を変えられるようにして、自在な刺激と観察が可能になる。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図。 カットするレーザ光の波長分布例を示す図。 図２の示すレーザ光をカットするためのフィルタの特性を示す図。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図。 本発明の第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図。 本発明の第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の構成図。 光学素子によるレーザ光カット機構を設けない場合におけるレーザ光のカット方法について説明するための図。 本発明の第６の実施形態の動作例を示す図。 光学的に焦点移動させる例を示す図。 デフォーマルミラーによって焦点位置を変更させる例を示す図。

符号の説明

１…標本
２…ステージ
３、４…レーザユニット
５…制御ユニット
３１、４１…コリメータレンズ
１０１、１０２、１０３、２０１、２０２、２０３…レーザ光源
１１１、１１２、２１１、２１２…ダイクロイックミラー
１１３、２１３…ミラー
１２１、２２１…ダイクロイックミラー
１２２、２２２…レーザ走査光学系
１２３、２２３…瞳投影レンズ
１２４、２２４…ミラー
１２５、２２５…結像レンズ
１２６、２２６…対物レンズ
１３１、２３１…コンフォーカルレンズ
１３５、２３５…ＡＯＴＦ
１３６…サーキュレータ
１４１、２４１…ピンホール
１４２、２４２…形状可変ミラー
１４４、１４６、２４４、２４６…リレー光学系
１４７、２４７…ジンバルミラー
１４８、２４８…リレー光学系
１５１、２５１…ダイクロイックミラー
１６１、１６２、２６１、２６２…フィルタ
１６１、１７１、２６１、２７１…フィルタ
１６３、１６４、２６３、２６４…結像レンズ
１６５、１６６、２６５、２６６…平面グレーティング
１６７、１６８、２６７、２６８…可変スリット
１７１、２７１…フィルタ
１８１、１８２、２８１、２８２…検出器
１８５、２８５…集光レンズ
１９１、２９１…フィルタ

Claims (13)

1. レーザ光源からの光束を対物レンズで標本面上に集光し、前記標本からの透過光、反射光又は前記標本から発生する蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、
   少なくとも１つのレーザ光源から出力されたコヒーレント光を標本面上に対して走査する、前記標本の一方側と他方側にそれぞれ配置された観察用及び刺激用のレーザ走査光学系と、
   観察用のレーザ走査光学系に対する刺激用のレーザ走査光学系からの光の侵入を防止する光侵入防止手段とを具備したことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
2. 請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記光侵入防止手段は、前記観察用のレーザ走査光学系に設けられ、刺激用のレーザ走査光学系からの光をカットするレーザカット機構であることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
3. 請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記カット機構は、バリアフィルタ、ＡＯＴＦ、分光器、又はサーキュレータのいずれかを含むことを特徴するレーザ走査型顕微鏡。
4. 請求項１または請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記光侵入防止手段は、観察用のレーザ走査光学系と刺激用のレーザ走査光学系とが同時に走査するスキャンポイントが同一にならないように制御する制御手段であることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
5. 請求項１または請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記光侵入防止手段は、刺激用のレーザ走査光学系からの光を検出しないように、刺激用のレーザ走査光学系がレーザ光を照射する刺激用期間と観察用のレーザ走査光学系が蛍光を検出する観察期間とが異なる期間になるように制御する制御手段を具備することを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
6. 請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記制御手段は、前記観察用のレーザ走査光学系のフレーム走査において、1フレーム終了から次フレーム開始までの帰線期間中に前記刺激用期間を設けることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
7. 請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記制御手段は、観察用のレーザ走査光学系のライン走査において、ライン端部の走査点折り返し期間中に前記刺激用期間を設けることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
8. 請求項２または請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡において、蛍光分離用及び励起分離用のダイクロイックミラーが、刺激用のレーザ走査光学系からの光に対するバリア性能を有するカット機構として機能することを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
9. 請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記光侵入防止手段は、標本の一方側および他方側に配置されたレーザ走査光学系の偏光方向を直交するようにしたことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
10. 請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、標本の一方側および他方側に配置されたレーザ走査系の一方のレーザ走査系が全反射顕微鏡に係る走査系であることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡
11. 請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、標本の一方側および他方側に配置されたレーザ走査系の少なくとも１つの走査系がマルチフォトン・レーザ走査型顕微鏡に係る走査系であることを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
12. 請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、標本の一方側および他方側に配置されたレーザ走査光学系の少なくとも一方の焦点位置を、光学的に移動させる光学手段を更に具備することを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
13. 請求項１２に記載のレーザ走査型顕微鏡において、前記光学手段は、デフォーマラブルミラーを含むことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。

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