KR100860947B1 - 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치에 관한 것으로, 본 발명은 적외선 펌프광(pump beam)을 발생시키는 펌프광원; 프로브광(probe beam; 탐색광)을 발생하는 프로브광원; 상기 펌프광과 프로브광을 시간적으로 동기화하고 공간적으로 동축 상에 일치시키는 빔 컴바이너(beam combiner); 결합된 펌프광과 프로브광을 평면으로 주사되도록 하는 스캐너(Scanner); 주사된 펌프광 및 프로브광을 시료 내부의 국소점으로 집속하는 제 1 광학집속계; 집속된 빔이 시료와 상호작용하여 위상변이된 빔을 모아서 평행광을 만드는 제 1 수집광학계; 평행광 중에서 적외선 펌프광을 제거하고 위상변이된 프로브광을 분리시키는 제 1 이색성 빔 스플리터(beam splitter); 상기 스캐너에 의해 주사된 빔에서 일부의 프로브광을 분리시켜 기준 프로브광을 생성시키는 기준간섭계; 상기 위상변이된 프로브광과 기준 프로브광을 결합시키는 광 간섭계 빔 컴바이너(beam combiner); 결합된 프로브광으로부터 분자진동 광신호의 세기를 검출하는 광검출기; 검출된 광신호를 수집하여 시료의 분자진동 결맞음 강도에 따라 분광신호를 생성 및 추출하는 데이터분석기; 를 포함하여 이루어진다.
이에 따라 본 발명은 분자진동과 강한 공명을 일으키는 적외선 펌핑광을 이용함으로써 종래의 자발 라만 산란 (Raman scattering) 또는 간섭성 반스톡스 라만 산란 (CARS)을 이용한 분자진동 현미경의 낮은 측정감도 문제를 해결할 수 있고, 더불어 파장이 짧은 탐색광을 매개로 비선형 분자진동 분광신호를 추출함으로써 종 래의 적외선 (infrared: IR) 선형흡수 분자진동 현미경의 공간 분해능을 극복하여 가시광 대역 광학 현미경이 가지는 우수한 광 회절한계 해상력을 달성할 수 있다. 또한, 본 발명은 분자진동 분광 현미경 기술 분야에서 영상 취득 속도와 영상 품질을 획기적으로 향상하는 데 기여할 수 있다.
레이저 현미경, 분자진동 분광학, 적외선 흡수 분광, 자발 라만 산란, 간섭성 반스톡스 라만 산란, 비선형 광학

Description

적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치{Imaging Apparatus for Infrared Rays Nonlinear Molecular Vibratial Microscopy}
도 1은 적외선 흡수 분광신호 측정의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도.
도 2는 자발 라만 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도.
도 3은 CARS 비선형 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도.
도 4는 본 발명에 의한 적외선 비선형 분자진동 분광법이 제안하는 레이저-시료 상호작용 에너지 준위 및 천이 다이어그램.
도 5는 본 발명의 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 기법의 신호광 분석에 이용되는 측정 물리량 및 공간분해 특성을 보여주는 개념도.
도 6은 본 발명에 의해 새로이 제안된 적외선 비선형 분자진동 분광법을 활용한 현미경 이미징 장치 구성을 나타낸 도면.
도 7은 신호광 생성 광 간섭계 장치의 간섭 신호출력 원리를 나타낸 개념도.
** 도면의 주요 부분에 대한 도면 부호의 설명 **
10: 펌프광원 11: 진폭 변조기(amplitude modulator)
20: 프로브광원 30: 빔 컴바이너(beam combiner)
31: 빔 확대기(beam expander)
40: 스캐너(Scanner) 50: 제 1 광학집속계
60: 제 1 수집광학계
70: 제 1 이색성 빔 스플리터(beam splitter)
80: 기준간섭계 81: 제 2 이색성 빔 스플리터
82: 제 2 광학집속계 83: 제 2 수집광학계
84: 광경로 지연조절기
90: 광 간섭계 빔 컴바이너(beam combiner)
100: 광검출기 101: 위상잠금 증폭기(lock-in amplifier)
110: 데이터분석기
본 발명은 적외선 비선형 분자진동 분광 현미경 장치 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단일 파장 또는 다파장의 레이저 빔을 시료 내부에 집속 및 공간 주사하여 얻은 비선형 분광 신호를 이용하여 분자진동 현미경 영상을 취득하는 기술에 관한 것이다.
세포나 조직과 같은 생체 시료를 비롯하여 광학적으로 거의 투명한 미세 시료를 관찰함에 있어서 기존의 일반 광학현미경이 가지는 문제점은, 시료 내의 다양한 소기관 (intracellular organs)과 물질에 대해 뚜렷한 형태학적 영상을 얻기 매 우 어렵고, 더 나아가 분자화학종의 공간분포에 대한 구별된 측정이 거의 불가능하다는 것이다. 이는 시료와 가시광선이 상호작용할 때, 관찰 대상 (objects)과 배경 매질 (background substance) 간의 차이가 미미해 광학적 대비 (optical contrast)가 제공되지 않기 때문이다. 즉, 시료 내의 관찰하려는 특정 미세 구조물 또는 미량의 물질이 주위를 둘러싼 배경매질과 분간이 되지 않는 것이다.
광학영상을 통해 다양한 세포내 대사 물질이나 소기관의 거동을 관찰함으로써 생명과학 현상 및 질병 메커니즘을 규명하기 위한 방편으로, 일반 광학현미경의 원리적 한계를 극복할 수 있는 레이저 형광 현미경이 오래전부터 널리 사용되고 왔다. 원리는 관찰하고자 하는 대상 물질에 선택적으로 결합되는 형광 표지자를 시료에 투입해 염색한 후, 자외선 또는 가시광 영역의 레이저광을 조사하여 발생한 형광 (fluorescence)을 공간적으로 검출하는 방법이다. 이를 통해 대상 물질에 선택적인 고대비 광학영상을 취득할 수 있으나, 형광 표지자라는 외부물질 (exogenous material)을 생체 시료에 도입함으로써 시료 자체를 자연 상태 그대로 유지하지 못한 상황에서 관찰이 이루어진다는 것이 근본적 문제점으로 지적되고 있다. 도입된 외부물질은 종종 생체 시료의 활성을 떨어뜨려서 생체 물질의 거동에 대한 온전한 정보를 얻지 못하게 할 뿐 아니라, 미약한 레이저광 노출에도 형광표지 색소가 쉽게 광표백 (photobleaching)이 일어나기 때문에 지속적인 영상 관찰이 불가능한 단점도 가지고 있다.
레이저 형광 현미경의 이러한 단점을 피하기 위한 대안으로서, 분자선택적 표지자의 도움 없이 물질 자체의 고유한 분광학적 특성을 검출하여 분자영상을 취 득하는 현미경 기술이 주목받고 있다. 특정 분자를 빛과 상호작용시켜서 고유의 진동 지문 (molecular vibrational fingerprint) 분광신호를 분석하는 대표적인 방법으로, 적외선 흡수 (infrared absorption) 분광법과 라만 산란 (Raman scattering) 분광법을 들 수 있으며 현미경 광학계와 결합되어 미세 구조에 대한 분자영상 측정에 이용되고 있다.
도 1은 적외선 흡수 분광신호 측정의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도이다.
적외선 흡수 현미경은, 시료에 조사된 레이저 광이 특유의 분자진동과 공명을 일으키는 파장을 가질 때 강하게 흡수되어 투과 또는 반사된 레이저의 세기가 감소되는 원리를 이용한다. 시료 내부로 집속되는 레이저 빔의 주사 위치에 대해서 파장에 따른 레이저 감쇠도를 측정하면 적외선 흡수 분자 영상이 얻어지는 것이다.
도 2는 자발 라만 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도이다.
라만 현미경에서 분자 영상을 구성하는 픽셀 데이터는 특정한 단일 파장의 레이저를 시료에 조사하여 발생된 자발 라만 스펙트럼으로 이루어진다. 적외선 흡수 방법과 달리, 관찰 대상인 분자진동 모드에 공명을 이루지 않는 고정된 파장의 입사 레이저 광자가 비탄성 산란을 통해 적색 천이 (red-shifted) 라만 분광 신호를 생성하는데, 이 때 입사 광자와 라만 산란된 광자의 에너지 차는 상호작용을 하는 시료 내 물질의 분자진동 모드 에너지에 해당한다. 즉, 시료에 의한 레이저 산란광을 수집해 얻은 라만 스펙트럼은 시료 구성물질의 특유한 분자진동 모드 정보를 담고 있다.
상기한 적외선 흡수 현미경과 라만 현미경은 각기 나름대로의 장단점을 가지고 있다.
적외선 흡수 현미경은 선형흡수 현상에 기초하므로 원리와 신호 해석이 간단하고, 여기 레이저가 분자진동 모드와 공명을 일으켜 관찰되는 직접흡수 분광신호를 이용하므로 측정의 신호대 잡음비 또는 감도가 매우 높다. 그러나 분자진동에 공명 흡수를 일으키는 2.5 ~ 18 ㎛ 범위의 중적외선 (mid IR) 파장대역에서는, 현미경 영상에 요구되는 우수한 품질의 파장가변 레이저 광원을 구현하기가 실질적으로 매우 어렵고, 광 회절현상의 제약으로 인해 가시광 현미경의 공간분해능 (0.3 ~ 0.5 ㎛ )에 비해 크게 떨어지는 10 ~ 40 ㎛정도의 공간분해능이 원리적 한계라고 할 수 있다. 파장가변 중적외선 광원의 문제에 대해서는, 가시광에서 중적외선에 이르는 넓은 스펙트럼을 지닌 백색 광원을 사용하는 대신, 측정부에 파장분산 (dispersive) 검출기나 푸리에-변환 분광 (Fourier-transform spectroscopy)을 위한 광 간섭계를 채용한 우회적 해결법을 동원하고 있다.
이에 반해, 라만 현미경은 분자진동 주파수와 관계없는 임의의 단일 파장 광원을 사용하므로 장치의 구성에 있어서 여기용 레이저 광원이 차지하는 비중이 낮고 동작이 간편하다는 장점을 내세울 수 있다. 또한 가시광 영역의 짧은 파장을 갖는 레이저 광원을 사용함으로써, 우수한 공간분해능의 현미경 영상을 얻는데 확실히 유리하다. 다만, 분광 정보를 주는 라만 산란 신호의 세기가 극히 미약해서 영상을 취득하는데 걸리는 시간이 매우 길어지는 단점을 지닌다. 특히, 살아있는 생체 시료의 동적 특성을 관찰하거나 광 손상의 위험으로 인해 여기용 레이저의 강도 를 충분히 증가시키지 못할 경우, 이는 더욱 취약한 문제점으로 작용하게 된다.
적외선 흡수 현미경이나 라만 현미경의 상기 취약점을 개선하기 위한 기술도 연구개발이 진행된 바 있다.
적외선 흡수 현미경의 낮은 공간분해능을 개선하기 위해, 수 백 nm 크기의 개구 (aperture)가 팁 끝부분에 뚫린 금속 표면코팅 광섬유를 사용한 주사 근접장 적외선 현미경 (scanning near-field IR microscope)이 이용되고 있다. 공간분해능이 적외선 광의 회절한계에 의해 결정되지 않고 광 파장에 관계없이 광섬유 팁에 형성된 개구 크기에 의존하는 것을 특징으로 하며, 이를 통하여 가시광 영역 광학 현미경에 준하는 공간분해능을 달성할 수 있다. 하지만, 현미경 영상을 얻기 위해서는 시료 표면 상에서 광섬유 팁을 미세하게 기계적으로 스캔하여야 하는데 개구의 적외선 광 투과효율 (~10-6 이하) 까지 극히 낮아서 빠른 영상 취득이 불가능하다. 또한, 현재의 기술수준에서 적외선을 효율적으로 전달하는 광섬유를 제작하는데 필요한 신뢰성 있는 공정기술 자체도 확립되지 못한 상태이다. 즉, 적외선 흡수 현미경의 공간분해능을 극복하면서, 측정 감도와 현미경 영상 취득 속도 면에서 희생을 감수한 것이다.
간섭성 반스톡스 라만 산란 현미경 (coherent anti-Stokes Raman scattering microscope; CARS microscope)은 종래 라만 현미경의 큰 단점이라 할 수 있는 낮은 측정감도와 느린 영상취득 속도를 획기적으로 개선한 것이다. 분자진동을 검출함에 있어서 라만 산란 현상을 이용하는 것은 종래의 라만 현미경과 유사하지만, 근본적인 차이는 선형광학 현상인 자발 라만 산란 (spontaneous Raman scattering)을 이용하는 것이 아니라 3개의 입사 레이저 광이 시료와 상호작용하여 비선형 광학 신호 (nonlinear optical signal)을 생성하는 일종의 사광파혼합법 (four wave mixing) 이다.
도 3은 CARS 비선형 분광신호 생성의 원리를 나타낸 분자진동천이 모식도이다.
원리는 다음과 같다. 시료 특정분자의 라만천이 (Raman shift) 만큼 주파수 차이가 있는 2개의 입사 레이저 광 (펌프광 및 스톡스광) 이 맥놀이를 일으키면서 이 파형에 결맞는 (coherent) 분자진동 (forced harmonic oscillation)을 강제 유도한다. 위상이 일치된 진동을 하는 분자들에 3번째 레이저 광 (탐색광)이 입사되면, 상호작용 후 레이저 파장이 짧아지는 반스톡스 (anti-Stokes) 라만 산란이 일어나면서 동일한 위상을 갖고 특정 진행방향을 갖는 간섭성 (coherent) 신호광이 출력된다. 이러한 비선형 광학적 신호를 시료 공간 상에서 정밀하게 고속 맵핑 (mapping)하면 CARS 현미경영상이 얻어진다.
CARS 현미경의 가장 큰 장점은, 라만 현미경과 마찬가지로 분자진동 선택적 영상을 얻되 매우 높은 측정감도와 영상 취득속도를 제공하는 것이다. 시료 손상이 없는 레이저 강도 제한조건에서도 CARS는 자발 라만 산란의해 약 10,000배 이상 강한 신호광을 발생시키므로, 신호대 잡음비가 높은 좋은 품질의 영상을 빠른 속도로 얻을 수 있다. CARS 현상은 사광파혼합을 일으키는 물질 고유의 3차 비선형 감수율 (nonlinear optical susceptibility) 특성에 의한 것이므로, 입사 레이저 광 세기의 3제곱에 비례하는 신호 증대효과가 있고, 레이저 공초점 현미경처럼 시료 내부에 대한 3차원 영상을 높은 공간 분해능으로 얻을 수 있는 기능이 구현된다. 또한, 레이저 상호작용 후 측정 시료에 어떠한 레이저 에너지도 남기지 않는 광매개변환 (optical parametric conversion) 프로세스이기 때문에, 레이저에 의한 시료 열 손상을 원리적으로 피할 수 있는 비침습적 측정법이다.
하지만, CARS 현미경도 실제 적용에 있어서 결정적인 단점이 존재하는데, 분자의 고유진동과 무관한 비공명성 (non-resonant) 3차 비선형 감수율의 영향으로 인해 분자 선택성과 신호대 잡음비의 저하가 문제로 지적되고 있다. 또한 중적외선 영역의 직접적인 공명 흡수를 이용한 방법에 비해서 측정감도가 매우 떨어진다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 시료를 염색하거나 표지자 처리하지 않고 내부 물질 고유의 분자진동을 검출함에 있어서, 중적외선 레이저 광의 분자진동 공명을 활용하되 회절한계에 의한 심각한 공간분해능 저해 문제를 극복하도록 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 공간분해능 확보를 위하여 종래에 시도된 근접장 광학탐침을 통한 접근법을 사용하지 않고, 구현이 용이하고 응용 범위가 넓은 원거리장 (far-field) 광학기법을 채용한 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장 치를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 중적외선 레이저 광원을 사용함으로써 수반되는 측정감도 상의 장점을 활용하면서 공간분해능 측면에서의 불리함을 극복할 수 있는 핵심원리가 되는 새로운 형태의 비선형광학 사광파혼합 분광법을 고안하는 것이 주된 목표이다.
또, 본 발명의 부수적인 목적은 실제 현미경 이미징 시스템에서 구현이 가능한 비선형광학 신호 수집 및 처리 광학계를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 적외선 비선형 분자진동 분광 현미경 장치는 물질의 고유 분자진동에 공명을 이루는 파장의 적외선 펌핑광과 함께 고정 단파장의 탐색광을 조합하여 시료 내부에 동시 집속 및 공간 주사함으로써 생성되는 비선형 분자진동 분광 신호로부터 분자진동 현미경 영상을 얻는 것을 가장 큰 특징으로 한다.
이에 따라 본 발명의 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치는 임의의 분자진동 대역 주파수로 시료 구성 매질분자를 여기시켜 공명 상호작용하도록 하여 결맞음 상태를 만드는 적외선 펌프광(pump beam)을 발생시키는 펌프광원(10); 상기 적외선 펌프광에 의해 시료 내부에 국소적으로 유도된 분자 결맞음 상태를 검출하는 프로브광(probe beam; 탐색광)을 발생시키는 프로브광원(20); 상기 펌프광과 프로브광을 시간적으로 동기화하고 공간적으로 동축 상에 일치시키는 빔 컴바이 너(beam combiner)(30); 현미경 영상을 얻기 위해 상기 빔 컴바이너(30)에 의해 결합된 펌프광과 프로브광을 평면으로 주사되도록 하는 스캐너(Scanner)(40); 상기 스캐너(40)에 의해 주사된 펌프광 및 프로브광을 시료 내부의 국소점으로 집속하는 제 1 광학집속계(50); 상기 제 1 광학집속계(50)에 의해 집속된 빔이 시료와 상호작용하여 위상변이된 빔을 모아서 평행광을 만드는 제 1 수집광학계(60); 상기 제 1 수집광학계(60)에 의해 만들어진 평행광 중에서 적외선 펌프광을 제거하고 위상변이된 프로브광을 분리시키는 제 1 이색성 빔 스플리터(beam splitter)(70); 상기 스캐너(40)에 의해 주사된 빔에서 일부의 프로브광을 분리시켜 기준 프로브광을 생성시키는 기준간섭계(80); 상기 위상변이된 프로브광과 기준 프로브광을 결합시키는 광 간섭계 빔 컴바이너(beam combiner)(90); 상기 광 간섭계 빔 컴바이너(90)에 의해 결합된 프로브광으로부터 분자진동 간섭 광신호의 세기를 검출하는 광검출기(100); 상기 광검출기(100)로부터 검출된 간섭 광신호를 수집하여 시료의 분자진동 결맞음 강도에 따라 분광신호를 생성 및 추출하는 데이터분석기(110); 를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 기준간섭계(80)는 상기 스캐너(40)에 의해 주사된 빔에서 펌프광은 통과시키고 일부의 프로브광을 분리시키는 제 2 이색성 빔 스플리터(81)와, 분리된 프로브광을 집속하는 제 2 광학집속계(82)와, 상기 제 2 광학집속계(82)에 의해 집속된 빔을 모아서 평행광을 만드는 제 2 수집광학계(83) 및 상기 제 2 수집광학계(83)에 의해 만들어진 평행광의 광경로를 지연시키는 광경로 지연조절기(84)를 포함하여 이루어진 마흐-젠더형 (Mach-Zehnder) 광 간섭계로 되며, 상기 데이터분석기(110)는 상기 펌프광원의 진폭변조 및 위상변조된 프로브광의 신호광과 기준 프로브광의 신호광과의 위상 변화를 감지하는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 상기 광검출기(100)는 상기 분자진동 간섭 광신호에 대한 변조 주파수의 2차 조화파를 기준 주파수로 설정한 위상잠금 증폭기(lock-in amplifier)를 이용하는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명의 상기 펌프광원은 파장가변 가시광/근적외선 반복펄스 레이저와 파장고정 반복펄스 레이저의 차주파수 생성법(DFG: difference frequency generation)을 이용해 구현된 파장가변 분자진동 공명 광원인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 스캐너(40)는 갈바노 미러를 사용하여 펌프광-탐색광 결합빔을 평면으로 고속 주사되도록 하는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 상기 광검출기(100)는 광을 증폭시켜 검출하는 광전증배관 (PMT: photomultiplier tube) 또는 고속 광다이오드 (photodiode)인 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명의 상기 이미징 장치는 현미경의 이미징 장치에 사용되는 것을 특징으로 한다.
이하, 상기한 바와 같은 구성을 가지는 본 발명에 의한 적외선 비선형 분자진동 분광 현미경 장치를 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.
도 4는 본 발명에 의한 적외선 비선형 분자진동 분광법이 제안하는 레이저-시료 상호작용 에너지 다이어그램이다.
특정 분자진동에 대하여 선택적인 분광신호를 얻는데 있어서, 분자진동과 공 명을 이루는 주파수 ω A 를 갖는 레이저가 시료에 입사되면 강한 흡수가 일어난다. 만일 레이저 첨두 출력이 충분히 높으면 분자진동 에너지 준위로 여기된 분자가 비선형 광학적 현상에 의해서 다시 기저 에너지 준위로 공명 천이를 일으킨다. 이때, 기여하는 레이저의 주파수 ω D 는 공명 흡수 주파수 ω A 와 같으며. 상기한 공명 흡수와 기저 준위 천이는 사실상 하나의 동일한 레이저가 간섭성을 제공하면서 2개의 작용을 연속적으로 일으킨다. 레이저와의 상호작용에 의해서 시료는 기저 에너지 상태로 회귀하지만, 본래의 상태와 달리 분자진동 공명천이를 매개로 한 간섭성 (coherence) 전자 상태를 띠게 된다.
광학적으로 볼 때, 간섭성 전자상태의 분자 집합체는 조사된 레이저 광의 세기 I IR 과 물질 계수 n 2 에 비례하는 비선형 굴절률 변화
Figure 112007041655743-pat00001
가 본래의 굴절률 n 0 에 유도된다. 이때, 비공명 주파수 ω P 를 갖는 프로브광(probe beam; 탐색광)이 시료에 입사하면, 상기한 비선형 굴절률 변화가 반영되어 프로브광과 주파수 ω S 가 같으면서 위상이 변화된 신호광이 발생하게 된다.
도 5는 본 발명의 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 기법의 신호광 분석에 이용되는 측정 물리량 및 공간분해 특성을 보여주는 개념도이다.
본 발명에 의한 분광 신호의 발생은 상기한 바와 같이, 적외선 대역 ( ω a , ω p )의 공명 흡수 및 기저 준위 천이를 유도하는 빛과 이에 따른 위상 변화를 감지 하기 위한 가시광/근적외선 대역 (ω p )의 프로브광이 공간적으로 일치되었을 때 일어난다. 현미경 상에서 우수한 공간분해능을 가지는 분광 신호를 발생시키기 위해서, 사용되는 각 레이저 빔은 대물렌즈(objective lens)를 통해 집속되며, 또한 동일한 시간에 국소화되어야 한다.
공명 흡수 및 기저 준위 천이 유도용 적외선 레이저 빔 ( ω a , ω D } )이 존재하지 않는 경우, 가시광/근적외선 대역 ( ω p )의 프로브광은 시료 내부에 집속되었다가 그대로 같은 주파수 ( ω S = ω P )의 신호광으로 출력되며 아무런 분자진동 정보를 포함하지 않는다. 상기 경우와 달리, 적외선 레이저 빔 ( ω A , ω D )이 시료의 분자진동과 상호작용하게 되면, 시료에 집속된 프로브광 ( ω P )으로부터 주파수는 같지만 ( ω S = ω P ) 위상 변화 ( Delta phi )된 신호광을 얻을 수 있다. 즉, 적외선 레이저 빔 ( ω A , ω D )이 존재하는 경우와 부재하는 경우 간의 신호광 위상 변화 ( Delta phi ) 크기를 측정함으로써, 특정한 주파수 ( ω A = ω D)에서 선택적으로 공명이 일어나는 분자화학종의 농도를 정량화할 수 있다.
본 발명에 의한 비선형 분광 이미징 장치의 공간분해능은 일반적인 레이저 현미경에 사용되는 이미징 장치의 경우와는 상이한 특성을 지닌다.
현미경 대물렌즈를 통해 집속된 레이저 빔을 이용하여 얻을 수 있는 일반 광 학 영상의 이론적 공간분해능 한계는, 횡방향 (x축 또는 y축)으로 delta r= lambda / prime 2NA이며, 종방향 (z축)으로는 delta z APPROX 3 delta r 정도가 된다. 이 때, lambda 는 집속 레이저 빔의 파장이며, NA는 대물렌즈의 수치구경 (numerical aperture)으로서 매질의 굴절률과 빔 집속각에 의해 결정된다. 기술적으로 분자진동 공명흡수 천이를 유도하는 적외선 대역의 레이저 빔을 공간상에 집속할 수 있는 크기는 2.5~18 ㎛가 한계치이며, 적외선 분광 현미경의 공간분해능과 직결된다.
하지만, 본 발명은 파장이 다른 복수의 레이저 빔이 시료와 상호작용하는 특유의 비선형 광학 현상을 활용함으로써 공간분해능의 향상을 이루는 것이 특징이다. 본 발명에 의한 비선형 분광 신호는, PωS (3)= χ(3)Eω AEω D *Eω P 으로 주어지는 시료의 3차 비선형 분극 (nonlinear polarization)을 통해 재복사 (re-radiation)되는 주파수 ω S 의 광파 Eω S 에 의해 생성된다. 즉, 3차 비선형 감수율 χ(3) ω S;ω A,- ω D,ω P)을 가지는 시료에 각각 ω A,ω D,ω P의 주파수를 갖는 광파 Eω A,Eω D,Eω P가 같은 지점에 동시에 존재할 때에만 관찰이 가능하다. 각각의 입사 광파가 현미경 대물렌즈를 통해 유한한 크기의 공간에 집속될 경우, 개별 광파가 전부 공간적으로 겹치면서 진폭의 곱이 영(zero)이 되지 않는 영역으로 신호광 발생이 국소화됨으로써 공간분해능이 증대된다.
본 발명에 있어서, 분자진동과 공명을 이루는 적외선 대역의 흡수 (Eω A) 및 기저 준위 천이 (Eω D)를 유도하는 레이저 빔의 집속 한계는 2.5~18 ㎛ 이지만, 훨씬 협소한 영역으로 집속이 가능한 가시광/근적외선 대역의 탐색광 (Eω P)에 의하여 0.3 ~ 0.7 ㎛ 범위의 최종 공간분해능이 얻어진다.
도 6은 본 발명에 의해 새로이 제안된 적외선 비선형 분자진동 분광법을 활용한 현미경 이미징 장치 구성을 나타낸 도면이다. 상기 장치는 비선형 광학 신호의 위상 변화를 감지하여 분자진동 분광신호를 추출하는 방식의 광 간섭계 장치를 이용한 구성 예이다.
도시된 바와 같이, 본 발명에 의한 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치는 적외선 펌프광(pump beam)을 발생시키는 펌프광원(10); 프로브광(probe beam; 탐색광)을 발생시키는 프로브광원(20); 상기 펌프광과 프로브광을 시간적으로 동기화하고 공간적으로 동축 상에 일치시키는 빔 컴바이너(beam combiner)(30); 결합된 펌프광과 프로브광을 평면으로 주사되도록 하는 스캐너(Scanner)(40); 주사된 펌프광 및 프로브광을 시료 내부의 국소점으로 집속하는 제 1 광학집속계(50); 집속된 빔이 시료와 상호작용하여 위상변이된 빔을 모아서 평행광을 만드는 제 1 수집광학계(60); 평행광 중에서 적외선 펌프광을 제거하고 위상변이된 프로브광을 분리시키는 제 1 이색성 빔 스플리터(beam splitter)(70); 상기 스캐너(40)에 의해 주사된 빔에서 일부의 프로브광을 분리시켜 기준 프로브광을 생성시키는 기준간섭계(80); 상기 위상변이된 프로브광과 기준 프로브광을 결합시키는 광 간섭계 빔 컴바이 너(beam combiner)(90); 결합된 프로브광으로부터 분자진동 광신호의 세기를 검출하는 광검출기(100); 검출된 광신호를 수집하여 시료의 분자진동 결맞음 강도에 따라 분광신호를 생성 및 추출하는 데이터분석기(110); 를 포함하여 이루어진다.
상기 적외선 펌프광원(10)은 임의의 분자진동 대역 주파수로 시료 구성 매질분자를 여기시켜 공명 상호작용하도록 하여 결맞음 상태를 만드는 적외선 펌프광(pump beam)을 발생시키는 역할을 한다. 상기 펌프광원(10)은 분자진동에 공명을 이루는 흡수 (주파수 ω A)와 기저 준위 천이 (주파수 ω D )를 일으키는 2개의 광파 성분을 제공하는 파장가변 광원이며 첨두 세기가 큰 반복 펄스를 출력하는 것이 바람직하다.
상기 프로브광원(20)은 상기 적외선 펌프광에 의해 시료 내부에 국소적으로 유도된 분자 결맞음 상태를 검출하는 프로브광(probe beam; 탐색광)을 발생시키는 역할을 한다. 상기 프로브광원(20)은 가시광 또는 근적외선 대역 주파수 (ω P )의 프로브광을 발생시키며, 상기 적외선 펌프광원(10)에 의해 유도된 간섭성 전자상태의 분자 집합체를 통과하는 과정에서 신호광 (주파수 ω S = ω P )을 생성시키게 된다.
이 때, 상기 적외선 펌프광원(10)과 상기 가시광선 프로브광원(20)은 시간적으로 매우 짧은 폭을 갖는 반복 펄스를 출력하는데, 높은 정밀도로 동기화하기 위한 동기화기(synchronizer) 또는 광학적 펄스 지연기(optical pulse delay generator)가 사용된다.
시간적으로 동기화된 상기 적외선 펌프광과 가시광선 프로브광은, 공간적으 로 동축 상에 겹쳐지면서 빔 크기를 일치시키기 위한 부가 장치를 통하여 결합된다. 부가 장치라 함은, 펌프광 또는 프로브광 경로 상에 놓인 빔 확대기(beam expander)(31)와 상기 펌프광과 프로브광을 시간적으로 동기화하고 공간적으로 동축 상에 일치시키는 빔 컴바이너(beam combiner)(30)를 포함한다.
상기 빔 컴바이너(30)는 주파수 대역이 다른 펌프광과 프로브광 간의 반사 및 투과 특성이 정반대인 이색성 빔 컴바이너(dichroic beam combiner)이다.
상기 빔 컴바이너(30)에 의해 결합된 펌프광과 프로브광은 현미경 영상을 얻기 위해 스캐너(Scanner)(40)에 의해 평면으로 주사되게 되며 시료 앞에 위치한 현미경 대물렌즈(microscope objective) 즉 제 1 광학집속계(50)로 향하고, 시료 내부의 국소점으로 집속된다.
상기 제 1 수집광학계(60)는 상기 제 1 광학집속계(50)에 의해 집속된 빔이 시료와 상호작용하여 위상변이된 빔을 모아서 평행광을 만든다.
상기 제 1 수집광학계(collector)에 의해 평행광으로 시준 (collimation)된 후, 적외선 펌프광을 제거하는 제 1 이색성 빔 스플리터(IR cut-off filter)(70)를 거치면서 위상변이된 프로브광만이 분리된다.
상기 기준간섭계(기준팔 광경로; interferometric reference arm)(80)는 상기 스캐너(40)에 의해 주사된 빔에서 일부의 프로브광을 분리시켜 기준 프로브광을 생성시키게 된다. 상기 기준 프로브광은 위상변이된 프로브광과의 위상차를 이용함으로써 시료의 분자진동 결맞음 강도를 분석하게 된다.
상기 기준간섭계(80)는 상기 스캐너(40)에 의해 주사된 빔에서 펌프광은 통 과시키고 일부의 프로브광을 분리시키는 제 2 이색성 빔 스플리터(81)와, 분리된 프로브광을 집속하는 제 2 광학집속계(82)와, 상기 제 2 광학집속계(82)에 의해 집속된 빔을 모아서 평행광을 만드는 제 2 수집광학계(83) 및 상기 제 2 수집광학계(83)에 의해 만들어진 평행광의 광경로를 지연시키는 광경로 지연조절기(84)를 포함하여 이루어진 마흐-젠더형 (Mach-Zehnder) 광 간섭계로 되는 것이 바람직하다.
상기 제 1 이색성 빔 스플리터(70)에 의해 분리된 위상변이된 프로브광과 상기 기준간섭계(80)에 의해 생성된 기준 프로브광은 광 간섭계 빔 컴바이너(beam combiner)(90);에 의해 결합되게 된다.
상기 광검출기(100)는 상기 광 간섭계 빔 컴바이너(90)에 의해 결합된 프로브광으로부터 분자진동 간섭 광신호의 세기를 검출하게 된다.
상기 데이터분석기(110)는 상기 광검출기(100)로부터 검출된 광신호를 수집하여 시료의 분자진동 결맞음 강도에 따라 분광신호를 생성 및 추출하는 역할을 한다. 이때, 상기 데이터분석기(110)는 상기 펌프광원의 진폭변조 및 위상변조된 프로브광의 신호광과 기준 프로브광의 신호광과의 위상 변화를 감지하게 된다.
이와 같이 본 발명은 상기 현미경 광경로와 마흐-젠더형(Mach-Zehnder) 간섭을 일으키는 기준간섭계(80)를 추가함으로써 구성된다.
상기 기준간섭계는 제 2 이색성 빔 스플리터(IR cut-off beam splitter)(81)를 펌프광과 프로브광이 결합되어 진행하는 경로 상에 삽입함으로써 시작된다. 상기 제 2 이색성 빔 스플리터(81)를 통해 반사된 일부의 프로브광은 시료가 존재하 지 않는 현미경 대물렌즈 (microscope objective) 즉, 제 2 광학집속계(82)와 제 2 광학집속계(collector)를 거친 후, 광경로 지연 조절기(optical path delay controller)를 통과하여 광 간섭계 빔 컴바이너(90)에 도달한다.
상기 광 간섭계 빔 컴바이너(beam combiner)(90)에 의해서 상기 현미경 광경로와 상기 기준팔 광경로를 각각 진행한 탐색광이 합쳐지면 간섭에 의한 신호광이 생성된다. 간섭 신호광의 세기 ( I int )는 상기 현미경 광경로를 통과한 프로브광의 세기 (I sig )와 상기 기준팔 광경로를 각각 진행한 프로브광의 세기 ( I ref ), 그리고 두 광경로 간의 위상차 ( Delta phi )에 의하여 다음과 같이 주어진다.
Figure 112007041655743-pat00002
상기 위상차 Delta phi 는 시료의 공간적 위치
Figure 112007041655743-pat00003
에 따른 불균일성을 고려한 두 광경로 간 길이차에 기인하며, 시료 상태의 시간적 변화 (t)에 따라 변조가 가능하다.
상기 적외선 펌프광원(10) 앞에 삽입된 진폭 변조기(amplitude modulator)(11)를 이용하여, 적외선 펌프광의 진폭 (EIR)를 각 주파수 (ωm)로 변조하면 시료 내부에서 비선형 굴절률 변화 (Kerr effect) Δn=n2IIR 를 유도하는 적외선 펌프광의 세기 IIR 가 다음과 같이 변조된다.
Figure 112007041655743-pat00004
따라서, 시료의 비선형 위상 변화 Delta phi 가 변조된 적외선 펌프광의 세기 (IKerr)와 불균일 시료의 공간적 특성에 따른 계수
Figure 112007041655743-pat00005
에 비례한다고 하면, 광 간섭계 장치의 광로 간 위상차는 다음과 같이 표현된다.
Figure 112007041655743-pat00006
이 때,
Figure 112007041655743-pat00007
는 적외선 펌프광 변조와 무관한 위상차 항을 의미한다. 광 간섭계 장치의 총 위상차
Figure 112007041655743-pat00008
는 교류 성분 (AC)
Figure 112007041655743-pat00009
과 직류 성분 (DC)
Figure 112007041655743-pat00010
으로 나눌 수 있으며, 다음으로 주어진다.
Figure 112007041655743-pat00011
Figure 112007041655743-pat00012
따라서, 변조된 광 간섭계 신호광의 세기는 도 7에 제시한 도식과 같은 양상을 보인다.
도 7은 신호광 생성 광 간섭계 장치의 간섭 신호출력 원리를 나타낸 개념도 이다.
변조 위상차
Figure 112007041655743-pat00013
를 갖는 광 간섭계 신호광의 세기는
Figure 112007041655743-pat00014
으로 주어지는데, 간섭 기준팔 광경로의 직류 성분 위상차
Figure 112007041655743-pat00015
를 광 경로 지연 조절기 (optical path delay controller)를 미세 조정하여,
Figure 112007041655743-pat00016
이 되도록 맞추면,
Figure 112007041655743-pat00017
의 광 간섭계 신호광이 출력된다.
본 발명의 상기 광 간섭계 신호광의 출력은 렌즈를 통해 고감도 고속 광검출기(photodetector)(100)에 집속되어 광전류 (photocurrent) 측정이 이루어진다. 이때, 상기 광검출기(100)는 상기 분자진동 간섭 광신호에 대한 변조 주파수의 2차 조화파를 기준 주파수로 설정한 위상잠금 증폭기(lock-in amplifier)(101)를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 위상잠금 증폭기(101)에 의해 상기 펌프광의 진폭 변조 주파수
Figure 112008040288420-pat00018
에 대한 2차 조화파 (2nd harmonics) 기준의 위상잠금 (lock-in) 증폭이 이루어진다. 상기 위상잠금된 광전류 신호는 다음과 같은 형태를 가지며,
Figure 112007041655743-pat00019
최종적으로 진폭 성분인
Figure 112007041655743-pat00020
이 시료의 분자진동 검출신호로 사용된다. 이 때, J 1 은 수학적으로 1차 Bessel 함수를 의미한다.
시료의 공간적 위치
Figure 112007041655743-pat00021
에 따라서 상기 시료 분자진동 검출 신호를 측정하면 적외선 비선형 분자진동 현미경 영상이 얻어지는데, 이를 위해 상기 시료 집속 광학장치에 의해 형성되는 레이저 빔 국소점의 공간적 위치를 시료 내부에서 3차원적으로 변화시키는 스캐너(40)를 사용한다.
본 발명의 상기 스캐너는, 시료의 위치를 XY 평면과 Z축 방향으로 기계적 이송 (motorized translation) 하거나, 펌프광-탐색광 결합 빔의 진행방향을 2차원 평면 상에서 고속 주사하는 갈바노 미러 스캐너를 사용하는 것이 바람직하다.
상기와 같은 구성으로 된 본 발명에 의한 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치는 고분해능 현미경 장치에 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 비선형광학 사광파혼합 (four-wave mixing) 분광법을 적외선 분자진동 이미징 시스템에 최초로 도입하여, 분자 검출감도가 높으면서 공간분해능 역시 매우 우수한 원거리장 (far-field) 레이저 현미경 장치 구성을 이룸을 요점으로 한다.
상술한 바와 같이 본 발명은 분자진동과 강한 공명을 일으키는 적외선 펌핑광을 이용함으로써 종래의 자발 라만 산란 (Raman Scattering) 또는 간섭성 반스톡스 라만 산란 (CARS)을 이용한 분자진동 현미경의 낮은 측정감도 문제를 해결할 수 있고, 더불어 파장이 짧은 탐색광을 매개로 비선형 분자진동 분광신호를 추출함으로써 종래의 적외선 (IR) 선형흡수 분자진동 현미경의 공간 분해능을 극복하여 가시광 대역 광학 현미경이 가지는 우수한 광 회절한계 해상력을 달성할 수 있다. 또한, 본 발명은 분자진동 분광 현미경 기술 분야에서 영상 취득 속도와 영상 품질을 획기적으로 향상하는 데 기여할 수 있다.

Claims (7)

  1. 임의의 분자진동 대역 주파수로 시료 구성 매질분자를 여기시켜 공명 상호작용하도록 하여 결맞음 상태를 만드는 적외선 펌프광(pump beam)을 발생시키는 펌프광원(10);
    상기 적외선 펌프광에 의해 시료 내부에 국소적으로 유도된 분자 결맞음 상태를 검출하는 프로브광(probe beam; 탐색광)을 발생시키는 프로브광원(20);
    상기 펌프광과 프로브광을 시간적으로 동기화하고 공간적으로 동축 상에 일치시키는 빔 컴바이너(beam combiner)(30);
    현미경 영상을 얻기 위해 상기 빔 컴바이너(30)에 의해 결합된 펌프광과 프로브광을 평면으로 주사되도록 하는 스캐너(Scanner)(40);
    상기 스캐너(40)에 의해 주사된 펌프광 및 프로브광을 시료 내부의 국소점으로 집속하는 제 1 광학집속계(50);
    상기 제 1 광학집속계(50)에 의해 집속된 빔이 시료와 상호작용하여 위상변이된 빔을 모아서 평행광을 만드는 제 1 수집광학계(60);
    상기 제 1 수집광학계(60)에 의해 만들어진 평행광 중에서 적외선 펌프광을 제거하고 위상변이된 프로브광을 분리시키는 제 1 이색성 빔 스플리터(beam splitter)(70);
    상기 스캐너(40)에 의해 주사된 빔에서 일부의 프로브광을 분리시켜 기준 프로브광을 생성시키는 기준간섭계(80);
    상기 위상변이된 프로브광과 기준 프로브광을 결합시키는 광 간섭계 빔 컴바이너(beam combiner)(90);
    상기 광 간섭계 빔 컴바이너(90)에 의해 결합된 프로브광으로부터 분자진동 간섭 광신호의 세기를 검출하는 광검출기(100);
    상기 광검출기(100)로부터 검출된 간섭 광신호를 수집하여 시료의 분자진동 결맞음 강도에 따라 분광신호를 생성 및 추출하는 데이터분석기(110);
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 기준간섭계(80)는 상기 스캐너(40)에 의해 주사된 빔에서 펌프광은 통과시키고 일부의 프로브광을 분리시키는 제 2 이색성 빔 스플리터(81)와, 분리된 프로브광을 집속하는 제 2 광학집속계(82)와, 상기 제 2 광학집속계(82)에 의해 집속된 빔을 모아서 평행광을 만드는 제 2 수집광학계(83) 및 상기 제 2 수집광학계(83)에 의해 만들어진 평행광의 광경로를 지연시키는 광경로 지연조절기(84)를 포함하여 이루어진 마흐-젠더형 (Mach-Zehnder) 광 간섭계로 되며, 상기 데이터분석기(110)는 상기 펌프광원의 진폭변조 및 위상변조된 프로브광의 신호광과 기준 프로브광의 신호광과의 위상 변화를 감지하는 것을 특징으로 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 광검출기(100)는 상기 분자진동 간섭 광신호에 대한 변조 주파수의 2차 조화파를 기준 주파수로 설정한 위상잠금 증폭기(lock-in amplifier)(101)를 이용하는 것을 특징으로 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 펌프광원은 파장가변 가시광/근적외선 반복펄스 레이저와 파장고정 반복펄스 레이저의 차주파수 생성법(DFG: difference frequency generation)을 이용해 구현된 파장가변 분자진동 공명 광원인 것을 특징으로 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 스캐너(40)는 갈바노 미러를 사용하여 펌프광-탐색광 결합빔을 평면으로 고속 주사되도록 하는 것을 특징으로 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 광검출기(100)는 광을 증폭시켜 검출하는 광전증배관 (PMT: photomultiplier tube) 또는 고속 광다이오드 (photodiode)인 것을 특징으로 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 이미징 장치.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항에서 선택되는 어느 한 항에 의한 상기 이미징 장치는 현미경의 이미징 장치에 사용되는 것을 특징으로 하는 적외선 비선형 분자진동 분광 현미경.
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